專利名稱：促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在國(guó)立健康研究院(National Institutes of Health)資金No.R01 NS37901資助的研究項(xiàng)目下由政府資助完成的。政府在這個(gè)發(fā)明中享有某些權(quán)利。
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2001年8月13日遞交的臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)No.60/311,870的權(quán)益，茲將其全文并入作為參考，包括所有的插圖、表格和附圖。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)損傷是長(zhǎng)期喪失勞動(dòng)力的一個(gè)主要起因。較差的神經(jīng)損傷治療伴隨著肌肉萎縮，并且當(dāng)斷離的軸突不能與遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)重建連續(xù)性時(shí)可以導(dǎo)致令人痛苦的神經(jīng)瘤。雖然神經(jīng)在損傷后具有再生的潛力，這個(gè)能力嚴(yán)格地取決于再生神經(jīng)纖維(及其軸突芽)與斷離的神經(jīng)段(以及其中的施旺細(xì)胞基膜)進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕佑|。未能橫穿間隙或損傷部位并進(jìn)入斷離的遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)段的基膜的再生軸突將會(huì)潰變，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡、肌肉萎縮和永久的機(jī)能缺失(Fawcett JW等 Annu Rev Neurosci 1343-60)。
簡(jiǎn)要地，神經(jīng)攜帶神經(jīng)元的周圍突起(或軸突)。神經(jīng)元胞體位于脊髓中(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)、沿著脊柱的神經(jīng)節(jié)中(脊髓感覺神經(jīng)節(jié))或者遍布全身器官的神經(jīng)節(jié)中(自主和腸神經(jīng)節(jié))。神經(jīng)由軸突、施旺細(xì)胞和大量的結(jié)締組織鞘組成(Dagum AB J Hand Ther 11111-117)。外覆層神經(jīng)外膜是由緩沖神經(jīng)束的外部壓力并且圍繞神經(jīng)束膜的膠原性結(jié)締組織構(gòu)成的。神經(jīng)束膜環(huán)繞每束神經(jīng)纖維，并且與神經(jīng)內(nèi)膜微血管中的內(nèi)皮細(xì)胞一起，行使血-神經(jīng)屏障的功能。神經(jīng)內(nèi)膜位于神經(jīng)束膜的內(nèi)部，并且由環(huán)繞施旺細(xì)胞和軸突的膠原性組織組成。神經(jīng)束組(fascicular group)由兩個(gè)或更多個(gè)分別被神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜環(huán)繞的神經(jīng)束(fascicle)組成。神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)局部解剖圖是穩(wěn)定的，或者是一組感覺神經(jīng)束或者是一組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)束。神經(jīng)元由胞體(細(xì)胞體)和軸突組成，軸突可以是數(shù)英尺長(zhǎng)。
當(dāng)神經(jīng)損傷存在軸突破壞、但是神經(jīng)內(nèi)膜鞘的連續(xù)性完整無(wú)損(例如，擠壓傷)的時(shí)候，軸突在它們?cè)瓉?lái)的基膜內(nèi)再生，并且徹底痊愈是可以預(yù)期的。相反，軸突再生在神經(jīng)橫斷之后受到嚴(yán)重地影響，而且外科手術(shù)恢復(fù)高度地依賴于如上所述的神經(jīng)元件的重新對(duì)接(realignment)(Dagum AB J Hand Ther 11111-117)。神經(jīng)外膜縫合術(shù)(神經(jīng)縫合術(shù))是治療神經(jīng)橫斷的主要方法。不過(guò)，再生程度是高度可變的，并且充其量可以預(yù)期功能的部分恢復(fù)(Terzis JK等The Peripheral NerveStructure，function and reconstruction，Hampton Press，Norfolk)。盡管存在當(dāng)前顯微外科技術(shù)的技術(shù)現(xiàn)狀，但由于神經(jīng)精細(xì)的顯微結(jié)構(gòu)和不能實(shí)現(xiàn)的軸突到軸突的精確接合，在神經(jīng)橫斷修復(fù)之后功能的完全恢復(fù)仍然是一個(gè)不能及的理想。
神經(jīng)切除術(shù)為神經(jīng)移植提供了正當(dāng)理由，但存在若干實(shí)際問題。這些年來(lái)，已經(jīng)探索了各種神經(jīng)移植物的備選方案。目前被視為有發(fā)展前途的備選方案是關(guān)于同種異體神經(jīng)移植物的應(yīng)用。雖然供體移植物可獲得性遇到其它器官替代策略的困難，但神經(jīng)移植物中細(xì)胞元件的存活可能遠(yuǎn)不是那么重要。盡管施旺細(xì)胞明顯有助于再生過(guò)程，但神經(jīng)鞘結(jié)構(gòu)已含有促進(jìn)軸突再生的必要腳手架和粘性線索(adhesive cues)，并且在無(wú)細(xì)胞(例如冷凍殺死的)神經(jīng)移植物中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了具有重要意義的再生(Ide C等Brain Res 28861-75；Hall SMNeuropathol Appl Neurobiol12401-414；Gulati AKJ Neurosurg 68117-123；Nadim W等Neuropathol Appl Neurobiol 16411-421)。殺死定居的抗原遞呈細(xì)胞(例如施旺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)可以使移植物的免疫原性大為降低。利用無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物極大地降低或消除了宿主-移植物免疫排斥的顧慮(Evans PJ等Prog Neurobiol 43187-233；Evans PJ等Muscle Nerve 211507-1522)。這些特性為冷凍殺死的(無(wú)細(xì)胞)同種異體和異種神經(jīng)移植物的應(yīng)用提供了可觀的前景。另一方面，沒有存活細(xì)胞預(yù)先排除了看似促進(jìn)再生過(guò)程的神經(jīng)變性以及隨后的重塑(Bedi KS等Eur JNeurosci 4193-200；Danielsen N等Brain Res 666250-254)。
層粘連蛋白是基膜主要的生長(zhǎng)促進(jìn)成分，其是用于軸突成功再生的粘性刺激物(Wang，GY等Brain Res 570116-125)。然而，雖然正常(未受損傷的)神經(jīng)具有豐富的層粘連蛋白，正常神經(jīng)仍然抑制或者抵抗軸突生長(zhǎng)(Langley JN JPhysiol 31365-391；Brown MC等EurJNeurosci 6420-428)。這意味著層粘連蛋白的生長(zhǎng)促進(jìn)活性在正常神經(jīng)環(huán)境下被抑制，而且層粘連蛋白活性在神經(jīng)變性中必須以某種方式被恢復(fù)從而確保再生。
正常周圍神經(jīng)對(duì)于軸突生長(zhǎng)而言是一種較差的基質(zhì)(Zuo J.等J Neurobiol 3441-54；Bedi KS等Eur J Neurosci 4193-200)。試驗(yàn)結(jié)果顯示正常神經(jīng)基膜內(nèi)的層粘連蛋白不能接近再生的軸突芽(Zuo J.等J Neurosci 185203-5211；Ferguson TA，和D.Muir MolCell Neurosci 16157-167；Agius E.等J Neurosci 18328-338)。一旦神經(jīng)損傷，斷離的節(jié)段(損傷遠(yuǎn)側(cè))經(jīng)歷廣泛的變性(degeneration)過(guò)程，引起廣泛的重塑(remolding)。在創(chuàng)傷誘導(dǎo)的神經(jīng)變性中，斷離的軸突死亡，它們的髓鞘碎片和產(chǎn)生的殘骸通過(guò)吞噬作用清除。盡管存在這種變性，鞘結(jié)構(gòu)和基膜仍保存下來(lái)。施旺細(xì)胞增生并為神經(jīng)作好軸突再生的準(zhǔn)備。這整個(gè)的過(guò)程，包括重塑方面，通常被稱作為神經(jīng)變性?，F(xiàn)在清楚神經(jīng)損傷導(dǎo)致遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)段的積極改變，并且實(shí)驗(yàn)證明變性的神經(jīng)比正常神經(jīng)具有更大的軸突生長(zhǎng)促進(jìn)潛力(Bedi KS等Eur J Neurosci 4193-200；Danielsen NJ等Brain Res 666250-254；Agius E等J Neurosci 18328-338)。所以，變性過(guò)程似乎參與將正常神經(jīng)從抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)化到促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的狀態(tài)的機(jī)制(Salonen VJ等JNeurocytol 16713-720；Danielsen N等Brain Res 681105-108)。
與神經(jīng)損傷有關(guān)的功能喪失因軸突破壞而引起。軸突非常細(xì)且脆，因而最輕微的損傷(包括受壓)都可以導(dǎo)致斷離反應(yīng)(軸索切斷)。在軸索切斷中，損傷遠(yuǎn)側(cè)的軸突死亡并且變性。對(duì)于神經(jīng)來(lái)說(shuō)問題最小的損傷是擠壓傷(軸索斷傷)，其中發(fā)生軸索切斷，但是神經(jīng)鞘的連續(xù)性保持完整。在軸索斷傷的情況下，由于基膜保持連續(xù)，軸突典型地?zé)o需外科手術(shù)的干預(yù)就得以再生。為使斷離的周圍神經(jīng)成功地再生，自近側(cè)神經(jīng)殘段萌發(fā)的軸突芽首先必須定位之后進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)段的施旺細(xì)胞基膜內(nèi)。這一決定性必要條件被認(rèn)為造成了與擠壓傷相比神經(jīng)橫斷后相對(duì)較差的再生。在神經(jīng)橫斷(神經(jīng)斷傷)中，神經(jīng)部分或者完全地?cái)嚯x。橫斷損傷中軸突和神經(jīng)鞘都斷離，破壞了神經(jīng)連續(xù)性和軸突再生所需的引導(dǎo)機(jī)制。重建神經(jīng)的神經(jīng)元件的連續(xù)性的外科接合術(shù)(神經(jīng)縫合術(shù))對(duì)于軸突再生是必要的。此外，神經(jīng)橫斷和修復(fù)后的軸突再生也會(huì)因?yàn)榻鼈?cè)和遠(yuǎn)側(cè)元件的未對(duì)準(zhǔn)而復(fù)雜化。即使是在尖銳器械利落橫斷的例子中，整個(gè)神經(jīng)結(jié)構(gòu)也會(huì)被破壞。腫脹以及軸漿自切口端的外流導(dǎo)致迅速增生效應(yīng)，其干擾基膜腳手架的準(zhǔn)確接合和重新對(duì)接。盡管通過(guò)顯微外科技術(shù)可以改善神經(jīng)束的對(duì)接，軸突-軸突的接合仍然是一個(gè)理想化的目標(biāo)。由于軸突的小尺寸以及結(jié)締組織的相對(duì)優(yōu)勢(shì)，多數(shù)在外科手術(shù)接合后從近側(cè)殘段萌發(fā)的軸突芽最有可能首先遭遇富含抑制性硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)的非許可性基質(zhì)。這可能解釋了與周圍神經(jīng)橫斷修復(fù)相關(guān)聯(lián)的顯著的潛代期和不穩(wěn)定的再生。證據(jù)顯示CSPGs結(jié)合層粘連蛋白并抑制其生長(zhǎng)促進(jìn)活性，并且CSPG在損傷后的變性過(guò)程中將被降解。從而，使CSPGs失活的此過(guò)程能夠解釋為何變性對(duì)于神經(jīng)再生是必要的。最近發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)含有豐富的CSPG，其抑制神經(jīng)內(nèi)膜層粘連蛋白的生長(zhǎng)促進(jìn)活性(Zuo J等[1998a]J Neurobiol 3441-54)。抑制神經(jīng)突的CSPGs在包繞施旺細(xì)胞基膜的神經(jīng)內(nèi)膜組織中很豐富，并且在神經(jīng)損傷后迅速地被上調(diào)(Braunewell KH等[1995a]Eur JNeurosci 7805-814；Braunewell KH等[1995b]Eur J Neurosci7792-804)。所以，任何神經(jīng)微細(xì)結(jié)構(gòu)的未對(duì)準(zhǔn)(在損傷和修復(fù)后)都將迫使再生的軸突芽遇到非許可性組織的干涉，這可能嚴(yán)重地限制了它們進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的基膜。最近的研究支持某些CSPG降解酶是層粘連蛋白的生長(zhǎng)促進(jìn)特性可在變性的神經(jīng)內(nèi)藉以恢復(fù)的一種機(jī)制的結(jié)論(Zuo J等[1998b]J Neurosci 185203-5211；Ferguson TA等Mol Cell Neurosci 16157-167)。此外，這個(gè)過(guò)程可通過(guò)在神經(jīng)損傷部位和神經(jīng)移植物上施用CSPG-降解酶而實(shí)現(xiàn)以改善再生(Zuo J等Exp Neurol 176221-228；Krekoski CA等J Neurosci 216206-6213)。一種特別有效的此類CSPG-降解酶是軟骨素酶(chondroitinase)ABC，一種降解CSPG雙糖側(cè)鏈的細(xì)菌酶(Zuo J等[1998a]J Neurobiol 3441-54)。其它包括基質(zhì)金屬蛋白酶家族的特定成員，MMP-2和MMP-9，它們降解CSPG的核心蛋白(Ferguson TA等Mol Cell Neurosci 16157-167)。
雖然軟骨素酶ABC(一種糖胺聚糖裂解酶)降解硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和透明質(zhì)酸鹽，其增強(qiáng)神經(jīng)組織的生長(zhǎng)促進(jìn)特性的能力歸功于CSPG降解(Zuo J等Exp Neurol 154654-662；Ferguson TA等Mol Cell Neurosci 16157-167)。此外，已經(jīng)證明軟骨素酶ABC治療不會(huì)破壞神經(jīng)鞘的組織或者將層粘連蛋白從施旺細(xì)胞基膜中轉(zhuǎn)移出來(lái)(Krekoski CA等J Neurosci 216206-6213)。
在神經(jīng)橫斷修復(fù)模型中，對(duì)抑制性CSPG的降解去除了再生軸突芽的一個(gè)主要障礙，并導(dǎo)致其向遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)更加茁壯和一致的生長(zhǎng)(Krekoski CA等J Neurosci 216206-6213)。
已經(jīng)證明變性的神經(jīng)具有提高的支持軸突生長(zhǎng)的能力(Giannini C等J Neuro pathol Exp Neurol 49550-563；Hasan N等J Anat189293-302)。變性的作用很可能歸因于神經(jīng)基膜的改變，因?yàn)樵趶念A(yù)變性的神經(jīng)制備的無(wú)細(xì)胞移植物中軸突再生也得以改善(Danielsen N等Brain Res 681105-108)。在整個(gè)變性過(guò)程中，施旺細(xì)胞基膜保持結(jié)構(gòu)完整。
動(dòng)物模型已經(jīng)證明從體內(nèi)預(yù)變性的神經(jīng)制備的移植物在支持神經(jīng)再生方面要比新鮮切除的移植物好得多(Danielsen N等Brain Res 681105-108)。不過(guò)，建立預(yù)變性神經(jīng)的方法(即，神經(jīng)損傷后繼之以一段體內(nèi)存活期以允許組織變性)在人體中是不切實(shí)際的。
體內(nèi)周圍神經(jīng)變性導(dǎo)致幾種細(xì)胞外基質(zhì)分子的周轉(zhuǎn)提高，這取決于神經(jīng)元、施旺細(xì)胞以及侵入的巨嗜細(xì)胞對(duì)蛋白水解酶的釋放和活化。損傷后基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性的調(diào)節(jié)暗示MMP-2和MMP-9在神經(jīng)變性和再生期間參與胞外基質(zhì)的重塑(La Fleur等J Exp Med 1842311-2326；Kherif等Neuropathol Appl Neurobiol 24309-319；Ferguson等Mol Cell Neurosci 16157-167)。MMP-9在損傷后立即在周圍神經(jīng)中表達(dá)，并且主要是在損傷部位。MMP-9的表達(dá)與血液-神經(jīng)屏障的崩潰、粒細(xì)胞的積聚和巨嗜細(xì)胞的入侵相關(guān)(Shubayev等Brain Res 85583-89；Siebert等J Neuropathol Exp Neurol 6085-93)。大多數(shù)證據(jù)表明造血細(xì)胞顯著地有助于MMP-9活性的升高(Taskinen等Acta Neuropathol(Berl)93252-259)。在另一方面，MMP-2在正常周圍神經(jīng)中由施旺細(xì)胞組成型地表達(dá)(Yamada等Acta Neuropathol(Berl)89199-203)。損傷后數(shù)天，MMP-2表達(dá)被上調(diào)，并且潛在酶相當(dāng)程度地轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚孕问?Ferguson等Mol CellNeurosci 16157-167)。
體外變性導(dǎo)致神經(jīng)外植塊的神經(jīng)突促進(jìn)活性得到實(shí)質(zhì)上的提高。這種提高通過(guò)添加MMP抑制劑被封阻，同時(shí)發(fā)生的凈明膠水解活性的提高也被封阻(由原位酶譜證明)。在培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊中神經(jīng)突促進(jìn)活性迅速上升，并且與MMP-2的上調(diào)和活化平行。相反，體內(nèi)變性的最初效果僅僅是抑制正常神經(jīng)原本就很低的神經(jīng)突促進(jìn)活性，在此期間MMP-2的體內(nèi)表達(dá)或活化沒有變化。不過(guò)，橫斷神經(jīng)的神經(jīng)突促進(jìn)活性確實(shí)在體內(nèi)隨著時(shí)間提高，并且這與突然爆發(fā)的MMP-2的表達(dá)和活化相對(duì)應(yīng)(Ferguson和Muir，2000，Mol Cell Neurosci 16157-167；Shubayev和Myers，2000，Brain Res 85583-89)。
體外試驗(yàn)顯示體內(nèi)預(yù)變性的神經(jīng)段比正常神經(jīng)段具有較大的神經(jīng)突促進(jìn)活性(Bedi等Eur J Neurosci 4193-200；Agius等JNeurosci 18328-338；Ferguson等Mol Cell Neurosci 16157-167)。不過(guò)，體內(nèi)測(cè)試預(yù)變性的神經(jīng)移植物的研究產(chǎn)生了與之矛盾的結(jié)果，特別是當(dāng)利用細(xì)胞(活)神經(jīng)移植物的時(shí)候(Gordon等JHand Surg [Am]442-47；Danielsen等Brain Res 666250-254；Hasan等J Anat 189(Pt2)293-302)。但是，預(yù)變性似乎對(duì)增強(qiáng)進(jìn)入無(wú)細(xì)胞移植物的再生特別有利(Ochi等Exp Neurol 128216-225；Danielsen等Brain Res 681105-108)。這說(shuō)明，在變性時(shí)，細(xì)胞和分子機(jī)制起著增強(qiáng)基膜的生長(zhǎng)促進(jìn)特性的作用，然后其在細(xì)胞元件被殺死后保留了刺激神經(jīng)再生的能力。體外預(yù)變性可以導(dǎo)致無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的生長(zhǎng)促進(jìn)能力相當(dāng)程度地提高，這在本發(fā)明的低溫培養(yǎng)和移植模型中很容易地得到了證明。無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植與軸突再生開始的實(shí)質(zhì)性延遲相關(guān)聯(lián)(Danielsen等Brain Res 681105-108)。
許多關(guān)于神經(jīng)外植塊培養(yǎng)物和神經(jīng)移植物保存的研究聚焦于神經(jīng)段的冷藏。與促進(jìn)培養(yǎng)中神經(jīng)移植物的有限變性的努力不同，冷藏法目的是在最低限度的缺血性條件下保存神經(jīng)以抑制細(xì)胞和蛋白水解活性。Levi等(Levi A等Glia 10121-131)發(fā)現(xiàn)冷藏1周后細(xì)胞存活力顯著下降，并且在冷藏3周后僅有少量存活的施旺細(xì)胞殘留在神經(jīng)外植塊中。后來(lái)，Lassner等(Lassner等J Reconstr Microsurg 11447-453)報(bào)道培養(yǎng)基(DMEM，而非冷藏液)對(duì)于維持施旺細(xì)胞存活力以及對(duì)于冷藏缺血條件下貯藏的神經(jīng)移植物的再生潛力具有正面效果。雖然不利于神經(jīng)移植物的生長(zhǎng)促進(jìn)潛力的最優(yōu)化，持續(xù)冷藏確實(shí)會(huì)進(jìn)一步降低細(xì)胞存活力、免疫原性以及同種異體神經(jīng)移植物免疫排斥的問題(Evans等MuscleNerve 211507-1522)。鑒于這個(gè)原因，延長(zhǎng)的冷藏和冷凍殺死的神經(jīng)同種異體移植物比新鮮同種異體移植物導(dǎo)致更好的再生(Evans等Microsurgery 19115-127)。
從而，本領(lǐng)域仍然需要可以用于改善傳統(tǒng)神經(jīng)修復(fù)結(jié)果的低風(fēng)險(xiǎn)輔助療法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)的組合物和方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)-降解酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、或其組合組成的組中選擇的CSPG降解酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、MMP-2、及MMP-9、或其組合組成的組中選擇的CSPG降解酶。
本發(fā)明還涉及促進(jìn)人或動(dòng)物損傷的神經(jīng)組織修復(fù)的方法。本發(fā)明的方法包括向神經(jīng)修復(fù)、接合、移植物、或者損傷的神經(jīng)給藥一種或多種CSPG-降解酶。本發(fā)明的方法改善再生軸突越過(guò)神經(jīng)-神經(jīng)或神經(jīng)-移植物界面的能力，并增強(qiáng)基膜腳手架內(nèi)的軸突生長(zhǎng)。抑制性CSPG的降解建立了一個(gè)更加許可的神經(jīng)基質(zhì)，并且允許軸突芽更好地進(jìn)入神經(jīng)的施旺細(xì)胞基膜，從而增加成功伸入損傷的神經(jīng)組織或植入的神經(jīng)移植物的軸突的數(shù)目。此外，這也使得軸突芽可以采取正確的路徑，從而導(dǎo)致功能恢復(fù)進(jìn)一步的改善。
本發(fā)明還涉及通過(guò)用CSP-降解酶處理制備神經(jīng)移植物的方法。優(yōu)選地，神經(jīng)移植物(同種異體的或者異種的)是新鮮和沒有變性的，并且在神經(jīng)移植物冷凍之前或之后用CSPG-降解酶處理。如果是在移植物的細(xì)胞活著的時(shí)候處理的，則移植物可以就此植入，或者隨后被冷凍殺死使之無(wú)細(xì)胞化。在一個(gè)實(shí)施方式中，神經(jīng)組織在處理后被無(wú)細(xì)胞化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，神經(jīng)組織通過(guò)冷凍殺死無(wú)細(xì)胞化。
本發(fā)明還涉及培養(yǎng)新鮮(或者為運(yùn)輸而短暫保存)的神經(jīng)組織用于隨后作為神經(jīng)移植物植入人或動(dòng)物體內(nèi)的方法。優(yōu)選地，從人或動(dòng)物供體中收獲新鮮的神經(jīng)組織，并在允許組織離體發(fā)生變性和重塑的生理?xiàng)l件下培養(yǎng)，通過(guò)內(nèi)源性過(guò)程促進(jìn)施旺細(xì)胞在組織內(nèi)的增生和基膜的活化。在一個(gè)實(shí)施方式中，神經(jīng)組織/移植物在培養(yǎng)后被無(wú)細(xì)胞化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，神經(jīng)組織/移植物通過(guò)冷凍殺死被無(wú)細(xì)胞化。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及提供用于植入人或動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)移植物的方法。優(yōu)選地，供體移植物的橫斷面特征與植入部位的神經(jīng)組織橫斷面特征相似。
附圖的簡(jiǎn)短說(shuō)明

圖1A-1D顯示了軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的CSPG新表位(neoepitope)免疫熒光。無(wú)細(xì)胞(冷凍殺死的)大鼠坐骨神經(jīng)段整個(gè)用軟骨素酶ABC在體外處理16小時(shí)。圖1A顯示了由Ab1918標(biāo)記的新表位(軟骨素酶-依賴性)，證明用軟骨素酶整體處理有效地滲透所有的神經(jīng)區(qū)室并且降解CSPG側(cè)鏈。在圖1B中，Ab1918免疫標(biāo)記的強(qiáng)度并不因?yàn)橛密浌撬孛割~外處理圖1A中所示神經(jīng)的切片而增加，說(shuō)明最初的整體處理是徹底的。在圖1C中，軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段中施旺細(xì)胞基膜的結(jié)構(gòu)完整性通過(guò)層粘連蛋白免疫熒光證實(shí)。圖1D顯示了8天后軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞居間神經(jīng)移植物的體內(nèi)Ab1918免疫標(biāo)記。
圖2顯示了通過(guò)由軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段的低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)反映的抑制性CSPG的失活。無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段整體用軟骨素酶(″Ch′ase″)或單獨(dú)用介質(zhì)處理。進(jìn)行神經(jīng)切片，然后再用軟骨素酶或僅用介質(zhì)進(jìn)行后處理。將分離的雞胚DRG神經(jīng)元在該神經(jīng)切片上生長(zhǎng)24小時(shí)，并如材料和方法中所述記錄神經(jīng)突的長(zhǎng)度。通過(guò)對(duì)每個(gè)條件下至少250個(gè)神經(jīng)元的評(píng)定進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果以平均值(-SEM)表示，并且利用Studentt檢驗(yàn)比較整體施用介質(zhì)和軟骨素酶條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性。*P＜0.001。
圖3顯示了居間無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的連續(xù)性和GAP-43免疫染色評(píng)估。每個(gè)神經(jīng)移植物的連續(xù)性通過(guò)在縱切面上檢測(cè)近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)-移植物的接合來(lái)證實(shí)。在近側(cè)接合處，GAP-43標(biāo)記揭示眾多的再生軸突進(jìn)入移植物的近側(cè)面。GAP-43不標(biāo)記無(wú)細(xì)胞移植物中任何其余元件。
圖4顯示了8天后軸突再生進(jìn)入無(wú)細(xì)胞居間神經(jīng)移植物。這一系列代表性的切片來(lái)自兩個(gè)動(dòng)物，其均接受了介質(zhì)處理和軟骨素酶處理的移植物。從近側(cè)移植物(1.2mm，頂部)開始隨后以0.56mm間隔獲取的連續(xù)切片用GAP-43免疫標(biāo)記。在每個(gè)接受雙側(cè)移植物的動(dòng)物(n＝9)中，較之于介質(zhì)處理的對(duì)照，軸突生長(zhǎng)更多地進(jìn)入了用軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞移植物中。圖像在神經(jīng)外膜處進(jìn)行修剪以接近圖5中數(shù)字圖像分析所評(píng)定的視野。
圖5顯示了再生軸突能更多地進(jìn)入用軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物中。8-天的居間神經(jīng)移植物的連續(xù)切片(如圖4所示)通過(guò)數(shù)字圖像分析評(píng)定GAP-43-標(biāo)記的軸突分布。數(shù)據(jù)代表在進(jìn)入移植物內(nèi)特定的距離處(從近側(cè)到遠(yuǎn)側(cè))對(duì)9個(gè)介質(zhì)處理的和9個(gè)軟骨素酶處理的移植物評(píng)估的平均值(-SEM)。
圖6顯示了4天后軸突再生進(jìn)入無(wú)細(xì)胞居間神經(jīng)移植物的開始節(jié)段。對(duì)4天無(wú)細(xì)胞移植物的神經(jīng)-移植物界面以及緊近側(cè)的區(qū)域進(jìn)行了檢測(cè)，以比較進(jìn)入移植物的0.3mm處的GAP-43-標(biāo)記的軸突分布。數(shù)據(jù)代表3個(gè)介質(zhì)處理的和3個(gè)軟骨素酶處理的移植物的平均值(-SEM)。
圖7顯示了移植物內(nèi)軸突再生和施旺細(xì)胞遷移的聯(lián)系。8天移植物的連續(xù)切片進(jìn)行GAP-43(軸突)和S-100(施旺細(xì)胞)的免疫標(biāo)記。在軟骨素酶處理的移植物的近側(cè)區(qū)域，最常見施旺細(xì)胞與再生軸突緊密關(guān)聯(lián)。觀察到偶然的沒有與施旺細(xì)胞共遷移的軸突簇(箭頭)。在移植物較遠(yuǎn)側(cè)，常見沒有伴隨施旺細(xì)胞的軸突。在該移植物較遠(yuǎn)側(cè)的區(qū)域幾乎沒有被S-100強(qiáng)烈地免疫標(biāo)記的單個(gè)施旺細(xì)胞，該區(qū)主要含有與冷凍殺死的施旺細(xì)胞殘骸相關(guān)的微弱的S-100染色。
圖8A和8B顯示了遠(yuǎn)側(cè)移植物接合處軸突和施旺細(xì)胞的生長(zhǎng)。對(duì)8天的軟骨素酶處理移植物和遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)殘段的縱向連續(xù)切片進(jìn)行GAP-43(軸突)免疫標(biāo)記，如圖8A中所示，以及S-100(施旺細(xì)胞)免疫標(biāo)記，如圖8B中所示。在圖8A中，軸突(小箭頭)接近、穿過(guò)遠(yuǎn)側(cè)接合處，并在宿主遠(yuǎn)側(cè)殘段內(nèi)擴(kuò)散生長(zhǎng)。在圖8B中，S-100標(biāo)記的施旺細(xì)胞在宿主遠(yuǎn)側(cè)殘段中很豐富，但是即便有侵入移植物遠(yuǎn)側(cè)面的施旺細(xì)胞，也是很少的(其主要含有與冷凍殺死的施旺細(xì)胞殘骸相關(guān)的微弱的S-100免疫染色)。
圖9A和9B分別顯示了CSPG新表位和層粘連蛋白被染色的人神經(jīng)。這些結(jié)果說(shuō)明，雖然人神經(jīng)的總體結(jié)構(gòu)比大鼠神經(jīng)更為復(fù)雜，支持軸突再生的基膜大體上相似，并且調(diào)控生長(zhǎng)的分子成分(CSPG和層粘連蛋白)是豐富的。圖9A還通過(guò)新表位標(biāo)記證明，CSPG側(cè)鏈在軟骨素酶處理的人類神經(jīng)段中被有效地降解。
圖10顯示了利用人類神經(jīng)段通過(guò)低溫培養(yǎng)試驗(yàn)反映的抑制性CSPG的失活。人神經(jīng)用軟骨素酶處理，隨之分析神經(jīng)突促進(jìn)活性。分離的雞DRG神經(jīng)元在切片上生長(zhǎng)24小時(shí)并記錄神經(jīng)突長(zhǎng)度。結(jié)果以平均值(-SEM)表示。利用Studentt檢驗(yàn)比較介質(zhì)處理和軟骨素酶處理?xiàng)l件的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性(P＜0.001)。
圖11顯示在一種人到大鼠的異種移植模型中軸突較好地生長(zhǎng)進(jìn)入軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物中。人神經(jīng)束(與大鼠坐骨神經(jīng)的直徑相似)被移植到在大鼠坐骨神經(jīng)中制備的缺口中。8天居間神經(jīng)異種移植物的連續(xù)切片通過(guò)數(shù)字圖像分析來(lái)評(píng)定GAP-43標(biāo)記的軸突分布圖。數(shù)據(jù)代表在進(jìn)入移植物內(nèi)特定的距離(從近側(cè)到遠(yuǎn)側(cè))對(duì)2個(gè)介質(zhì)處理的和2個(gè)軟骨素酶處理的移植物估定的平均值(-SEM)。
圖12A-12D顯示了損傷的坐骨神經(jīng)中通過(guò)單次注射軟骨素酶ABC發(fā)生的CSPG降解。檢測(cè)了兩種損傷模型，雙側(cè)神經(jīng)橫斷和修復(fù)(圖12A、12B、和12D)以及雙側(cè)神經(jīng)擠壓(圖12C)。在損傷時(shí)右側(cè)坐骨神經(jīng)用軟骨素酶ABC(2μl 1U)在神經(jīng)損傷部位遠(yuǎn)側(cè)2mm處注射。神經(jīng)橫斷和修復(fù)后4天，CSPG-新表位免疫染色在接合部位的整個(gè)神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)鞘中(圖12A)(注意神經(jīng)外膜的縫合)以及距接合處數(shù)mm的整個(gè)遠(yuǎn)側(cè)(圖12B)和近側(cè)(未顯示)神經(jīng)橫斷面區(qū)域中均很強(qiáng)烈。如圖12C中所示，在軟骨素酶注射后2天檢測(cè)的擠壓傷神經(jīng)中得到了相似的結(jié)果。由體內(nèi)注射軟骨素酶發(fā)生的CSPG的降解程度通過(guò)在組織切片后對(duì)軟骨素酶第二次處理的神經(jīng)進(jìn)行CSPG-新表位免疫標(biāo)記來(lái)檢測(cè)，如圖12D中所示。在第二次應(yīng)用后連續(xù)切片中的染色強(qiáng)度并不顯著不同(比較圖12B和圖12D)，說(shuō)明單次體內(nèi)注射軟骨素酶有效地降解了周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的CSPG。
圖13A和13B顯示了在神經(jīng)擠壓傷后用軟骨素酶ABC處理并不改變軸突再生。成年大鼠接受雙側(cè)坐骨神經(jīng)擠壓傷，并且一側(cè)神經(jīng)用軟骨素酶ABC注射，而對(duì)側(cè)神經(jīng)僅接受介質(zhì)。損傷后兩天取出神經(jīng)，并用GAP-43免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記再生的軸突。兩只代表性動(dòng)物中(均接受介質(zhì)和軟骨素酶注射)緊鄰神經(jīng)擠壓傷處遠(yuǎn)側(cè)的再生軸突分布圖示于圖13A。如圖13B所示，評(píng)定了遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)連續(xù)切片中GAP-43-免疫標(biāo)記的軸突。軟骨素酶處理的(Ch′ase)神經(jīng)的軸突再生與介質(zhì)處理的對(duì)照神經(jīng)相比沒有顯著差別。數(shù)據(jù)代表進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)內(nèi)每隔0.56mm對(duì)6個(gè)軟骨素酶處理的和6個(gè)介質(zhì)處理的神經(jīng)估定的平均值(±SEM)。
圖14A和14B顯示了在神經(jīng)橫斷和神經(jīng)縫合修復(fù)后用軟骨素酶ABC處理顯著增強(qiáng)了軸突再生。成年大鼠接受雙側(cè)神經(jīng)橫斷以及端到端的修復(fù)。一側(cè)神經(jīng)用軟骨素酶ABC注射，而對(duì)側(cè)神經(jīng)僅接受介質(zhì)。損傷后4天取出神經(jīng)，并用GAP-43免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記再生的軸突。兩只代表動(dòng)物中(均接受介質(zhì)和軟骨素酶注射)緊鄰神經(jīng)接合處遠(yuǎn)側(cè)的再生軸突的分布圖示于圖14A。如圖14B所示，評(píng)定了遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)連續(xù)切片中GAP-43-免疫標(biāo)記的軸突。軟骨素酶處理的(Ch′ase)神經(jīng)中軸突再生比介質(zhì)處理的對(duì)照顯著增強(qiáng)。數(shù)據(jù)代表進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)內(nèi)每隔0.56mm對(duì)7個(gè)軟骨素酶處理的和7個(gè)介質(zhì)處理的神經(jīng)估定的平均值(±SEM)。
圖15A和15B顯示了神經(jīng)外植塊培養(yǎng)物的低溫培養(yǎng)試驗(yàn)。如圖15A所示，新鮮切除的大鼠坐骨神經(jīng)外植塊在含有0、2或10％胎牛血清的DMEM/N2中培養(yǎng)1、2、4和7天。如圖15B所示，神經(jīng)外植塊在不添加和添加GM6001(MMP抑制劑)的含有2％血清(培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn))的DMEM/N2中培養(yǎng)2天。然后冷凍切片神經(jīng)，并在含有NGF的DMEM/N2中在組織切片上種植胚性DRG神經(jīng)元。24小時(shí)后，對(duì)DRG神經(jīng)元進(jìn)行GAP-43免疫染色，并通過(guò)數(shù)字顯微照相和圖像分析測(cè)量神經(jīng)突生長(zhǎng)。對(duì)照條件是正常神經(jīng)(培養(yǎng)0天)。數(shù)據(jù)代表在每一條件下評(píng)定的大于250個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)突長(zhǎng)度平均值(±SEM)，其中所述神經(jīng)元來(lái)自2個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的至少4個(gè)獨(dú)立神經(jīng)外植塊培養(yǎng)物。
圖16顯示了神經(jīng)外植塊培養(yǎng)物的酶譜分析。神經(jīng)外植塊在含有2％血清的DMEM/N2中培養(yǎng)0(對(duì)照，C)、1、2、4和7天。然后提取神經(jīng)并通過(guò)明膠覆蓋電泳分析。酶譜揭示了酶原形式和活化形式的明膠酶，其在著色的凝膠內(nèi)顯示為透明的條帶。對(duì)照神經(jīng)主要地含有MMP-2原和痕量活化的MMP-2。在培養(yǎng)2天或更長(zhǎng)時(shí)間的神經(jīng)外植塊中，存在著MMP-2含量的漸進(jìn)增長(zhǎng)以及向活性形式的迅速轉(zhuǎn)化。MMP-9在對(duì)照及早期外植塊中可以忽略不計(jì)，然而在第4和第7天檢測(cè)到痕量。分子量指示重組人MMP-9原(92kD)、活化MMP-9(84kD)、MMP-2原(72kD)和活化MMP-2(66kD)的位置。
圖17A-17F顯示了通過(guò)原位酶譜對(duì)神經(jīng)段中凈明膠水解活性的定位。對(duì)照神經(jīng)(圖17A和圖17B)和培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊(2天，2％血清)(圖17C和圖17D)的組織切片用淬滅的熒光素標(biāo)記的明膠覆蓋，該明膠可以被組織內(nèi)的明膠水解活性轉(zhuǎn)化為熒光肽。在正常神經(jīng)中檢測(cè)到組成型明膠水解活性(圖17A)，其在更高的放大倍數(shù)(圖17B)下與施旺細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。如圖17C和17D所示，在培養(yǎng)的神經(jīng)中明膠水解活性更加強(qiáng)烈，并且散布在培養(yǎng)神經(jīng)的整個(gè)神經(jīng)內(nèi)膜中。如圖17E和17F所示，在GM6001存在的條件下培養(yǎng)的神經(jīng)中明膠水解活性顯著下降。
圖18A-18D顯示了培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊中MMP-2和MMP-9的免疫表達(dá)。如圖18A所示，培養(yǎng)神經(jīng)(2天，2％血清)的MMP-2免疫標(biāo)記在施旺細(xì)胞和周圍的基膜(插圖)內(nèi)強(qiáng)烈。在圖18B中，S-100免疫標(biāo)記顯示了擴(kuò)增的施旺細(xì)胞群在神經(jīng)內(nèi)的重定位。如圖18C所示，MMP-9免疫標(biāo)記在神經(jīng)束內(nèi)事實(shí)上是不存在的，除了罕見的細(xì)胞分布之外。周圍的神經(jīng)外膜中的一些細(xì)胞被MMP-9免疫標(biāo)記。在圖18D中，OX42標(biāo)記顯示了散布于整個(gè)神經(jīng)外膜而少見于培養(yǎng)神經(jīng)的神經(jīng)束內(nèi)的巨噬細(xì)胞。
圖19A-19D顯示了培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊中的沃勒氏變性。培養(yǎng)2天的神經(jīng)段中觀察到的變性改變是體內(nèi)觀察到的早期沃勒氏變性的記憶。在圖19A中，神經(jīng)絲免疫標(biāo)記顯示，與如圖19B(圖19A和19B插圖，縱向切片)中所示的培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊(2天，2％血清)中環(huán)狀和片段化的軸突不同，正常神經(jīng)中形成緊湊且連續(xù)的軸突。如圖19C所示，層粘連蛋白免疫標(biāo)記顯示基膜結(jié)構(gòu)完整，并且層粘連蛋白表達(dá)在施旺細(xì)胞中被上調(diào)(插圖)。如圖19D所示，軸突變性和由施旺細(xì)胞引起的髓鞘質(zhì)突出在用甲苯胺藍(lán)著色的半薄切片中尤為明顯。如圖19D插圖中所示，在培養(yǎng)2天的神經(jīng)段中未觀察到導(dǎo)致進(jìn)一步髓鞘質(zhì)變性(崩解和濃縮)和吞噬作用清除的變性過(guò)程。
圖20A和20B顯示了體外預(yù)變性的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物中的軸突再生。正常和培養(yǎng)(2天，2％血清)的神經(jīng)移植物被冷凍殺死，修剪至10mm的長(zhǎng)度，并用作為居間移植物來(lái)修復(fù)橫斷的坐骨神經(jīng)。宿主大鼠接受雙側(cè)移植物，一側(cè)為正常的(未培養(yǎng)的)，而一側(cè)為預(yù)變性的(培養(yǎng)的)。8天后通過(guò)評(píng)定橫切片中的GAP-43-免疫陽(yáng)性分布圖來(lái)評(píng)估軸突再生。在圖20A中，顯示了有代表性的來(lái)自兩個(gè)動(dòng)物的對(duì)照和預(yù)變性移植物的切片。切片顯示進(jìn)入移植物1.5mm處的軸突再生。免疫熒光圖像的象素值被反轉(zhuǎn)。如圖20B所示，按測(cè)定的進(jìn)入移植物的距離進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)代表各種條件下6個(gè)神經(jīng)的平均值(±SEM)。
發(fā)明的詳細(xì)公開本發(fā)明提供了促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)的組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法可被用來(lái)恢復(fù)因疾病、創(chuàng)傷事件或外科手術(shù)操作中斷的神經(jīng)的連續(xù)性。本發(fā)明的組合物和方法通過(guò)增加成功穿入損傷的神經(jīng)組織或植入的神經(jīng)移植物的軸突的數(shù)目促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)，導(dǎo)致更好的功能恢復(fù)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包括硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)-降解酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包括從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、或其組合構(gòu)成的組中選擇的CSPG-降解酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包括從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、MMP-2、及MMP-9、或其組合構(gòu)成的組中選擇的CSPG-降解酶。
CSPG-降解酶可以是人類、動(dòng)物或細(xì)菌來(lái)源的，天然存在或者重組的。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“CSPG-降解酶”還旨在包括這類酶的生物學(xué)活性片段和變體，例如保留了實(shí)質(zhì)量的CSPG-降解活性的那些片段和變體。本發(fā)明的組合物可以包括適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用一種或多種CSPG-降解酶處理的神經(jīng)組織。
除了一種或多種CSPG-降解酶以外，本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括生物或藥學(xué)活性分子，例如生長(zhǎng)因子。這類生長(zhǎng)因子包括，但不限于，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-1和2)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4和-5(NT-3、-4和-5)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I、II)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(GGF-2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)因子/膽堿能分化因子(LIF/CDF)。這類分子可以自天然來(lái)源或通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得。還可以利用保留其生物或藥學(xué)活性的這類分子的片段或變體。
本發(fā)明還涉及促進(jìn)人類或動(dòng)物損傷的神經(jīng)組織修復(fù)的方法。本發(fā)明的方法包括向神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)組織施用一種或多種CSPG-降解酶。本發(fā)明的方法改善再生軸突越過(guò)神經(jīng)-神經(jīng)或神經(jīng)-移植物界面的能力，并使基膜腳手架內(nèi)部的軸突生長(zhǎng)得以增強(qiáng)。抑制性CSPG的降解建立了一個(gè)更加許可的神經(jīng)基質(zhì)(nerve substratum)，并且允許軸突芽更好地進(jìn)入神經(jīng)的施旺細(xì)胞基膜，從而增加成功地穿入損傷的神經(jīng)組織或植入的神經(jīng)移植物的軸突的數(shù)目。
向損傷的神經(jīng)施用CSPG-降解酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，CSPG-降解酶被施用于損傷的神經(jīng)、神經(jīng)損傷部位或者神經(jīng)損傷修復(fù)部位。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，CSPG-降解酶被施用于主要的神經(jīng)修復(fù)部位，包括斷離或修剪的神經(jīng)的接合(即端到端的神經(jīng)接合)部位。神經(jīng)損傷可以是神經(jīng)橫斷(神經(jīng)斷傷)，其中神經(jīng)部分或者完全地?cái)嚯x，或者是小范圍損傷并通過(guò)外科手術(shù)切除，而且神經(jīng)外膜接合術(shù)(神經(jīng)縫合術(shù))是修復(fù)此損傷神經(jīng)的主要方法。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的組合物和方法可被用來(lái)促進(jìn)涉及損傷神經(jīng)的至少一種神經(jīng)鞘的連續(xù)性中斷的神經(jīng)損傷的修復(fù)，所述神經(jīng)鞘例如基膜、神經(jīng)束膜或神經(jīng)外膜。優(yōu)選地，外科手術(shù)修復(fù)旨在重新對(duì)接神經(jīng)元件。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，神經(jīng)損傷為擠壓傷(軸索斷傷)或更極端的損傷，其中發(fā)生軸索切斷，但是神經(jīng)鞘的連續(xù)性保持完整或者稍微受到損害。在軸索斷傷的情況下，軸突典型地?zé)o需外科手術(shù)的干預(yù)就得以再生。
在某些情況下，神經(jīng)段是病態(tài)的、被無(wú)可挽回地?fù)p傷或者閉塞的，并通過(guò)外科手術(shù)切除。修復(fù)可以包括植入移植物或修補(bǔ)物以橋接斷口。植入物可以天然的(例如，神經(jīng)或血管移植物)、天然衍生物(例如，生物聚合物管)或合成導(dǎo)管(聚硅氧烷管)。這些物質(zhì)被連接到切斷的神經(jīng)端。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，CSPG-降解酶被施用于連接部位，在任一端或者兩端。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶可以被施用于居間移植物上一處或兩處的宿主-移植物界面。CSPG-降解酶可以在外科手術(shù)修復(fù)損傷的神經(jīng)組織或者將移植物植入受體內(nèi)之前、期間或之后施用。
向神經(jīng)移植物施用CSPG-降解酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，CSPG-降解酶被施用于神經(jīng)移植物。當(dāng)CSPG-降解酶被施用于神經(jīng)移植物時(shí)，可以處理整個(gè)移植物。CSPG-降解酶可以施用于整個(gè)神經(jīng)移植物作整體處理。這種施用為移植前的預(yù)處理或者溫育，并且可以包括或可以不包括除去所施用的酶的操作。整體處理可以應(yīng)用于活(新鮮)的或者先前冷凍的神經(jīng)移植物。整體處理不排除在與宿主神經(jīng)接合的部位額外施用CSPG-降解酶，而是可以與之聯(lián)合使用。
根據(jù)本發(fā)明的方法，CSPG-降解酶可以被施用于神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)組織，或者兩者兼而有之。CSPG-降解酶可以在植入前、期間或之后施用于神經(jīng)移植物。CSPG-降解酶可以被施用于移植物的任何部分，例如待與損傷神經(jīng)的殘段相接的一端或兩端。如果CSPG-降解酶被施用于損傷的神經(jīng)，該酶可以被施用于能促進(jìn)損傷的神經(jīng)修復(fù)的損傷神經(jīng)的任何區(qū)域，例如損傷部位或者鄰近損傷的部位。CSPG-降解酶可以被置于將應(yīng)用于神經(jīng)移植物的培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基可以是不確定成分的培養(yǎng)基、確定成分培養(yǎng)基、或者補(bǔ)充有例如血清的確定成分培養(yǎng)基。本發(fā)明還包括在植入前貯藏神經(jīng)移植物的貯液。這種貯液含有如上所述的培養(yǎng)基，和至少一種CSPG-降解酶。這種貯液可以還包括組織膠粘劑，例如血纖蛋白膠。這種貯液可以還包括其它生物學(xué)活性劑，例如上文所列的生長(zhǎng)因子。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“移植物”是指被用來(lái)植入人或動(dòng)物體內(nèi)的任何組織。各種類型的移植物都被涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，例如自體移植物、同基因移植物、同種異體移植物和異種移植物。移植物的大小(例如，長(zhǎng)度和直徑)對(duì)本發(fā)明不是關(guān)鍵的。舉例來(lái)說(shuō)，神經(jīng)移植物的長(zhǎng)度可以從大約1厘米到大約10厘米，或者超過(guò)大約10厘米。神經(jīng)移植物的直徑可以按照需要與任何損傷的神經(jīng)或神經(jīng)的一部分的直徑相匹配。神經(jīng)移植物可以是結(jié)構(gòu)上完整的神經(jīng)段，以沿受體神經(jīng)的長(zhǎng)橋接缺口，或者取代遠(yuǎn)側(cè)端，即用于端到端移植。作為選擇的，神經(jīng)移植物可以是部分神經(jīng)段，或者具有奇怪的形狀(例如神經(jīng)片(nerve flap))，并用來(lái)重建具有少許結(jié)構(gòu)破壞但保持其物理連續(xù)性的撕裂神經(jīng)。
任選地，CSPG-降解酶可以聯(lián)合組織膠粘劑，例如生物膠而施用于損傷的神經(jīng)或者神經(jīng)移植物。優(yōu)選地，生物膠是含有血纖蛋白的膠粘劑，例如血纖蛋白膠、血纖蛋白粘合劑或者血小板凝膠(platelet gel)。生物膠在外科手術(shù)領(lǐng)域是公知的(Suri A等Neurol.India 5023-26；Alibai E等Irn J.Med.Sci.24(3 & 4)92-97；Sames M等Physiol.Res.46(4)303-306；Jackson M等 Blood Coag.Fibrinolysis 7737-746；Fasol R等J Thorac.Cardiovasc.Surg.1071432-1439)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“血纖蛋白膠”、“血纖蛋白粘合劑”和“血纖蛋白組織膠粘劑”可互換使用，是指含有纖維蛋白原和凝血酶的一組制劑，其在施用部位導(dǎo)致形成血纖蛋白凝塊。組織膠粘劑可以與CSPG-降解酶同時(shí)或者順序地施用。組織膠粘劑可以與CSPG-降解酶存在于相同的制劑中，或者以單獨(dú)的制劑施用于損傷的神經(jīng)和/或神經(jīng)移植物。優(yōu)選地，膠粘劑不含有可以吸引殘余的神經(jīng)結(jié)構(gòu)上的軸突生長(zhǎng)的物質(zhì)例如層粘連蛋白，或者含有將與所用酶競(jìng)爭(zhēng)或者抑制酶活的物質(zhì)或抑制劑。
本發(fā)明中所用的CSPG-降解酶可通過(guò)各種方法并以多種制劑形式施用于神經(jīng)移植物或者損傷的神經(jīng)組織。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“施用”、“給藥”、“接觸”和“處理”可互換使用。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶可以局部施用于于神經(jīng)移植物或者損傷的神經(jīng)組織(例如，逐滴地)，或者通過(guò)注射給藥。局部施用或通過(guò)注射局部給藥因控制性更強(qiáng)而是優(yōu)選的。此外，CSPG-降解酶或者含有這種酶的組合物優(yōu)選以液體的可流動(dòng)制劑形式施用。CSPG-降解酶也可以被吸附到多孔材料上，或者舉例來(lái)說(shuō)，配制成軟膏、油膏、凝膠、霜?jiǎng)┗蚺菽?br> 本發(fā)明還包括促進(jìn)損傷的神經(jīng)組織修復(fù)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括含有至少一種CSPG-降解酶的第一室，以及含有例如本文所述的那些組織膠粘劑的第二室。任選地，試劑盒可以包括用于混合CSPG-降解酶和組織膠粘劑的第三室。試劑盒可以被直接地或者間接地通過(guò)神經(jīng)移植物用來(lái)修復(fù)損傷的神經(jīng)組織。試劑盒可以包括使用本領(lǐng)域已知的各種材料，例如塑料、玻璃和/或紙制品的包裝。
藥物組合物。一種或多種CSPG-降解酶可以被摻入到適合向患者，例如人或動(dòng)物給藥的藥物組合物中。這種組合物典型地包括至少一種CSPG-降解酶和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括任何及所有的與藥物給藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣料、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。將這樣的介質(zhì)和藥劑應(yīng)用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。輔助活性化合物同樣可以被摻入到組合物中。優(yōu)選地，藥物組合物包括至少一種CSPG-降解酶和組織膠粘劑。例如血纖蛋白膠。
本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)制備藥學(xué)上有用的組合物的已知方法配制。制劑在本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知并且容易獲得的多種資料來(lái)源中有描述。舉例來(lái)說(shuō)，Remington′s Pharmaceutical Science(Martin EWEaston Pennsylavania，Mack Publishing Company，19thed.)描述了可用于本發(fā)明的制劑。適于腸胃外給藥的制劑包括，舉例來(lái)說(shuō)，無(wú)菌注射水溶液，它可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、和使得制劑與目的受體的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以在單次劑量或多次劑量容器中給出，舉例來(lái)說(shuō)，密封的安瓿、小藥瓶、和由玻璃或塑料制成的一次性注射器，并且可以以在臨用前僅需要無(wú)菌液體載體，舉例來(lái)說(shuō)，注射用水的冷凍干燥(凍干)狀態(tài)貯藏?，F(xiàn)用的注射溶液和懸浮液可以從無(wú)菌粉末、顆粒、藥片等制備。應(yīng)當(dāng)理解，除了上文特別提及的成分之外，本發(fā)明的制劑可以包括本領(lǐng)域中常規(guī)的、顧及到所討論制劑的類型的其它藥劑。藥物組合物可以與給藥說(shuō)明書一起包括在容器、包裝或者給藥器(dispenser)中。
CSPG-降解酶可以配制在適合給藥方式的載體中，例如鹽水或水性緩沖液。CSPG-降解酶還可以包含在控釋制劑中、或者與之聯(lián)系。這樣的材料包括，但不限于，生物可降解基質(zhì)和顆粒，例如脂質(zhì)體、脂球或小泡?？蒯屩苿┛梢允巧锟山到饩酆匣|(zhì)。CSPG-降解酶還可以作為凝膠或薄膜施用，或者包含在合成的移植物或植入物中。
CSPG-降解酶可以與保護(hù)酶免于迅速?gòu)捏w內(nèi)消除的載體一起配制，例如控釋制劑，包括植入物和微膠囊化遞送系統(tǒng)。優(yōu)選地，載體是生物可降解和/或生物可吸收的。生物可降解的生物相容性聚合物可被用于該控釋制劑中，例如ethylene vinyl acetate、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。
控釋制劑在本質(zhì)上可以是微粒(例如微米或納米級(jí))，例如球或膠囊。微?？梢跃哂邪环N或多種CSPG-降解酶的核心，其被外層或外殼包被。外殼可以被包被的CSPG-降解酶降解(以致殼從內(nèi)部開始降解)。舉例來(lái)說(shuō)，殼可以至少部分地由透明質(zhì)酸組成，這樣當(dāng)殼內(nèi)的透明質(zhì)酸被包被的CSPG-降解酶降解時(shí)(部分或者完全地)，CSPG-降解酶得以釋放。作為選擇地，殼可以通過(guò)另外一種或者來(lái)自外部施用的、或者存在于體內(nèi)環(huán)境中的降解劑降解(這樣殼從外部開始降解)。
美國(guó)專利No.5,320,837描述了通過(guò)使具有氨基的酶，例如透明質(zhì)酸酶或者軟骨素酶與馬來(lái)酸酐和可共聚化的聚烷撐二醇醚的共聚物反應(yīng)獲得的控釋制品。反應(yīng)產(chǎn)物可溶于水和/或有機(jī)溶劑，并且能夠通過(guò)水解緩慢地釋放酶。
美國(guó)專利No.4,933,185描述了用于遞送被包被在具有由可特異性地被酶降解的聚合物，例如離子交聯(lián)多糖形成的核心和速率控制外殼的微膠囊中由酶(例如透明質(zhì)酸酶)組成的生物學(xué)活性物質(zhì)的控釋體系。當(dāng)核心被降解時(shí)，外殼的完整性喪失，導(dǎo)致生物學(xué)活性物質(zhì)突然從膠囊內(nèi)釋放出來(lái)。該′185專利中的控釋體系可以被用來(lái)遞送一種或多種CSPG-降解酶。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶可以作為生物學(xué)活性物質(zhì)、或者核心降解酶、或者兩者以發(fā)揮作用。
控釋制劑可以造成CSPG-降解酶一次初始的暴露，并在一個(gè)特定的時(shí)間段后，接著造成一次或多次延遲的暴露。作為選擇地，控釋制劑可以導(dǎo)致CSPG-降解酶的單次緩釋。作為選擇地，持續(xù)釋放制劑可以允許CSPG-降解酶的持續(xù)釋放。任選地，CSPG-降解酶的持續(xù)釋放可以與一次或多次的脈沖釋放相結(jié)合。
CSPG-降解酶的載體，例如植入物，可以具有適合特定應(yīng)用的大小和形狀。因此，載體可以具有期望的體積和期望的形狀，依據(jù)預(yù)期考慮的載體待投入使用的活體區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)。形狀的例子包括，但不限于，圓柱形、半圓柱形或者環(huán)形。載體可以是與損傷的神經(jīng)或神經(jīng)移植物相接觸的墊、套、板、棍或線。優(yōu)選地，載體的形狀不具有可能激怒或者以其它方式刺激活體周圍組織的邊或角。
從載體中釋放的CSPG-降解酶的數(shù)量以及釋放持續(xù)時(shí)間可以被控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。載體可以被固定于或者牢固于移植物或者損傷的神經(jīng)上或者鄰近移植物或者損傷神經(jīng)的組織上。載體可以在例如，24小時(shí)到3個(gè)月的一段時(shí)期內(nèi)，持續(xù)地在神經(jīng)損傷部位釋放CSPG-降解酶。
有賴于所利用的特定載體，CSPG-降解酶可以在載體的制造期間或之后被包含在載體之內(nèi)、用載體包被、或者以其它方式與載體連接。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶可以與商業(yè)產(chǎn)品連接。
載體還可以行使遞送其它生物學(xué)活性劑，例如細(xì)胞(如施旺細(xì)胞)或生長(zhǎng)因子連同CSPG-降解酶的功能。通過(guò)載體遞送的細(xì)胞可以來(lái)源于患者、或者來(lái)自同種或不同種的其它來(lái)源。通過(guò)載體遞送的細(xì)胞可以被遺傳修飾以產(chǎn)生生物學(xué)活性劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是外科手術(shù)套(surgical cuff)，例如在美國(guó)專利No.4,602,624、美國(guó)專利No.5,487,756、以及公開的美國(guó)專利申請(qǐng)No.2002/0071828中描述的那些，其可以緊鄰神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)(例如在損傷部位)而被植入。本發(fā)明的套包括一種待施用于神經(jīng)移植物或者損傷的神經(jīng)組織的套管(sleeve)。套管可以是各種形狀。舉例來(lái)說(shuō)，套管可以是至少部分或完全地包繞損傷神經(jīng)和/或神經(jīng)移植物的管狀修補(bǔ)物或包裹物，并且可以包括任何與利用加套技術(shù)直接或間接地通過(guò)神經(jīng)移植物連接損傷神經(jīng)的兩端以便恢復(fù)神經(jīng)連續(xù)性的目的用途相適配的裝置。如果套是管狀的，套可以任選地包括帶有鄰接的第一和第二邊緣的縱向狹長(zhǎng)切口以便容易地施用于神經(jīng)移植物或者損傷的神經(jīng)。舉例來(lái)說(shuō)，縱向狹長(zhǎng)切口的第一和第二鄰接邊緣能夠彼此接觸，但該接觸是可分開的，從而允許該狹長(zhǎng)切口兩鄰接邊緣的分離并暴露出管狀套管的內(nèi)腔。損傷的神經(jīng)和/或神經(jīng)移植物可以被插入該內(nèi)腔中，允許縱向狹長(zhǎng)切口的鄰接邊緣回復(fù)至彼此可分離地接觸的狀態(tài)，從而將損傷的神經(jīng)和/或神經(jīng)移植物放置在一起并可暴露于CSPG-降解酶。
任選地，外科手術(shù)套可以利用常規(guī)的縫合技術(shù)或者組織膠粘劑，例如能夠施用于神經(jīng)系統(tǒng)的生物膠，或者其它手段而固定到神經(jīng)上。優(yōu)選地，生物膠是含有血纖蛋白的膠，例如BIOCOLLE(BIOTRANSFUSION)，CRTS(Lille)，ISSUCOL(IMMUNOAG，Vienna Austria)等等。套可以是剛性支持物，舉例來(lái)說(shuō)，一種自卷曲板。當(dāng)與相應(yīng)的組織接觸時(shí)，自卷曲板可以自動(dòng)包繞損傷的神經(jīng)和/或神經(jīng)移植物。套可以是滲透性的、非滲透性的、或者半滲透性的。任選地，套可以包括電刺激神經(jīng)移植物或損傷神經(jīng)的裝置和/或記錄神經(jīng)移植物或損傷神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)電活動(dòng)的裝置，例如在美國(guó)專利No.5,487,756中所述的。優(yōu)選地，CSPG-降解酶自套的內(nèi)表面，即朝向神經(jīng)移植物或損傷神經(jīng)的表面釋放或者以其它方式運(yùn)作。
外科手術(shù)套可以通過(guò)遞送系統(tǒng)，例如貯藏庫(kù)或表達(dá)系統(tǒng)，例如在公開的美國(guó)專利申請(qǐng)No.2002/0071828中描述的腺病毒構(gòu)建物，向神經(jīng)移植物或損傷神經(jīng)提供CSPG-降解酶。軟骨素裂解酶表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，其中一些被描述在美國(guó)專利No.6,054,569、美國(guó)專利No.6,093,563、公開的美國(guó)專利申請(qǐng)No.2001/0034043以及Tralec，A.L.Appl.Environ.Microbiol.6629-35之中。
外科手術(shù)套可以由許多合成材料組成，例如聚硅氧烷、PAN/PVC、PVFD、聚四氟乙烯(PTFE)纖維或者丙烯酸共聚物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，優(yōu)選使用由生物材料組成或與之為基礎(chǔ)的套，所述生物材料例如尤其可以是交聯(lián)膠原蛋白、骨粉、基于碳水化合物的聚合物、聚乙醇酸/聚乳酸衍生物、透明質(zhì)酸酯、或者基于白堊的支持物。優(yōu)選地，在本發(fā)明的構(gòu)架內(nèi)利用膠原蛋白或者聚硅氧烷。它可以是，舉例來(lái)說(shuō)，人、牛或鼠源的膠原蛋白。更優(yōu)選地，應(yīng)用由I或III或IV型、較佳地IV/IVox膠原蛋白雙層或聚硅氧烷雙層組成的套。作為具體的例子，這里可以提及，一種由聚硅氧烷組成的SILASTIC套(DOW-CORNING)。此外，套可以有利地為管狀，具有柱形或角形截面。套徑可以根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員予以調(diào)整。特別地，為了刺激周圍神經(jīng)的再生，可以使用相對(duì)小的，從0.05到15mm的直徑。更優(yōu)選地，套內(nèi)直徑在0.5和10mm之間。至于脊髓再生的應(yīng)用，可以選擇具有更大內(nèi)徑的套。特別地，對(duì)于這些應(yīng)用，所用的套具有可能最高達(dá)15到20mm的內(nèi)直徑，這取決于有關(guān)的神經(jīng)截面。為了橋接在臂叢水平撕脫的神經(jīng)根，套直徑優(yōu)選地與根的直徑相符。套的長(zhǎng)度通常由待彌補(bǔ)的喪失物的大小決定?？梢允褂瞄L(zhǎng)度在0.5和5cm之間的套。優(yōu)選地，套的長(zhǎng)度保持小于5cm，大于5cm的喪失物是不太常見的。
CSPG-降解酶可以以各種濃度施用于神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)，但優(yōu)選以濃縮的形式施用。理想濃度將隨著神經(jīng)大小和酶而改變。舉例來(lái)說(shuō)，軟骨素酶可以在從大約10單位/mL到大約1000單位/mL的濃度范圍內(nèi)施用。優(yōu)選地，軟骨素酶在從大約100單位/mL到大約500單位/mL的濃度范圍內(nèi)施用于神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)組織。MMPs可以在從大約0.1μg/ml到大約100μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用。優(yōu)選地，MMP是在從大約10μg/ml到大約50μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用的。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法，CSPG-降解酶可以聯(lián)合生物學(xué)活性分子，例如生長(zhǎng)因子向神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)組織給藥?？梢赃B同CSPG-降解酶一起給藥的其它生物學(xué)活性劑包括遺傳修飾或非遺傳修飾的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的組合物可以包括這樣的細(xì)胞。細(xì)胞可以是非干細(xì)胞(成熟和/或特化細(xì)胞，或者它們的前體或先祖細(xì)胞)或者干細(xì)胞。因此，給予的細(xì)胞可以彈性地從全能或多能干細(xì)胞(例如成人或胚胎干細(xì)胞)、前體或先祖細(xì)胞延伸至高度特化或成熟的細(xì)胞，例如中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的那些細(xì)胞(例如施旺細(xì)胞)。
干細(xì)胞可以從許多來(lái)源獲得，舉例來(lái)說(shuō)，包括胎兒組織、成年組織、髓細(xì)胞血液(cord cell blood)、外周血、骨髓、和腦。干細(xì)胞和非干細(xì)胞(例如，特化或成熟細(xì)胞，以及前體或先祖細(xì)胞)可以被分化和/或遺傳修飾。通常用來(lái)鑒定干細(xì)胞和表征分化細(xì)胞類型的方法和標(biāo)志描述在科學(xué)文獻(xiàn)中(例如，干細(xì)胞科學(xué)進(jìn)展和未來(lái)研究方向(Stem CellsScientificProgress and Future Research Directions)，附錄E1-E5，國(guó)立健康研究院報(bào)告，2001年6月)。據(jù)報(bào)道含有干細(xì)胞的成年組織列表正在增長(zhǎng)，并且包括骨髓、外周血、腦、脊髓、牙髓、血管、骨骼肌、皮膚和消化系統(tǒng)的上皮、角膜、視網(wǎng)膜、肝臟和胰臟。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以向神經(jīng)移植物或損傷的神經(jīng)組織給藥遺傳修飾的宿主，例如重組細(xì)胞。宿主可以被遺傳修飾以產(chǎn)生一種或多種CSPG-降解酶。優(yōu)選地，CSPG-降解酶是由重組細(xì)胞分泌的。舉例來(lái)說(shuō)，軟骨素裂解酶表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，其中一些被描述在美國(guó)專利No.6,054,569、美國(guó)專利No.6,093,563、公開的美國(guó)專利申請(qǐng)No.2001/0034043以及Tralec，A.L. Appl.Environ.Microbiol.6629-35之中。任選地，重組宿主被遺傳修飾，以重組產(chǎn)生CSPG-降解酶以及其它生物學(xué)活性劑。
編碼一種或多種CSPG-降解酶的核酸分子可以被插入到載體中，并用作為基因治療載體。基因治療載體可以通過(guò)，舉例來(lái)說(shuō)，靜脈內(nèi)注射、局部給藥、或者通過(guò)立體定位注射遞送給患者?；蛑委熭d體的藥物制品可以包括處于可接受稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包含埋植了或者以其它方式結(jié)合了基因遞送介質(zhì)的緩釋載體。此外，這種藥物制品可以包括治療有效量的重組產(chǎn)生CSPG-降解酶的細(xì)胞。
遺傳修飾宿主細(xì)胞所用的各種方法是本領(lǐng)域公知的，并且被描述在，舉例來(lái)說(shuō)，Sambrook等(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，和Gloves，D.M.(1985)DNA Cloning，Vol.IA Practical Approach，IRLPress，Oxford中。因此，從來(lái)源提取DNA、進(jìn)行限制性酶消化、DNA片段電泳、加尾并使質(zhì)粒和插入的DNA退火、連接DNA、轉(zhuǎn)化細(xì)胞例如原核和真核細(xì)胞、制備質(zhì)粒DNA、電泳蛋白以及分析DNA序列都落在遺傳工程領(lǐng)域人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。
為降低免疫原性，本發(fā)明所用的神經(jīng)移植物可以通過(guò)許多本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制成無(wú)細(xì)胞的。舉例來(lái)說(shuō)，神經(jīng)組織可以通過(guò)如材料和方法部分所述的冷凍殺死法，或者通過(guò)用去污劑化學(xué)提取(Sondell M等Brain Res 79544-54)制成無(wú)細(xì)胞的。神經(jīng)移植物可以在施用一種或多種CSPG-降解酶之前、期間或之后被無(wú)細(xì)胞化。
體外神經(jīng)培養(yǎng)。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)用于植入人或動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)組織的方法。本發(fā)明的培養(yǎng)方法涉及在體外“預(yù)變性”神經(jīng)組織，這在移植物植入之后可提高再生軸突越過(guò)移植物和宿主神經(jīng)組織間界面的能力。沒有被理論束縛，本發(fā)明的培養(yǎng)方法允許活神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)CSPG-降解酶并促進(jìn)施旺細(xì)胞增殖，正如在體內(nèi)神經(jīng)變性重塑過(guò)程期間天然發(fā)生的那樣。
體外培養(yǎng)方法包括在允許神經(jīng)組織體外生長(zhǎng)和提高神經(jīng)組織在隨后作為移植物植入時(shí)的神經(jīng)突促進(jìn)活性的條件下，培養(yǎng)神經(jīng)組織。神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高可以通過(guò)神經(jīng)組織的體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定，例如本文所述的低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)。
作為選擇地，還可以利用神經(jīng)組織的體內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)。分析神經(jīng)突向外生長(zhǎng)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且典型地包括定性或定量地測(cè)定神經(jīng)突在固相支持物，例如微量培養(yǎng)板或者顯微載片上的向外生長(zhǎng)程度?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)熒光。
本發(fā)明的方法可以包括自人或動(dòng)物分離神經(jīng)組織，并且在體外短期培養(yǎng)神經(jīng)組織，培養(yǎng)時(shí)間在從大約24小時(shí)到大約96小時(shí)的范圍內(nèi)變化。在體外較長(zhǎng)時(shí)間的溫育可導(dǎo)致生長(zhǎng)促進(jìn)特性的退化和喪失。優(yōu)選地，神經(jīng)組織被培養(yǎng)大約24小時(shí)到大約72小時(shí)。更優(yōu)選地，神經(jīng)組織被培養(yǎng)大約48小時(shí)。
神經(jīng)組織可以在大約10℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)。優(yōu)選地，神經(jīng)組織在大約30℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)。更優(yōu)選地，神經(jīng)組織在大約37℃下培養(yǎng)。
神經(jīng)組織可以在確定成分培養(yǎng)基或者補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。確定成分培養(yǎng)基可以是，舉例來(lái)說(shuō)，N2培養(yǎng)基或者Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。如果利用補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基，血清可以是人或動(dòng)物的，例如胎牛血清。優(yōu)選地，神經(jīng)組織在確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，神經(jīng)組織是一個(gè)在培養(yǎng)后并且在植入宿主前被無(wú)細(xì)胞化的神經(jīng)移植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，神經(jīng)移植物通過(guò)冷凍殺死無(wú)細(xì)胞化。盡管實(shí)施本發(fā)明的培養(yǎng)方法時(shí)無(wú)需外源酶，但該方法也可以包括使神經(jīng)組織同一種或多種CSPG-降解酶接觸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及提供用于植入人或動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)移植物的方法。優(yōu)選地，神經(jīng)移植物的橫斷面特征與植入部位的宿主神經(jīng)組織，例如宿主近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)殘段的橫斷面特征相似。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括產(chǎn)生潛在宿主(即移植物受體)的神經(jīng)殘段橫斷面的數(shù)字圖像數(shù)據(jù)，分析圖像數(shù)據(jù)以限定神經(jīng)元件的坐標(biāo)位置和它們的直徑，以便產(chǎn)生受體模板，并將受體模板數(shù)據(jù)與能夠被貯藏在存儲(chǔ)器中的供體模板數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。供體模板數(shù)據(jù)為來(lái)自貯藏的神經(jīng)移植物“庫(kù)”的數(shù)字圖像數(shù)據(jù)。然后可以選擇與受體神經(jīng)殘段在結(jié)構(gòu)元件上對(duì)接程度最高的貯藏神經(jīng)移植物植入受體內(nèi)。相關(guān)參數(shù)包括一種或多種結(jié)構(gòu)元件的直徑、厚度和/或空間排列(即邊界)，其中結(jié)構(gòu)元件包括，但不限于，神經(jīng)外膜、神經(jīng)束組、神經(jīng)束、髓鞘和軸突。所以，神經(jīng)移植物和宿主神經(jīng)之間的對(duì)接可以被最大化。優(yōu)選地，所選的神經(jīng)移植物具有相似的神經(jīng)束組和軸突橫斷面排列。
美國(guó)專利No.5,231,580描述了許多確定神經(jīng)特征的方法。數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的產(chǎn)生可以利用本領(lǐng)域公知的方法和設(shè)備實(shí)現(xiàn)，例如數(shù)碼像機(jī)。圖像數(shù)據(jù)的分析和受體模板數(shù)據(jù)與貯藏的供體模板數(shù)據(jù)的比較可以，舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)能夠進(jìn)行圖像掃描、分析和模式識(shí)別的運(yùn)算法則實(shí)現(xiàn)。為選擇神經(jīng)移植物和受體神經(jīng)之間最接近的匹配，可以建立相似性閾值。
本發(fā)明的方法和組合物可以施用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的神經(jīng)組織。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的神經(jīng)移植物可以作為PNS中的居間神經(jīng)移植物，或者腦和脊髓及其任何外延中的橋接物。
本發(fā)明的CSPG-降解酶可以從許多來(lái)源獲得，包括天然產(chǎn)生該酶的生物，或者通過(guò)遺傳修飾產(chǎn)生(或過(guò)量產(chǎn)生)該酶(產(chǎn)生重組酶)的生物。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶可以從細(xì)菌來(lái)源獲得，包括那些天然產(chǎn)生該酶，或者那些被遺傳修飾產(chǎn)生(或過(guò)量產(chǎn)生)該酶的細(xì)菌。CSPG-降解酶也可以從哺乳動(dòng)物來(lái)源獲得，包括天然產(chǎn)生該酶的那些哺乳動(dòng)物，或者被遺傳修飾產(chǎn)生(或過(guò)量產(chǎn)生)該酶的那些哺乳動(dòng)物。作為選擇地，CSPG-降解酶可以被化學(xué)合成。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“近側(cè)”部分旨在指保持與神經(jīng)元胞體的連續(xù)性的軸突部分，或者包含這些軸突的神經(jīng)部分?！斑h(yuǎn)側(cè)”部分旨在指自神經(jīng)元胞體斷離的軸突部分，或者包含這些斷離軸突的神經(jīng)部分。
在周圍神經(jīng)損傷的情況下，其近側(cè)部分是與神經(jīng)節(jié)或脊髓連接的部分。周圍神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)部分旨在指與運(yùn)動(dòng)終板(神經(jīng)肌肉接點(diǎn))或感覺器官連接的神經(jīng)最外周的部分。在脊髓損傷的情況下，近側(cè)部分是與核接觸的部分或者更前端的部分。遠(yuǎn)側(cè)部分旨在指延伸至末端突觸的部分。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”，是指降低或減緩與患者所遭受的特定神經(jīng)損傷相關(guān)的至少一種不良效應(yīng)或癥狀。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是指能夠復(fù)制或自我更新、并發(fā)育成許多細(xì)胞類型的特化細(xì)胞的未特化的細(xì)胞。干細(xì)胞經(jīng)歷分裂產(chǎn)生至少另一個(gè)與起源細(xì)胞具有相同能力的干細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，在合適的條件下，造血干細(xì)胞可以產(chǎn)生第二代干細(xì)胞和神經(jīng)元。干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(例如起源于胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的那些干細(xì)胞)和成年干細(xì)胞(可存在于更成熟的動(dòng)物，包括人的全身)。如本文所用的，干細(xì)胞旨在包括在處于晚于胚胎期的成熟期(例如，胎兒、嬰兒、青少年、少年、成年等)的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的那些干細(xì)胞。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“先祖細(xì)胞”(也稱為“前體細(xì)胞”)是未特化的或者具有特化細(xì)胞的部分特征的細(xì)胞，其能夠進(jìn)行細(xì)胞分裂并產(chǎn)生兩個(gè)特化細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，髓樣先祖/前體細(xì)胞能夠進(jìn)行細(xì)胞分裂產(chǎn)生兩個(gè)特化細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞)。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“共給藥”及其變體是指同時(shí)(在一個(gè)或多個(gè)制品中)或者連續(xù)地施用兩種或者多種藥劑。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“組合”包括亞組合。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、MMP-2和MMP-9的組合將包括，舉例來(lái)說(shuō)，軟骨素酶ABC和MMP-2的亞組合。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”或“生物學(xué)活性的”旨在指與特定藥劑、分子、化合物等相關(guān)聯(lián)的活性。舉例來(lái)說(shuō)，CSPG-降解酶軟骨素酶的生物學(xué)活性是CSPG的降解。優(yōu)選地，CSPG-降解酶活性包括軟骨素-4-硫酸、軟骨素-6-硫酸、或者軟骨素-4-硫酸和軟骨素-6-硫酸兩者的斷裂或裂解。因此，特定CSPG-降解酶的生物學(xué)活性片斷及變體同樣表現(xiàn)出CSPG-降解酶活性。同樣地，生長(zhǎng)因子，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1的生物學(xué)活性片斷將表現(xiàn)出正常地與該生長(zhǎng)因子相關(guān)的生物學(xué)活性。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”是指本發(fā)明的細(xì)胞的基因型通過(guò)本領(lǐng)域已知的導(dǎo)致基因型永久或短暫改變的任何手段(舉例來(lái)說(shuō)，包括通過(guò)細(xì)胞或病毒顆粒的多核苷酸序列的直接傳遞、感染性病毒顆粒的傳遞、以及通過(guò)任何已知可攜帶多核苷酸的物質(zhì)進(jìn)行的傳遞)有意地引入外源核酸而發(fā)生的穩(wěn)定或瞬時(shí)改變。核酸可以是合成的，或者天然來(lái)源的，并且可以包含基因、部分基因或者其它有用的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾”并不旨在包括天然發(fā)生的改變，例如通過(guò)天然病毒活動(dòng)、天然遺傳重組等等發(fā)生的改變。
多種載體可被用來(lái)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾。載體可以是疫苗、復(fù)制或擴(kuò)增載體。在本發(fā)明這方面的一些實(shí)施方式中，多核苷酸可操作地與能夠?qū)е略摱嗪塑账嵝蛄斜磉_(dá)的調(diào)控元件相連。這樣的載體包括，例如，染色體、附加體和病毒來(lái)源的載體，例如，來(lái)源于細(xì)菌質(zhì)粒、來(lái)自噬菌體、來(lái)自轉(zhuǎn)座子、來(lái)自酵母附加體、來(lái)自插入元件、來(lái)自酵母染色體元件、來(lái)自病毒例如桿狀病毒、乳多空病毒例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及來(lái)源于上述載體來(lái)源的組合的載體，例如那些來(lái)源于質(zhì)粒和噬菌體的遺傳元件的載體(例如粘粒和噬菌粒)。
如上所示，被利用來(lái)進(jìn)行遺傳修飾的載體還可以包含促使本發(fā)明的核苷酸序列編碼的多肽，例如CSPG-降解酶，或其生物學(xué)活性片斷或變體能在給定宿主細(xì)胞中表達(dá)和/或分泌的必要元件。載體可以包含一種或多種選自啟動(dòng)子、翻譯起始信號(hào)、翻譯終止信號(hào)以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的元件。在某些實(shí)施方式中，載體可以在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地維持，并且可以任選地，包含指導(dǎo)翻譯的蛋白分泌的信號(hào)序列。其它實(shí)施方式提供了在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中不穩(wěn)定的載體。載體可以整合進(jìn)宿主染色體中，或者是自主復(fù)制的載體。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，載體包含可操作地與編碼蛋白或肽的核酸序列連接的啟動(dòng)子，一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以及任選地，一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記(例如，抗生素抗性基因)。用于表達(dá)本發(fā)明的多肽的非限制性示例載體包括pBr-型載體、pET-型質(zhì)粒載體(PROMEGA)、pBAD質(zhì)粒載體(INVITROGEN)或下文實(shí)施例中所提供的那些。此外，根據(jù)本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以克隆或表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。
可用于控制表達(dá)的啟動(dòng)子包括，但不限于，CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist和Chambon Nature 290304-310)、勞氏肉瘤病毒3′長(zhǎng)末端重復(fù)中包含的啟動(dòng)子(Yamamoto等Cell 22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等Proc.Natl.Acad.Sci.USA781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等 Nature29639-42)；原核載體包含啟動(dòng)子例如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(VillKamaroff等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 753727-3731)、或者tac啟動(dòng)子(DeBoer等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8021-25)；參見ScientificAmerican中的″來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白″，1980，24274-94；植物表達(dá)載體包含胭脂堿合成酶啟動(dòng)子區(qū)(Herrera-Estrella等Nature 303209-213)或者花椰菜花葉病毒的35S RNA啟動(dòng)子(Gardner等Nucl.Acids Res.92871)、以及光合作用酶二磷酸核酮糖羧化酶的啟動(dòng)子(Herrera-Estrella等Nature 310115-120)；來(lái)自酵母或真菌的啟動(dòng)子元件例如Gal 4啟動(dòng)子、ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(甘油磷酸激酶)啟動(dòng)子，和/或堿性磷酸酶啟動(dòng)子。
本發(fā)明還提供了“同源”或“修飾”核苷酸序列的應(yīng)用。修飾的核酸序列應(yīng)理解為是指根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)通過(guò)誘變獲得的、并且與正常序列相比表現(xiàn)出改變的任何核苷酸序列。舉例來(lái)說(shuō)，在用于多肽表達(dá)的調(diào)控和/或啟動(dòng)子序列中導(dǎo)致本發(fā)明多肽表達(dá)水平改變的突變提供了一種“修飾核苷酸序列”。同樣地，對(duì)本發(fā)明的多核苷酸的替代、缺失或添加也提供了“同源”或“修飾”核苷酸序列。在各種實(shí)施方式中，“同源”或“修飾”核酸序列與天然(天然存在的)CSPG-降解酶具有基本上相同的生物學(xué)或血清學(xué)活性?！巴础被颉靶揎棥焙塑账嵝蛄羞€可以被理解為是指本發(fā)明的多核苷酸的剪接變體或者編碼如下文所限定的“修飾多肽”的任何核苷酸序列。
用于本發(fā)明目的的同源核苷酸序列涵蓋與核苷酸序列的堿基具有至少(或至少大約)20.00％到99.99％(包括在內(nèi))的百分比一致性的核苷酸序列。
上述范圍的百分比一致性應(yīng)當(dāng)被看作包括了在20.00％和99.99％之間以0.01％為間隔的任何分?jǐn)?shù)百分比，并為這些百分比提供了書面描述和支持。這些百分比純粹是統(tǒng)計(jì)學(xué)百分比，并且兩個(gè)核酸序列之間的差別可以隨機(jī)地在整個(gè)序列長(zhǎng)度內(nèi)分布。
在不同的實(shí)施方式中，與本發(fā)明中所用的核苷酸序列的堿基表現(xiàn)出百分比一致性的同源序列可以與編碼CSPG-降解酶的多核苷酸序列具有百分之20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99的一致性。
蛋白以及核酸序列的同源性都可以利用本領(lǐng)域已知的任何種類的序列比較算法和程序進(jìn)行評(píng)估。這樣的算法和程序包括，但絕不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA及CLUSTALW(Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-2448；Altschul等J.Mol.Biol.215(3)403-410；Thompson等Nucleic AcidsRes.22(2)4673-4680；Higgins等Methods Enzymol.266383-402；Altschul等J.Mol.Biol.215(3)403-410；Altschul等Nature Genetics 3266-272)。
根據(jù)本主題發(fā)明的方法給予患者的細(xì)胞或組織可以來(lái)源于人或其它哺乳動(dòng)物，舉例來(lái)說(shuō)，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物和豬。來(lái)源物種的具體例子包括，但不限于，人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如猿、黑猩猩、猩猩、猴子)；家畜(寵物)例如狗、貓、豚鼠、倉(cāng)鼠、越南垂腹豬、兔子和雪貂；馴化農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、水牛、野牛、馬、驢、豬、綿羊和山羊；典型地動(dòng)物園中可見的野生動(dòng)物，例如熊、獅子、虎、豹、象、河馬、犀牛、長(zhǎng)頸鹿、羚羊、樹獺、瞪羚、斑馬、角馬、草原土撥鼠、考拉熊、袋鼠、負(fù)鼠、浣熊、熊貓、大熊貓、鬣狗、海豹、海獅、海象、鼠海豚、海豚和鯨。
同樣地，可得益于本公開的治療方法的哺乳動(dòng)物種類包括，但不限于，人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如猿、黑猩猩、猩猩、猴子)；家畜(如寵物)例如狗、貓、豚鼠、倉(cāng)鼠、越南垂腹豬、兔子和雪貂；馴化農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、水牛、野牛、馬、驢、豬、綿羊和山羊；典型地動(dòng)物園中可見的野生動(dòng)物，例如熊、獅子、虎、豹、象、河馬、犀牛、長(zhǎng)頸鹿、羚羊、樹獺、瞪羚、斑馬、角馬、草原土撥鼠、考拉熊、袋鼠、負(fù)鼠、浣熊、熊貓、鬣狗、海豹、海獅、海象、水獺、鼠海豚、海豚和鯨。
本文提及或引用的所有的專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)專利申請(qǐng)、以及出版物在此全文并入作為參考，同樣并入作為參考的還有同時(shí)遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.________，(UF-336XC1)“神經(jīng)修復(fù)的材料和方法”；美國(guó)專利申請(qǐng)No._______，(UF-336XC2)“神經(jīng)移植的材料和方法”以及美國(guó)專利申請(qǐng)No._______，(UF-336XC3)“神經(jīng)移植的材料和方法”，包括所有的圖、表、附圖、核苷酸序列以及氨基酸序列，只要它們不與本說(shuō)明書所顯示的明確教導(dǎo)相矛盾即可。
材料和方法用于神經(jīng)橫斷和神經(jīng)擠壓實(shí)驗(yàn)的外科手術(shù)操作。所有的外科手術(shù)操作是根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行的。年青成年SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN Indianapolis，IN)用甲苯噻嗪(15mg/kg，肌肉內(nèi)注射)繼之以氯胺酮-HCl(110mg/kg，腹膜內(nèi)注射)深度麻醉。6只動(dòng)物接受雙側(cè)神經(jīng)擠壓損傷。暴露坐骨神經(jīng)，然后在internalobdurator腱遠(yuǎn)側(cè)4mm處用DUMONT#5號(hào)鉗以穩(wěn)定的壓力擠壓30秒。擠壓部位用神經(jīng)外膜縫合標(biāo)記。在不同的實(shí)驗(yàn)組中，8只大鼠利用鋸齒剪接受雙側(cè)坐骨神經(jīng)橫斷損傷。近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)殘段利用9-0 ETHILON縫線通過(guò)神經(jīng)外膜神經(jīng)縫合術(shù)包上。然后施用血纖蛋白膠(纖維蛋白原和凝血酶)以穩(wěn)固此聯(lián)合。在兩種損傷模型中，右側(cè)坐骨神經(jīng)用軟骨素酶ABC(1U2μl)(高度純化，無(wú)蛋白水解酶；SIGMA CHEMICAL CO.，St.Louis，MS)在損傷遠(yuǎn)側(cè)2-mm處注射。左側(cè)坐骨神經(jīng)(具有與右側(cè)相同的損傷)單獨(dú)用介質(zhì)(溶于PBS中的0.1％牛血清白蛋白)注射?？p合肌肉切口，并用金屬夾夾緊皮膚。在自麻醉狀態(tài)恢復(fù)以后，動(dòng)物被返回作標(biāo)準(zhǔn)舍養(yǎng)。外科手術(shù)后兩天(對(duì)于擠壓傷)和四天(對(duì)于橫斷傷)，在麻醉?xiàng)l件下取出神經(jīng)并如下文所述固定。8只接受神經(jīng)橫斷損傷和修復(fù)的動(dòng)物中有1只因?yàn)樵诨謴?fù)期間一側(cè)神經(jīng)喪失連續(xù)性而被排除。
用軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的制備。成年(180-200g)雌性SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN，Indianapolis，IN)被用作為神經(jīng)供體和受體宿主。供體大鼠用氟烷麻醉并斷頸處死。通過(guò)臀肌割裂切口暴露并分離不帶下面筋膜的坐骨神經(jīng)。切出腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)岔口處喙形端一段15-mm的神經(jīng)段。該節(jié)段用冷無(wú)菌林格液漂洗，通過(guò)將末端釘?shù)奖∷芰现С治锷鲜怪€(wěn)固，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)低溫小瓶中。將該小瓶在液氮中浸沒2分鐘，然后轉(zhuǎn)移到37℃水浴2分鐘。重復(fù)這個(gè)凍/融循環(huán)，產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物，隨之貯藏在液氮中。在移植前一天，令神經(jīng)移植物溫?zé)嶂潦覝?，并?7℃在含有2單位/ml軟骨素酶ABC(SIGMA，St.Louis，MO)的100μl磷酸緩沖鹽溶液pH7.4(PBS)中或僅在PBS(介質(zhì))中溫育16小時(shí)。移植物用林格液漂洗兩次，并放置在冰上備用。軟骨素酶ABC制品是高度純化的，并且制造商聲稱其基本上沒有蛋白水解酶活性。
用于軟骨素酶實(shí)驗(yàn)的居間神經(jīng)移植術(shù)。12只大鼠接受雙側(cè)無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物，一側(cè)為軟骨素酶處理的，而一側(cè)是介質(zhì)處理的移植物。宿主大鼠用甲苯噻嗪(15mg/kg，肌肉內(nèi)注射)和氯胺酮(110mg/kg，腹膜內(nèi)注射)深度麻醉。暴露坐骨神經(jīng)，并由置于神經(jīng)和下面組織之間的塑料插入物支撐。于坐骨神經(jīng)缺口和岔口之間半途的神經(jīng)區(qū)域首先包上血纖蛋白膠。利用鋸齒剪，剪下2.5-mm的宿主神經(jīng)段，并用新鮮修剪的10-mm無(wú)細(xì)胞移植物取代。移植物在每一端各用一根9-0 ETHILON縫線通過(guò)神經(jīng)外膜神經(jīng)縫合術(shù)與宿主神經(jīng)殘段接合。然后施用血纖蛋白膠以穩(wěn)定接合，其與最初的血纖蛋白涂層聯(lián)合減少了神經(jīng)元件的外突(神經(jīng)內(nèi)膜的迅速增殖)(Menovsky T等Neurosurgery 44224-226)。肌肉用4-0縫線，而皮膚用創(chuàng)傷夾嚴(yán)縫。在自麻醉狀態(tài)恢復(fù)以后，動(dòng)物被返回作標(biāo)準(zhǔn)舍養(yǎng)。
9只大鼠在移植后8天殺死，4只4天后殺死。動(dòng)物被深度麻醉并斷頸處死。取出移植物和3mm的近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)宿主神經(jīng)，浸在4％多聚甲醛的0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)中于4℃過(guò)夜。樣品用PBS平衡，并于4℃在30％的蔗糖/磷酸緩沖液中浸漬2天。利用解剖顯微鏡和作為界標(biāo)的神經(jīng)外膜縫線，將每個(gè)樣品再分為3個(gè)節(jié)段，代表a)近側(cè)神經(jīng)-移植物界面，b)主移植物和c)遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)-移植物界面。樣品被包埋并冷凍切片。取穿過(guò)神經(jīng)-移植物界面的縱向切片檢測(cè)接合的連續(xù)性。
主移植物在橫切面上按記錄的尺度連續(xù)切片以通過(guò)顯微鏡檢評(píng)估軸突生長(zhǎng)程度。再生軸突通過(guò)GAP-43免疫熒光(見下文)在0.56mm間距的移植物切片上標(biāo)記。利用SPOT數(shù)碼像機(jī)系統(tǒng)(DIAGNOSTICINSTRUMENTS，INC.，Sterling Heights，MI)和AXIOVERT 10顯微鏡(CARL ZEISS，Thornwood，NY)獲取表面熒光顯微照片。利用IMAGE-PRO PLUS軟件(MEDIA CYBERNETICS，Silver Springs，MD)評(píng)定GAP-43-陽(yáng)性軸突分布圖。
用于預(yù)變性實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)外植塊培養(yǎng)。成年(180-200gm)雌性SPRAGUE DAWLEY大鼠(HARLAN，Indianapolis，IN)被用作為神經(jīng)供體和移植物受體。這個(gè)項(xiàng)目受到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及應(yīng)用委員會(huì)的評(píng)審和批準(zhǔn)。供體大鼠用異氟烷深度麻醉并斷頸處死。通過(guò)臀肌割裂切口暴露并分離不帶下面筋膜的坐骨神經(jīng)。切出腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)岔口處喙形端一段15-mm的神經(jīng)段。該節(jié)段用冷無(wú)菌林格液漂洗，并通過(guò)將末端釘?shù)奖∷芰现С治锷鲜怪€(wěn)固。神經(jīng)外植塊在含有N2補(bǔ)充物的DULBECCO′S改良的EAGLES′培養(yǎng)基(DMEM/N2)中或者在補(bǔ)充有2％或10％胎牛血清(FBS)(ATLANTA BIOLOGICALS，Atlanta，GA)的DMEM/N2中培養(yǎng)1、2、4和7天。正如說(shuō)明的，一些外植塊在存在MMP抑制劑GM6001(50uM)的條件下培養(yǎng)(Grobelny等Biochem.，317152-7154)。培養(yǎng)的神經(jīng)在DMEM中徹底洗滌，然后轉(zhuǎn)移到密封管中。管在液氮中浸沒2分鐘，然后在37℃水浴中融化5分鐘。重復(fù)兩次這個(gè)凍-融循環(huán)，產(chǎn)生冷凍殺死的(無(wú)細(xì)胞)神經(jīng)段。新鮮切除的神經(jīng)(未培養(yǎng)的對(duì)照)利用相同的操作冷凍殺死。然后這些無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段a)被包埋以冷凍切片用于低溫培養(yǎng)試驗(yàn)或者b)貯藏在液氮中(長(zhǎng)達(dá)2周)用于生化分析和作為居間神經(jīng)移植物。制備的用于組織學(xué)檢測(cè)的神經(jīng)外植塊用乙醛固定，而省去冷凍殺死操作。
體內(nèi)神經(jīng)變性是通過(guò)近骨盆處單次橫斷坐骨神經(jīng)實(shí)現(xiàn)的。近側(cè)殘段被移出并結(jié)扎以排除軸突生長(zhǎng)。脛肌和皮膚被嚴(yán)縫，并允許橫斷的神經(jīng)原位變性2或7天。
免疫細(xì)胞化學(xué)。軸突再生通過(guò)GAP-43免疫熒光和數(shù)字圖像分析評(píng)估。封固在載片上的組織切片用PBS洗滌，然后用PBS中的0.5％TritonX-100處理10分鐘。切片用封閉緩沖液(PBS中的10％血清+0.1％TritonX-100)處理，然后與一抗(在封閉液中稀釋)在4℃過(guò)夜溫育。結(jié)合的抗體用豬抗-兔免疫球蛋白(DAKO CORPORATION，Carpinteria，CA)或羊抗-小鼠免疫球蛋白(Sigma)FITC-偶聯(lián)的二抗于室溫暗處標(biāo)記1小時(shí)?？?小鼠二抗臨用前用大鼠血清預(yù)吸附。切片洗滌、用PBS中的4％多聚甲醛后固定、漂洗、并在熒光封固劑中蓋上蓋玻片。親和純化的兔抗-GAP-43肽抗體利用已知的方法制備(Ferguson TA等Mol Cell Neurosci，16157-167)并以2μg/ml應(yīng)用。多克隆抗體1918(CHEMICONINTERNATIONAL，Temecula，CA)(1∶1000)僅僅結(jié)合到通過(guò)軟骨素酶ABC消化暴露出的、仍然與CSPG核心蛋白連結(jié)區(qū)相連的不飽和雙糖單位上(Bertolotto A等J Neurol Sci 73233-244)。多克隆抗-EHS層粘連蛋白抗體(Sigma)(1∶1000)被用來(lái)標(biāo)記基膜。多克隆抗-S-100抗血清(Dako)(1∶500)被用來(lái)標(biāo)記施旺細(xì)胞。暗視場(chǎng)圖像被反轉(zhuǎn)并優(yōu)化以便在PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS INC.，San Jose，CA)中打印。
低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)。低溫培養(yǎng)是神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)，其中神經(jīng)元直接地培養(yǎng)在新鮮/冷凍神經(jīng)切片上，并如先前所描述的方法(Ferguson TA等Mol Cell Neurosci，16157-167)進(jìn)行。簡(jiǎn)要地，軟骨素酶和介質(zhì)處理的神經(jīng)段以20μm切片，封固在無(wú)菌氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)-包被的蓋玻片上，并于-20℃貯存?zhèn)溆?。在指出的時(shí)候，切片用軟骨素酶ABC(0.1單位/ml)或者介質(zhì)(50mM Tris-HCl，(pH8.0)，含50mM NaCl)在37℃處理2小時(shí)。純化的來(lái)自8天雞胚的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元直接在含有10ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子的確定成分的N2培養(yǎng)基(Bottenstein JE等Exp Cell Res 125183-190)中接種在神經(jīng)切片上。低溫培養(yǎng)試驗(yàn)在溫育24小時(shí)后通過(guò)100％甲醇固定而終止。DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)通過(guò)GAP-43免疫熒光標(biāo)記評(píng)估。表面熒光顯微照片的獲取按針對(duì)組織切片時(shí)所述的方法進(jìn)行。神經(jīng)突長(zhǎng)度直接利用IMAGE-PRO PLUS軟件(MEDIA CYBERNETICS，Silver Springs，MD)測(cè)量。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)條件下評(píng)定至少250個(gè)具有大于1個(gè)胞體(～15μm)的神經(jīng)突的神經(jīng)元。
用于神經(jīng)預(yù)變性實(shí)驗(yàn)的凝膠酶譜。將神經(jīng)段置于冰冷提取緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.6，含1％Triton X-100，200mM NaCl，和10mMCaCl2)中，并通過(guò)探頭超聲波勻漿(15秒)。樣品在4℃振蕩30分鐘，并離心收集可溶性成分(12,000g，20分鐘)?？扇苄猿煞种械目偟鞍缀坷肂RADFORD REAGENT(BIO-RAD LABORATORIES，Hercules，CA)測(cè)定。溶解在提取緩沖液中的牛血清白蛋白被用作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)。提取物無(wú)需加熱溶解在非還原性Laemmli樣品緩沖液中，并在含有1.5mg/ml豬明膠的10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上于4℃電泳。凝膠短暫地在水中漂洗，然后在2.5％Triton X-100中洗滌3次達(dá)45分鐘之久。用3次5分鐘水洗除去Triton，酶譜凝膠在溫育緩沖液(50mM Tris-HCI，pH8.0，5mM CaCl2，0.02％疊氮化鈉)中顯影21小時(shí)。固定凝膠并用0.05％考馬斯亮藍(lán)著色。具有明膠水解活性的蛋白帶在明膠凝膠的藍(lán)色背景下顯示為清澈的裂解區(qū)域。明膠水解條帶與潛在和活性形式的重組人MMP-2和MMP-9，以及預(yù)著色的分子量標(biāo)準(zhǔn)(BIO-RAD)進(jìn)行共遷移比較。獲取數(shù)字顯微照片并利用IMAGE-PRO PLUS軟件進(jìn)行明膠水解條帶的光密度測(cè)量。
用于神經(jīng)預(yù)變性實(shí)驗(yàn)的原位酶譜。將未固定的正常和培養(yǎng)神經(jīng)的冷凍切片(10μm)封固在載玻片上，并用含有20μg/ml分子內(nèi)淬滅的熒光素標(biāo)記的明膠底物(MOLECULAR PROBES INC.，Eugene，OR)(Oh等，1999)的反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.2mM疊氮化鈉，pH7.6)覆蓋。在對(duì)照條件下，反應(yīng)緩沖液中包括MMP抑制劑EDTA(30mM)。在37℃溫育24小時(shí)后，切片用PBS漂洗，并用磷酸緩沖液中的4％多聚甲醛固定。切片用水漂洗，并利用Citifluor封固。組織切片中通過(guò)明膠水解活性產(chǎn)生的熒光素明膠肽通過(guò)表面熒光顯微鏡觀察和照相。
用于預(yù)變性實(shí)驗(yàn)的居間神經(jīng)移植術(shù)。6只大鼠接受雙側(cè)無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物，一側(cè)為正常(未培養(yǎng)的)而一側(cè)為體外預(yù)變性的(在2％血清中培養(yǎng)2天)。宿主大鼠用甲苯噻嗪(15mg/kg，肌肉內(nèi)注射)和氯胺酮(110mg/kg，腹膜內(nèi)注射)深度麻醉。暴露坐骨神經(jīng)，并由置于神經(jīng)和下面組織之間的塑料插入物支撐。在坐骨神經(jīng)缺口和岔口之間中途的神經(jīng)區(qū)域首先包上血纖蛋白膠。利用鋸齒剪剪下2.5-mm的宿主神經(jīng)段。融化移植物并用解剖刀片新鮮修剪至10mm。移植物在每一端各用一根9-0 ETHILON縫線通過(guò)神經(jīng)外膜神經(jīng)縫合術(shù)與宿主神經(jīng)殘段接合。然后施用血纖蛋白膠以穩(wěn)定接合，其與最初施用于宿主神經(jīng)的血纖蛋白涂層組合減少了神經(jīng)元件的外突(神經(jīng)內(nèi)膜的迅速增殖)(Menovsky和Bartels，1999，Neurosurgery，44224-225，pp.225-226討論)。肌肉用4-0縫線，而皮膚用創(chuàng)傷夾嚴(yán)縫。在自麻醉狀態(tài)恢復(fù)以后，動(dòng)物被返回作標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。在移植后8天宿主大鼠被深度麻醉并斷頸處死。取出移植物和3mm的近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)宿主神經(jīng)，浸在4％多聚甲醛、0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)中于4℃過(guò)夜。樣品用PBS平衡，并于4℃在30％的蔗糖/磷酸緩沖液中浸漬2天。樣品被包埋并按記錄的尺度在橫切面上冷凍切片。移植物內(nèi)的再生軸突通過(guò)GAP-43免疫熒光(見下文)標(biāo)記。獲取表面熒光顯微照片，并利用IMAGE-PRO PLUS軟件評(píng)定GAP-43-陽(yáng)性軸突分布圖。
用于神經(jīng)預(yù)變性實(shí)驗(yàn)的免疫熒光標(biāo)記。固定的組織切片用PBS中的0.5％Triton X-100處理10分鐘。非特異性抗體結(jié)合通過(guò)用含有0.1％Triton X-100和10％正常血清的PBS(封閉緩沖液)預(yù)處理封閉。一抗在封閉緩沖液中稀釋并在4℃過(guò)夜施用。結(jié)合的一抗用與熒光素或羅丹明偶聯(lián)的豬抗-兔免疫球蛋白(DAKO CORPORATION，Carpinteria，CA)或羊抗小鼠免疫球蛋白(Sigma)于室溫暗處標(biāo)記1小時(shí)?？剐∈蠖古R用前用大鼠血清預(yù)吸附。神經(jīng)突長(zhǎng)度(低溫培養(yǎng))和軸突再生(移植術(shù))通過(guò)多克隆抗-GAP-43 IgG(2μg/ml)(Ferguson和Muir，2000，Mol Cell Neurosci，16157-167)(NB300-143；NOVUS BIOLOGICAL，Littleton，CO)免疫標(biāo)記評(píng)估。其它一抗包括多克隆抗-MMP-2 IgG(4μg/ml)(MMP2/475；Muir，1995)；多克隆抗-MMP-9 IgG(4ug/ml)(AB19047；CHEMICON，Temecula，CA)；多克隆抗-S-100抗血清(1∶500)(DAKO)；和多克隆OX42抗血清(1∶500)(SEROTEK，Raleigh，NC)；以及單克隆抗-神經(jīng)絲IgG(4ug/ml)(NAP4；Harris等，1993)。在一些情況下，表面熒光顯微照片被反轉(zhuǎn)并增強(qiáng)反差，以便在PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS，San Jose，CA)中打印。
以下是舉例說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)理解為限制性的。所有的百分比以重量計(jì)，而所有的溶劑混合比例除非另外指出否則按體積計(jì)。
實(shí)施例1-用軟骨素酶處理無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段對(duì)CSPG的降解這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)定是否軟骨素酶處理有效地降解整個(gè)完整的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段中的CSPG。大鼠坐骨神經(jīng)段(長(zhǎng)1.5cm)通過(guò)重復(fù)凍融循環(huán)被無(wú)細(xì)胞化，然后整體在軟骨素酶ABC溶液中浸浴16小時(shí)。軟骨素酶預(yù)處理的神經(jīng)中的CSPG降解通過(guò)新表位抗體Ab1918免疫標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)抗體與通過(guò)軟骨素酶ABC對(duì)硫酸軟骨素鏈裂解后在核心蛋白上產(chǎn)生的表位結(jié)合(Bertolotto等J Neurol Sci，73233-244)。Ab1918免疫染色在整個(gè)預(yù)處理的神經(jīng)段中均很強(qiáng)烈，如圖1A所示。此外，Ab1918免疫染色的強(qiáng)度并不因?yàn)橛密浌撬孛笇?duì)這些切片額外地進(jìn)行后處理而增加，如圖1B所示。Ab1918免疫活性在未暴露于軟骨素酶的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)中不存在(未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明整體軟骨素酶處理有效地滲透到所有的神經(jīng)區(qū)室，并且徹底地降解CSPG側(cè)鏈。
在正常神經(jīng)中，CSPG和層粘連蛋白主要地一起分布于神經(jīng)鞘和基膜中，包括施旺細(xì)胞基膜(Zuo等[1998a]J.Neurobiol.，3441-54)。它們的分布在重復(fù)凍融之后不變，而且在光學(xué)顯微鏡水平?jīng)]有整體軟骨素酶處理改變ECM結(jié)構(gòu)的跡象，如圖1A和1C所示。軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段的完整性是將其隨后用作為神經(jīng)再生移植物的一個(gè)重要的考慮因素。因而，還檢測(cè)了神經(jīng)移植后預(yù)處理神經(jīng)段的結(jié)構(gòu)完整性。體內(nèi)8天后Ab1918免疫反應(yīng)性的強(qiáng)度和分布(在未被宿主細(xì)胞浸潤(rùn)的移植物區(qū)域)不變，說(shuō)明最初的施旺細(xì)胞基膜結(jié)構(gòu)保持完整，如圖1D所示。綜上所述，這些結(jié)果證明無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的整體軟骨素酶處理有效地降解CSPG，而不會(huì)危害基膜腳手架或者擾亂其層粘連蛋白內(nèi)容物的定位。
實(shí)施例2-用軟骨素酶處理無(wú)細(xì)胞神經(jīng)段對(duì)抑制性CSPG的失活軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)中抑制性CSPG的失活通過(guò)低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)測(cè)定。將雞胚DRG神經(jīng)元種植在制備的神經(jīng)段切片上，并通過(guò)評(píng)定神經(jīng)突生長(zhǎng)來(lái)評(píng)估神經(jīng)突促進(jìn)活性。結(jié)果示于圖2。在僅用介質(zhì)整體預(yù)處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)切片上，平均神經(jīng)突長(zhǎng)度為49μm。在用軟骨素酶整體預(yù)處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)上，神經(jīng)突生長(zhǎng)平均為96μm，與對(duì)照相比為95％的增長(zhǎng)。為了測(cè)定整體軟骨素酶處理是否徹底，在切片后用軟骨素酶處理神經(jīng)組織(后處理)，并在之上進(jìn)行低溫培養(yǎng)試驗(yàn)。正如所預(yù)期的，僅用介質(zhì)整體處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)的神經(jīng)突促進(jìn)活性通過(guò)用軟骨素酶后處理顯著增加(86％)。相反，軟骨素酶后處理對(duì)來(lái)自整體軟骨素酶處理的神經(jīng)移植物的切片僅具有微小的附加效果。
這些結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)將無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物節(jié)段在小量軟骨素酶ABC中浸浴，抑制性CSPG被有效地降解和失活。此外，整體軟骨素酶處理有效地使神經(jīng)移植物脫抑制，而不破壞基膜腳手架上與層粘連蛋白相關(guān)的神經(jīng)突促進(jìn)潛能。后一點(diǎn)被諸如在正常和變性神經(jīng)的低溫培養(yǎng)試驗(yàn)(Ferguson和Muir，2000，Mol Cell Neurosci，16157-167)中所觀察到的現(xiàn)象——在軟骨素酶處理的無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物切片上發(fā)生的神經(jīng)突生長(zhǎng)嚴(yán)格地與施旺細(xì)胞基膜相關(guān)聯(lián)——所加強(qiáng)。
實(shí)施例3-神經(jīng)再生通過(guò)軟骨素酶對(duì)無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的處理而增強(qiáng)下列實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)細(xì)胞同基因神經(jīng)移植物測(cè)驗(yàn)軟骨素酶處理改善神經(jīng)再生的假說(shuō)。如實(shí)施例2所述，無(wú)細(xì)胞坐骨神經(jīng)段整體用介質(zhì)或軟骨素酶ABC處理。10-mm的居間神經(jīng)移植物通過(guò)用血纖蛋白膠加固的神經(jīng)外膜神經(jīng)縫合術(shù)與宿主神經(jīng)連接。9只宿主大鼠每一只都接受雙側(cè)移植物，一側(cè)為介質(zhì)處理的而一側(cè)為軟骨素酶處理的移植物。再生在8天后開始檢測(cè)。首先，在縱向切片上檢測(cè)近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)-移植物接合，以評(píng)估外科手術(shù)接合的對(duì)接情況，如圖3所示。所有的移植物都具有連續(xù)性，因此被包括在隨后的分析中。再生的評(píng)定建立在對(duì)生長(zhǎng)的軸突強(qiáng)烈著色的GAP-43免疫標(biāo)記的基礎(chǔ)上。冷凍殺死的移植物內(nèi)軸突和施旺細(xì)胞殘骸是GAP-43免疫陰性的，而宿主施旺細(xì)胞僅僅十分微弱的著色(強(qiáng)度低于用于數(shù)字評(píng)定的閾值)。以規(guī)定的空間間隔在移植物內(nèi)通過(guò)評(píng)定橫切片中的GAP-43免疫陽(yáng)性分布來(lái)評(píng)估軸突生長(zhǎng)。在所有的移植物中均觀察到些許的軸突向內(nèi)生長(zhǎng)，如圖4所示。不過(guò)，進(jìn)入軟骨素酶處理的移植物中的生長(zhǎng)顯著比進(jìn)入對(duì)照移植物中的生長(zhǎng)更強(qiáng)并且分布更廣。定量結(jié)果示于圖5。
進(jìn)入軟骨素酶處理的移植物中的軸突平均數(shù)目(GAP-43免疫陽(yáng)性分布圖)比進(jìn)入對(duì)照移植物中的平均大3倍多。而進(jìn)入對(duì)照移植物的軸突總是受限，并且最常見為在中央成簇，進(jìn)入軟骨素酶處理的移植物中的最初軸突生長(zhǎng)分布更廣，并且在近側(cè)端尤為豐富。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明軸突穿入無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的成功性通過(guò)用軟骨素酶預(yù)處理移植物而顯著提高。不過(guò)，在兩種條件下一致觀察到在移植物遠(yuǎn)側(cè)有相似數(shù)目的軸突。這表明軸突穿入對(duì)照移植物發(fā)生在早期，隨后暫時(shí)地受限，而軸突在整個(gè)8天的時(shí)間內(nèi)持續(xù)穿入軟骨素酶處理的移植物。
為了測(cè)定是否軸突生長(zhǎng)進(jìn)入無(wú)細(xì)胞移植物的潛伏期可以通過(guò)軟骨素酶處理而縮短，對(duì)4天的移植物進(jìn)行相同的分析，但只檢測(cè)移植物的最近側(cè)面以及在橫切片上對(duì)其進(jìn)行評(píng)定。雖然只檢測(cè)了3只接受雙側(cè)移植物的動(dòng)物，結(jié)果與8天移植物中觀察到的相一致。此外，在移植物最近側(cè)面(離宿主-移植物界面0.3mm)，穿入軟骨素酶處理的移植物中的軸突平均多5倍，如圖6所示。從這些結(jié)果可以得出結(jié)論——軟骨素酶處理縮短潛伏期，并顯著改善進(jìn)入無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的軸突再生。
實(shí)施例4-在軟骨素酶處理的移植物的基膜管內(nèi)的軸突再生由于神經(jīng)再生是否成功取決于軸突在層粘連蛋白豐富的基膜管內(nèi)的生長(zhǎng)，故測(cè)定了軸突生長(zhǎng)與基膜的聯(lián)系是否由于無(wú)細(xì)胞移植物的軟骨素酶處理而改變。8天移植物的橫切片用GAP-43和層粘連蛋白雙標(biāo)記。層粘連蛋白標(biāo)記強(qiáng)烈，并且基膜看起來(lái)在對(duì)照和軟骨素酶處理的整個(gè)移植物中類似地保持完整。雖然重復(fù)的凍融、酶處理、外科手術(shù)操作并且在體內(nèi)8天，細(xì)胞外基質(zhì)腳手架看起來(lái)仍結(jié)構(gòu)完整。多個(gè)GAP-43標(biāo)記的軸突(或神經(jīng)突)明顯存在于各基膜內(nèi)，并且觀察到其中絕大部分與管內(nèi)腔表面緊密相連。在對(duì)照和處理過(guò)的移植物中觀察到相似并且是少量數(shù)目的附著不確定的神經(jīng)突。大體上，軸突在基膜內(nèi)生長(zhǎng)的傾向不因?yàn)闊o(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物的軟骨素酶處理而改變。
實(shí)施例5-軸突生長(zhǎng)和施旺細(xì)胞遷移進(jìn)入軟骨素酶處理的移植物8天移植物的連續(xù)切片進(jìn)行S-100和GAP-43免疫標(biāo)記，以檢測(cè)施旺細(xì)胞就軸突生長(zhǎng)而言的遷移。移植物含有兩種不同模式的S-100著色；強(qiáng)烈著色與活的宿主來(lái)源的施旺細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，而弱著色與冷凍殺死的施旺細(xì)胞殘骸相關(guān)。除非另行指出，以下描述指的是強(qiáng)烈著色的(活)施旺細(xì)胞的分布。在移植物近側(cè)區(qū)，施旺細(xì)胞和軸突的分布大體上—致，如圖7所示。發(fā)現(xiàn)零星的軸突簇，沒有任何明顯的施旺細(xì)胞關(guān)聯(lián)。在沒有生長(zhǎng)的軸突的區(qū)域也發(fā)現(xiàn)分散的施旺細(xì)胞。施旺細(xì)胞十分顯然進(jìn)入了8天的移植物?？墒?，在移植物的較遠(yuǎn)側(cè)點(diǎn)，常見沒有伴隨施旺細(xì)胞的軸突，如圖7所示。這在包括遠(yuǎn)側(cè)接合處的縱向切片中得到證實(shí)，如圖8所示。S-100標(biāo)記的施旺細(xì)胞在遠(yuǎn)側(cè)宿主殘段中很豐富，但假如有的話也很少侵入移植物的遠(yuǎn)側(cè)面(此處僅含有冷凍殺死的施旺細(xì)胞殘骸)，如圖8B所示。圖7、8A和8B中提供的例子來(lái)自于軟骨素酶處理的移植物，并在對(duì)照移植物中觀察到同樣的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)提示軟骨素酶處理的移植物中軸突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要地歸功于基膜神經(jīng)突促進(jìn)活性的增強(qiáng)。
僅在緊緊圍繞近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)接合處的組織的縱向切片中檢測(cè)了軸突生長(zhǎng)的路徑。一旦進(jìn)入移植物，軸突被引導(dǎo)向遠(yuǎn)側(cè)生長(zhǎng)，并且移植物內(nèi)沒有偏離生長(zhǎng)或神經(jīng)瘤形成的跡象。這提示引導(dǎo)機(jī)制(或者與遠(yuǎn)側(cè)殘段相關(guān)聯(lián)的趨化性能)在軟骨素酶處理的移植物中沒有受到損害。此外，基于軸突達(dá)到移植物遠(yuǎn)側(cè)區(qū)域的幾個(gè)例子，軸突走出移植物，并繼續(xù)生長(zhǎng)進(jìn)入宿主神經(jīng)殘段，如圖8A所示。
實(shí)施例6-通過(guò)軟骨素酶處理無(wú)細(xì)胞入神經(jīng)段產(chǎn)生的抑制性CSPG的降解和失活上文實(shí)施例中描述的利用大鼠神經(jīng)進(jìn)行的許多實(shí)驗(yàn)還利用人神經(jīng)進(jìn)行了重復(fù)。除了另外指出，利用人神經(jīng)的實(shí)施例6和7也按照實(shí)施例1和2中描述的用于大鼠神經(jīng)的操作進(jìn)行。人腓腸神經(jīng)和脛神經(jīng)從腿截肢外科手術(shù)新鮮獲得。截肢對(duì)于不牽連神經(jīng)的疾病(例如骨癌)是必要的，而且神經(jīng)根據(jù)組織學(xué)檢測(cè)判斷是正常的。
首先檢測(cè)人神經(jīng)，以確定它們的CSPG和層粘連蛋白含量與大鼠神經(jīng)中所觀察到的是否類似。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示支持神經(jīng)再生的基膜既含有CSPG又含有層粘連蛋白，兩者的共同定位方式和其它物種中的相同。圖9A和9B分別顯示了CSPG新表位和層粘連蛋白著色的人神經(jīng)。此外，利用低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)人神經(jīng)的生長(zhǎng)促進(jìn)特性通過(guò)軟骨素酶的處理而提高。定量結(jié)果示于圖10。
實(shí)施例7-軟骨素酶處理的人神經(jīng)移植物內(nèi)的軸突再生在下列實(shí)驗(yàn)中，測(cè)驗(yàn)了軟骨素酶處理在大鼠異種移植模型中可以改善神經(jīng)再生通過(guò)無(wú)細(xì)胞人神經(jīng)移植物的假說(shuō)。從人神經(jīng)中取出的亞單位(單個(gè)神經(jīng)束)整體用介質(zhì)或軟骨素酶ABC處理。10-mm的居間神經(jīng)移植物通過(guò)用血纖蛋白膠加固的神經(jīng)外膜神經(jīng)縫合術(shù)與大鼠宿主坐骨神經(jīng)連接。2只宿主大鼠每一只均接受雙側(cè)移植物，一側(cè)為介質(zhì)處理的而一側(cè)為軟骨素酶處理的移植物。再生在8天后開始檢測(cè)。在移植物內(nèi)以規(guī)定的空間間距評(píng)定橫切片中的GAP-43免疫陽(yáng)性分布，以評(píng)估軸突生長(zhǎng)。
進(jìn)入軟骨素酶處理的移植物中的生長(zhǎng)比進(jìn)入對(duì)照移植物中的生長(zhǎng)顯著地強(qiáng)，并且分布更廣。定量結(jié)果示于圖11。進(jìn)入軟骨素酶處理的移植物中的軸突平均數(shù)目(GAP-43免疫陽(yáng)性分布圖)比對(duì)照移植物中的平均大3倍多。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明軸突穿入無(wú)細(xì)胞人神經(jīng)移植物的成功性通過(guò)用CSPG-降解酶預(yù)處理移植物而顯著提高。這個(gè)異種移植模型還證明無(wú)細(xì)胞人神經(jīng)不被大鼠宿主排斥(在8天內(nèi))，證實(shí)了無(wú)細(xì)胞神經(jīng)的低免疫原性。
實(shí)施例8-軟骨素酶注射后神經(jīng)內(nèi)CSPG的隆解動(dòng)物接受或者雙側(cè)神經(jīng)擠壓傷或者雙側(cè)神經(jīng)橫斷以及直接的縫合修復(fù)。同時(shí)，一側(cè)神經(jīng)注射軟骨素酶ABC，而對(duì)側(cè)只接受介質(zhì)。首先檢測(cè)是否軟骨素酶處理有效地降解了損傷神經(jīng)中的CSPG。損傷部位和損傷部位周圍的神經(jīng)組織切片利用CSPG-新表位抗體免疫標(biāo)記?？贵w結(jié)合于通過(guò)軟骨素酶ABC裂解硫酸軟骨素鏈后在CSPG核心蛋白上產(chǎn)生的新的表位。在損傷和使用軟骨素酶后4天的橫斷神經(jīng)中，CSPG-新表位免疫染色在接合處和周圍數(shù)mm的遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的整個(gè)橫切面上是強(qiáng)烈的，如圖12A和12B所示。強(qiáng)烈免疫標(biāo)記還在進(jìn)入近側(cè)神經(jīng)內(nèi)數(shù)mm處觀察到。在擠壓傷神經(jīng)中取得類似結(jié)果，如圖12C所示。當(dāng)作為免疫染色方法的一部分，向組織切片應(yīng)用第二次軟骨素酶處理的時(shí)候，接近接合處和注射部位的組織的CSPG-新表位標(biāo)記至多在邊緣處更強(qiáng)烈，如圖12D所示。這些結(jié)果表明軟骨素酶ABC體內(nèi)處理如果不是完全的話，也基本上降解了注射部位，包括神經(jīng)損傷和修復(fù)部位周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的CSPG。
實(shí)施例9-在神經(jīng)擠壓傷(軸索斷傷)后，軟骨素酶處理不改變軸突再生檢測(cè)了軟骨素酶處理改善軸突再生通過(guò)神經(jīng)擠壓傷部位的假說(shuō)。雙側(cè)軸索斷傷通過(guò)重度擠壓坐骨神經(jīng)而仍保持神經(jīng)鞘的連續(xù)性來(lái)實(shí)現(xiàn)。在損傷的時(shí)候，一側(cè)神經(jīng)用軟骨素酶ABC注射，而對(duì)側(cè)神經(jīng)僅接受介質(zhì)注射。由于神經(jīng)擠壓后軸突的迅速重新生長(zhǎng)，在損傷后2天檢測(cè)穿過(guò)損傷部位的軸突生長(zhǎng)。再生軸突通過(guò)GAP-43免疫熒光標(biāo)記，并通過(guò)數(shù)字圖像分析評(píng)定。正如預(yù)期的那樣，對(duì)照神經(jīng)中，直接伸向損傷部位遠(yuǎn)側(cè)的軸突再生是茁壯的并廣泛分布于整個(gè)神經(jīng)橫切面上，如圖13A所示。同樣在軟骨素酶處理的神經(jīng)中觀察到相似的再生反應(yīng)和生長(zhǎng)模式。在兩種條件下，免疫標(biāo)記非常密集，并且在每個(gè)基膜管內(nèi)都觀察到數(shù)目眾多的神經(jīng)突。GAP-43免疫反應(yīng)性的定量評(píng)價(jià)表明神經(jīng)擠壓后的軸突再生受軟骨素酶施用的影響不明顯(圖13B)。同樣地，在軟骨素酶處理的神經(jīng)中也沒有軸突再生的潛伏期或速率改變的跡象。
實(shí)施例10-神經(jīng)橫斷(神經(jīng)斷傷)修復(fù)后軸突再生通過(guò)軟骨素酶處理而增強(qiáng)檢測(cè)了軟骨素酶處理改善通過(guò)神經(jīng)接合處的軸突生長(zhǎng)的假說(shuō)。雙側(cè)神經(jīng)斷傷通過(guò)剪刀剪斷坐骨神經(jīng)然后通過(guò)神經(jīng)外膜縫合和血纖蛋白膠修復(fù)以實(shí)現(xiàn)。一側(cè)神經(jīng)用軟骨素酶ABC注射，而對(duì)側(cè)神經(jīng)僅接受介質(zhì)注射。由于神經(jīng)橫斷后再生潛伏期的緣故，在損傷后4天檢測(cè)穿過(guò)接合處的軸突生長(zhǎng)。在對(duì)照神經(jīng)中，軸突進(jìn)入主要地以成片方式發(fā)生，并且局限于遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的離散亞區(qū)中；另外只發(fā)現(xiàn)很少的軸突散布于整個(gè)剩余的神經(jīng)橫切面上，如圖14A所示。向遠(yuǎn)側(cè)更遠(yuǎn)處延伸的軸突數(shù)目(4天后)迅速下降，并且在離接合處3mm的范圍內(nèi)趨近于0。相反，侵入軟骨素酶處理的神經(jīng)中的軸突更加茁壯，并且廣泛地遍布于整個(gè)神經(jīng)橫切面上。在7/7的動(dòng)物中，在軟骨素酶處理的神經(jīng)中進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的軸突數(shù)目比對(duì)照神經(jīng)中的多。平均起來(lái)，緊鄰接合處遠(yuǎn)側(cè)的軸突的數(shù)目在軟骨素酶處理的神經(jīng)中增大兩倍，而且3/7的動(dòng)物增加多于3.5倍，如圖14B所示。軟骨素酶處理的神經(jīng)中的軸突數(shù)目與對(duì)照神經(jīng)中的軸突數(shù)目的比例逐漸地從2∶1(剛好越過(guò)接合處)升至4∶1以上(在伸向遠(yuǎn)側(cè)殘段的更遠(yuǎn)點(diǎn)上)。因此，除了增加侵入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的軸突數(shù)目，軟骨素酶處理還縮短軸突侵入的潛伏期和/或提高遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)段內(nèi)的生長(zhǎng)速率。遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)所有部分中的軸突生長(zhǎng)很清楚地是嚴(yán)格線性的，并且與神經(jīng)的長(zhǎng)軸對(duì)齊。此外，再生軸突(GAP-43)和基膜(層粘連蛋白)的雙免疫標(biāo)記顯示了軸突在遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的基膜內(nèi)再生的強(qiáng)烈傾向不因軟骨素酶處理而改變。
這些發(fā)現(xiàn)證明擠壓傷后軸突再生在軟骨素酶處理的神經(jīng)和對(duì)照神經(jīng)中相似。相反，通過(guò)橫斷神經(jīng)接合處的軸突再生被加速，并且向遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)段侵入的軸突在注射軟骨素酶的神經(jīng)中增加了數(shù)倍。因此，在神經(jīng)連續(xù)性被破壞的橫斷傷中，軟骨素酶的施用顯著地提高了軸突進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)段基膜的能力并明顯地促進(jìn)了再生。
根據(jù)本發(fā)明，單次注射軟骨素酶可以顯著改善穿過(guò)接合的周圍神經(jīng)界面的軸突再生。抑制性CSPG的降解可以建立更為許可性的神經(jīng)基質(zhì)，并給予軸突芽更大的自由行動(dòng)空間以實(shí)現(xiàn)其定位并進(jìn)入遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)的施旺細(xì)胞基膜內(nèi)。在這個(gè)過(guò)程中軸突面臨的困難通過(guò)橫斷損傷后較之于擠壓傷后與再生相關(guān)的潛伏期的增加而得以證明。值得注意地，數(shù)據(jù)提示軟骨素酶處理的一個(gè)重要效果是縮短周圍神經(jīng)橫斷模型的再生潛伏期。此外，已知如果軸突不能夠橫穿接合處，則軸突芽就會(huì)變性(Fu，S.Y. 和T.Gordon1997，Mol Neurobiol 1467-116)。
實(shí)施例11-培養(yǎng)的神經(jīng)段的神經(jīng)突促進(jìn)活性新鮮切割的(有細(xì)胞)大鼠坐骨神經(jīng)段在含有0、2和10％胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不超過(guò)7天。對(duì)照(未培養(yǎng)的)和培養(yǎng)的神經(jīng)進(jìn)行冷凍切片，并且通過(guò)低溫培養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)估其神經(jīng)突促進(jìn)活性。結(jié)果示于圖15A。在對(duì)照神經(jīng)切片上生長(zhǎng)的雞胚DRG神經(jīng)元具有的平均神經(jīng)突長(zhǎng)度為118μm。在培養(yǎng)1-4天的神經(jīng)外植塊切片上的神經(jīng)突生長(zhǎng)明顯較好。對(duì)于在確定成分培養(yǎng)基(0％血清)中培養(yǎng)的神經(jīng)，神經(jīng)突促進(jìn)活性在體外第2天達(dá)到最大值，與對(duì)照神經(jīng)相比為43％的增加。在含有2％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1或2天的神經(jīng)外植塊的神經(jīng)突促進(jìn)活性增長(zhǎng)70％多。在10％血清中培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊在體外第2天也達(dá)到類似的最大值。神經(jīng)外植塊的神經(jīng)突促進(jìn)活性在更長(zhǎng)的培養(yǎng)期后下降，并且在第7天降至對(duì)照條件的水平之下。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)在體外短期培養(yǎng)的時(shí)候，無(wú)論向培養(yǎng)基中添加或不添加血清，神經(jīng)外植塊的神經(jīng)突促進(jìn)活性都顯著增加。神經(jīng)外植塊被阻止貼壁于培養(yǎng)容器上，并且沒有觀察到細(xì)胞向外生長(zhǎng)。不過(guò)，所有條件下的細(xì)胞存活性在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中都得到證實(shí)，在所述實(shí)驗(yàn)中在切碎并被壓在培養(yǎng)表面的神經(jīng)外植塊中觀察到茁壯的細(xì)胞遷移。
實(shí)施例12-體外和體內(nèi)預(yù)變性的比較利用低溫培養(yǎng)試驗(yàn)，比較體外預(yù)變性的和體內(nèi)預(yù)變性的大鼠坐骨神經(jīng)的神經(jīng)突促進(jìn)活性。如上文所述(見圖15A和15B)，在2％血清中培養(yǎng)2天的神經(jīng)外植塊上的DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)(體外預(yù)變性)比對(duì)照神經(jīng)(未預(yù)變性的)大70％。而且，培養(yǎng)期更長(zhǎng)的神經(jīng)外植塊(4和7天)導(dǎo)致漸少的神經(jīng)突促進(jìn)活性。培養(yǎng)7天的神經(jīng)比對(duì)照條件下少37％的活性。通過(guò)比較，在體內(nèi)預(yù)變性的神經(jīng)的神經(jīng)突促進(jìn)活性比在體外預(yù)變性的神經(jīng)要低得多。在體內(nèi)預(yù)變性2天的神經(jīng)上的神經(jīng)突生長(zhǎng)為35.8μm，比對(duì)照條件下少72％的活性(126.5μm)(t-test，p＜0.001)。不過(guò)，這種抑制隨著時(shí)間而逆轉(zhuǎn)，并且體內(nèi)預(yù)變性7天導(dǎo)致神經(jīng)突生長(zhǎng)比對(duì)照條件下增加12％(p＝0.06)。這些數(shù)據(jù)表明體外預(yù)變性提高神經(jīng)段的神經(jīng)突促進(jìn)活性的程度比體內(nèi)預(yù)變性所實(shí)現(xiàn)的程度要大。
實(shí)施例13-體外變性是MMP依賴性的神經(jīng)段在含2％血清并添加或不添加MMP抑制劑GM6001的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。培養(yǎng)神經(jīng)的神經(jīng)突促進(jìn)活性通過(guò)低溫培養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)估。結(jié)果示于圖15B。與圖15A中所顯示的相似，生長(zhǎng)在培養(yǎng)的神經(jīng)(2天，2％血清)上的DRG神經(jīng)元的平均神經(jīng)突長(zhǎng)度為210μm，比(未培養(yǎng))對(duì)照神經(jīng)增加68％。不過(guò)，對(duì)于在GM6001存在條件下培養(yǎng)的神經(jīng)，這種增加減至僅有14％。每種條件下神經(jīng)段的離散培養(yǎng)(壓片制備物)顯示了豐富的細(xì)胞向外生長(zhǎng)，表明沒有細(xì)胞存活性的喪失。此外，用GM6001處理分離的施旺細(xì)胞培養(yǎng)物證實(shí)這種基于hydromate的二肽毒性非常低。這些結(jié)果有力地暗示了MMP活性在變性過(guò)程中提高培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊的神經(jīng)突促進(jìn)活性。
實(shí)施例14-培養(yǎng)的神經(jīng)段中的MMP表達(dá)酶譜凝膠分析MMP-2和MMP-9是主要的能夠降解明膠(裂解的膠原蛋白)的胞外蛋白酶，并且它們的主要底物是基膜的IV型膠原蛋白。在大鼠內(nèi)，MMP-2在體內(nèi)由施旺細(xì)胞組成型地表達(dá)，并且在神經(jīng)損傷后上調(diào)。另一方面，MMP-9在正常神經(jīng)中檢測(cè)不到，并在損傷之后與入侵的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相聯(lián)系而存在。在本發(fā)明中，對(duì)體外神經(jīng)變性的檢測(cè)最大限度地排除了由造血細(xì)胞引起的MMP表達(dá)作用，從而為確定由定居的神經(jīng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的MMP表達(dá)作用提供了獨(dú)一無(wú)二的機(jī)會(huì)。培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊中的MMP水平首先通過(guò)明膠底物覆蓋凝膠電泳(酶譜)檢測(cè)。明膠酶譜對(duì)于檢測(cè)MMP-2和MMP-9非常靈敏，并且具有同時(shí)揭示潛在和活性兩種形式的附加優(yōu)勢(shì)。神經(jīng)段在2％血清存在的條件下培養(yǎng)1、2、4和7天。提取的神經(jīng)的有代表性的酶譜分析示于圖16。正常(未培養(yǎng)的對(duì)照)神經(jīng)在Mr＝72kD處顯示出占優(yōu)勢(shì)的明膠水解帶，其與人重組MMP-2的酶原形式共遷移。觀察到痕量活化的MMP-2(Mr＝66kD)，而MMP-9(Mr＝92和84kD)未檢測(cè)到。在培養(yǎng)的神經(jīng)中，活化的MMP-2迅速增長(zhǎng)，并且總MMP-2含量出現(xiàn)實(shí)質(zhì)增加。MMP-9在培養(yǎng)1或2天的神經(jīng)中檢測(cè)不到，而在4和7天的樣品中檢測(cè)到痕量活化的MMP-9。對(duì)于在確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊，獲得相似的結(jié)果，證實(shí)血清對(duì)神經(jīng)樣品中觀察到的明膠水解活性沒有貢獻(xiàn)。這些結(jié)果表明在體外神經(jīng)變性中MMP-2迅速活化，并被增量調(diào)節(jié)。值得注意的是，明膠酶譜檢測(cè)MMP-9比檢測(cè)MMP-2敏感若干倍(Ladwig等Wound Repair Regen 1026-37)，這預(yù)示著MMP-9含量在神經(jīng)樣品中可忽略不計(jì)。
實(shí)施例15-培養(yǎng)的神經(jīng)段中的MMP活性原位酶譜MMPs的活性通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄、酶原活化以及基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑的作用進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過(guò)原位酶譜檢測(cè)了神經(jīng)段中的凈明膠水解活性。組織切片用淬滅的熒光素-明膠(其可以被組織內(nèi)的明膠水解活性轉(zhuǎn)化為熒光肽)覆蓋。在正常神經(jīng)中檢測(cè)到組成型的明膠水解活性，大多與沿著神經(jīng)內(nèi)膜基膜排列的施旺細(xì)胞相關(guān)聯(lián)(如圖17A和17B所示)。在培養(yǎng)的神經(jīng)中，散布于神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)的明膠水解活性具有普遍的增加，并且施旺細(xì)胞被更強(qiáng)烈地標(biāo)記，如圖17C和17D所示。還檢測(cè)了在GM6001存在條件下培養(yǎng)的神經(jīng)的明膠水解活性。如上所述，GM6001阻斷在培養(yǎng)的神經(jīng)中觀察到的神經(jīng)突促進(jìn)活性的增加。GM6001處理的神經(jīng)外植塊中的明膠水解活性幾乎不可檢測(cè)，如圖17E和17F所示。匯總起來(lái)這些結(jié)果表明明膠水解活性通過(guò)神經(jīng)外植塊培養(yǎng)顯著提高，并且GM6001有效地阻斷體外變性期間新生的MMP活性。
實(shí)施例16-培養(yǎng)的神經(jīng)段中的MMP分布免疫熒光標(biāo)記通過(guò)免疫熒光顯微術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)了2天的神經(jīng)外植塊中的MMP-2和MMP-9分布。培養(yǎng)的神經(jīng)的MMP-2免疫標(biāo)記在施旺細(xì)胞內(nèi)和周圍基膜內(nèi)強(qiáng)烈，如圖18A所示。用S-100著色施旺細(xì)胞顯示最強(qiáng)烈的MMP-2免疫標(biāo)記與遷移的施旺細(xì)胞有關(guān)(圖18B；并見下文)。此外，MMP-2免疫表達(dá)與通過(guò)原位酶譜獲得的明膠水解活性模式非常相似。另一方面，MMP-9免疫標(biāo)記除了罕見的細(xì)胞分布之外，在神經(jīng)束內(nèi)實(shí)質(zhì)上不存在。在周圍的神經(jīng)外膜中見到些許的細(xì)胞MMP-9免疫表達(dá)，如圖18C所示。OX42標(biāo)記被用來(lái)鑒定巨噬細(xì)胞，其分散在培養(yǎng)神經(jīng)的整個(gè)神經(jīng)外膜內(nèi)，并且很少分布在神經(jīng)束內(nèi)，如圖18D所示。MMP-9和OX42標(biāo)記的區(qū)室性分布提示巨噬細(xì)胞是主要的MMP-9來(lái)源。此外，施旺細(xì)胞以及可能地一些神經(jīng)束膜成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-2，并且還在周圍的細(xì)胞外基質(zhì)中觀察到彌散的MMP-2免疫反應(yīng)性。
實(shí)施例17-培養(yǎng)的神經(jīng)段中的細(xì)胞分布和軸突再生神經(jīng)損傷后，施旺細(xì)胞被激活，與其髓鞘解離并廣泛地遷移。培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊的S-100免疫標(biāo)記表明許多施旺細(xì)胞喪失了其伸長(zhǎng)的形態(tài)和與軸突的緊密結(jié)合——典型的損傷反應(yīng)，如圖18B所示。正如所預(yù)期的那樣，當(dāng)與循環(huán)系統(tǒng)分離后，神經(jīng)外植塊中的巨噬細(xì)胞的數(shù)目比在體內(nèi)神經(jīng)變性中觀察到的低得多。此外，在神經(jīng)束內(nèi)極少發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞，并且?guī)缀跛蠴X42標(biāo)記的細(xì)胞都限于神經(jīng)外膜，如圖18D所示。顯然在神經(jīng)切斷時(shí)存在于神經(jīng)外膜區(qū)室中的巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)期間不侵入內(nèi)部神經(jīng)區(qū)室。從而，體外神經(jīng)外植塊成為這樣的神經(jīng)變性模型，其中施旺細(xì)胞的貢獻(xiàn)可以獨(dú)立于侵入的巨噬細(xì)胞而被評(píng)估。
通過(guò)神經(jīng)絲的免疫標(biāo)記檢測(cè)了培養(yǎng)的神經(jīng)外植塊中的軸突變性。結(jié)果示于圖19A-19D。與正常神經(jīng)中觀察到的連續(xù)神經(jīng)絲染色不—樣，如圖19A所示，培養(yǎng)2天的神經(jīng)段中的神經(jīng)絲被片斷化并且不規(guī)則，如圖19B所示。與體內(nèi)軸突變性相似，培養(yǎng)的神經(jīng)既含有環(huán)狀的又含有濃縮的神經(jīng)絲，表明細(xì)胞骨架的瓦解和軸突的變性。軸突變性在用甲苯胺藍(lán)著色的半薄切片中尤為明顯，它顯示了殘留髓鞘內(nèi)的空洞或者密集的小球，如圖19D所示。培養(yǎng)2天的神經(jīng)中觀察到的變性變化是體內(nèi)看到的初期沃勒氏變性的記憶(由Stoll和Muller綜述，1999，Brain Pathol 9313-325)。在培養(yǎng)的神經(jīng)中也觀察到二期沃勒氏變性的主要特征，包括髓鞘形態(tài)變化和由施旺細(xì)胞引起的髓鞘質(zhì)外突以及施旺細(xì)胞增生，如圖19D所示。不過(guò)，導(dǎo)致進(jìn)一步的髓鞘質(zhì)變性(瓦解和濃縮)以及吞噬作用清除的變性過(guò)程在2天的神經(jīng)外植塊培養(yǎng)物中沒有發(fā)生。雖然存在實(shí)質(zhì)上的變性改變，但基膜腳手架保持結(jié)構(gòu)完整，并且重塑通過(guò)施旺細(xì)胞高水平的層粘連蛋白表達(dá)得以證實(shí)，如圖19C所示。
實(shí)施例18-培養(yǎng)的神經(jīng)作為無(wú)細(xì)胞居間移植物本實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)細(xì)胞神經(jīng)同種異體移植物測(cè)驗(yàn)體外預(yù)變性改善神經(jīng)再生的假說(shuō)。宿主大鼠接受雙側(cè)無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物，一側(cè)為正常(未變性的)而一側(cè)為體外預(yù)變性的(在2％血清中培養(yǎng)2天)。8天后通過(guò)評(píng)定橫切面中的GAP-43免疫陽(yáng)性分布評(píng)估軸突再生。軸突生長(zhǎng)在所有移植物中均觀察到，并且是集中分布的，表明近側(cè)宿主神經(jīng)和移植物之間良好的對(duì)接和接合，如圖20A和20B所示。在6/6的動(dòng)物中，穿過(guò)近側(cè)神經(jīng)-移植物接合處并進(jìn)入移植物的軸突數(shù)目在體外預(yù)變性移植物中比在對(duì)側(cè)對(duì)照移植物中多。平均起來(lái)，體外預(yù)變性移植物內(nèi)的軸突的數(shù)值大兩倍，如圖20B所示。在兩種移植物條件下，軸突生長(zhǎng)發(fā)生在基膜管內(nèi)，并且伴隨著宿主來(lái)源的施旺細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)證明軸突再生進(jìn)入無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物通過(guò)體外預(yù)變性增強(qiáng)。
變性可以提高切除的周圍神經(jīng)和衍生的神經(jīng)移植物的生長(zhǎng)促進(jìn)特性。本實(shí)驗(yàn)利用神經(jīng)外植塊培養(yǎng)模型研究MMPs在這個(gè)變性過(guò)程中的作用。同時(shí)，由于體內(nèi)神經(jīng)預(yù)變性對(duì)于制備人同種異體移植物是不可行的，故檢測(cè)了體外預(yù)變性的神經(jīng)移植物的屬性。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持以下結(jié)論首先，早期沃勒氏變性發(fā)生在周圍神經(jīng)外植塊的短期培養(yǎng)中，雖然不存在造血巨噬細(xì)胞。通過(guò)體外變性可以顯著提高神經(jīng)段的神經(jīng)突促進(jìn)活性，并且比體內(nèi)預(yù)變性的神經(jīng)引起更大程度的提高。由體外變性導(dǎo)致的神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高歸功于施旺細(xì)胞增強(qiáng)的MMP-2表達(dá)和MMP-2的活化。最后，體外預(yù)變性增強(qiáng)軸突再生進(jìn)入無(wú)細(xì)胞居間神經(jīng)移植物。
這個(gè)周圍神經(jīng)體外變性的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMP-9以痕量存在，并主要地與少量的局限于神經(jīng)外膜鞘的細(xì)胞群有關(guān)。MMP-9免疫標(biāo)記基本上在培養(yǎng)神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)膜區(qū)室內(nèi)不存在。相反，MMP-2，特別是其活性形式，在培養(yǎng)神經(jīng)的神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)迅速升高。將免疫定位和原位酶譜數(shù)據(jù)綜合起來(lái)考慮，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出結(jié)論，即MMP-2由施旺細(xì)胞表達(dá)，并且在體外神經(jīng)變性期間活性酶被釋放到周圍的神經(jīng)內(nèi)膜中。
與目前的神經(jīng)外植塊觀察資料結(jié)合，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明MMP-2提供了如果不是主要的也是充分的用于增強(qiáng)切除的神經(jīng)(和預(yù)變性的神經(jīng)移植物)的生長(zhǎng)促進(jìn)特性的變性機(jī)制。
根據(jù)本發(fā)明，利用支持細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)神經(jīng)外植塊可以允許細(xì)胞介導(dǎo)的變性，并顯著增強(qiáng)神經(jīng)移植物的再生潛力。神經(jīng)外植塊可以被冷凍殺死并冷凍貯藏，以后用作為居間神經(jīng)移植物。冷凍殺死的神經(jīng)移植物事實(shí)上消除了移植物免疫排斥的顧慮。鑒于這個(gè)原因，無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物比有細(xì)胞神經(jīng)移植物在不實(shí)施免疫抑制的同種異體移植中具有更好的臨床應(yīng)用潛力。
應(yīng)當(dāng)理解本文所描述的實(shí)施例和實(shí)施方式僅僅是用于舉例說(shuō)明的目的，而且根據(jù)它們的各種修飾或改變將會(huì)是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠想到的，因而應(yīng)當(dāng)包括在本申請(qǐng)的精神和范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)損傷的神經(jīng)修復(fù)的方法，其中所述方法包括向損傷的神經(jīng)施用至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、及基質(zhì)金屬蛋白酶-9、或其組合組成的組中選擇的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、及軟骨素酶AC、或其組合組成的組中選擇的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括向損傷的神經(jīng)共施用組織膠粘劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中組織膠粘劑是生物膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中組織膠粘劑選自由血纖蛋白膠和血小板凝膠組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括向損傷的神經(jīng)施用生物學(xué)活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中生物學(xué)活性劑是生長(zhǎng)因子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中生長(zhǎng)因子選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、表皮生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-5、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)因子/膽堿能分化因子。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括向損傷的神經(jīng)施用細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中細(xì)胞是干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中細(xì)胞是施旺細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶在損傷部位或者臨近損傷部位處施用于損傷神經(jīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷包括損傷神經(jīng)的至少一種選自基膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜的神經(jīng)鞘的連續(xù)性的中斷。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是神經(jīng)斷傷。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是神經(jīng)斷傷，其中所述方法還包括接合損傷神經(jīng)，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被施用于接合部位。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中損傷神經(jīng)部分或完全地被斷離，具有一個(gè)近側(cè)端和一個(gè)遠(yuǎn)側(cè)端，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被施用于損傷神經(jīng)的近側(cè)端或者損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)端或者損傷神經(jīng)的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述方法還包括將組織膠粘劑施用于損傷神經(jīng)的近側(cè)端或者損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)端或者損傷神經(jīng)的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述方法還包括將損傷神經(jīng)的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端縫合在一起。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶在損傷神經(jīng)內(nèi)導(dǎo)致軟骨素-4-硫酸、軟骨素-6-硫酸、或者軟骨素-4-硫酸和軟骨素-6-硫酸裂解。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中損傷神經(jīng)部分或完全地被斷離，具有一個(gè)近側(cè)端和一個(gè)遠(yuǎn)側(cè)端，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶縮短軸突進(jìn)入神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端的潛伏期。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中損傷神經(jīng)部分或完全地被斷離，具有一個(gè)近側(cè)端和一個(gè)遠(yuǎn)側(cè)端，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶提高軸突進(jìn)入損傷神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端的速率。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶局部地施用于損傷神經(jīng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是神經(jīng)斷傷，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶局部地施用于神經(jīng)斷傷的任一側(cè)。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被注射到損傷神經(jīng)中。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是神經(jīng)斷傷，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被注射到神經(jīng)斷傷的任一側(cè)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶與藥學(xué)上可接受的載體一起施用。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是從由液體、凝膠、泡沫、固體、和聚合物組成的組中選擇的。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是從由膜、海綿、纖維結(jié)構(gòu)、粉末、毛狀物和顆粒組成的組中選擇的。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是控釋體系。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是外科手術(shù)套，并且其中外科手術(shù)套在施用時(shí)至少部分地包繞損傷神經(jīng)。
34.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶，并且其中軟骨素酶在從大約10單位/ml到大約1000單位/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶，并且其中軟骨素酶在從大約100單位/ml到大約500單位/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
36.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶，并且其中基質(zhì)金屬蛋白酶在從大約0.1μg/ml到大約100μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶，并且其中基質(zhì)金屬蛋白酶在從大約10μg/ml到大約50μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中損傷神經(jīng)是損傷的周圍神經(jīng)。
39.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是細(xì)菌酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是哺乳動(dòng)物酶。
41.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是重組酶。
42.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的施用包括向損傷神經(jīng)施用遺傳修飾的宿主，其中宿主已經(jīng)被編碼該硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的多核苷酸遺傳修飾。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中遺傳修飾的宿主是細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是因疾病所致。
45.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是因創(chuàng)傷所致。
46.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中神經(jīng)損傷是因外科手術(shù)操作所致。
47.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中損傷的神經(jīng)是哺乳動(dòng)物神經(jīng)。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中損傷的神經(jīng)為人類的神經(jīng)。
49.一種藥物組合物，其包含至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶和藥學(xué)上可接受的載體。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
51.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、及基質(zhì)金屬蛋白酶-9、或其組合組成的組中選擇的。
52.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、及軟骨素酶AC、或其組合組成的組中選擇的。
53.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
54.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在大約10單位/ml到大約1000單位/ml的濃度范圍內(nèi)的軟骨素酶。
55.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在大約100單位/ml到大約500單位/ml的濃度范圍內(nèi)的軟骨素酶。
56.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在大約0.1μg/ml到大約100μg/ml的濃度范圍內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶。
57.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在大約10μg/ml到大約50μg/ml的濃度范圍內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶。
58.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述藥物組合物還包含組織膠粘劑。
59.權(quán)利要求58的藥物組合物，其中組織膠粘劑選自由血纖蛋白膠和血小板凝膠組成的組。
60.權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體是從由固體、液體、凝膠、霜?jiǎng)?、油膏、和泡沫組成的組中選擇的。
61.權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體是控釋體系。
62.權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體是外科手術(shù)套。
63.一種促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)的外科手術(shù)套，其中所述套包含至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶以及待施用于神經(jīng)移植物或者損傷神經(jīng)的套管。
64.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述套管包括一個(gè)管，其中所述管限定一個(gè)用于插入神經(jīng)移植物或者損傷神經(jīng)的腔。
65.權(quán)利要求64的外科手術(shù)套，其中所述管具有一個(gè)沿著所述管的長(zhǎng)縱向延伸的狹長(zhǎng)切口。
66.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述外科手術(shù)套還包含將所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶遞送到損傷神經(jīng)的工具。
67.權(quán)利要求66的外科手術(shù)套，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶遞送工具包含聚合物。
68.權(quán)利要求67的外科手術(shù)套，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶遞送工具包含用于產(chǎn)生所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的表達(dá)系統(tǒng)。
69.權(quán)利要求68的外科手術(shù)套，其中所述表達(dá)系統(tǒng)包括遺傳修飾的細(xì)胞，其中所述遺傳修飾的細(xì)胞包含編碼所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的多核苷酸。
70.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述套還包含種在所述套管之上的活細(xì)胞。
71.權(quán)利要求70的外科手術(shù)套，其中所述活細(xì)胞包括施旺細(xì)胞。
72.權(quán)利要求70的外科手術(shù)套，其中所述活細(xì)胞被編碼所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的多核苷酸遺傳修飾。
73.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述套管是柔性的。
74.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
75.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、及基質(zhì)金屬蛋白酶-9、或其組合組成的組中選擇的。
76.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
77.權(quán)利要求63的外科手術(shù)套，其中所述套管包括待與所述神經(jīng)移植物或者損傷神經(jīng)接觸的板。
78.權(quán)利要求77的外科手術(shù)套，其中所述板為平板。
79.權(quán)利要求77的外科手術(shù)套，其中所述板為自卷曲板，并且其中所述板在與所述神經(jīng)移植物或者損傷神經(jīng)接觸時(shí)自動(dòng)包繞所述神經(jīng)移植物或者損傷神經(jīng)。
80.一種促進(jìn)損傷神經(jīng)組織修復(fù)的試劑盒，所述試劑盒包括含有至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的第一室，以及含有組織膠粘劑的第二室。
81.權(quán)利要求80的試劑盒，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合組成的組中選擇的。
82.權(quán)利要求80的試劑盒，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
83.權(quán)利要求80的試劑盒，其中所述組織膠粘劑選自由血纖蛋白膠和血小板凝膠組成的組。
84.權(quán)利要求80的試劑盒，其中所述試劑盒還包括用于混合所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶和所述組織膠粘劑的第三室。
85.一種制備用于植入的神經(jīng)移植物的方法，包括向神經(jīng)移植物施用至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
87.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、及基質(zhì)金屬蛋白酶-9、或其組合組成的組中選擇的。
88.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、及軟骨素酶AC或其組合組成的組中選擇的。
89.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
90.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物具有第一末端和第二末端，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被施用于神經(jīng)移植物的第一末端，或者神經(jīng)移植物的第二末端，或者神經(jīng)移植物的第一末端和第二末端。
91.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶施用于神經(jīng)移植物整體。
92.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶局部施用于神經(jīng)移植物。
93.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被注射到神經(jīng)移植物中。
94.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中通過(guò)將神經(jīng)移植物置于含有所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的培養(yǎng)基中來(lái)向神經(jīng)移植物施用硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
95.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。
96.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中培養(yǎng)基是不確定成分的培養(yǎng)基。
97.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述方法還包括向神經(jīng)移植物施用組織膠粘劑。
98.根據(jù)權(quán)利要求97的方法，其中組織膠粘劑是血纖蛋白膠。
99.根據(jù)權(quán)利要求97的方法，其中組織膠粘劑是血小板凝膠。
100.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述方法還包括向神經(jīng)移植物施用生物學(xué)活性劑。
101.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中生物學(xué)活性劑是生長(zhǎng)因子。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中生長(zhǎng)因子選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、表皮生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-5、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、胰島素樣生長(zhǎng)因子-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)因子/膽堿能分化因子。
103.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述方法還包括向神經(jīng)移植物施用細(xì)胞。
104.根據(jù)權(quán)利要求103的方法，其中細(xì)胞是干細(xì)胞。
105.根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中細(xì)胞是施旺細(xì)胞。
106.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶在神經(jīng)移植物內(nèi)導(dǎo)致軟骨素-4-硫酸、軟骨素-6-硫酸、或者軟骨素-4-硫酸和軟骨素-6-硫酸裂解。
107.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中一旦神經(jīng)移植物被接合到損傷神經(jīng)上，硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶可以縮短軸突進(jìn)入神經(jīng)移植物的潛伏期。
108.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中一旦神經(jīng)移植物被接合到損傷神經(jīng)上，硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶可以提高軸突進(jìn)入神經(jīng)移植物的速率。
109.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物包括周圍神經(jīng)組織。
110.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶，并且其中軟骨素酶在從大約10單位/ml到大約1000單位/ml的濃度范圍內(nèi)施用于神經(jīng)移植物。
111.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶，并且其中軟骨素酶在從大約100單位/ml到大約500單位/ml的濃度范圍內(nèi)施用于神經(jīng)移植物。
112.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶，并且其中基質(zhì)金屬蛋白酶在從大約0.1μg/ml到大約100μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用于神經(jīng)移植物。
113.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶，并且其中基質(zhì)金屬蛋白酶在從大約10μg/ml到大約50μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用于神經(jīng)移植物。
114.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是細(xì)菌酶。
115.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是哺乳動(dòng)物酶。
116.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是重組酶。
117.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物的長(zhǎng)度在大約1厘米到大約10厘米的范圍內(nèi)。
118.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物的長(zhǎng)度大于大約10厘米。
119.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物是活的神經(jīng)移植物。
120.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述神經(jīng)移植物是活的神經(jīng)移植物，并且其中所述方法還包括使活神經(jīng)移植物無(wú)細(xì)胞化。
121.根據(jù)權(quán)利要求120的方法，其中所述神經(jīng)移植物是活的神經(jīng)移植物，并且其中在向神經(jīng)移植物施用硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶之前使活神經(jīng)移植物無(wú)細(xì)胞化。
122.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述神經(jīng)移植物是活的神經(jīng)移植物，并且其中所述方法還包括通過(guò)冷凍殺死神經(jīng)移植物使此活神經(jīng)移植物無(wú)細(xì)胞化。
123.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中所述神經(jīng)移植物是活的神經(jīng)移植物，并且其中所述方法還包括通過(guò)用去污劑化學(xué)提取使活神經(jīng)移植物無(wú)細(xì)胞化。
124.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
125.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物來(lái)源于從人類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、嚙齒類動(dòng)物和牛組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物。
126.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物是自體移植物。
127.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物是同種異體移植物。
128.根據(jù)權(quán)利要求85的方法，其中神經(jīng)移植物是異種移植物。
129.一種促進(jìn)損傷的神經(jīng)修復(fù)的方法，其中所述方法包括在損傷部位植入神經(jīng)移植物，并且將至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶施用于(a)神經(jīng)移植物；或(b)損傷的神經(jīng)；或(c)神經(jīng)移植物和損傷的神經(jīng)。
130.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
131.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、軟骨素酶AC、透明質(zhì)酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、及基質(zhì)金屬蛋白酶-9、或其組合組成的組中選擇的。
132.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶ABC、軟骨素酶A、軟骨素酶C、及軟骨素酶AC、或其組合組成的組中選擇的。
133.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
134.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中所述方法還包括將組織膠粘劑施用于(a)神經(jīng)移植物；或(b)損傷的神經(jīng)；或(c)神經(jīng)移植物和損傷的神經(jīng)。
135.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中所述方法還包括將細(xì)胞施用于(a)神經(jīng)移植物；或(b)損傷的神經(jīng)；或(c)神經(jīng)移植物和損傷的神經(jīng)。
136.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中細(xì)胞是干細(xì)胞。
137.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中細(xì)胞是施旺細(xì)胞。
138.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)損傷包括損傷神經(jīng)的至少一種選自基膜、神經(jīng)束膜、和神經(jīng)外膜的神經(jīng)鞘的連續(xù)性的中斷。
139.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)損傷是神經(jīng)斷傷。
140.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)損傷是神經(jīng)斷傷，其中所述植入包括將神經(jīng)移植物接合到損傷神經(jīng)中，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被施用于接合部位。
141.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中損傷神經(jīng)部分或完全地被斷離，具有一個(gè)近側(cè)端和一個(gè)遠(yuǎn)側(cè)端，其中神經(jīng)移植物具有第一末端和第二末端，并且其中所述植入包括將神經(jīng)移植物插入到損傷神經(jīng)的近側(cè)端和遠(yuǎn)側(cè)端之間，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶被施用于至少一個(gè)以下部位(a)損傷神經(jīng)的近側(cè)端；(b)損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)端；(c)神經(jīng)移植物的第一末端；和(d)神經(jīng)移植物的遠(yuǎn)側(cè)端。
142.根據(jù)權(quán)利要求141的方法，其中所述方法還包括將組織膠粘劑施用于至少一個(gè)以下部位(a)損傷神經(jīng)的近側(cè)端；(b)損傷神經(jīng)的遠(yuǎn)側(cè)端；(c)神經(jīng)移植物的第一末端；和(d)神經(jīng)移植物的遠(yuǎn)側(cè)端。
143.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中所述植入包括將神經(jīng)移植物接合到損傷神經(jīng)中，并將神經(jīng)移植物縫合到損傷神經(jīng)上。
144.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶導(dǎo)致軟骨素-4-硫酸、軟骨素-6-硫酸、或者軟骨素-4-硫酸和軟骨素-6-硫酸裂解。
145.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶縮短軸突從損傷神經(jīng)進(jìn)入神經(jīng)移植物的潛伏期。
146.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶提高軸突從損傷神經(jīng)進(jìn)入神經(jīng)移植物的速率。
147.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是局部施用的。
148.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是通過(guò)注射施用的。
149.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶施用于神經(jīng)移植物整體。
150.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶與藥學(xué)上可接受的載體一起施用。
151.根據(jù)權(quán)利要求150的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是從由液體、凝膠、泡沫、固體、和聚合物組成的組中選擇的。
152.根據(jù)權(quán)利要求150的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是從由膜、海綿、纖維結(jié)構(gòu)、粉末、毛狀物、和顆粒組成的組中選擇的。
153.根據(jù)權(quán)利要求150的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是控釋體系。
154.根據(jù)權(quán)利要求150的方法，其中藥學(xué)上可接受的載體是外科手術(shù)套，其中外科手術(shù)套至少部分地包繞植入的神經(jīng)移植物。
155.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶，并且其中軟骨素酶在從大約10單位/ml到大約1000單位/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
156.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶，并且其中軟骨素酶在從大約100單位/ml到大約500單位/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
157.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶，并且其中基質(zhì)金屬蛋白酶在從大約0.1μg/ml到大約100μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
158.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶，并且其中基質(zhì)金屬蛋白酶在從大約10μg/ml到大約50μg/ml的濃度范圍內(nèi)施用于損傷神經(jīng)。
159.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中損傷的神經(jīng)是損傷的周圍神經(jīng)。
160.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中損傷的神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)，并且神經(jīng)移植物包括周圍神經(jīng)組織。
161.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是細(xì)菌酶。
162.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是哺乳動(dòng)物酶。
163.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是重組酶。
164.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的施用包括向損傷的神經(jīng)、或者神經(jīng)移植物、或者損傷的神經(jīng)和神經(jīng)移植物施用遺傳修飾的宿主，其中宿主已經(jīng)被編碼所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的多核苷酸遺傳修飾。
165.根據(jù)權(quán)利要求164的方法，其中遺傳修飾的宿主是細(xì)胞。
166.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是自體的。
167.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是同種異體的。
168.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是異種的。
169.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
170.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物來(lái)源于從人類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、嚙齒類動(dòng)物和牛組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物。
171.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中損傷的神經(jīng)是人類的，并且神經(jīng)移植物來(lái)源于從非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、嚙齒類動(dòng)物和牛組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物。
172.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中在所述植入之前向神經(jīng)移植物施用硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
173.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中在所述植入之后向神經(jīng)移植物施用硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
174.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物包括活的移植物。
175.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物包括活的移植物，并且其中所述方法還包括在所述植入無(wú)細(xì)胞神經(jīng)移植物前，使活神經(jīng)移植物無(wú)細(xì)胞化。
176.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中所述方法還包括在所述植入神經(jīng)移植物之前切除損傷的神經(jīng)。
177.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物是末端神經(jīng)移植物。
178.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)移植物是居間神經(jīng)移植物。
179.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)損傷是因疾病所致。
180.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)損傷是因創(chuàng)傷所致。
181.根據(jù)權(quán)利要求129的方法，其中神經(jīng)損傷是因外科手術(shù)操作所致。
182.一種促進(jìn)損傷的神經(jīng)修復(fù)的方法，其中神經(jīng)損傷包括損傷神經(jīng)的至少一種選自基膜、神經(jīng)束膜、和神經(jīng)外膜的神經(jīng)鞘的連續(xù)性的中斷，其中所述方法包括將神經(jīng)移植物植入損傷的神經(jīng)，并向損傷的神經(jīng)、或者神經(jīng)移植物、或者損傷的神經(jīng)和神經(jīng)移植物施用軟骨素酶。
183.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物包括周圍神經(jīng)組織。
184.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是自體的。
185.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是同種異體的。
186.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是異種的。
187.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
188.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物來(lái)源于從人類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、嚙齒類動(dòng)物和牛組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物。
189.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中損傷的神經(jīng)是人類的，并且神經(jīng)移植物來(lái)源于從非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、嚙齒類動(dòng)物和牛組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物。
190.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物是末端神經(jīng)移植物。
191.根據(jù)權(quán)利要求182的方法，其中神經(jīng)移植物是居間神經(jīng)移植物。
192.一種包含神經(jīng)組織的神經(jīng)移植物，其通過(guò)包括向所述神經(jīng)組織施用至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶的方法制備。
193.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
194.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
195.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中所述方法還包括向所述神經(jīng)組織施用組織膠粘劑。
196.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織包括活組織，并且其中所述方法還包括使所述活神經(jīng)組織無(wú)細(xì)胞化。
197.權(quán)利要求196的神經(jīng)移植物，其中使所述神經(jīng)組織無(wú)細(xì)胞化包括冷凍殺死所述神經(jīng)組織。
198.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織是周圍神經(jīng)組織。
199.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是末端神經(jīng)移植物。
200.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是居間神經(jīng)移植物。
201.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織是哺乳動(dòng)物組織。
202.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)組織是從人類組織、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織、豬組織、嚙齒類動(dòng)物組織和牛組織組成的組中選擇的。
203.權(quán)利要求201的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織是人類組織。
204.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是自體移植物。
205.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是同種異體移植物。
206.權(quán)利要求192的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是異種移植物。
207.一種用于神經(jīng)移植物的貯液，其包含至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶和培養(yǎng)基。
208.權(quán)利要求207的貯液，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合、或其生物學(xué)活性片段或變體組成的組中選擇的。
209.權(quán)利要求207的貯液，其中所述硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
210.權(quán)利要求207的貯液，其中所述培養(yǎng)基包括確定成分培養(yǎng)基。
211.權(quán)利要求207的貯液，其中所述培養(yǎng)基包括不確定成分的培養(yǎng)基。
212.一種用于制備作為神經(jīng)移植物的神經(jīng)組織的方法，其中所述方法包括在允許神經(jīng)組織體外生長(zhǎng)并且提高神經(jīng)組織在隨后植入時(shí)的神經(jīng)突促進(jìn)活性的條件下在體外培養(yǎng)神經(jīng)組織。
213.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高是通過(guò)神經(jīng)組織的體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定的。
214.根據(jù)權(quán)利要求213的方法，其中體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)包括低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)。
215.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高是通過(guò)神經(jīng)組織的體內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定的。
216.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的時(shí)間為允許神經(jīng)組織在體外預(yù)變性的時(shí)間。
217.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的時(shí)間為能夠增加隨后植入時(shí)神經(jīng)組織內(nèi)軸突的進(jìn)入和軸突在其中的生長(zhǎng)程度的時(shí)間。
218.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的時(shí)間在大約24小時(shí)到大約96小時(shí)范圍內(nèi)。
219.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的時(shí)間在大約24小時(shí)到大約72小時(shí)范圍內(nèi)。
220.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)進(jìn)行大約48小時(shí)。
221.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)是在大約10℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
222.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)是在大約30℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
223.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)是在大約37℃的溫度下進(jìn)行的。
224.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)組織是外植塊。
225.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)組織是哺乳動(dòng)物組織。
226.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)組織是從人類組織、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織、豬組織、嚙齒類動(dòng)物組織和牛組織組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物組織。
227.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)組織是人類組織。
228.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)移植物是自體移植物。
229.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)移植物是同種異體移植物。
230.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)移植物是異種移植物。
231.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織包括活神經(jīng)組織，并且其中所述方法還包括在所述培養(yǎng)后使所述活神經(jīng)組織無(wú)細(xì)胞化。
232.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述神經(jīng)組織包括活神經(jīng)組織，并且其中所述方法還包括在所述培養(yǎng)后冷凍殺死活神經(jīng)組織。
233.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述方法還包括將神經(jīng)組織冷凍貯藏。
234.根據(jù)權(quán)利要求233的方法，其中所述冷凍是在所述體外培養(yǎng)之后進(jìn)行的。
235.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述方法還包括向神經(jīng)組織施用至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
236.根據(jù)權(quán)利要求235的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在所述培養(yǎng)期間施用于神經(jīng)組織的。
237.根據(jù)權(quán)利要求235的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在所述培養(yǎng)之后施用于神經(jīng)組織的。
238.根據(jù)權(quán)利要求235的方法，其中所述方法還包括在所述體外培養(yǎng)之后冷凍殺死神經(jīng)組織，并且其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在所述冷凍殺死之后施用于神經(jīng)組織的。
239.根據(jù)權(quán)利要求235的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是從由軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶、及基質(zhì)金屬蛋白酶、或其組合組成的組中選擇的。
240.根據(jù)權(quán)利要求235的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是軟骨素酶。
241.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中神經(jīng)組織包括周圍神經(jīng)組織。
242.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述培養(yǎng)包括將神經(jīng)組織與培養(yǎng)基接觸。
243.根據(jù)權(quán)利要求242的方法，其中培養(yǎng)基包括確定成分培養(yǎng)基。
244.根據(jù)權(quán)利要求242的方法，其中培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有血清的確定成分培養(yǎng)基。
245.根據(jù)權(quán)利要求242的方法，其中培養(yǎng)基包括不確定成分的培養(yǎng)基。
246.根據(jù)權(quán)利要求242的方法，其中培養(yǎng)基包括dulbecco改良的eagles培養(yǎng)基。
247.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述方法還包括在所述的神經(jīng)組織體外培養(yǎng)前從哺乳動(dòng)物中分離神經(jīng)組織。
248.根據(jù)權(quán)利要求212的方法，其中所述方法還包括向神經(jīng)組織施用組織膠粘劑。
249.一種增強(qiáng)用作為神經(jīng)移植物的神經(jīng)組織的再生潛力的方法，其中所述方法包括將神經(jīng)組織在體外培養(yǎng)大約24小時(shí)到大約96小時(shí)。
250.根據(jù)權(quán)利要求249的方法，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)進(jìn)行大約24小時(shí)到大約72小時(shí)。
251.根據(jù)權(quán)利要求249的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)進(jìn)行大約48小時(shí)。
252.根據(jù)權(quán)利要求249的方法，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)是在大約10℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
253.根據(jù)權(quán)利要求249的方法，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)是在大約30℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
254.根據(jù)權(quán)利要求249的方法，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)是在大約37℃的溫度下進(jìn)行的。
255.根據(jù)權(quán)利要求249的方法，其中所述培養(yǎng)包括將神經(jīng)組織與培養(yǎng)基接觸。
256.一種包含神經(jīng)組織的神經(jīng)移植物，其通過(guò)包括在允許神經(jīng)組織體外生長(zhǎng)并且提高神經(jīng)組織在隨后植入時(shí)的神經(jīng)突促進(jìn)活性的條件下在體外培養(yǎng)神經(jīng)組織的方法制備。
257.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高是通過(guò)神經(jīng)組織的體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定的。
258.權(quán)利要求257的神經(jīng)移植物，其中體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)包括低溫培養(yǎng)生物試驗(yàn)。
259.權(quán)利要求257的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高是通過(guò)神經(jīng)組織的體內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定的。
260.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的時(shí)間為能增加隨后植入時(shí)神經(jīng)組織內(nèi)軸突的進(jìn)入及軸突在其中的生長(zhǎng)程度的時(shí)間。
261.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)進(jìn)行大約24小時(shí)到大約96小時(shí)。
262.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)進(jìn)行大約24小時(shí)到大約72小時(shí)。
263.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)進(jìn)行大約48小時(shí)。
264.權(quán)利要求249的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)是在大約10℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
265.權(quán)利要求249的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)是在大約30℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
266.權(quán)利要求249的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)是在大約37℃的溫度下進(jìn)行的。
267.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織包括活神經(jīng)組織，并且其中所述方法還包括使活神經(jīng)組織無(wú)細(xì)胞化。
268.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述神經(jīng)組織包括活神經(jīng)組織，并且其中所述方法還包括冷凍殺死活神經(jīng)組織。
269.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述方法還包括將神經(jīng)組織冷凍貯藏。
270.權(quán)利要求268的神經(jīng)移植物，其中所述冷凍是在所述體外培養(yǎng)之后進(jìn)行的。
271.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中所述培養(yǎng)包括將神經(jīng)組織與培養(yǎng)基接觸。
272.權(quán)利要求271的神經(jīng)移植物，其中培養(yǎng)基包括確定成分培養(yǎng)基。
273.權(quán)利要求271的神經(jīng)移植物，其中培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有血清的確定成分培養(yǎng)基。
274.權(quán)利要求271的神經(jīng)移植物，其中培養(yǎng)基包括不確定成分的培養(yǎng)基。
275.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)組織是哺乳動(dòng)物組織。
276.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)組織是從人類組織、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織、豬組織、嚙齒類動(dòng)物組織和牛組織組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物組織。
277.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)組織是人類組織。
278.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)組織包括周圍神經(jīng)組織。
279.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是自體移植物。
280.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是同種異體移植物。
281.權(quán)利要求256的神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是異種移植物。
282.一種促進(jìn)損傷的神經(jīng)修復(fù)的方法，包括在損傷部位植入神經(jīng)移植物，其中神經(jīng)移植物是通過(guò)包括在允許神經(jīng)移植物體外生長(zhǎng)并且提高神經(jīng)移植物在隨后植入時(shí)的神經(jīng)突促進(jìn)活性的條件下在體外培養(yǎng)神經(jīng)移植物的處理方法來(lái)制備的。
283.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物體外培養(yǎng)的時(shí)間為能增加隨后植入時(shí)神經(jīng)移植物內(nèi)軸突的進(jìn)入及軸突在其中的生長(zhǎng)程度的時(shí)間。
284.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高是通過(guò)神經(jīng)移植物的體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定的。
285.根據(jù)權(quán)利要求284的方法，其中體外神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)包括低溫培養(yǎng)試驗(yàn)。
286.根據(jù)權(quán)利要求284的方法，其中神經(jīng)突促進(jìn)活性的提高是通過(guò)神經(jīng)移植物的體內(nèi)神經(jīng)突向外生長(zhǎng)試驗(yàn)測(cè)定的。
287.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物體外培養(yǎng)的時(shí)間在大約24小時(shí)到大約96小時(shí)范圍內(nèi)。
288.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物體外培養(yǎng)的時(shí)間在大約24小時(shí)到大約72小時(shí)范圍內(nèi)。
289.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物體外培養(yǎng)的時(shí)間為大約48小時(shí)。
290.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物的體外培養(yǎng)是在大約10℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
291.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物的體外培養(yǎng)是在大約30℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。
292.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物的體外培養(yǎng)是在大約37℃的溫度下進(jìn)行的。
293.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物包括活的神經(jīng)組織，并且其中所述處理方法還包括使活神經(jīng)組織無(wú)細(xì)胞化。
294.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述神經(jīng)移植物包括活的神經(jīng)組織，并且其中所述處理方法還包括冷凍殺死活神經(jīng)組織。
295.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述處理方法還包括將神經(jīng)組織冷凍貯藏。
296.根據(jù)權(quán)利要求295的方法，其中所述冷凍是在所述體外培養(yǎng)之后進(jìn)行的。
297.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述培養(yǎng)包括將神經(jīng)移植物與培養(yǎng)基接觸。
298.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中培養(yǎng)基包括確定成分培養(yǎng)基。
299.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有血清的確定成分培養(yǎng)基。
300.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中培養(yǎng)基包括不確定成分的培養(yǎng)基。
301.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物是哺乳動(dòng)物組織。
302.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物是從人類組織、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織、豬組織、嚙齒類動(dòng)物組織和牛組織組成的組中選擇的哺乳動(dòng)物組織。
303.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物是人類組織。
304.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物包括周圍神經(jīng)組織。
305.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中損傷的神經(jīng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織。
306.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述方法還包括向損傷的神經(jīng)、或者神經(jīng)移植物、或者損傷的神經(jīng)和神經(jīng)移植物施用組織膠粘劑。
307.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物是末端神經(jīng)移植物。
308.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物是居間神經(jīng)移植物。
309.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述方法還包括向損傷的神經(jīng)、或者神經(jīng)移植物、或者損傷的神經(jīng)和神經(jīng)移植物施用至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
310.根據(jù)權(quán)利要求309的方法，其中硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶是在所述體外培養(yǎng)之后施用于神經(jīng)移植物的。
311.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中所述方法還包括在所述神經(jīng)移植物施用前切除損傷的神經(jīng)。
312.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是自體的。
313.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是同種異體的。
314.根據(jù)權(quán)利要求282的方法，其中神經(jīng)移植物與損傷的神經(jīng)是異種的。
315.一種提供用于植入潛在的神經(jīng)移植物受體的損傷神經(jīng)中的神經(jīng)移植物的方法，其中損傷的神經(jīng)包含近側(cè)神經(jīng)殘段，并且其中所述方法包括(a)確定潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段的橫斷面特征；(b)比較潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段的橫斷面特征和多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物的橫斷面特征；和(c)選擇具有與潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段的橫斷面特征相似的橫斷面特征的侯選供體神經(jīng)移植物。
316.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述確定包括產(chǎn)生潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段的數(shù)字圖像數(shù)據(jù)，其中圖像數(shù)據(jù)含有關(guān)于潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段的橫斷面特征的信息。
317.根據(jù)權(quán)利要求316的方法，其中所述比較包括分析圖像數(shù)據(jù)以限定神經(jīng)元件的坐標(biāo)位置和神經(jīng)元件的直徑，以便產(chǎn)生潛在受體模板，并且比較潛在受體模板和侯選供體移植物神經(jīng)模板，其中侯選供體移植物模板包括神經(jīng)元件的坐標(biāo)位置和神經(jīng)元件的直徑，其中所述坐標(biāo)位置是通過(guò)分析從多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)獲得的。
318.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段的橫斷面特征和多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物的橫斷面特征包含此潛在受體近側(cè)神經(jīng)殘段和多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)神經(jīng)結(jié)構(gòu)元件的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。
319.根據(jù)權(quán)利要求318的方法，其中一個(gè)或多個(gè)參數(shù)是從由直徑、厚度、和空間排列組成的組中選擇的。
320.根據(jù)權(quán)利要求319的方法，其中一個(gè)或多個(gè)神經(jīng)結(jié)構(gòu)元件是從由神經(jīng)外膜、神經(jīng)束、神經(jīng)束組、髓鞘和軸突組成的組中選擇的。
321.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所選擇的供體神經(jīng)移植物與潛在受體的神經(jīng)殘段具有最高的神經(jīng)結(jié)構(gòu)元件對(duì)接程度。
322.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物是冷凍貯藏的。
323.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物在允許神經(jīng)組織變性的條件下在體外培養(yǎng)。
324.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物在體外培養(yǎng)之前或之后被冷凍。
325.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物是自體的。
326.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物與潛在受體的近側(cè)神經(jīng)殘段是同種異體的。
327.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物與潛在受體的近側(cè)神經(jīng)殘段是異種的。
328.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物是哺乳動(dòng)物的。
329.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物是人類的。
330.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中潛在受體是人。
331.根據(jù)權(quán)利要求315的方法，其中向所述多個(gè)侯選供體神經(jīng)移植物施用至少一種硫酸軟骨素蛋白聚糖降解酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進(jìn)損傷的神經(jīng)組織修復(fù)的組合物和方法，以及神經(jīng)移植物的制備。本發(fā)明的組合物和方法可被用來(lái)恢復(fù)由疾病、創(chuàng)傷事件或者外科手術(shù)操作中斷的神經(jīng)的連續(xù)性。
文檔編號(hào)A61L27/36GK1553952SQ02817886
公開日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2002年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者D·F·繆爾, D F 繆爾 申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金公司