一種疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表達載體的沙門氏菌。該疫苗組合物解決了現(xiàn)有的兔瘟組織滅活疫苗需通過注射免疫，及其免疫后所造成的易出現(xiàn)結塊等副作用的問題；還解決了現(xiàn)有的兔瘟組織滅活疫苗制備過程中，存在病毒逃逸的生物安全問題。
【專利說明】一種疫苗組合物及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品，特別是涉及一種疫苗組合物，以及制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 兔瘟是對養(yǎng)兔業(yè)造成危害最大的一種病毒性傳染病，具有高度接觸致死性，其病 原體是兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)。RHDV經呼吸道和消化 道的黏膜進行感染，主要感染3月齡以上的家兔，發(fā)病率為90%-100%，致死率為95%-100%。
[0003] RHDV為杯狀病毒科（Caliciviridae)、兔病毒屬（Lagovirus),為單股正鏈RNA病 毒，其基因組長7437nt，含有2個開放閱讀框（ORF)，無囊膜，表面有殼粒。RHDV病毒粒子的 衣殼由180個亞單位組成，這些亞單位在化學結構上完全相同，單體分子稱為VP60。VP60 是RHDV的主要結構蛋白，分子量約為60kDa，可刺激機體產生中和抗體。
[0004] 目前,疫苗免疫對RHDV的預防和/或治療起重要作用。然而市場上銷售的兔瘟疫 苗大多為組織滅活苗，需通過注射免疫，且免疫后易出現(xiàn)結塊等副作用。另外，RHDV組織滅 活疫苗在制備時，需將兔瘟病毒注射兔，取致死兔肝、脾組織進行滅活，從而導致出現(xiàn)病毒 逃逸的生物安全問題。
[0005] 陳寶林等公開了 一種兔瘟疫苗(新劑型兔瘟疫苗的研究[J]中國畜禽傳染病 19971 :28_30)，將攻毒后兔肝臟等器官經研磨后加入福爾馬林滅活加入油乳劑制成疫苗。 然而該兔癌油乳劑滅活苗吸收差，有大小不一顆粒及針頭狀出血點，免疫后25天尚未完全 吸收。


【發(fā)明內容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物采用鼠傷寒 沙門氏菌載體表達兔瘟病毒VP60蛋白，以制備RHDVVP60蛋白重組活載體疫苗，從而解決了 現(xiàn)有的兔瘟組織滅活疫苗需通過注射免疫，及其免疫后所造成的易出現(xiàn)結塊等副作用的問 題；還解決了現(xiàn)有的兔瘟組織滅活疫苗制備過程中，存在病毒逃逸的生物安全問題。
[0007] 本發(fā)明的兔瘟疫苗組合物可通過口服途徑進行免疫，解決了現(xiàn)有兔瘟病毒疫苗需 注射免疫，以及免疫后注射部位出現(xiàn)結塊等問題；制備過程也比較安全，同時避免了病毒逃 逸的生物安全問題。
[0008] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的含有 兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列的表達載體的沙門氏菌。
[0009] 優(yōu)選地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的蛋白序列為SEQ ID NO. 2 ;更優(yōu)選地，所述兔瘟 病毒VP60蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
[0010] 優(yōu)選地，所述表達載體為原核表達載體；更優(yōu)選地，所述載體攜帶asd基因，可 編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶；進一步優(yōu)選地，所述載體為PYA3341、pYA3342、pYA248、 PYA262中的一種或幾種或其改進型。
[0011] 優(yōu)選地，所述沙門氏菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌；更優(yōu)選地，所述沙門氏菌為asd基 因缺陷型菌株；進一步優(yōu)選，所述沙門氏菌為asd基因缺陷型減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550。 [0012] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物進一步包括凍干保護劑，所述凍干保護劑為脫脂奶粉、蔗 糖、明膠、海藻糖中的一種或幾種。
[0013] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物中沙門氏菌含量為彡IXlO9Cfu/頭份；優(yōu)選地，所述沙門 氏菌含量為彡IX IOltlCfu/頭份。
[0014] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種疫苗組合物的制備方法，所述方法包括：（1)反 轉錄兔瘟病毒VP60基因，將其連接到克隆載體擴增，然后連接到表達載體，獲得重組表達 質粒；（2)將所述重組表達質粒轉入第一中間宿主菌擴增，然后轉入第二中間宿主菌進行 甲基化修飾，獲得經甲基化修飾的重組質粒；（3)將所述重組質粒轉入終宿主菌，誘導表 達，獲得兔瘟疫苗組合物。
[0015] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中克隆載體為pGEM-T、pMD18-T、pMD19-T、PUC18的一種或幾 種；所述的表達載體為攜帶asd基因、可編碼天冬氨酸-3 -半醛脫氫酶的原核表達載體。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中所述的第一中間宿主菌為X6212,所述的第二中間宿主 菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730 ;所述步驟（3)中所述的終宿主菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌 X4550,更優(yōu)選為所述的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550為asd基因缺陷型菌株。
[0017] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療兔瘟病毒 性傳染病的藥物中的應用。
[0018] 基于此，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0019] (1)本發(fā)明的兔瘟疫苗組合物可通過口服途徑進行免疫，不經過傳統(tǒng)的注射途徑， 避免了現(xiàn)有組織疫苗免疫注射后，注射部位出現(xiàn)結塊現(xiàn)象所帶來的副作用，同時也不需添 加增強免疫效力的添加物質。
[0020] (2)本發(fā)明所制備的兔瘟疫苗組合物含有兔瘟病毒的結構蛋白VP60基因，免疫動 物后可同時產生細胞免疫和體液免疫應答，尤其可有效刺激動物黏膜產生分泌型的抗體；
[0021] (3)本發(fā)明所述的兔瘟疫苗組合物在制備過程中，不需要使用具有感染性的兔瘟 病毒，比較安全，避免了病毒逃逸的生物安全問題。
[0022] 序列表中：
[0023] 序列1為兔瘟病毒RHDV毒株VP60蛋白核苷酸序列；
[0024] 序列2為兔瘟病毒RHDV毒株VP60蛋白氨基酸序列。

【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
[0026] 本實施例中所用的"免疫量"是指提供針對流感疫苗的免疫劑量，主要取決于以下 因素：被免疫動物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態(tài)以及動物之前是否接受過對抗同 樣病毒的疫苗。
[0027] 本實施例中所用的兔瘟病毒VP60基因序列，來源于已報道的兔瘟中國分離株，在 NCBI中的序列號為DQ280493. 1。
[0028] 下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料， 若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0029] 實施例1兔瘟病毒VP60克隆載體的構建
[0030] 根據(jù)已報道RHDV毒株的VP60序列（NCBI登錄號為DQ280493. 1)，設計上、下游 引物，并在兩端分別添加BamHI和PstI酶切位點，PCR擴增VP60基因全長序列。引物 由Invitrogen公司合成，上游引物序列為CGGGATCCATGGAGGGCAAAGC，下游引物序列為 CCCTGCAGTCAGAC ATAAGAAAAGC。將病兔肝組織樣品加入10倍體積的生理鹽水研磨，3000rpm 離心lOmin，取上清，提取總RNA，同時，進行RHDV反轉錄以獲得cDNA片段。將獲得的cDNA 片段作為模板，進行PCR擴增，反應程序為：95°C預變性5min，94°C變性45s，52°C復性30s， 72°C延伸60s，35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴增產物使用1%凝膠進行電泳檢測。結 果出現(xiàn)1740bp的條帶，與目的基因片段大小相同。
[0031] 將目的基因片段回收，與pGEM-T連接，連接體系：VP60基因20iU、pGEM-T載體 0. 5 yl、連接酶緩沖液2. O yl、T4DNA連接酶I. O yl、滅菌雙蒸水8. 5 yl。連接反應條件為 16°C，30min。將連接產物加入DH5a感受態(tài)細胞，冰上放置30min，然后42°C加熱45s，置冰 上lmin，加入890 ill的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min，將培養(yǎng)物接種含100 ii g/ml 氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)過夜。結果顯示：LB固體培養(yǎng)基出現(xiàn)白色小菌落。 挑典型菌落，接種于含有100 U g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，200rpm培養(yǎng)10h。
[0032] 實施例2兔瘟病毒VP60克隆載體pGEM-T-VP60的鑒定
[0033] PCR擴增上述實施例1中pGEM-T-VP60載體轉化的DH5 a細菌VP60基因，PCR程 序如實施例1所述。提取PCR陽性的DH5 a質粒，使用BamH I、PstI雙酶切鑒定，所用酶切 體系如表1所示，酶切反應條件為37°C反應4h。酶切產物使用1%凝膠電泳檢測，并回收目 的基因。將PCR和酶切鑒定均為陽性的質粒，送基因公司進行測序。
[0034] 表1酶切反應體系
[0035]

【權利要求】
1. 一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的含有兔瘟病毒VP60蛋白核酸序列 的表達載體的沙門氏菌。
2. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述兔瘟病毒VP60蛋白的蛋白序列為SEQ ID NO. 2 ;優(yōu)選地，所述兔瘟病毒VP60蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
3. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述表達載體為原核表達載體；更優(yōu)選 地，所述載體攜帶asd基因，可編碼天冬氨酸-3 -半醛脫氫酶；進一步優(yōu)選地，所述載體為 pYA3341、pYA3342、pYA248、pYA262中的一種或幾種或其改進型。
4. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述沙門氏菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌；優(yōu) 選地，所述沙門氏菌為asd基因缺陷型菌株；進一步優(yōu)選，所述沙門氏菌為asd基因缺陷型 減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550。
5. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物進一步包括凍干保護劑， 所述凍干保護劑為脫脂奶粉、蔗糖、明膠、海藻糖中的一種或幾種。
6. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物中沙門氏菌含量為 彡lX109cfu/頭份；優(yōu)選地，所述沙門氏菌含量為彡lXKTcfu/頭份。
7. -種疫苗組合物的制備方法，所述方法包括： (1) 反轉錄兔瘟病毒VP60基因，將其連接到克隆載體擴增，然后連接到表達載體，獲得 重組表達質粒； (2) 將所述重組表達質粒轉入第一中間宿主菌擴增，然后轉入第二中間宿主菌進行甲 基化修飾，獲得經甲基化修飾的重組質粒； (3) 將所述重組質粒轉入終宿主菌，誘導表達，獲得兔瘟疫苗組合物。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，所述步驟（1)中克隆載體為pGEM-T、pMD18-T、 PMD19-T、PUC18的一種或幾種；所述的表達載體為攜帶asd基因、可編碼天冬氨酸-0 -半 醛脫氫酶的原核表達載體。
9. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，所述步驟（2)中所述的第一中間宿主菌為X6212， 所述的第二中間宿主菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌X3730 ;所述步驟（3)中所述的終宿主菌為 減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550,更優(yōu)選為所述的減毒鼠傷寒沙門氏菌X4550為asd基因缺陷型 菌株。
10. 權利要求1?6任一項所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療兔瘟病毒性傳染 病的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/14GK104415350SQ201310412578
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權日:2013年9月11日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司