專利名稱：骨合成代謝化合物以及使用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療哺乳動物的化合物，特別是那些用于維持或增加人的骨量和/或骨密度和/或骨強度，同時使現(xiàn)有治療方法中的不希望的副作用減至最小或消除的化合物。
相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)描述雌激素和雄性激素除了在生殖生物學(xué)中起關(guān)鍵作用之外，在包括骨在內(nèi)的幾種非生殖組織中也起著重要的調(diào)控作用。事實上，絕經(jīng)期的雌激素缺乏導(dǎo)致了現(xiàn)代最普遍的骨合成代謝疾病—絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。預(yù)防該疾病的最好方法(也是FDA唯一認可的方法)就是在絕經(jīng)后持續(xù)進行幾十年的雌激素替代治療。根據(jù)雌激素替代治療在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥上的功效，并假定雌激素對于生殖組織和非生殖組織的作用是基于相同的受體作用機制，在過去60年間，已經(jīng)對數(shù)百萬的絕經(jīng)后女性進行了雌激素替代治療，以預(yù)防雌激素缺乏給生殖組織和非生殖組織帶來的不良后果。由于去勢或伴隨年齡增長帶來的生育能力下降造成的男性雄性激素(也可能是雌激素)缺乏也是男性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的一個主要因素。
骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)為骨量和骨質(zhì)降低，導(dǎo)致骨骼脆性增大，容易骨折。骨骼是一種由活細胞和蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)組成的動態(tài)組織。它能夠通過由兩種高度特異的細胞實現(xiàn)的重建過程保持持續(xù)的再生破骨細胞除去舊的骨骼，成骨細胞形成新的骨骼。重建過程主要發(fā)生在骨骼的內(nèi)表面，是由一種叫做基本多細胞單位(BMU)的暫時性解剖結(jié)構(gòu)來完成的。這些BMU包括前面的破骨細胞群和后面的成骨細胞群。BMU遍布骨骼的表面，破骨細胞形成凹陷，隨后即被成骨細胞形成的新骨填滿。破骨細胞發(fā)生凋亡(細胞程序性死亡)，很快被吞噬細胞除去。在成骨細胞的壽命期(大約3個月，破骨細胞大約為3個星期)內(nèi)，一些成骨細胞轉(zhuǎn)化為骨襯細胞，覆蓋在靜止的骨表面，一些被礦化的骨基質(zhì)包埋成為骨細胞。但是，大部分成骨細胞也發(fā)生凋亡。
大部分成年人骨骼的代謝障礙，包括骨質(zhì)疏松癥，被認為是破骨細胞的骨吸收和相繼的成骨細胞的骨形成的不平衡所造成的。性類固醇(雌激素或雄性激素)減小了破骨細胞和成骨細胞的生成率，因而減少了骨重建的次數(shù)。因此，性類固醇水平的降低將會導(dǎo)致骨重建速度加快。性類固醇也調(diào)節(jié)破骨細胞和成骨細胞的壽命期，但是相反地，它也調(diào)控它們凋亡的過程。雌激素缺乏加速了成骨細胞和骨細胞的凋亡，延緩了破骨細胞的凋亡。形成骨的成骨細胞的壽命的縮短和吸收骨的破骨細胞的壽命的延長打破了骨形成和骨吸收之間的平衡，導(dǎo)致骨吸收過度。因此性類固醇缺乏導(dǎo)致骨損失并誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥。
絕經(jīng)期的卵巢功能喪失是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的一個主要危險因素，同樣也是性欲喪失、血管運動障礙如熱潮，脂蛋白的不良變化、認知功能下降，或者冠狀動脈疾病，中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病的一個主要危險因素。雌激素廣泛用于治療女性絕經(jīng)期病癥和障礙，例如用于維持骨礦物質(zhì)密度，調(diào)節(jié)熱潮紅，增強認知和幸福感，增進心血管健康，降低血脂等等。但是，這些治療中所使用的代表性雌激素，例如雌二醇(Estrace)或者共軛馬雌激素(Premarin)，都有不希望的效果。例如，它們會刺激子宮和乳腺，使這兩個組織發(fā)生癌癥的危險性增大，它們也會刺激任何存在的雌激素反應(yīng)性癌細胞的生長。
在美國，所有現(xiàn)有用于預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物—雌激素、雷洛昔芬、二膦酸鹽、和鼻降鈣素噴霧—都是抗吸收制劑，它們會減少成骨細胞的生成，和/或減少破骨細胞的生成，降低其功能，減緩骨重建的速度。目前還沒有什么治療可以將通過將骨量從高骨折危險性的程度提高到正常程度，從而補充損失的骨骼，例如由于骨質(zhì)疏松癥而損失的骨骼。每天注射甲狀旁腺激素(PTH)，注射1.5到2年可以補充損失的骨骼，這是一種新的骨合成代謝療法，也是一種可以真正增加骨量的療法。這種療法還在等待FDA的批準(zhǔn)。過去認為所謂的合成代謝類固醇可以用于治療骨質(zhì)疏松癥，但是由于它會產(chǎn)生女性男性化的副作用，這種治療方式已經(jīng)不予考慮。因此，除了PTH之外，已經(jīng)使用的或正在考慮使用的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物沒有能補充損失的骨骼，例如由于骨質(zhì)疏松損失的骨骼的骨合成代謝類藥物。也沒有能治療絕經(jīng)后雌激素缺乏造成的障礙，例如冠狀動脈疾病，中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病的化合物，包括雌激素和雷洛昔芬。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可作為非生殖雌激素樣信號激活劑(ANGELS)的化合物。ANGELS化合物是一類可以模仿雌激素和雄性激素的非生殖作用，但是缺少其生殖作用的小分子物質(zhì)。例如，可以刺激骨骼形成，但是幾乎沒有或者沒有雌性化或雄性化作用的ANGELS化合物。
優(yōu)選的實施方案中提供了以能有效增加或維持一種骨骼特性的給藥方案給予患者ANGELS化合物的方法，其中所述骨骼特性選自骨量、骨密度和骨強度。優(yōu)選地，ANGELS化合物是非酚的。在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物選自雌烯二醇，雄烯二醇，雌烷二醇，雄烷二醇，去雌烯二醇，同雌烯二醇，斷雌烯二醇，去雄烯二醇，同雄烯二醇，斷雄烯二醇，去雌烷二醇，同雌烷二醇，斷雌烷二醇，去雄烷二醇，同雄烷二醇，斷雄烷二醇和雌三烯醇。
在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物是一種雌烯二醇或一種雄烯二醇。優(yōu)選地，雌烯二醇是5(10)-雌烯二醇。優(yōu)選地，5(10)-雌烯二醇選自5(10)-雌烯-3α，17α-二醇，5(10)-雌烯-3α，17β-二醇，5(10)-雌烯-3β，17α-二醇，5(10)-雌烯-3β，17β-二醇。優(yōu)選地，ANΓEΛ∑化合物是5(6)-雌烯二醇或5(6)-雄烯二醇。優(yōu)選地，ANΓEΛ∑化合物選自5(6)-雌烯-3α，17α-二醇，5(6)-雌烯-3α，17β-二醇，5(6)-雌烯-3β，17α-二醇，5(6)-雌烯-3β，17β-二醇，5(6)-雄烯-3α，17α-二醇，5(6)-雄烯-3α，17β-二醇，5(6)-雄烯-3β，17α-二醇，5(6)-雄烯-3β，17β-二醇。優(yōu)選地，ANΓEΛ∑化合物是4-雌烯二醇或4-雄烯二醇。優(yōu)選地，ANΓEΛ∑化合物選自4-雌烯-3α，17α-二醇，4-雌烯-3α，17β-二醇，4-雌烯-3β，17α-二醇，4-雌烯-3β，17β-二醇，4-雄烯-3α，17α-二醇，4-雄烯-3α，17β-二醇，4-雄烯-3β，17α-二醇，4-雄烯-3β，17β-二醇。
在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物是一種雌烷二醇或者一種雄烷二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物選自雌烷-3α，17α-二醇，雌烷-3α，17β-二醇，雌烷-3β，17α-二醇，雌烷-3β，17β-二醇，雄烷-3α，17α-二醇，雄烷-3α，17β-二醇，雄烷-3β，17α-二醇，雄烷-3β，17β-二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物是5α-雌烷二醇或者5α-雄烷二醇，優(yōu)選地，ANGELS化合物選自5α-雌烷-3α，17α-二醇，5α-雌烷-3α，17β-二醇，5α-雌烷-3β，17α-二醇，5α-雌烷-3β，17β-二醇，5α-雄烷-3α，17α-二醇，5α-雄烷-3α，17β-二醇，5α-雄烷-3β，17α-二醇，5α-雄烷-3β，17β-二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物是5β-雌烷二醇或者5β-雄烷二醇，優(yōu)選地，ANGELS化合物選自5β-雌烷-3α，17α-二醇，5β-雌烷-3 α，17β-二醇，5β-雌烷-3β，17α-二醇，5β-雌烷-3β，17β-二醇，5β-雄烷-3 α，17α-二醇，5β-雄烷-3α，17β-二醇，5β-雄烷-3β，17α-二醇，5β-雄烷-3β，17β-二醇。
在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物選自去雌烯二醇，同雌烯二醇，斷雌烯二醇，去雄烯二醇，同雄烯二醇，斷雄烯二醇，去雌烷二醇，同雌烷二醇，斷雌烷二醇，去雄烷二醇，同雄烷二醇，斷雄烷二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物選自去雌烯二醇，同雌烯二醇，斷雌烯二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物選自去雌烷二醇，同雌烷二醇，斷雌烷二醇。優(yōu)選地ANGELS化合物選自去雄烯二醇，同雄烯二醇，斷雄烯二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物選自去雄烷二醇，同雄烷二醇，斷雄烷二醇。
在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物是雌三烯醇。優(yōu)選地，雌三烯醇選自雌三烯-2-醇，雌三烯-3-醇，雌三烯-4-醇和雌三烯-5-醇。優(yōu)選地，雌三烯醇選自斷雌三烯醇，去雌三烯醇和同雌三烯醇。優(yōu)選地，雌三烯醇選自下組
其中R7，R8，R9，R10，R11，和R13分別選自氫原子，C1-C5烷基和三氟甲基；A和B分別獨立地選自CH或N；R12選自氫原子，羥基，和C1-C5烷基。優(yōu)選地，R7，R8，R9，R10，R11和R13分別選自氫原子，甲基，乙基和三氟甲基。
在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物選自 其中R是氫原子或C1-C5烷基；R’和R”分別選自氫原子，C1-C5烷基，三氟甲基，苯基，和C1-C5烷基取代的苯基。優(yōu)選地，R選自氫原子，甲基和乙基，R’和R”分別選自氫原子，甲基，乙基，丙基，三氟甲基，苯基，2-甲苯?；?，3-甲苯?；?-甲苯?；?br> 在優(yōu)選的實施方案中，ANGELS化合物選自下組 其中R1選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基，苯基和C1-C5烷基苯基；R2選自氫原子，C1-C5烷基和三氟甲基；R3選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基，羥基環(huán)烷基，苯基和C1-C5烷基苯基。優(yōu)選地，R1選自氫原子，甲基，乙基，異丙基，環(huán)己基和苯基；R2選自氫原子，甲基，乙基，異丙基和三氟甲基；R3選自氫原子，甲基，乙基，異丙基，苯基，環(huán)己基，環(huán)戊基和4-羥基環(huán)己基。
在優(yōu)選的實施方案中，給予ANGELS化合物的患者患有骨障礙。優(yōu)選地，骨障礙選自骨質(zhì)疏松癥，佩吉特病，成骨不全，慢性甲狀旁腺功能亢進，甲狀腺功能亢進，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，Gorham-Stout病，麥-奧綜合癥，癌癥骨轉(zhuǎn)移，多發(fā)性骨髓瘤骨轉(zhuǎn)移和牙槽嵴骨丟失。優(yōu)選地，骨障礙是骨質(zhì)疏松癥。優(yōu)選地，骨質(zhì)疏松癥選自絕經(jīng)后的，男性的，老年的，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的，乙醇誘發(fā)的，與厭食/閉經(jīng)相關(guān)的，骨骼固定術(shù)誘發(fā)的，體重降低誘發(fā)的，移植后的，轉(zhuǎn)移的，先天的，和青少年的骨質(zhì)疏松癥。
在優(yōu)選的實施方案中，通過給予ANGELS化合物而增加或維持的骨骼特性是骨量，和/或骨密度，和/或骨強度。
在另外的優(yōu)選實施方案中進一步提供了以能有效進行下述治療的給藥方案給予患者ANGELS化合物的方法，包括提高性欲，控制血管舒縮障礙，促進血管舒張，減少骨丟失，減少情緒波動，降低膽固醇，減少低密度脂蛋白(LDL)，增加高密度脂蛋白(HDL)，減緩動脈硬化，減緩癌癥發(fā)展，減緩心血管疾病發(fā)展，減緩年齡相關(guān)的神經(jīng)退化癥，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，降低癌癥的危險性，降低心血管疾病的危險性，降低中風(fēng)的危險性，降低神經(jīng)退行性疾病的危險性。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效控制血管舒縮障礙或者促進血管舒張。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效減緩心血管疾病的發(fā)展，減緩動脈硬化，降低心血管疾病的危險性，或者降低中風(fēng)的危險性。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效地降低膽固醇，降低LDL，或者增加HDL。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效地減緩年齡相關(guān)的神經(jīng)退化癥，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，或者降低神經(jīng)退行性疾病的危險性。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效地提高性欲。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效地減少骨丟失。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效地減少情緒波動。優(yōu)選地，該給藥方案可以有效地降低癌癥的危險性或者減緩癌癥發(fā)展。
另外的優(yōu)選實施方案進一步提供了ANGELS化合物，以及包含一種或多種所述化合物的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含一種化合物，該化合物由選自下組的式表示
其中R1，R3和R6分別選自氫原子或甲基；其中m和n分別是1至3的整數(shù)；其中R2和R5分別選自氫原子，鹵素，巰基，羥基，氰基，氨基，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5硫代烷基，C1-C5酯，C1-C5烷氧基，C1-C5?；珻1-C5烷基胺，和C1-C5酰氧基；R4選自氫原子，乙烯基，乙炔基，芳香基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5酯，和C1-C5酰基。
在優(yōu)選的實施方案中，這些化合物由下式表示，其中m，n的取值，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同 在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的n為1或3。在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的m為1或3。優(yōu)選地，這些化合物由下式表示，其中不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)同類結(jié)構(gòu)中的相同
優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，其中m，n的取值，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同 在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的n為1或3。在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的m為1或3。這些化合物由下式表示，其中不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)同類結(jié)構(gòu)中的相同 優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，其中m，n的取值，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同 在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的n為1或3。在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的m為1或3。優(yōu)選地，這些化合物由下式表示，其中不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)同類結(jié)構(gòu)中的相同 優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，其中m，n的取值，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同
在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的n為1或3。在優(yōu)選的實施方案中，該結(jié)構(gòu)式中的m為1或3。優(yōu)選地，這些化合物由下列通式表示，其中不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)同類結(jié)構(gòu)中的相同 優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
另外的優(yōu)選實施方案進一步提供了ANGELS化合物，以及包含一種或多種所述化合物的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含一種化合物，該化合物由選自下組的式表示
其中R1，R3和R6分別選自氫原子和甲基；R2和R5分別選自氫原子，鹵素，巰基，羥基，氰基，氨基，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5硫代烷基，C1-C5酯，C1-C5烷氧基，C1-C5?；?，C1-C5烷基胺，和C1-C5酰氧基；R4選自氫原子，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5酯，和C1-C5?；?。在優(yōu)選的實施方案中，這些化合物由下式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同 優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同
優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同 優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
另外的優(yōu)選實施方案進一步提供了ANGELS化合物，以及包含一種或多種所述化合物的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含一種化合物，該化合物由選自下組的式表示
其中R13，R14和R15分別選自氫原子，乙烯基，乙炔基，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基；R16選自氫原子，羥基，和C1-C5羥烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同
優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中R13和R14分別選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基；R16是羥基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同 優(yōu)選地，在該結(jié)構(gòu)式中，R13，R14和R15分別選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同
優(yōu)選地，在該結(jié)構(gòu)式中，R13，R14和R15分別選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基。
另外的優(yōu)選實施方案進一步提供了ANGELS化合物，以及包含一種或多種所述化合物的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含一種化合物，該化合物由選自下組的式表示 其中m和n分別是1至4的整數(shù)；R3和R5分別選自羥基，氫原子，C1-C5烷基，C1-C5羥烷基，C1-C5烷氧基，C1-C5硫代烷氧基，苯基和C1-C5烷基取代的苯基；R6選自氫原子和C1-C5烷基。
在另外的優(yōu)選實施方案中，這些化合物由下列通式表示，不同的R基團的選擇與上述相應(yīng)結(jié)構(gòu)中的相同
優(yōu)選地，該結(jié)構(gòu)式中，R3選自氫原子，甲基和乙基；R5和R6分別選自氫原子和C1-C5烷基。


根據(jù)下面的描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面都將變得明顯可見，下述描述和附圖是舉例說明而并非限制本發(fā)明，其中圖1A-F顯示了性類固醇的抗凋亡作用需要細胞質(zhì)激酶的非生殖活化和下游轉(zhuǎn)錄依賴和不依賴型事件。
圖2顯示了雌激素對SRE-SEAP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要Src/Shc/ERK信號途徑。
圖3顯示了雌激素對AP-1-SEAP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要JNK信號途徑。
圖4顯示了SER和AP-1依賴型轉(zhuǎn)錄是通過性別-非特異性的，非生殖的機制進行的。
圖5A-B顯示了ERa介導(dǎo)的SRE-SEAP活化需要雌二醇誘導(dǎo)的Elk-1的磷酸化。
圖6顯示了性類固醇通過ER或AR的抗凋亡作用需要有轉(zhuǎn)錄作用，包括Elk-1，C/EBPβ，CREB和JNK1/AP-1的調(diào)控。
圖7A-D顯示了雌激素和雄性激素對雌性和雄性小鼠的非生殖性骨骼作用的等同性。
圖8顯示了性類固醇對破骨細胞的促凋亡作用需要Src/ERK信號途徑。
圖9A-D顯示了雌激素和雄性激素對雌性和雄性小鼠的骨骼作用的等同性。
圖10A-C顯示了4-雌烯-3α，17β-二醇(ABX102)與全長人ER和ER的相對結(jié)合親和力。
圖11A-C顯示了性腺切除的小鼠給予4-雌烯-3α，17β-二醇(4-Ed)以后骨密度增加。
圖12A-C顯示了小鼠給予4-雌烯-3α，17β-二醇(4-Ed)以后脊椎壓縮強度的增加，骨髓空腔的保持和成骨細胞凋亡的預(yù)防。
圖13A-G顯示了切除卵巢的小鼠給予4-雌烯-3α，17β-二醇(4-Ed)以后小梁寬度和皮質(zhì)寬度增加，成骨細胞數(shù)目增加，血清骨鈣素增加。
圖14A-D顯示了4-雌烯-3α，17β-二醇(4-Ed)對雌性或雄性的生殖組織和乳腺癌細胞都沒有作用。
圖15A-B顯示了4-雌烯-3α，17β-二醇(4-Ed)相關(guān)化合物(根據(jù)示意圖1A)的生殖和非生殖活性的篩選結(jié)果。
示意圖1A(圖16A)顯示了不同優(yōu)選雌烯，雌烷，雄烯，雄烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
示意圖1B(圖16B)顯示了優(yōu)選雌烯，雌烷，雄烯，雄烷的一般結(jié)構(gòu)。
示意圖1C(圖16C)顯示了不同雌烯，雌烷，雄烯，雄烷的優(yōu)選合成方法。
示意圖2A(圖17A)顯示了具有有效能的修飾取代基的雌烯，雌烯類似物和衍生物的一般結(jié)構(gòu)。
示意圖2B(圖17B)顯示了具有有效能的修飾取代基的雌烯類似物的優(yōu)選合成方法。
示意圖3A(圖18A)顯示了優(yōu)選的雌烯的同，去，斷和環(huán)類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
示意圖3B(圖18B)顯示了優(yōu)選的雌烯的同，去，斷和環(huán)類似物的一般結(jié)構(gòu)。
示意圖3C(圖18C)顯示了優(yōu)選的雌烯的同，去，斷和環(huán)類似物的合成示意圖4A(圖19A)顯示了不同的優(yōu)選的雌烯的雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子類似物。
示意圖4B(圖19B)顯示了不同的雌烯的雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子類似物的一般結(jié)構(gòu)。
示意圖4C(圖19C)顯示了不同的雌烯的雜環(huán)類似物的優(yōu)選合成方法。
示意圖4D(圖19D)顯示了不同的雌烯的含雜原子的非環(huán)分子類似物的優(yōu)選合成方法。
示意圖5A(圖20A)顯示了不同的優(yōu)選雌三烯類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
示意圖5B(圖20B)顯示了優(yōu)選雌三烯類似物的一般結(jié)構(gòu)。
示意圖5C(圖20C)顯示了不同的碳環(huán)形雌三烯類似物的優(yōu)選合成方法。
示意圖5D(圖20D)顯示了不同的雜環(huán)核和含雜原子的非環(huán)分子核雌三烯類似物的優(yōu)選合成方法。
優(yōu)選實施方案詳述在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及ANGELS化合物和用這些化合物增進健康和幸福感的方法。ANGELS是小分子(分子量大約是1000或以下)化合物，可以模仿雌激素和雄性激素的非生殖作用，但是缺少其生殖作用。優(yōu)選的ANGELS化合物是非酚的，因此也不是雌激素。在人中，雌激素和雄性激素的非生殖作用包括許多種骨合成代謝，動脈保護和神經(jīng)保護功能。非生殖作用的例子包括促進血管舒張，抑制熱潮紅，減少骨損失，增加骨密度，增加骨量，增加骨強度，減少情緒波動，降低膽固醇，減緩動脈硬化，減緩癌癥發(fā)展，減緩心血管疾病發(fā)展，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，降低癌癥的危險性，降低心血管疾病的危險性，降低中風(fēng)的危險性，和/或降低神經(jīng)退行性疾病的危險性。
但是，雖然維持或提高人體內(nèi)雌激素或雄性激素的水平具有有益的效果，其也具有生殖性的副作用。這些生殖性的副作用一般表現(xiàn)為子宮癌，乳腺癌和/或卵巢癌，和/或在給異性施用的時候臨床上出現(xiàn)的顯著雌性化或雄性化作用。例如，以能有效產(chǎn)生有益的非生殖作用的給藥方案給予男性雌激素，會出現(xiàn)不希望的雌性化作用，例如胸部發(fā)育，(男子女性型乳房)，胸部疼痛(乳腺疼痛)，以及毛發(fā)生長減少，射精體積減少，精子數(shù)量下降。同樣地，以能有效產(chǎn)生有益的非生殖性作用的給藥方案給予女性雄性激素也會出現(xiàn)不希望的雄性化作用，例如面部毛發(fā)生長，(多毛癥)，粉刺，喉部增大，聲音低沉，肌肉過度生長，陰蒂增大(clitoromegaly)，和閉經(jīng)。
優(yōu)選的ANGELS化合物至少部分地將骨質(zhì)疏松的骨骼恢復(fù)到正常的骨量，骨密度，和/或骨強度，現(xiàn)有的治療方法是不可能達到這個效果的，優(yōu)選地該化合物還可以提供雌激素和/或雄性激素的其它有益效果，并且在臨床上沒有顯著的生殖組織癌癥危險性，也沒有臨床上的顯著的雄性化和雌性化副作用。ANGELS化合物不是目前所理解的SERM，SERM存在骨骼和心血管系統(tǒng)中是雌激素激動劑，但是在子宮和乳腺中是雌激素拮抗劑。例如雷洛昔芬在骨骼中只有在缺乏雌激素的時候是一種弱雌激素激動劑，雷洛昔芬和他莫昔芬，另一種SERM，在存在雌激素的時候，例如在絕經(jīng)前婦女中在骨骼中是拮抗劑。換句話說，SERM在雌激素充足的狀態(tài)下引起骨損失。SERM最多在骨骼中起到和雌激素一樣的作用，但是雌激素不再是治療骨質(zhì)疏松癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物。除此之外，最近的證據(jù)表明，SERM對男性無效。最終雷洛昔芬在血管舒縮系統(tǒng)中做為雌激素的拮抗劑，加劇了熱潮紅。
如下所述，認為ANGELS化合物的作用機制與雌激素或SERM完全不同。本發(fā)明不受任何作用理論限制，但是數(shù)據(jù)表明性類固醇保護成人骨骼的受體作用機制與用于維持生殖組織的量和功能或者刺激乳腺癌細胞增殖的受體作用機制根本不同。特別地，性類固醇的受體的生殖作用對于它們對生殖組織的作用來說是必須的，但是這種作用對于它們對骨骼的保護作用來說卻不是必需的。例如，認為雌激素或雄性激素對成骨細胞的抗凋亡作用和對破骨細胞的促凋亡作用是通過對MAP激酶的非生殖性調(diào)控以及下游轉(zhuǎn)錄依賴型和不依賴型事件完成的。ANGELS化合物實際上是實現(xiàn)了這些非生殖性的功能，同時也不影響其轉(zhuǎn)錄。例如，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)雖然性類固醇可以防止骨損失，但是優(yōu)選的ANGELS化合物對雌性和雄性都可以增加骨量和/或骨密度和/或骨強度而不影響生殖組織。
優(yōu)選的ANGELS化合物對于骨骼比雌激素效果更好，而且對子宮或乳腺的活性很小或沒有。除此之外，優(yōu)選的ANGELS化合物對于男性是有效的，因為幾乎沒有雌性化作用。而且，優(yōu)選的ANGELS化合物對于血管舒縮系統(tǒng)的作用和雌激素一樣，可以減少熱潮紅。下面把優(yōu)選的ANGELS化合物分為四類。這種類別是為了方便起見而并非是限制本發(fā)明的范圍?？梢岳斫猓@里引述的具體的化合物和/或化合物種類包括其立體異構(gòu)體，鹽，衍生物和代謝物。這里本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解不同的結(jié)構(gòu)式代表所有的立體異構(gòu)體。
類別I雌烯，雌烷，雄烯和雄烷類別I包含的ANGELS化合物如示意圖1A所示，包含其他類似物和衍生物的一般結(jié)構(gòu)如示意圖1B所示。類別I中一些簡單的物質(zhì)是已知的化合物，其中一些都是商業(yè)可獲得的(例如，從Steraloids Inc.，Newport，Rhode Island獲得)。類別I中的一些類似物中的不同環(huán)連接和融合位置是從天然類固醇中的(即，5α，8β，9α，10β，13β，14α，17β)轉(zhuǎn)換而來的，優(yōu)選的是那些5β和/或17α構(gòu)型的。所有這些類似物都可以用熟知的合成類固醇的方法，或者現(xiàn)有的或商業(yè)上可獲得的(Steraloids Inc.，Newport，Rhode Island)將類固醇轉(zhuǎn)換為新的類似物或者衍生物的方法來制備。類固醇合成和類固醇轉(zhuǎn)換反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法參閱下述參考文獻Fieser and Fieser，1967；Fried and Edwards，1972；Kirk andHartshorn，1968；Shoppee，1964；and Djerassi，1963。類別I中某些化合物合成的示例見示意圖1C。
可以通過在不同位點的取代增加類別I中各化合物的功效，尤其是7α，11β和17α位點，其取代方式見示意圖2A，這些取代增加了選擇性的骨合成代謝活性。這三個位點的優(yōu)選取代基包括鹵素，雜原子，和取代的雜原子基團，烷基，烯基，炔基，芳基以及雜芳基，烷基，烯基，炔基，芳基，雜芳基，鹵素以及上述取代基的雜原子取代類似物。這三個位點的最優(yōu)選取代基包括小的鹵素或取代的(C1-C4)雜原子，低級烷基或環(huán)烷基(C1-C5)，低級烯基或炔基(C2-C6)，低級芳基和雜芳基，以及烷基，烯基，炔基，芳香基，雜芳基，鹵素和上述具有低級取代基(C1-C4)的雜原子取代類似物。更優(yōu)選的取代基包括，在7α位置，小的鹵素(F，Cl，或Br)或者具有低級烷基取代(C1-C2)的雜原子。在11β位置，更優(yōu)選的取代包括帶有或沒有小的鹵素(F，Cl，Br)，或者帶有具有低級(C1-C2)烷基，烯基，炔基，芳基或沒有或具有帶有或沒有小的鹵素原子(F，Cl，Br)的低級烷基(C1-C3)的雜芳基的低級烷基(C1-C3)，或者具有H或低級(C1-C2)烷基取代的雜原子。在17α位置，更優(yōu)選的取代包括帶有或沒有小的鹵素(F，Cl，Br)的低級烷基(C1-C3)，烯基，炔基，芳基或沒有或具有帶有或沒有小的鹵素原子(F，Cl，Br)的低級烷基(C1-C3)的雜芳基，或具有H或低級(C1-C2)烷基取代的雜原子。
示意圖2A的示例是基于一個簡單的雌烯或雌烷系統(tǒng)，但是類別I的所有化合物，優(yōu)選的是示意圖1A和1B所示的，都可以進行類似取代。應(yīng)當(dāng)理解的是，由天然類固醇中的位置(即，5α，8β，9α，10β，13β，14α，17β)轉(zhuǎn)換而來的具有不同環(huán)連接和融合位置的類似物都具有類似的或是增強的骨合成代謝活性。本發(fā)明不受任何理論限制，但是認為選擇性的取代能夠調(diào)節(jié)化合物與雌激素受體之間的結(jié)合親和力和結(jié)合動力學(xué)，減少非特異性結(jié)合，和/或減少代謝。
優(yōu)選的類別I的ANGELS化合物包括雌烯二醇(例如5(10)-雌烯二醇，5(6)-雌烯二醇，4-雌烯二醇)，雄烯二醇(例如5(6)-雄烯二醇，4-雄烯二醇)，雌烷二醇(例如5α-雌烷二醇，5β-雌烷二醇)，雄烷二醇(例如5α-雄烷二醇，5β-雄烷二醇)。優(yōu)選的ANGELS化合物的實例包括5(10)-雌烯-3α，17α-二醇，5(10)-雌烯-3α，17β-二醇，5(10)-雌烯-3β，17α-二醇，5(10)-雌烯-3β，17β-二醇，5(6)-雌烯-3α，17α-二醇，5(6)-雌烯-3α，17β-二醇，5(6)-雌烯-3β，17α-二醇，5(6)-雌烯-3β，17β-二醇，5(6)-雄烯-3α，17α-二醇，5(6)-雄烯-3α，17β-二醇，5(6)-雄烯-3β，17α-二醇，5(6)-雄烯-3β，17β-二醇，4-雌烯-3α，17α-二醇，4-雌烯-3α，17β-二醇，4-雌烯-3β，17α-二醇，4-雌烯-3β，17β-二醇，4-雄烯-3α，17α-二醇，4-雄烯-3α，17β-二醇，4-雄烯-3β，17α-二醇，4-雄烯-3β，17β-二醇，雌烷-3 α，17α-二醇，雌烷-3α，17β-二醇，雌烷-3β，17α-二醇，雌烷-3β，17β-二醇，雄烷-3 α，17α-二醇，雄烷-3α，17β-二醇，雄烷-3β，17α-二醇，雄烷-3β，17β-二醇，5α-雌烷-3α，17α-二醇，5α-雌烷-3α，17β-二醇，5α-雌烷-3β，17α-二醇，5α-雌烷-3β，17β-二醇，5α-雄烷-3α，17α-二醇，5α-雄烷-3α，17β-二醇，5α-雄烷-3β，17α-二醇，5α-雄烷-3β，17β-二醇。優(yōu)選地，ANGELS化合物是5β-雌烷二醇或者5β-雄烷二醇，優(yōu)選地，ANGELS化合物選自5β-雌烷-3α，17α-二醇，5β-雌烷-3α，17β-二醇，5β-雌烷-3β，17α-二醇，5β-雌烷-3β，17β-二醇，5β-雄烷-3α，17α-二醇，5β-雄烷-3α，17β-二醇，5β-雄烷-3β，17α-二醇，5β-雄烷-3β，17β-二醇。
合成這樣的取代化合物的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。一般的參考文獻中都可以找到類固醇合成的例子，尤其是17α位點的取代。對于7α和11β位點的取代，給出下述參考文獻7α(French et al.，1993b；Tedesco et al.，1997a)及其所引用的文獻；11(French et al.，1993b；Pomper et al.，1990；Tedesco etal.，1997a)及其所引用的文獻；類別I中某些化合物的合成示例見示意圖2C。
一些優(yōu)選的ANGELS化合物以下述式(I)到(IV)表示
其中R1，R3和R6分別是氫原子，甲基或乙基，更優(yōu)選是甲基；m和n分別是1-3的整數(shù)，R2和R5分別選自氫原子，鹵素，巰基，羥基，氰基，氨基，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5烷巰基，C1-C5酯，C1-C5烷氧基，C1-C5酰基，C1-C5烷基胺，C1-C5酰氧基，；R4選自氫原子，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5酯，C1-C5酰基。式(I)到(IV)所表示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式包括所有立體異構(gòu)體，因此R1，R2，R3，R4，R5，和R6的立體化學(xué)構(gòu)型分別可以是α或者β。R2取代基可與環(huán)中的任何(CH2)m碳原子或是其它碳原子相連。
在一個優(yōu)選的實施方案中，式(I)表示4-雌烯二醇和4-雄烯二醇，其中m＝n＝2，如下式(V)所示。優(yōu)選地，R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，以及C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基，R5選自氫原子和C1-C5烷基。優(yōu)選的4-雌烯二醇和4-雄烯二醇的結(jié)構(gòu)如表1所示，參照式(V)。

表1 4-雌烯二醇和4-雄烯二醇

在一個優(yōu)選的實施方案中，式(II)表示5(10)-雌烯二醇，其中m＝n＝2，如下式(VI)所示。優(yōu)選地，R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，以及C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基，R5選自氫原子和C1-C5烷基。優(yōu)選的5(10)-雌烯二醇的結(jié)構(gòu)如表2所示，參照式(VI)。

表2 5(10)-雌烯二醇

在一個優(yōu)選的實施方案中，式(III)表示5(6)-雌烯二醇和5(6)-雄烯二醇，其中m＝n＝2，如下式(VII)所示。優(yōu)選地，R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，以及C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基，R5選自氫原子和C1-C5烷基。優(yōu)選的5(6)-雌烯二醇和5(6)-雄烯二醇的結(jié)構(gòu)如表3所示，參照式(VII)。

表3 5(6)-雌烯二醇和5(6)-雄烯二醇


在一個優(yōu)選的實施方案中，式(IV)表示雌烷二醇和雄烷二醇，其中m＝n＝2，如下式(VIII)所示。優(yōu)選的雌烷二醇和雄烷二醇的結(jié)構(gòu)如表4和式(VIII)所示，其中R6是氫原子。優(yōu)選地，R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，以及C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基，R5選自氫原子和C1-C5烷基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解式(VIII)表示所有立體異構(gòu)體，包括5α和5β立體異構(gòu)體。

表4 雌烷二醇和雄烷二醇

類別II雌烯和雌烷的環(huán)修飾類似物許多環(huán)擴大(A，B，C或D環(huán)的擴大都稱為“同雌烯二醇，同雄烯二醇，同雌烷二醇和同雄烷二醇”)，縮小(A，B，C或D環(huán)的縮小都稱為“去雌烯二醇，去雄烯二醇，去雌烷二醇和去雄烷二醇”)，或斷開(A，B，C或D環(huán)的斷開都稱為“斷雌烯二醇，斷雄烯二醇，斷雌烷二醇和斷雄烷二醇”或者A/B，B/C或C/D稱為“環(huán)雌烯二醇，環(huán)雄烯二醇，環(huán)雌烷二醇和環(huán)雄烷二醇”)的雌烯二醇，雄烯二醇，雌烷二醇和雄烷二醇類似物都是已知的。類別II的化合物示例見示意圖3A，具有優(yōu)選的環(huán)大小，取代基，和取代方式的化合物的一般結(jié)構(gòu)見示意圖3B。
示意圖3A和3B中的示例是具代表性的雌烯，但是類別II中還包括示意圖1A和1B所示的任何雌烯，雌烷，雄烯，雄烷類似物的同，去，斷，環(huán)類似物。類別II還包括那些具有由天然類固醇中的位置(即，5α，8β，9α，10β，13β，14α，17β)轉(zhuǎn)換而來的不同環(huán)連接和融合位置的類似物。
已知有許多方法可用于同，去，斷，環(huán)類似物的合成。從一般的參考文獻中可以找到很多類固醇合成的實例。特別引用下述有關(guān)類固醇合成和修飾反應(yīng)的出版物Fieser and Fieser，1967；Fried and Edwards，1972；Kirk and Hartshorn，1968；Shoppee，1964；Djerassi，1963；以及這些出版物所引用的文獻。除此之外，還有許多公知的方法可用于擴大碳環(huán)，例如制備同類固醇，用于縮小碳環(huán)，例如制備去類固醇，還有用于斷開碳環(huán)和碳鏈，例如制備不同的斷和環(huán)類似物(Paquette，1995；Trost，1991)。這些方法在描述合成方法的書中都有詳細記述，例如Smith and March的書(Smith and March，2001)和Larock的書(Larock，1989)另外在一些專題綜述中以也有。類別II中某些化合物的合成示例如示意圖3C所示。
在一個優(yōu)選的實施方案中，式(I)表示去雌烯二醇和去雄烯二醇，其中m和/或n為1或2，或同雌烯二醇和同雄烯二醇，其中m和/或n為2或3，或同時包含去環(huán)和同環(huán)的雌烯二醇和雄烯二醇，其中m或n一個為1，一個為3。優(yōu)選ANGELS化合物的結(jié)構(gòu)如表5所示，參照式(I)，其中R2和R3是氫原子，R3是甲基。
表5 去/同-雌烯二醇和去/同-雄烯二醇

在一個優(yōu)選的實施方案中，式(II)表示去5(10)-雌烯二醇，其中m和/或n為1或2，或同5(10)-雌烯二醇，其中m和/或n為2或3，或同時包含去環(huán)和同環(huán)的5(10)-雌烯二醇，其中m或n一個為1，一個為3。優(yōu)選地R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，和C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。不同優(yōu)選ANGELS化合物的結(jié)構(gòu)如表6所示，參照式(II)，其中R3是甲基，R5是氫原子。
表6 去/同-雌烯二醇

在一個優(yōu)選的實施方案中，式(III)表示去5(6)-雌烯二醇和去5(6)-雄烯二醇，其中m和/或n為1或2，或同5(6)-雌烯二醇和同5(6)-雄烯二醇，其中m和/或n為2或3，或同時包含去環(huán)和同環(huán)的5(6)-雌烯二醇和5(6)-雄烯二醇，其中m或n一個為1，一個為3。優(yōu)選地，R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，和C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。不同優(yōu)選ANGELS化合物的結(jié)構(gòu)如表7所示，參照式(III)，其中R3是甲基，R5是氫原子。
表7 去/同-雌烯二醇和去/同-雄烯二醇

在一個優(yōu)選的實施方案中，式(IV)表示去雌烷二醇和去-雄烷二醇，其中m和/或n為1或2，或同雌烷二醇和同雄烷二醇，其中m和/或n為2或3，或同時包含去環(huán)和同環(huán)的雌烷二醇和雄烷二醇，其中m或n一個為1，一個為3。優(yōu)選地，R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，和C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。不同優(yōu)選ANGELS化合物的結(jié)構(gòu)如表8所示，參照式(IV)，其中R2和R5是氫原子，R3是甲基。
表8 去/同-雌烷二醇和去/同-雄烷二醇

在優(yōu)選的實施方案中，類別(II)的ANGELS化合物由下述結(jié)構(gòu)式表示，其中R13，R14和R15分別選自氫原子，乙烯基，乙炔基，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基；其中R16選自氫原子，羥基和C1-C5羥烷基。
更優(yōu)選地，上圖所示的每一個結(jié)構(gòu)式中，R13，R14和R15分別獨立地選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基，R16優(yōu)選是羥基。在此實施方案中，更優(yōu)選的結(jié)構(gòu)式選自下組
最優(yōu)選地，上圖所示的每一個結(jié)構(gòu)式中，R13，R14和R15分別獨立地選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基。
在優(yōu)選的實施方案中，類別(II)的ANGELS化合物由下述結(jié)構(gòu)式表示，其中m和n分別是1到4的整數(shù)；R3和R5分別獨立地選自羥基，氫原子，C1-C5烷基，C1-C5羥烷基，C1-C5烷氧基，C1-C5硫代烷氧基，苯基，和C1-C5烷基取代的苯基；R6選自氫原子和C1-C5烷基 在此優(yōu)選實施方案中，更優(yōu)選的化合物結(jié)構(gòu)選自下組，其中R3，R5和R6同上
最優(yōu)選地，上圖所示的每一個結(jié)構(gòu)式中，R3選自氫原子，甲基和乙基；R5和R6分別選自氫原子和C1-C5烷基。
類別III雌烯和雌烷的雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子類似物類別III的優(yōu)選化合物如示意圖4A所示；一般結(jié)構(gòu)如示意圖4B所示。示例給出的結(jié)構(gòu)是簡單的雌烯或雌烷，但是類別III中也包括如示意圖1所示的其它雌烯，雌烷，雄烯，和雄烷的雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子類似物。
類別III化合物中的雜原子使得可以使用適合固相和液相自動合成的組合方法，從而進行快速合成，參見，Stauffer andKatzenellenbogen，2000b以及其中所引用的文獻。
類別III化合物的合成可以使用上述參考文獻中的方法，以及相關(guān)書刊(Eicher and Hauptmann，1995；Gilchrist，1992；Guptaet al.，1999；Joule et al.，1995)和其所引用的參考文獻中介紹的基本的雜環(huán)合成方法，以及有機合成領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的基本雜原子合成方法。這一類的某些化合物的合成示例如示意圖4C和4D所示。
ANGELS化合物也可以是雜環(huán)雌烯類似物。不同的優(yōu)選雜環(huán)雌烯類似物可以由下式表示，其中R是氫原子或C1-C5烷基；R’和R”分別選自氫原子，C1-C5烷基，三氟甲基，和C1-C5烷基取代的苯基。優(yōu)選的ANGELS化合物示例如下表9所示。

表9 雜環(huán)雌烯類似物

ANGELS化合物還可以是含雜原子的非環(huán)分子雌烯類似物。不同的優(yōu)選含雜原子的非環(huán)分子雌烯類似物可以由下式表示，其中R1選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基，苯基，和C1-C5烷基苯基；R2選自氫原子，C1-C5烷基，三氟甲基；R3選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基，羥基環(huán)烷基，苯基，和C1-C5烷基苯基。優(yōu)選的ANGELS化合物示例如下表10所示。

表10 含雜原子的非環(huán)分子雌烯類似物


類別IV雌烯-3-醇類似物類別IV包括雌烯-3-醇的類似物。例如雌三烯醇類似物。類別IV中優(yōu)選化合物實例如示意圖5A所示，類別IV化合物的一般結(jié)構(gòu)如示意圖5B所示。這些化合物的基本結(jié)構(gòu)優(yōu)選包含一個雌激素樣A環(huán)，即酚，該A環(huán)在C-1，2，3或4位置有羥基，或者包含其它能達到最大功效的結(jié)構(gòu)的組合。
正如示意圖1-4所示的那些雌烯類似物一樣，雌三烯醇也包含B，C，D環(huán)上的不同類似結(jié)構(gòu)，包括能強效果和/或選擇性的取代基(如示意圖2A所述)，去，同，斷，環(huán)類固醇類似物(如示意圖3A和B所述)，以及雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子類似物(如示意圖4A和B所示)。類別IV包含這些類似物。
在合成方面，雌三烯醇與雌激素更為相似，而不是雌烯，它們的合成都可以應(yīng)用上面所述的雌烯合成所使用的一般和特定方法，以及對A環(huán)進行適當(dāng)?shù)男揎椧允勾迫┐季哂邢鄳?yīng)的功能。這樣的修飾對于類固醇合成領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是公知的。類別IV的一些化合物的合成示例見示意圖5C和5D。
包含ANGELS化合物的藥物組合物在一個優(yōu)選實施方案中提供了包含一種或多種ANGELS化合物的藥物組合物，優(yōu)選的是類別I、II、III和/或IV的一種或多種化合物。因此，可給予有效量的ANGELS化合物或者其混合物以增加骨量和/或骨密度和/或骨強度，任選地，該混合物中還包括藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。應(yīng)當(dāng)理解的是，這里所描述的ANGELS化合物的不同給藥方法也適用于包含這些化合物的組合物。
ANGELS化合物可以任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M行全身，區(qū)域或局部遞送，例如，口服，胃腸外，靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，經(jīng)頰，鼻內(nèi)，吸入，陰道，直腸或局部，以液體或固體的形式。這里所描述的化合物給藥方法都是以特定劑量或是控釋載體給予的。
一種優(yōu)選的ANGELS化合物的給藥方式是口服?？诜M合物優(yōu)選包括一種惰性稀釋劑或者一種可食用載體?；钚曰衔锟煞庋b在明膠膠囊中或是壓縮成片劑。為達到治療目的，化合物可與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠囊的形式服用。組合物還可以包括藥學(xué)相容的粘合劑和/或助劑。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以包含下述藥學(xué)可接受的載體，或者具有相似性質(zhì)的化合物一種粘合劑例如微晶纖維素，黃蓍膠或明膠；一種賦形劑例如淀粉或乳糖，一種崩解劑例如褐藻酸，Primogel，或者玉米淀粉；一種潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterotes；一種助流劑例如膠體二氧化硅；一種甜味劑例如蔗糖或糖精；和/或一種調(diào)味劑例如薄荷，甲基水楊酸鹽，或橙調(diào)味料。如果是劑型是膠囊，那么除了上述物質(zhì)還可以包括液態(tài)載體例如脂肪油。除此之外，各種劑型還可以包括各種能夠改變物理形態(tài)的其它物質(zhì)，例如糖衣，蟲膠，或者其它腸內(nèi)吸收劑。
ANGELS化合物也可以作為酏劑，懸液，糖漿，糯米紙囊劑，口膠等的組分進行給藥。糖漿中除了活性化合物之外還可以包含蔗糖作為甜味劑，以及一定的防腐劑，染料和色素和調(diào)味料。
ANGELS化合物還可以和其它不影響其功能或能增進其功能的活性物質(zhì)混合使用，例如一種或幾種其它ANGELS化合物；經(jīng)典的雌激素如17β-雌二醇或乙炔基雌二醇；二膦酸鹽如阿侖膦酸鹽，羥乙膦酸鹽，帕米膦酸鹽，瑞日膦酸鹽，替魯膦酸鹽，佐利膦酸鹽，西馬膦酸鹽，唑侖膦酸鹽，衣班膦酸鹽，歐珀膦酸鹽，neridronate，EB-1053；鮭魚，鰻魚或人降鈣素；以及抗氧化劑如谷胱甘肽，抗壞血酸或亞硫酸氫鈉。藥學(xué)可接受的載體可以是溶液或是懸液，用于胃腸外，靜脈內(nèi)，皮下或局部給藥，因此可以包括下列組分無菌稀釋液例如注射用水，鹽溶液，不揮發(fā)性油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶液；抗菌試劑例如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；鰲合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖液例如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)滲透壓的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。胃腸外給藥可以封裝在安瓿瓶，一次性注射器或用塑料瓶制成的多劑量藥水瓶。如果進行靜脈內(nèi)給藥，優(yōu)選載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS)。
在優(yōu)選實施方案中，ANGELS化合物用能防止化合物在機體內(nèi)迅速排出的載體制備，例如控釋配方，包括植入和微膠囊遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的，生物相容的聚合物，例如乙烯基醋酸乙烯，聚酐，聚羥基乙酸，膠原，聚鄰酯，和聚乳酸。這些配方的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
脂質(zhì)體懸液(包括脂質(zhì)體，其包含的單克隆抗體靶定特定細胞的表面抗原)也是藥學(xué)可接受的載體?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域所熟知的方法來制備脂質(zhì)體，例如，美國專利No.4,522,811中所述。例如，脂質(zhì)體配方可以通過下述步驟制備將適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺，硬脂酰磷脂酰膽堿，arachadoyl磷脂酰膽堿，和/或膽固醇)溶于無機溶劑，然后濃縮，在容器表面留下一薄層干脂質(zhì)。然后將ANGELS化合物或其單磷酸、二磷酸、和/或三磷酸衍生物的水溶液注入容器。然后從容器邊緣人工攪拌游離的脂質(zhì)，使脂質(zhì)團塊散開，形成脂質(zhì)體懸液。
對于胃腸外給藥，ANGELS化合物優(yōu)選與藥學(xué)可接受的注射賦形劑以單位劑量注射(溶液，懸液，乳液)的方式配藥。這樣的賦形劑優(yōu)選是無毒的，無治療作用的。例如水，鹽溶液，林格注射液，葡萄糖注射液，以及5％人血清清蛋白。也可以使用非水性賦形劑例如不揮發(fā)性油和油酸乙酯。也可以使用脂質(zhì)體作為載體。賦形劑還可以包含微量的添加劑例如能夠增強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖液和防腐劑。ANGELS化合物在載體中的濃度優(yōu)選是大約10ng/ml至大約100mg/ml，更優(yōu)選是10μg/ml至大約10mg/ml。
ANGELS化合物在藥物組合物中的濃度應(yīng)根據(jù)該化合物的吸收、失活和排泄速率，以及其它本領(lǐng)域所公知的因素而定。
使用ANGELS化合物及其藥物組合物進行治療的方法本發(fā)明公開的ANGELS化合物(包括含有此化合物的藥物組合物)優(yōu)選用于治療哺乳動物，更優(yōu)選用于治療人。優(yōu)選的治療方法包括首先確定患者需要治療，然后對其施用一種或幾種治療有效量的ANGELS化合物，更優(yōu)選地是一種或幾種類別I，II，III，和/或IV中的化合物。
本發(fā)明的ANGELS化合物可用于維持和/或增加骨量和/或骨密度和/或骨強度。優(yōu)選地，本發(fā)明的ANGLES化合物用于治療低骨量和/或骨密度和/或骨強度的患者，和/或具有低骨量和/或骨密度和/或骨強度危險的患者。確定哺乳動物是否具有低骨量和/或骨密度和/或骨強度的方法是本領(lǐng)域所公知的，包括雙重能量吸收測量法，臨床骨聲測量法，X射線，CAT掃描，以及骨組織切片的組織形態(tài)學(xué)檢查。骨損失的癥狀包括背部疼痛，隨時間增長的身高降低，伴隨著佝僂，以及骨折頻率增加。確定哺乳動物是否具有低骨量和/或骨密度和/或骨強度危險的方法是本領(lǐng)域所公知的，包括不同危險因素例如性別、年齡、種族、家族歷史、抽煙、雌激素或雄性激素缺乏、接觸皮質(zhì)激素，以及慢性酒精中毒的評估。
本發(fā)明的ANGELS化合物還可用于其它方面，例如增加性欲，控制血管收縮障礙，促進血管舒張，減少骨損失，減少情緒波動，降低膽固醇，減少低密度脂蛋白(LDL)，增加高密度脂蛋白(HDL)，減緩動脈硬化，減緩癌癥發(fā)展，減緩心血管疾病發(fā)展，減緩年齡相關(guān)的神經(jīng)退化癥，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，降低癌癥的危險性，降低心血管疾病的危險性，降低中風(fēng)的危險性，降低神經(jīng)退行性疾病的危險性。
本發(fā)明的ANGELS化合物(包括含有此化合物的藥物組合物)優(yōu)選以化合物治療有效量的給藥方案給予哺乳動物。治療有效量是指能有效減緩骨量和/或骨密度和/或骨強度損失速度的量，優(yōu)選是指能有效增加和/或維持骨量和/或骨密度和/或骨強度的量。
優(yōu)選的治療有效量可以在較大范圍內(nèi)變動。給藥劑量和給藥方案應(yīng)根據(jù)患者對治療的需要，例如需要增加骨密度和/或骨強度，以及根據(jù)特定活性ANGELS化合物的特性例如其治療的指標(biāo)，患者，患者病史以及其它本領(lǐng)域公知的因素而定。優(yōu)選地，ANGELS化合物的每日用量應(yīng)參考患者的體重為大約1μg/kg至大約100mg/kg，在適當(dāng)?shù)臈l件下也可以使用略高或略低的劑量。更優(yōu)選的ANGELS化合物每日用量參考患者的體重為大約10g/kg至大約10mg/kg，或者等效的持續(xù)釋放劑量。優(yōu)選的給藥方案包括長期給藥，優(yōu)選地至少1個月，更優(yōu)選地至少3個月。
治療有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過諸如臨床試驗的方法來確定。根據(jù)個體情況不同調(diào)節(jié)用藥量以達到維持和/或增加骨量和/或骨密度和/或骨強度的效果。預(yù)計也可使用持續(xù)釋放劑型和輸液。給藥可以通過口服，吸入，注射，輸液，植入，或其它任何適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> ANGELS化合物可以是單次給藥，或者也可以不定時小劑量給藥?？梢赃M一步理解為，對于任何特定的患者，都應(yīng)根據(jù)個人需要和醫(yī)務(wù)人員的專業(yè)判斷調(diào)整給藥方案，這里給出的濃度范圍只是舉例說明而并非限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明不受任何作用理論限制。下述討論中所給出的ANGELS化合物的作用機制是為了便于理解本發(fā)明，而并非限制本發(fā)明的范圍。
認為雌激素和雄性激素在許多組織和器官中都具有調(diào)控作用，這種調(diào)控作用是通過屬于核受體超家族的高度特異性蛋白的信號傳導(dǎo)實現(xiàn)的，所述核受體分別是雌激素受體(ER)α和β和雄性激素受體(AR)(King and Greene，1984；Quigley et al，1995；Mangelsdorf et al，1995；Kuiper et al，1996；McKenna and O’Malley，2002；Katzenellenbogen et al，1996；Moggs and Orphanides，2001；Hall et al，2001)。但是，這些激素的作用也無法解釋已知的由受體和DNA之間的反式和順式作用所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型。這種作用已被歸于“非染色體相關(guān)的”或“非生殖的”作用(Pietras andSzego，1977；Valverde et al，1999；McEwen and Alves，1999；Toran-Allerand et al，1999；Chen et al，1999；Simoncini et al，2000；Falkenstein et al，2000；Wyckoff et al，2001；Levin，2001)?！胺巧车摹弊饔门c已知的性類固醇對轉(zhuǎn)錄的作用之間的關(guān)系還不為人知。而且，迄今為止，還沒有證據(jù)表明性類固醇的非生殖作用在體內(nèi)是生物學(xué)相關(guān)的。
現(xiàn)已證明雌激素和雄性激素能夠快速激活Src/Shc/ERK信號途徑，從而減少成骨細胞/骨細胞的凋亡(Kousteni et al，2001)。這種作用只需要有其受體的配體結(jié)合域即可，而不像經(jīng)典的受體蛋白生殖作用那樣要通過核上的定位。令人意想不到的是，ER，ER和AR的作用都是類似的，不管配體是雌激素還是雄性激素。而且，這種非生殖效果可以與受體和合成配體的生殖效果分離開來。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)性類固醇可以通過一種與用于維持生殖器官的量和功能的受體作用機制完全不同的機制保護成人骨骼。特別地，本發(fā)明的結(jié)果證明了雌激素或者雄性激素可以通過對MAP激酶的非生殖調(diào)控和下游轉(zhuǎn)錄依賴型和不依賴型事件，對成骨細胞行使抗凋亡作用，對破骨細胞行使促凋亡作用。這種作用并沒有嚴格的配體/受體特異性，這個發(fā)現(xiàn)與性類固醇對雌性和雄性小鼠的骨骼的非生殖作用的等同性一致。本發(fā)明的優(yōu)選化合物，4-雌烯-3α，17β-二醇，能夠?qū)崿F(xiàn)這些非生殖作用，而不影響轉(zhuǎn)錄，在卵巢切除的雌性小鼠中可以將其骨量增加至充足雌激素的骨量之上，在睪丸切除的雄性小鼠中至少效果和DHT一樣，但是無論對于雌性或是雄性都不影響其生殖器官，因此也避免或是減小了使用雌激素或雄性激素帶來的副作用和危險性。這些結(jié)果表明ANGELS化合物代表了一種新的藥物治療方法，是一種骨合成代謝的，不分性別的激素替代療法。數(shù)據(jù)和結(jié)果如圖1-15所示。
圖1證明了胞質(zhì)激酶的非生殖活化作用以及下游轉(zhuǎn)錄依賴型和不依賴型時間對于性類固醇的抗凋亡作用來說是必要的。用報道構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染Hela細胞，在所述報道構(gòu)建體中SRE或AP-1誘導(dǎo)表達分泌型堿性磷酸酶(SEAP)，和野生型ERα(A和B)；或其配體結(jié)合位點(E)，或與膜定位序列(E-Mem)或核定位序列(E-Nuc)融合的E(A)。顯性失活(dn)MEK或dn JnK也轉(zhuǎn)入ERα轉(zhuǎn)染細胞的亞群中。將細胞與賦形劑或所述類固醇(10-8M)接觸15分鐘。然后除去含有類固醇的培養(yǎng)基，將細胞洗滌兩次，繼續(xù)放入不合類固醇的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。六小時后收集上清，測定SEAP活性。在圖1A和1B中，100％表示賦形劑處理的細胞的活性。(C)HeLa細胞用ERα和nEGFP以及所述轉(zhuǎn)錄因子的野生型或dn突變體共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞用10-8M E2處理1小時，然后用依托泊甙(100μM)處理6小時，然后根據(jù)熒光細胞的核形態(tài)檢測凋亡。(D)Hela細胞(上面的條帶)用ERα，一種Bad的非磷酸化dn突變體瞬間共轉(zhuǎn)染。鼠顱頂?shù)某晒羌毎?下面的條帶)用P13K抑制劑，渥曼青霉素預(yù)處理。后面的細胞處理同(C)。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。(E)提出激酶調(diào)節(jié)的性類固醇對基因轉(zhuǎn)錄和凋亡的非生殖調(diào)控模型。
圖2顯示了雌激素對SRE-SEAP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要Src/Shc/ERK信號途徑。Hela細胞用編碼全長ER和wt MEK或dn MEK，wt Src或一種缺乏激酶活性的Src突變體(Src K-)，以及wt Shc或一種磷酸化的初級位點被苯丙氨酸取代的dn Shc突變體(Y239F/Y240F/Y317F(Shc FFF)，Y317F(Shc YYF)或Y239F/Y240F(Shc FFY))的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。Src的激酶活性，Shc在317位酪氨酸的磷酸化，由Src激酶對Shc磷酸化的初級位點都是E2刺激SRE活性所必需的。100％表示賦形劑處理的細胞的活性。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。
圖3表示雌激素對AP-1-SEAP的調(diào)控需要JNK信號途徑。Hela細胞用編碼全長ERα和wt JNK1，dn JNK1，dn MEK，或者dnAP-1的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。100％表示賦形劑處理的細胞的活性。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。
圖4表示通過一種性別非特異的，非生殖的機制對SRE和AP-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄進行的調(diào)控。Hela細胞用AR和SRE-SEAP或AP-1-SEAP報道構(gòu)建體瞬間轉(zhuǎn)染。將細胞與賦形劑或類固醇(10-8M)接觸15分鐘。然后除去含有類固醇的培養(yǎng)基，將細胞洗滌兩次，繼續(xù)放入不含類固醇的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。六小時后收集上清，測定SEAP活性。100％表示賦形劑處理的細胞的活性。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。
圖5表示E2誘導(dǎo)的E1k-1磷酸化是SRE活化所必需的。A.Hela細胞與ERα，以及wt Elk-1或dn Elk-1構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。wt對照(ElkC)是包含多個ERK磷酸化位點的Elk-1的C末端(第307-428位氨基酸)(Marais et al，1993)，和GAL4的DNA結(jié)合位點(GAL4-DBD)的融合蛋白。ElkC活性通過與一個報道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染來檢測，該質(zhì)粒中熒光素酶的轉(zhuǎn)錄受到GLA4結(jié)合位點的調(diào)控(GAL4-luc)。dn Elk-1缺乏Elk-1的DNA結(jié)合位點。在ElkC383/389中，第138位和139位的絲氨酸，ERK的磷酸化靶位點，被丙氨酸取代。在存在ElkC構(gòu)建體時E2可以誘導(dǎo)Elk-1活性，但是存在dn Elk-1或磷酸化失活的ElkC383/389突變體的時候則無法誘導(dǎo)。B.Hela細胞用ERα，SRE-SEAP，ElkC或ElkC383/389構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。在存在ElkC構(gòu)建體時E2可以誘導(dǎo)SRE-SEAP活性，但是存在ElkC383/389的時候則無法誘導(dǎo)。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。
圖6顯示了ER或AR可調(diào)節(jié)性類固醇抗凋亡作用所必需的Elk-1，C/EBPβ，CREB，和JNK1/AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。Hela細胞與ERα(A)或AR(B或C)，以及nEGFP，和所述轉(zhuǎn)錄因子的野生型或dn突變體共轉(zhuǎn)染。細胞用10-8M E2處理1小時，然后用依托泊甙(100M)處理6小時。根據(jù)具有固縮核的轉(zhuǎn)染(熒光)細胞的百分數(shù)確定凋亡的細胞數(shù)量。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。
生殖組織的發(fā)育，生長，核功能的維持大體上在雌性中是依靠雌激素，在雄性中是依靠雄性激素。但是，性類固醇對于非生殖組織的作用的性別特異性卻并不嚴格。例如，雌激素對于防止骨損失，降低膽固醇，或減緩動脈硬化的功效在雌性和雄性中都是一樣的(Manolagas and Kousteni，2001；Khosla et al，1998；Bilezikian et al，1998；Hodgin et al，2001；Croniger et al，2001；Hodgin et al，2002；Lewis et al，2001；Manolagas et al，2002)。相反地，非芳香的雄性激素能夠促進胸部大動脈的舒張(Komesaroff etal，2001)；而且，數(shù)據(jù)顯示，4-雌烯-3，17-二醇在卵巢切除的成年雌性中可以預(yù)防骨損失。
圖7顯示了雌激素和雄性激素對于雌性和雄性小鼠的骨骼的非生殖作用是等同的。成骨細胞(A)分離自初生雌性或雄性小鼠的顱頂，小鼠性別通過將其肝DNA與一個Y染色體特異性cDNA探針進行Southern blot分析確定的；細胞培養(yǎng)如前所述。所述類固醇防止依托泊甙誘導(dǎo)的凋亡的能力如圖1D所示，下面的條帶。(B)破骨細胞取自成年雌性或雄性小鼠的骨髓培養(yǎng)物，然后用賦形劑或所述濃度的類固醇處理24小時并測定凋亡細胞的數(shù)目。從4只雌性小鼠和4只雄性小鼠中分別選出一個最具代表性的結(jié)果。每一個點都代表三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。(C和D)8月齡的Swiss Webster小鼠(每組n＝8-10)進行假手術(shù)，卵巢切除(OVX)或睪丸切除(ORX)。OVX和ORX的動物然后不進行處理或是立即植入含有E2(0.025mg)或DHT(10mg)的60天緩釋藥丸。六個星期后測定BMD和子宮或精囊重量。短豎線s表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，OVX或ORX*p＜0.05。
圖8顯示了性類固醇對破骨細胞的促凋亡作用需要Src/ERK信號途徑。破骨細胞用U012345或PP1預(yù)處理1小時，然后添加E2或DHT。24小時后，測定凋亡的破骨細胞百分數(shù)，結(jié)果如圖7所示。短豎線表示三次實驗值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，賦形劑處理組*p＜0.05，ANOVA。
圖9顯示了雌激素和雄性激素對雌性和雄性小鼠的骨骼作用的等同性。6月齡的Swiss Webster小鼠(每組n＝8-10)進行假手術(shù)，卵巢切除(OVX)，睪丸切除(ORX)，或性腺切除，立即植入含有E2(0.025mg)或DHT(10mg)的60天緩釋藥丸。六個星期后，測定體外骨髓培養(yǎng)物中的脊椎骨部位組織的成骨細胞凋亡(A)，體外骨髓培養(yǎng)物中的成骨細胞生成和破骨細胞生成(B和C)，以及血清骨鈣素濃度(D)。短豎線s表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，OVX或ORX*p＜0.05。
上述結(jié)果為性類固醇對非生殖性組織例如骨骼的作用的不嚴格的特異性提供了一種解釋。特別地，ERα或β或AR可以通過Src/Shc/ERK信號途徑傳導(dǎo)信號，不管配體是雌激素還是雄性激素，其作用都是類似的，這也證明了轉(zhuǎn)錄因子如SRE和AP-1的調(diào)控中的，和激酶下游蛋白如Bad的功能中的配體/受體特異性的可互換性。同樣地，數(shù)據(jù)表明，雌激素和雄性激素對于在體內(nèi)和體外，雌性和雄性中防止骨損失中的骨細胞的存活，其作用都是等同的。雌性和雄性骨細胞中的可互換的配體/受體相互作用是造成雌性和雄性中性類固醇作用等同的原因之一，與這一結(jié)論一致，在同時缺乏ERα和EPβ，或任何這種蛋白變體(DERKO)的小鼠細胞中，E2可以刺激ERK磷酸化，防止成骨細胞凋亡，刺激破骨細胞凋亡(Dupont et al，2000)。在野生型對照中，E2在DERKO細胞中的作用可以被ICI 182780或氟他胺所抑制，(Chen et al，2002)。而且，與AR介導(dǎo)的雌激素的作用相同，DERKO小鼠在OVX后骨骼出現(xiàn)疏松，但是這種現(xiàn)象可以通過給予E2來預(yù)防(Gentile et al，2001)。
圖10顯示了4-雌烯-3α，17β-二醇和E2對小羊子宮細胞溶質(zhì)，人ERα，和人EPβ的相對結(jié)合親和力(RBA)。所述化合物的賦形劑或11倍稀釋液與10nM3H E2和0.3-0.4nM所述蛋白在0℃，在包含50mM Tris，pH8.0，10％甘油，0.01M巰基乙醇和0.3mg/ml卵清蛋白的緩沖液中保溫18-24小時。蛋白被羥基磷石灰(HAP)吸收并洗去游離配體(Carlson et al，1997)。結(jié)果用特異結(jié)合的百分數(shù)表示。4-雌烯-3α，17β-二醇的RBA值在括號中表示，相對于E2(定義為100％)。記號表示兩次獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，其中每一個點都重復(fù)兩次。
圖11顯示了在性腺切除的小鼠中4-雌烯-3α，17β-二醇增加了骨密度。在三個獨立的實驗中，6月齡或8月齡的雌性或6月齡的雄性Swiss Webster小鼠(每組n＝8-10)進行假手術(shù)或性腺切除，立即植入含有E2(0.025mg)，DHT(10mg)或4-雌烯-3α，17β-二醇(7.6mg)的60天緩釋藥丸。8月齡雌性小鼠的實驗中，在4個星期和6個星期后測定全身，脊柱和下肢的BMD，6月齡雌性小鼠和雄性小鼠的試驗中只在6星期后測定(A、B和C)。(B)中雌性小鼠在6星期后測定的BMD數(shù)據(jù)是6月齡和8月齡小鼠的兩組實驗的綜合數(shù)據(jù)。
圖12顯示了圖11(A)的實驗中6月齡和8月齡的雌性和雄性小鼠的L5的壓縮強度。股骨末端縱向未脫鈣的部分見(B)。與接受替換治療劑量(1xERT)的賦形劑或E2的動物相比，接受4-雌烯-3α，17β-二醇的小鼠皮質(zhì)寬度和小梁寬度都有所增加，其用藥量是E2替換治療劑量的300倍(300xERT)。雌性小鼠(8月齡)和雄性小鼠的脊椎骨的L1-L4部分的成骨細胞發(fā)生凋亡(C)。短豎線表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，OVX或ORX*p＜0.05；OVX或ORX，以及OVX+E2**p＜0.05。
圖13顯示了4-雌烯-3α，17β-二醇增加了小梁和皮質(zhì)寬度，成骨細胞數(shù)目和血清骨鈣素。對6月齡雌性小鼠的脊椎骨L1-L4的組織形態(tài)分析(A-F)和6月齡和8月齡的雌性小鼠的總血清骨鈣素水平(G)。短豎線s表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)，OVX或ORX*p＜0.05；OVX或ORX，和OVX+E2**p＜0.05；OVX+E2+p＜0.05。本發(fā)明的ANGELS可用于維持和/或增加哺乳動物的骨量和/或骨密度和/或骨強度。需要施用這種化合物的哺乳動物，優(yōu)選是人，可以具有下述疾病女性骨質(zhì)疏松(絕經(jīng)后)，男性骨質(zhì)疏松，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松，骨骼固定術(shù)和年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松，先天的和青少年骨質(zhì)疏松，移植相關(guān)的骨質(zhì)疏松，以及牙槽嵴骨損失。除此之外，本發(fā)明的化合物特別地可以用于那些不能或不愿進行具有雄性化或雌性化作用的治療的患者。例如，乳腺癌患者(特別是那些促性腺激素減少激素(GnRH)骨轉(zhuǎn)移或卵巢切除的患者)，前列腺癌患者(特別是那些在進行GnRH/去勢治療的患者)，以及不適于用雌激素或雄性激素進行治療的骨髓瘤/淋巴瘤患者，因為其病情如癌癥有復(fù)發(fā)的危險。
圖14證明了4-雌烯-3α，17β-二醇對雌性或雄性的生殖組織或乳腺癌細胞沒有作用。圖11中顯示了雌性和雄性小鼠的子宮(A)或精囊(B)。另一個對8月齡的卵巢切除的小鼠進行的實驗也證實了4-雌烯-3α，17β-二醇對子宮沒有作用。(C)6月齡小鼠的縱向0.3m厚的子宮石蠟切片，用蘇木精染色，見圖11(短豎線為100m)。應(yīng)注意到OVX和OVX+4-雌烯-3α，17β-二醇處理的小鼠的子宮與假手術(shù)和OVX+E2處理的小鼠的子宮相比在形態(tài)上的差異上皮細胞較薄，萎縮，呈圓柱狀；基質(zhì)緊密；腺體數(shù)目減少；柱狀上皮細胞基質(zhì)，子宮內(nèi)膜基質(zhì)，和子宮肌層細胞的核與細胞質(zhì)的比值降低；缺乏有絲分裂活性。(D)MCF-7細胞的增殖通過3H-胸腺嘧啶的攝取來確定。
上述結(jié)果顯示4-雌烯-3α，17β-二醇確實能夠通過ER或AR實現(xiàn)雌激素或雄性激素的非生殖作用，而不影響正常的轉(zhuǎn)錄，而且在雌性中對于BMD和壓縮強度還具有比雌激素更好的效果；在雄性中的效果至少也和DHT相同。性類固醇在骨骼中如何能夠消除生殖作用，而達到更好的效果？現(xiàn)有的結(jié)果表明骨量基本是依靠骨生成和骨吸收之間的平衡，而骨生成和骨吸收又依賴成骨細胞和破骨細胞的壽命，壽命反映了凋亡的時間□而不是依賴骨重建的速度(Manolagas，2000)。雌激素或雄性激素，以及其它抑制骨重建的試劑可以通過填充由增長的骨重建造成的骨生成和骨吸收之間的暫時性間隙而初步達到骨量平衡。但是它們的效果隨時間而減弱，并不能重建正常的骨骼。4-雌烯-3α，17β-二醇引起的成骨細胞數(shù)目的增加以及血清骨鈣素的增加表明此化合物可以促成骨生成和骨吸收之間的平衡，并獲得骨量增加的持續(xù)性效果，因此能夠重建正常骨骼。
與E2或DHT處理的小鼠相比，4-雌烯-3α，17β-二醇處理的小鼠的BMD和強度的增加，可能是通過別的機制，例如成骨細胞生成的上調(diào)，或者促進形成成熟成骨細胞的前體。這種觀點與4-雌烯-3α，17β-二醇能夠活化促骨生長因子所用的幾種轉(zhuǎn)錄因子的效果一致；因此也表明ANGELS化合物一定還有除控制細胞壽命以外的其它生物學(xué)功能。例如，ERα的細胞核外功能對MAP激酶的活化抑制了c-jun的活性，E2激活的ER通過生殖性機制刺激AP-1的活性(Kushner et al，2000)。因此靶細胞對性類固醇的反應(yīng)是由非生殖作用和生殖作用之間的平衡決定的。因此，4-雌烯-3α，17β-二醇對于骨骼的突出效果在分子水平上應(yīng)是由于消除了對AP-1的反調(diào)控效果。根據(jù)這個猜想，c-jun的更強的抑制可以導(dǎo)致Wnt拮抗劑Dickkopf轉(zhuǎn)錄的降低，因此釋放Wnt信號—這是一種有效的骨合成代謝刺激信號(Boyden et al，2002；Grotewold and Ruther，2002)。
本發(fā)明給出的證據(jù)表明ANGELS化合物可以通過ER或AR的非生殖作用選擇性地激活信號傳導(dǎo)途徑中的激酶，但是不會影響這些受體的正常的轉(zhuǎn)錄活性，因此具有獨特的生物學(xué)效果它們將對骨骼的作用與性類固醇的生殖作用分離開來。與此相同，糖皮質(zhì)激素受體的生殖功能和非生殖功能的失活都會引起突變小鼠致死，然而消除這些受體的轉(zhuǎn)錄活性卻不會導(dǎo)致死亡—如果從生和死的字面上理解的話(Reichardt et al，1998)?；谶@種理解，認為ER或AR的機制特異性配體(與組織特異性配體(SERM)或一般的雌激素或雄性激素相對)，以及其它核受體的機制特異性配體，代表了一類新的藥物治療方法。
在生命的生殖后的晚期進行性類固醇替代，是一種基于性類固醇對非生殖組織發(fā)揮作用的治療方法，但是由于對生殖組織的作用導(dǎo)致了它的副作用。研究表明選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)在非生殖組織如骨骼中作為雌激素激動劑，而在生殖組織如子宮和乳腺中作為拮抗劑。由于4-雌烯-3α，17β-二醇對于骨骼具有不分性別的突出效果，并且它對生殖組織沒有作用，機制特異性配體，如4-雌烯-3α，17β-二醇，與雌激素或SERM相比具有優(yōu)良效果，可以替代性類固醇用于治療(Doran et al，2001；Ottet al，2002)。對現(xiàn)有激素替代療法的有效性和安全性的日益增長的關(guān)注(Santoro et al，1999；Herrington et al，2000；Manson andMartin，2001；Mosca et al，2001)使得上述發(fā)現(xiàn)適時地成為骨合成代謝方面的不分性別的激素替代療法。
圖15顯示了4-雌烯-3α，17β-二醇相關(guān)化合物(根據(jù)示意圖1A)的生殖活性與非生殖活性的篩選結(jié)果，下面將會對此進行詳細討論。
實施例骨合成代謝化合物的合成雌烯二醇和雌烷二醇的合成。
各種雌烯二醇，雌烷二醇，雄烯二醇和雄烷二醇在3，5，17位的差向異構(gòu)體的合成如示意圖1C所示。其中大部分化合物都是已知的，可以由文獻中的方法制備而得。
起始物質(zhì)睪酮和19-去睪酮是商業(yè)可獲得的(例如從Steraloids，Inc.，Newprot，Rhode Island獲得)。17β差向異構(gòu)的醇用Mitzunobu方法(Smith and March，2001)轉(zhuǎn)化而得17α差向異構(gòu)的醇。
硼氫化物還原反應(yīng)得到4-雌烯二醇和4-雄烯二醇。通常得到的是3α和3β醇的差向異構(gòu)混合物，但是此混合物可以通過色譜或結(jié)晶分離開。有時使用大量氫化物試劑(例如三-叔丁氧基氫化鋁鈉或二乙基硼氫化鋰)可以對3α和3β差向異構(gòu)的醇具有更好的選擇性效果。
A環(huán)烯酮進行金屬分解還原反應(yīng)，然后進行硼氫化物還原反應(yīng)可以得到各種雌烷二醇和雄烷二醇。
形成3-二烯-17-雙乙酸鹽，然后進行硼氫化物還原反應(yīng)和堿水解反應(yīng)可以得到各種5(6)-雌烯二醇和5(6)-雄烯二醇。
要生成不同的5(10)-雌烯二醇，將雌二醇甲基醚用Mitzunobu方法轉(zhuǎn)化，然后每種差向異構(gòu)體都進行Birch還原反應(yīng)，然后用弱酸如草酸處理(Smith and March，2001)。硼氫化物還原反應(yīng)可以得到不同的5(10)-雌烯二醇。氫化物還原反應(yīng)生成差向異構(gòu)的醇，然后分離立體異構(gòu)體。
環(huán)取代的雌烯二醇和雌烷二醇的合成在17α(系統(tǒng)A)，7α(系統(tǒng)B)和11β(系統(tǒng)C)具有親和力增強的取代基的不同雌烯二醇的合成見示意圖2B。要制備這三類取代雌烯二醇，雌二醇的3-甲基醚衍生物或已知的7α或11β取代雌激素(French et al.，1993b；Pomper et al.，1990)進行Birch還原反應(yīng)，然后用強酸處理(Smith and March，2001)得到相應(yīng)的共軛烯醇。
要制備17α取代的雌烯(系統(tǒng)A)，3-酮首先被選擇保護形成3-二烯醚(Fried and Edwards，1972)以便17-醇可以氧化成酮。然后選擇性地加入三甲硅烷基乙炔化鋰(或者其它適當(dāng)?shù)腉rignard或鋰試劑)生成17β醇。二烯醚然后用弱酸水解，然后3-酮用硼氫化鈉還原得到17α取代的雌烯。
在7取代的雌烯二醇(系統(tǒng)B)或11β取代的雌烯二醇(系統(tǒng)C)的制備中，根據(jù)文獻所述方法制備的起始雌激素衍生物已含有所需取代基。僅通過還原3-酮硼氫化鈉就可以得到所需雌烯二醇。
也可以制備含有7α，11β和17α取代基的不同組合的類似物，方法同制備含有其它取代基的方法。通過氫化物還原反應(yīng)制備差向異構(gòu)醇，然后分離立體異構(gòu)體。任何仲醇位點的立體異構(gòu)體都可以用Mitzunobu方法轉(zhuǎn)化，其中醇用三苯基膦，二異丙基氮二羧酸酯以及苯甲酸鈉處理。得到差向異構(gòu)的苯甲酸鹽，然后在回流乙醇中用K2CO3水解或在二惡烷水溶液中用KOH水解得到差向異構(gòu)的醇。
雄烯二醇和雄烷二醇的合成從睪酮和二氫睪酮合成雄烯二醇和雄烷二醇見示意圖1C，并給出了相應(yīng)雄烯二醇和雄烷二醇的合成方法。
環(huán)取代的雄烯二醇和雄烷二醇的合成許多在17位置具有取代基的雄烯二醇和雄烷二醇都是已知的，其中一部分是商業(yè)可獲得的。
在7位置具有取代基的雄烯二醇和雄烷二醇可以通過使適當(dāng)?shù)腉rignard或有機鋰試劑和6-去氫睪酮17-叔丁基-二甲基硅醚發(fā)生銅催化的1，6-共軛加成反應(yīng)制備。用氟化四丁基銨進行處理，斷開17位的保護基團，然后用與制備相應(yīng)的雌烯二醇和雌烷二醇的同樣的方法將7α取代的睪酮轉(zhuǎn)化為7α取代的雄烯二醇和雄烷二醇。
在11位置具有取代基的雄烯二醇和雄烷二醇可以用已知的1，4-雌烷二亞乙基四胺-3，11，17-三酮制備而得。乙二醇和甲苯亞磺酸處理可以使17-酮發(fā)生選擇性縮酮反應(yīng)。用1當(dāng)量的乙烯基Grignard試劑小心處理此二酮可以對反應(yīng)性更強的C-11酮進行選擇性添加。獲得的11烯丙基醇可以用三乙基硅烷和三氟乙酸處理，進行選擇性脫羥基反應(yīng)，選擇性地得到11β-乙烯基取代的產(chǎn)物。通過硼氫化物還原反應(yīng)可以得到11β-取代的雄烯二醇。加氫反應(yīng)還原X-4的雙鍵，得到11β-取代的雄烷二醇。
由雌烯二醇和雌烷二醇衍生的去類固醇，同類固醇，斷類固醇和環(huán)類固醇的合成由雌烯二醇和雌烷二醇衍生的去類固醇，同類固醇，斷類固醇和環(huán)類固醇的合成見示意圖3C。
將19-去睪酮進行標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)收縮反應(yīng)制備A-去雌烷(系統(tǒng)A)。用甲酸乙酯和氫化鈉處理酮引入2-重氮基，然后通過疊氮磺酰進行重氮基轉(zhuǎn)移反應(yīng)和去甲酰反應(yīng)，生成2-甲酸基酮(Larock，1989；Paquette，1995)。庫爾提斯重排(Smith and March，2001)，就是重氮甲酮的光解(太陽燈透過派熱克斯玻璃進行照射)，得到環(huán)縮小的酸。將此酸用四醋酸鉛處理(Paquette，1995)進行氧化脫羧反應(yīng)，得到所需的環(huán)縮小的去類固醇。
與雌烷(系統(tǒng)B)相關(guān)的高類固醇的合成是這樣的19去睪酮進行環(huán)擴大反應(yīng)C-3甲酮進行亞甲基化反應(yīng)，然后用四氧化鋨進行二羥基化反應(yīng)(Paquette，1995)，得到乙二醇。伯醇與甲苯磺酰氯和嘧啶進行選擇性反應(yīng)生成單甲苯磺酸鹽，然后用甲醇鈉處理，進行四甲基乙二醇區(qū)域選擇性重排(Smith and March，2001)，得到環(huán)擴大的甲酮。再通過硼氫化物還原反應(yīng)得到所需的環(huán)擴大的醇(同類固醇)。
雌烯(系統(tǒng)C)相關(guān)的斷類固醇可以由雌酮3-甲基醚制備而得。將該物質(zhì)用強堿熱解，得到道益氏酸(Chi et al.，1995；Scribneret al.，1997)。使A環(huán)苯基甲基醚進行Birch還原反應(yīng)，然后用強堿處理，得到共軛烯酮醇。再通過簡單的硼氫化物還原反應(yīng)得到所需的雌烯相關(guān)的D環(huán)斷開的斷類固醇。
雌烯類(系統(tǒng)D)的許多環(huán)類固醇的合成都可以通過p-甲氧苯基鋰與環(huán)酮(或環(huán)雙縮酮的單縮酮)的加成反應(yīng)得到?？梢酝ㄟ^硅烷介導(dǎo)的脫羥基反應(yīng)除去(Larock，1989)所產(chǎn)生的苯甲基羥基，或者用一種三烷基鋁和一種強劉易斯酸例如氯化鋁處理，用烷基取代所產(chǎn)生的苯甲基羥基。苯基甲基醚的Birch還原反應(yīng)和酸處理如前所述，然后進行硼氫化物還原反應(yīng)，得到所述的環(huán)類固醇雌烯類似物。由氫化物還原反應(yīng)產(chǎn)生的差向異構(gòu)的醇中分離立體異構(gòu)體。
相應(yīng)于特定去甾族類固醇，與斷類固醇相關(guān)的雌烯二醇類似物的結(jié)構(gòu)如系統(tǒng)E所示(這些結(jié)構(gòu)中的R1，R2和R3是C1-C5烷基)。這些類似物衍生于已知的非甾族雌激素己雌酚和苯雌酚。它們可以由己雌酚和苯雌酚通過一些簡單的反應(yīng)制備而得—己雌酚和苯雌酚中的六元環(huán)是酚，其中任意一個的或者兩個中的酚羥基都可以轉(zhuǎn)化為苯基或者環(huán)己烯醇或者環(huán)己醇。要轉(zhuǎn)化為苯基，一個的或者兩個中的酚羥基先轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的甲基磺酰酯，然后在碳載體上進行鈀催化的加氫作用。要將酚轉(zhuǎn)化為其它兩種環(huán)型(環(huán)己烯醇或環(huán)己醇)，可以進行下列反應(yīng)用甲基碘和碳酸鉀在乙醇中將酚轉(zhuǎn)化為甲基醚。進行Birch還原反應(yīng)(在液態(tài)氨和乙醇中用金屬鋰進行還原)，然后用強酸處理，將苯基甲基醚環(huán)轉(zhuǎn)化為共軛環(huán)己烯酮；在這些條件下具有游離酚的環(huán)不會被還原。環(huán)己烯酮進行硼氫化物還原反應(yīng)，得到相應(yīng)的環(huán)己烯醇。環(huán)己烯醇在碳載體上進行鈀催化的加氫作用得到環(huán)己醇。
用這些方法略加改變就可以得到其它環(huán)(例如B、C、D環(huán))被縮小或擴大或斷開的去類固醇，同類固醇和斷類固醇，以及具有不同大小環(huán)和其它取代基的環(huán)類固醇和非甾族雌烯樣化合物的類似物，這都是有機合成領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。除此之外，催化加氫反應(yīng)可用于制備相應(yīng)的去，同，斷，環(huán)類固醇的雌烷類似物。在合成過程中，需要對一些基團進行保護以防止功能性基團之間的相互作用。
具有雜環(huán)核的雌烯類似物的合成不同具有雜環(huán)核的雌烯類似物的合成示例見示意圖4C。這四種系統(tǒng)的合成詳述如下。
嘧啶雌烯類似物(系統(tǒng)A)通過將由腈制備而得的脒與1，3-二酮系統(tǒng)縮合而成。1，3-環(huán)己二烯(Aldrich)用1當(dāng)量的m-氯代過氧型苯甲酸(m-CPBA)在二氯甲烷中室溫處理1小時轉(zhuǎn)化成單環(huán)氧化物。單環(huán)氧化物用1當(dāng)量的二乙基氰化鋁在二氯甲烷中在-78到25℃處理3小時，加入SN2’生成氰基環(huán)己烯。將此腈用10倍過量的溶于THF的六甲基硅烷氨基化鋰處理，然后用30倍過量的TMS-Cl處理，生成相應(yīng)的過硅烷酰胺，這是縮合反應(yīng)所需要的第一個組分。1，3-二酮組分是由適當(dāng)?shù)?，3-二酮，例如2，4-戊二酮(R’，R”＝Me)(Aldrich)制備而得的。相應(yīng)的烯醇化物，由1當(dāng)量的溶于THF的NaH制備而得，用1當(dāng)量的醛例如丙醛，異丁醛，或苯甲醛處理，生成醛醇加成產(chǎn)物。其它1，3-二酮的前體都是商業(yè)可獲得的(Aldrich)或者可以通過酯和烯醇化酯之間的Claisen縮合反應(yīng)，然后用堿水解(5N KOH在MeOH中室溫反應(yīng)6小時)產(chǎn)生，上述酯和烯醇化酯可以由同一種酯而來(對稱的)，也可以由不同的酯而來(不對稱的)?？梢杂忙?酮酸脫羧基產(chǎn)生1，3-二酮。通過用等當(dāng)量的過硅烷酰胺和1，3-二酮在0.3當(dāng)量的溶于THF的氯化銨中回流處理10小時得到嘧啶。
噻吩類似物(系統(tǒng)B)通過3，4-雙取代噻吩進行雙金屬加成反應(yīng)制備而得。3，4-二烷基-噻吩是商業(yè)可獲得的，也可以由腈耦合反應(yīng)等一系列反應(yīng)制備而得。一種腈(對稱的)或兩種不同的腈(不對稱的)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的陰離子形式(2當(dāng)量的NaH，THF，35℃，1小時)，然后用0.5當(dāng)量的I2在0℃處理。對于不對稱的耦合，從兩種對稱雙腈中分離出混合雙腈。雙腈用6倍過量的二異丁基氫化鋁在甲苯中在-78℃處理6小時，還原為雙醛。將雙醛在二氯甲烷中于過量H2S和無水HCl室溫接觸6小時，產(chǎn)生相應(yīng)的3，4-雙取代噻吩。2位和5位的取代基通過兩次金屬加成反應(yīng)引入。將雙取代噻吩用1.5當(dāng)量的n-丁基鋰在THF中在-30℃處理1小時，再加入1當(dāng)量的溴化亞銅二甲亞砜復(fù)合物，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銅酸鹽，然后用過量的1，3-環(huán)己二烯的單環(huán)氧化物(參見上述系統(tǒng)A)處理，生成三元取代噻吩。然后用適當(dāng)?shù)娜┐姝h(huán)氧化物，而并不將噻吩鋰轉(zhuǎn)化為銅酸鹽，最后生成四元取代的噻吩。
吡咯雌烯類似物(系統(tǒng)C)通過適當(dāng)?shù)牧u基環(huán)己基肼和1，3-二酮的縮合反應(yīng)制備而得。肼組分是通過將等當(dāng)量的肼和1，3-環(huán)己二烯的單環(huán)氧化物(參見系統(tǒng)A)在乙醇中在50℃反應(yīng)1小時制備而得。1，3-二酮組分以下列方法制備用系統(tǒng)A中所述的方法制備1，3-二酮，該1，3-二酮也可以用標(biāo)準(zhǔn)的烯醇化烷基化方法(用1當(dāng)量的溶于THF的NaH處理，然后用過量的烷基化試劑處理)在位置進行烷基取代，然后將1，3-二酮轉(zhuǎn)化為二價陰離子(用當(dāng)量的溶于THF的NaH在室溫處理，然后用1當(dāng)量的BuLi在-20℃處理)，然后用1當(dāng)量的MoOPH(五氧化鉬嘧啶六甲基磷酸化三酰胺)在-20至25℃處理1小時，得到羥基-1，3-二酮。肼組分和1，3-二酮組分混合，然后在乙醇中保溫(25到60℃)12小時生成吡唑。
吡啶雌烯化合物(系統(tǒng)D)通過4-羥基-哌啶(Aldrich)和2-氯吡啶前體反應(yīng)而得。氯吡啶通過下列反應(yīng)制備而得1，4-二酮是商業(yè)可獲得的，或者也可以通過甲基烯醇化酮和0.5當(dāng)量的碘反應(yīng)制得，然后用過量的氰化鈉和氯化銨處理(丙醇回流12小時)，得到羥基吡啶中間體，然后用磷酰氯在1，2-二氯乙烷中處理(回流，2h)得到氯吡啶。將氯吡啶用4-羥基哌啶處理(1，2-二甲氧基乙烷，回流，1h)，得到氨基吡啶加合物。化合物上的羥基做為苯甲酸鹽(過量苯甲酰氯和甲苯，2N Na2CO3水溶液)被保護起來，然后用1.5當(dāng)量的Br2和0.2當(dāng)量的ZnBr2進行溴化處理。保護的溴吡啶與有機鋅試劑(Rieke Zn，THF，0-25℃)接觸，然后用過量醛處理。此加合物然后進行皂化處理(用2N NaOH在1∶1的二氧己環(huán)-水中)得到所需的吡啶產(chǎn)物。
有機合成領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述方法預(yù)見到合成其它配體核被替換為雜環(huán)的雌烯類似物，例如吡嗪和噠嗪以及示意圖4A所示的相關(guān)系統(tǒng)的方法。除此之外，可以用催化加氫反應(yīng)制備相應(yīng)的雜環(huán)核的雌烷類似物。
含雜原子的非環(huán)分子核雌烯類似物的合成三種不同的含雜原子的非環(huán)分子核雌烯類似物的合成示例如示意圖4D所示。所示的三種含雜原子的非環(huán)分子核雌烯類似物是通過氨基或脲形成反應(yīng)制備的。
三氟甲基取代的胺(系統(tǒng)A)是由三個組分制備的。三氟甲基酮組分是由一種甲氧基乙氧基甲基(MEM)醚保護的4-羥基環(huán)己烷甲醛加入三氟甲烷陰離子(通過四丁基氟化銨對三氟甲基三甲硅烷的原位作用實現(xiàn))制備得到。獲得的三氟甲基甲醇用Dess-Martin periodinane氧化，然后用MEM醚分解得到所需的三氟甲基酮。環(huán)己烷羧酸的制備是通過普通的甲酯基環(huán)己烯酮(由Robinson環(huán)形結(jié)構(gòu)制備得)氫化得環(huán)己酮，然后用NaBH4選擇性還原為環(huán)己醇。然后水解得到所需的酸。所需的酰胺的制備首先是通過在三氟甲基酮和環(huán)己基胺(Aldrich)之間進行還原性氨基化反應(yīng)，其中所產(chǎn)生的相應(yīng)亞胺被氰基硼氫化鈉還原。用碳二亞胺試劑(二環(huán)己基碳二亞胺，DCC)將獲得的仲胺然后和先前制備的環(huán)己烷羧酸耦合，得到所需的酰胺。
要制備三氟甲基取代的脲化合物(系統(tǒng)B)，先前制備的仲胺首先用羰基二咪唑活化，然后用4-羥基哌啶處理，得到所需的脲。
最終的胺(系統(tǒng)C)是通過復(fù)合苯胺(由苯胺對酮進行還原性氨基化而得，如系統(tǒng)A中所述)和環(huán)己烷羧酸(其制備方法在系統(tǒng)A中已有描述)的DCC耦合制得的。
有機合成領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述方法預(yù)見到合成其它含雜原子的非環(huán)分子核的雌烯類似物?？梢杂么呋託浞磻?yīng)制備相應(yīng)的含雜原子的非環(huán)分子核的雌烷類似物。在合成過程中，需要對一些基團進行保護以防治功能性基團之間的相互作用。
具有碳環(huán)核的雌三烯醇的合成具有碳環(huán)核的不同雌三烯醇的合成示例見示意圖5C。
雌二醇的不同的A環(huán)酚異構(gòu)體都是已知的，可以通過17-羥基的脫羥基作用，然后對16-脫水-類固醇進行加氫，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的碳環(huán)形雌三烯醇(系統(tǒng)A)。
具有碳環(huán)形核的斷雌三烯醇(系統(tǒng)B)可以用前面示意圖3C中系統(tǒng)C的同樣的方法以及相關(guān)方法，通過環(huán)的斷裂制備而得。這里所舉的例子使用的是商業(yè)可獲得的6-脫水雌二醇。B環(huán)用臭氧分解斷開(要小心不要過氧化以致影響A環(huán)酚)，然后用二甲亞砜處理臭氧化物，進行溫和的還原反應(yīng)。獲得的二醛通過使用肼和濃縮KOH進行雙Wolff-Kishner還原反應(yīng)，或者通過Cagliotti反應(yīng)(將醛轉(zhuǎn)化為甲苯磺酰腙，然后再用氰基硼氫化鈉還原)轉(zhuǎn)化為二甲基類似物。通過脫水和催化加氫作用除去17-羥基，如系統(tǒng)A的合成一樣。
環(huán)擴大(去雌三烯醇，系統(tǒng)C)和環(huán)縮小(同雌三烯醇，系統(tǒng)C)可以用示意圖3C(分別是系統(tǒng)A和系統(tǒng)B)中所描述的同樣的方法制得。
具有雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子核的雌三烯醇的合成不同的具有雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子核得雌三烯醇的合成示例見示意圖5D。
雜環(huán)雌三烯醇可以用標(biāo)準(zhǔn)的雜環(huán)合成方法制備(Gilchrist，1992；Gupta et al.，1999；Joule et al.，1995；Eicher and Hauptmann，1995)。對于具有嘧啶核的雌三烯醇(系統(tǒng)A)，可以使用前面在示意圖4C(系統(tǒng)A)中給出的方法。特別地，適當(dāng)?shù)碾?或者高甲硅烷脒)要和適當(dāng)?shù)?，3-二酮進行縮合。
噻吩核的雌三烯醇(系統(tǒng)B)用3，4-雙取代噻吩制備(見示意圖4C，系統(tǒng)B)。此噻吩用1當(dāng)量丁基鋰進行金屬化，轉(zhuǎn)化為氯化鋅衍生物(1當(dāng)量無水ZnCl2)，然后在鈀催化的Negishi反應(yīng)中和對碘苯酚耦合。三元取代的噻吩用醛進行親電子加成取代，用劉易斯酸如SnCl4進行催化，得到最終的噻吩核的雌三烯醇。
含雜原子的非環(huán)分子核的雌三烯醇(系統(tǒng)C)可以用如示意圖4D所示的方法制備。胺(如示意圖4D，系統(tǒng)A那樣制備)與對羥基苯甲酸縮合得到酰胺。有機合成領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述方法預(yù)見到合成其它雜環(huán)核和含雜原子的非環(huán)分子核的雌三烯醇類似物(尤其是示意圖4A，4C和4D所示的雜環(huán)和含雜原子的非環(huán)分子雌烯的雌三烯醇類似物)。
通過使用骨合成代謝化合物提高骨量，骨密度和/或骨強度的方法優(yōu)選的ANGELS化合物是骨合成代謝化合物。ERK和JNK激酶的活化分別導(dǎo)致血清反應(yīng)元件(SRE)和AP-1依賴型轉(zhuǎn)錄(Hill and Treisman，1995；Treisman，1996)。根據(jù)這個證據(jù)和以前的發(fā)現(xiàn)17β一雌二醇(E2)，DHT，以及一些未確定的雌烯，但是不包括吡唑(Mortensen et al，2001；Sun et al，1999)，可以以一種非生殖的方式激活ERK，本發(fā)明研究了這些配體對胞質(zhì)激酶下游的SRE-或AP-1-依賴型轉(zhuǎn)錄的作用。Hela細胞與E2接觸短短5分鐘就足以刺激SRE-并下調(diào)AP-1-依賴性轉(zhuǎn)錄活性(圖1A)。而且，正如E2對成骨細胞和破骨細胞的抗凋亡作用一樣，E2誘導(dǎo)的SRE活化被dn MEK，負責(zé)ERK磷酸化的激酶所阻礙。同樣地，E2對SRE的作用被dn Src或Sch突變體消除(圖2)。E2對AP-1-SEAP活性的下調(diào)作用被dn JNK1突變體破壞(圖1A)。dn MEK或dn AP-1沒有這些作用，但是它們能降低基礎(chǔ)AP-1-SEAP活性(圖3)。這些結(jié)果說明E2對SRE-和AP-1-活性的調(diào)節(jié)分別是基于對Src/Shc/ERK信號途徑和JNK途徑的活化。在用全長ER轉(zhuǎn)染的Hela細胞中獲得的結(jié)果和用僅包括配體結(jié)合域(E)的突變體轉(zhuǎn)染的細胞中獲得的結(jié)果是相同的(圖1A)。與Src/Shc/ERK信號傳導(dǎo)途徑的活化和抗凋亡作用一致，E域定位于質(zhì)膜(E-Mem)，而不是核(E-Nuc)，E域?qū)RE和AP-1都具有激素的作用，證明了受體/DNA之間直接的相互作用對于E2對SRE-和AP-1-活性的調(diào)控作用不是必需的；這種作用需要受體蛋白在細胞核外定位。在用DHT或4-雌烯-3α，17β-二醇處理的ER轉(zhuǎn)染的Hela細胞也證實了SRE的激活和AP-1的下調(diào)，但是在吡唑處理的細胞中沒有發(fā)現(xiàn)這些作用，這表明ER依賴的SRE和AP-1調(diào)控是通過受體作用的非生殖機制發(fā)生的(圖1B)。重要的是，用空載體而不是ER轉(zhuǎn)染的Hela細胞，并沒有表現(xiàn)出E2的作用，表明這種現(xiàn)象是ER依賴型的(數(shù)據(jù)沒有顯示)。雖然，用ER轉(zhuǎn)染的Hela細胞獲得的結(jié)果和用AR轉(zhuǎn)染的Hela細胞獲得的結(jié)果類似(圖4)，表明ER或AR依賴型的SRE和AP-1調(diào)控是基于可互換的性類固醇/受體之間的相互作用，也就是說E2可以通過AR作用，DHT可以通過ER作用。
Elk-1，C/EBPβ和CREB都是可以被ERK激活的轉(zhuǎn)錄因子(Cruzalegui et al，1999；Buck et al，1999；Bonni et al，1999)。對一般的特別是這些因子的轉(zhuǎn)錄是否參與SRE的活化和雌激素的抗凋亡效果進行了研究。RNA合成抑制劑放射菌素D或者蛋白合成抑制劑環(huán)四氮六甲圜，分別可以抑制3H-尿苷或3H-亮氨酸的結(jié)合，又不影響細胞的存活，它們可以消除E2對于依托泊甙誘導(dǎo)的小鼠顱頂成骨細胞凋亡的保護作用(數(shù)據(jù)未顯示)。更進一步地，E2通過ER致活的Elk-1發(fā)揮作用，Elk-1對于激素刺激SRE SEAP活性來說是必需的(圖5)。而且，dn Elk-1的過表達或者MAPK-致活的失活Elk-1突變體消除了E2的抗凋亡效果，但是野生型卻不能，這和放射菌素D的效果一樣，表明轉(zhuǎn)錄對于抗凋亡來說是必需的(圖1C)。E2對于凋亡的保護性作用也會被C/EBPβ或CREB的dn突變體消除。E2的抗凋亡作用還可以被JNK1或AP-1的dn構(gòu)建體消除，但是不能被活性JNK1，這和E2下調(diào)AP-1-SEAP活性的結(jié)果一致。dn型不參與E2的作用，表明其只需要AP-1的c-jun組分。dn Elk-1，C/EBPβ，CREB，JNK1和AP-1也會消除E2或DHT在AR轉(zhuǎn)染的HeLa細胞中的保護性作用，以及消除DHT在AR或ER轉(zhuǎn)染的細胞中的保護性作用(圖6)。已證明dn Elk-1，C/EBPβ，CREB，JNK1和AP-1的作用是通過表達內(nèi)源ERα和β，但不表達AR的骨MLO-Y4細胞而證實的(數(shù)據(jù)未顯示)。
與Elk-1的結(jié)果一致，ERK介導(dǎo)的E2對SRE活性的刺激也已在其它細胞類型中被證明(Duan et al，2001；De Jager et al，2001；Song et al，2002)，表明某些“非生殖”作用可以導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的變化。
激酶不僅通過改變基因轉(zhuǎn)錄，而且還不依賴于轉(zhuǎn)錄變化地改變蛋白功能活性來調(diào)節(jié)細胞生存(Bonni et al，1999；Scheid andDuronio，1998)。而且，有證據(jù)表明ERK或P13K都能誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bad的磷酸化使其失活(Yang et al，1995；Scheid et al，1999；Peruzzi et al，1999；Lizcano et al，2000)。對雌激素或4-雌烯-3α，17β-二醇的抗凋亡作用是否需要Bad上的這兩個信號途徑進行了研究。發(fā)現(xiàn)Bad的磷酸化和失活對雌激素或4-雌烯-3α，17β-二醇的抗凋亡作用不是必需的(圖1D)，表達dn Bad突變體的Hela細胞不能被磷酸化，它也不能對這兩個配體做出反應(yīng)。而且，渥曼青霉素，一種P13K抑制劑也可以減弱雌激素或4-雌烯-3α，17β-二醇的抗凋亡作用，而SB203580，一種p38抑制劑卻不能(圖1D)。在一些我們并未公布的研究中，也證明了PD98059，一種ERK抑制劑，或渥曼青霉素都可以破壞E2誘導(dǎo)的Bad的磷酸化(Kousteni et al，2002)。性類固醇的抗凋亡作用所需要的始于激酶的信號傳導(dǎo)途徑和其下游效應(yīng)子圖示于圖1E所示的模型中。
接下來要研究非生殖信號是否對除成骨細胞以外的其它骨細胞起作用，以及它們對骨細胞存活的作用是否是性非特異的。為此比較了E2，DHT，4-雌烯-3α，17β-二醇和吡唑?qū)碜源菩院托坌允蟮墓羌毎械某晒羌毎推乒羌毎淖饔?。發(fā)現(xiàn)E2，DHT或4-雌烯-3α，17β-二醇可以以劑量依賴的方式減弱成骨細胞初級培養(yǎng)物中的依托泊甙誘導(dǎo)的凋亡，但是吡唑沒有此作用。但是比較來自雌性或雄性的細胞制備物的時候，卻沒有發(fā)現(xiàn)E2，DHT或4-雌烯-3α，17β-二醇對它們的作用有什么不同(圖7A)。與它們對成骨細胞的作用完全相反，E2，DHT或4-雌烯-3α，17β-二醇以3倍劑量依賴的方式刺激破骨細胞的凋亡(不管培養(yǎng)基中是否存在基質(zhì)細胞/成骨細胞)，但是吡唑卻沒有此作用。而且E2，DHT或4-雌烯-3α，17β-二醇的這種作用對來自雌性或雄性的細胞也沒有什么不同(圖7B)。E2或DHT對成骨細胞或破骨細胞的壽命的作用被ER拮抗劑ICI182780或AR拮抗劑氟他胺抑制；在ER或AR轉(zhuǎn)染的Hela細胞中也觀察到同樣的現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未顯示)。在將破骨細胞和E2或DHT接觸之前分別用U012345或PP1，ERK和Src磷酸化的特異性抑制劑預(yù)處理1小時，可以破壞性類固醇和4-雌烯-3α，17β-二醇的促凋亡作用(圖8)。這個發(fā)現(xiàn)表明正如類固醇和4-雌烯-3α，17β-二醇對成骨細胞的抗凋亡作用一樣，它們對于破骨細胞的促凋亡作用也需要Src/ERK信號傳導(dǎo)途徑的活化。
由于雌激素和雄性激素在體外對于鼠成骨細胞具有抗凋亡作用，對于來自雌性和雄性的破骨細胞具有促凋亡作用，可互換的配體/受體相互作用可以調(diào)節(jié)ERK的活化，在性類固醇缺乏的小鼠中比較了E2和DHT對骨骼作用的性特異性。在這個研究中，成熟的Swiss Webster小鼠(8月齡)，每組n＝8-10，進行假手術(shù)或性腺切除(GNDX)。GNDX動物不進行處理，或者用含有E2或DHT的緩釋藥丸處理，用藥量以能夠維持性腺切除的雌性或雄性的子宮或精囊重量的最小劑量為準(zhǔn)。四個和/或六個星期后，測定脊椎骨的組織部分的成骨細胞凋亡，骨礦物質(zhì)密度(BMD)，體外骨髓培養(yǎng)物的成骨細胞生成和破骨細胞生成，血清骨鈣素，和子宮或精囊重量。卵巢切除(OVX)或睪丸切除(ORX)促進了成骨細胞的凋亡(圖7C和圖7D)，引起B(yǎng)MD損失(圖7F)。同樣地，性腺切除上調(diào)成骨細胞生成和破骨細胞生成(圖9)。不管小鼠性別如何，用E2或DHT都可以有效地阻止這些變化。與E2和DHT在骨骼作用上的等同性相反，對ORX雄性小鼠施用E2不能維持精囊重量(圖7F)；但是，對OVX雌性小鼠施用DHT可以維持子宮重量(圖7E)，可能是因為DHT的用藥量是E2的300倍。先前在小鼠中也證實過大劑量的DHT有子宮營養(yǎng)作用(Tobias et al，1994)。
已證明在體外4-雌烯-3α，17β-二醇選擇性地激活ER或AR的非生殖功能，而不影響正常的轉(zhuǎn)錄，在OVX或ORX的SwissWebster小鼠中把此化合物在體內(nèi)對骨骼和生殖組織的作用與E2或DHT進行比較。特別地，4-雌烯-3α，17β-二醇的用藥量為每60天緩釋藥丸中含7.6mg，與E2或DHT的效果相比較。在實驗中4-雌烯-3α，17β-二醇的用藥量是E2的300倍，這是由于4-雌烯-3α，17β-二醇與ER的結(jié)合能力較低(圖10)。4-雌烯-3α，17β-二醇對體重沒有影響。令人驚奇地，4-雌烯-3α，17β-二醇對雌性鼠全身和脊椎骨BMD的效果即使不比雌二醇好，其效果也與之相同(見試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析)。更令人驚奇的是，施用4-雌烯-3α，17β-二醇的OVX小鼠的下肢BMD有較大變化，不僅是與施用E2的OVX小鼠相比，而且與雌激素充足的對照組相比也是這樣，表明其在皮質(zhì)骨中具有合成代謝效果，也就是說，可以增加新的骨骼(圖11A和B)。4-雌烯-3α，17β-二醇對ORX小鼠至少也與DHT等效，ORX+4-雌烯-3α，17β-二醇組的脊椎骨BMD值顯著高于未受處理的ORX組，而ORX+DHT組沒有此效果(圖11C)。4-雌烯-3α，17β-二醇在脊椎骨中的作用至少也與雌二醇相同，同樣地，4-雌烯-3α，17β-二醇處理的小鼠的脊椎骨的骨骼壓縮強度也比施用E2的小鼠高。不過在雄性小鼠中，4-雌烯-3α，17β-二醇與DHT是等效的(圖12A)。重要的是，E2的藥理劑量(對小鼠來說是100×替換治療劑量)會引起不希望的封閉骨髓腔的作用，與之相反，4-雌烯-3α，17β-二醇對骨髓腔沒有不良效果(圖12B)。與體外實驗一樣，4-雌烯-3α，17β-二醇在性腺切除的雌性或雄性鼠中能防止腰椎的成骨細胞和骨細胞凋亡(圖12C)。
為了闡明能解釋4-雌烯-3α，17β-二醇與E2對骨骼不同作用的細胞機制，對末梢股骨的干骨后端和腰椎(L1-L4)都進行了組織形態(tài)學(xué)分析。在卵巢切除的小鼠中，股骨中某些網(wǎng)狀組織的組織形態(tài)的可變性很強，致使無法進行分析(結(jié)果未顯示)。相反地，4腰椎包含的網(wǎng)狀組織有末梢股骨干骨后端的八倍之多，而且其可變性較低。與E2處理的OVX小鼠相比，施用4-雌烯-3α，17β-二醇的小鼠具有顯著增大的皮質(zhì)寬度和小梁寬度，分別增大了27.8％和33.9％(圖13A和B)。最令人驚奇的是，4-雌烯-3α，17β-二醇處理的小鼠骨小梁上成骨細胞的數(shù)目顯著大于(319％)E2處理組(圖13C)；由成骨細胞生成的非礦化網(wǎng)狀骨質(zhì)(骨周長)也增加了270％(圖13D)。與OVX組相比，骨形成速度(圖13E)和破骨細胞數(shù)目(圖13F)都受到E2或4-雌烯-3α，17β-二醇的抑制。這些發(fā)現(xiàn)充分證明了在骨周期中E2替換治療劑量能抑制卵巢切除誘導(dǎo)的增長，與BMD的結(jié)果一致。最后，與4-雌烯-3α，17β-二醇處理的小鼠中BMD和較高的成骨細胞數(shù)目的結(jié)果一致，在兩次獨立的實驗中，血清骨鈣素—一個成骨細胞數(shù)目的生化指標(biāo)□都顯著高于OVX+E2組和雌激素充足的對照組(圖13G)。
最突出的是，不像E2和DHT，4-雌烯-3α，17β-二醇對性腺切除的小鼠的子宮或精囊重量沒有影響(圖1 4A和B)。對子宮的組織分析也證明了4-雌烯-3α，17β-二醇對生殖組織沒有影響(圖14C)。不像E2和吡唑，4-雌烯-3α，17β-二醇也不刺激MCF-7細胞增殖(圖14D)。這三個配體中的任何一個都不影響ER陰性的MDA-MB-2321細胞的增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。
一種快速檢測化合物的ANGELS活性的系統(tǒng)見圖15。圖15A顯示了競爭放射性結(jié)合檢測結(jié)果，確定了4-雌烯-3α，17β-二醇相關(guān)的十種化合物與雌激素受體α(ER)和雌激素受體β(ER)的親和力(Carlson，et a1.，1997)。親和力表示為相對結(jié)合親和力(RBA)值，其值是相對于標(biāo)準(zhǔn)雌二醇結(jié)合親和力的百分比(雌二醇的RBA是100)。對于圖15A中的化合物，只有1，5，9和10號化合物對于ER或ER有足夠的親和力，即對任何一種受體的RBA值都大于0.1；另外6種化合物的RBA值都小于0.1。
同樣的這十種化合物還用濃度為10-8M的報道基因檢測(Kousteni et al.，2001)檢測了其生殖活性(圖15B)。(圖15B，上面的條帶)。該檢測證明有5種化合物(1，5，6，9和10)都具有足夠的生殖學(xué)活性，也就是說，它們可以激活報道基因，使其達到比賦形劑對照組(Veh)和4-雌烯-3α，17β-二醇(4-ED)更高的水平，某些化合物(1，9和10)可以接近雌二醇(E2)的水平。因此，這些化合物不是ANGELS化合物，因為它們的生殖學(xué)活性較高。有5種化合物(2，3，4，7，8)在報道基因檢測中只表現(xiàn)出很少或者沒有表現(xiàn)出活性，它們進一步用劑量反應(yīng)檢測進行抗凋亡活性檢測(圖15B，lower panel)。所有這5種化合物都具有抑制依托泊甙誘導(dǎo)的凋亡的效果(Kousteni et al.，2001)，認為是ANGELS化合物。
實驗步驟質(zhì)粒SRE-和AP-1-SEAP構(gòu)自Clontech Laboratories(PaloAlto，CA)。ElkC和ElkC和dn Elk-1得自S.Safe，Texas A&M大學(xué)(Duan et al，2001)。GAL4-luc得自M.Karin，University ofCalifornia，San Diego(Tian and Karin，1999)。人ERα配體結(jié)合域(E)，E-Mem和E-Nuc突變體以及wt Src的cDNA和SrcK295M(Src K-)，野生型(wt)或Shc突變株以及dn MEK的構(gòu)建如文獻所述(Kousteni et al，2001)。JNK1和dn JNK1得自R.J.Davis，University of Massachusetts(Whitmarsh et al，2001)。112，136和155位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?AAA)的BAD突變體由X-MZhou(Apoptosis Technology，Inc.Cambridge，MA)提供(Zhou et al，2000)。Dn CREB和dn C/EBP由C.Vinson(National CancerInstitute，National Institutes of Health，Bethesda，MD)提供(Ahn etal，1998)。Dn AP-1(TAM67)由T.Chambers(University of Arkansasfor Medical Sciences，Little Rock，AR)提供(Brown et al，1994)。
瞬時轉(zhuǎn)染和報道基因檢測Hela細胞用LipofectaminePlus(Life Technologies Inc.)轉(zhuǎn)染。報道基因檢測(熒光素酶或分泌型堿性磷酸酶SEAP)中，血清饑餓型細胞用類固醇處理15分鐘，然后除去含有類固醇的培養(yǎng)基，用溶于PBS的1％BSA漂洗細胞兩次，然后加入新鮮的無類固醇的培養(yǎng)基。6小時后分別用Great EscAPe SEAP化學(xué)發(fā)光試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)或雙熒光素酶試劑盒(Promega，Madison，WI)根據(jù)說明書進行SEAP或熒光素酶檢測。報道基因活性都根據(jù)renilla熒光素酶活性進行歸一化。
MCF-7細胞增殖檢測MCF-7細胞是血清饑餓型的，在含有10-8M ICI 182780的培養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時，然后更換為含有載體或10-12-10-7M所述類固醇的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時。通過測量3H胸苷攝取檢測增殖(Bellido et al，1997)。
體外檢測凋亡細胞的數(shù)量Hela細胞或顱頂成骨細胞的凋亡分別通過直接觀察核形態(tài)變化或臺盼藍染色確定(Kousteni et al，2001)。用30ng/ml M-CSF和30ng/ml可溶RNAK配體培養(yǎng)的骨髓細胞中破骨細胞的凋亡通過測量caspase 3活性來確定(Weinstein et al，2002)。
骨骼的骨密度測量，組織形態(tài)測量，成骨細胞凋亡，脊椎壓縮強度測試，以及骨鈣素測量活小鼠的骨礦物質(zhì)密度(BMD)用DEXA測量，靜態(tài)或動態(tài)組織形態(tài)分析和成骨細胞凋亡用未脫鈣的骨骼部分通過原位nick-end標(biāo)記(ISEL)進行測量(Weinsteinet al，2002)。骨骼壓縮強度用單柱體材料測試機器和一個校準(zhǔn)拉力/壓力負載細胞和Merlin IX分析軟件(Model 5542，InstronCorp.，Canton，MA)進行測量。將第五節(jié)腰椎骨周圍的軟組織清除干凈，然后用薄紗布包起來，浸在37℃±0.5℃的生理鹽水中，測定其細胞死亡的天數(shù)(Weinstein，2000)。骨骼的長度，寬度和高度用0.01mm分辨率的數(shù)字測徑器(Mitutoyo#500-196，AceTools，F(xiàn)t.Smith，AR)測量。交叉部分假定為橢圓形，用公式A＝0.25π(寬)(高)來計算。關(guān)節(jié)和多刺的突起部分可能會干擾壓強測試，用虹膜剪刀剪去。將脊椎骨預(yù)置于小于0.5牛頓的負荷后，用螺旋調(diào)節(jié)的壓盤加壓，使用的是較小的微球形的壓盤以將由于樣品的不規(guī)則端部造成的剪切力減到最小。當(dāng)負載沿著caudocephald軸以0.5mm/min的速度移動直至斷裂時獲得最佳測量位置。記錄下最大的負載和最大的位移，通過壓強測量和骨骼大小計算出最終的強度或壓力。血清骨鈣素濃度通過放射性免疫檢測(Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，MA)確定(Jilka etal，1998)。
成骨細胞和破骨細胞前體的測定來自鼠股骨髓細胞的成骨細胞和破骨細胞前體通過文獻記述的方法測定(Jilka et al，1998)。
統(tǒng)計分析用ANOVA來檢測治療效果。特別地，對圖1-6和8，用Dunnett檢測(Kuehl et al，2000)檢測不同治療和載體對照組之間的差異。要檢測圖7A和B中不同化合物功效之間的差異，用線性趨勢檢驗(Kuehl，2002)比較劑量反應(yīng)曲線。用Bonferroni方法對圖7E和F，圖11A、B、C，圖12A，圖13，圖14A和B和圖9中的治療組進行成對比較。由于正態(tài)假設(shè)不適用于圖3C和D和圖12C的數(shù)據(jù)，因此用Wilcoxon秩和校驗(Steel et al，1997)和Bonferroni修正進行治療組的成對比較。在圖4D中，用雙方ANOVA檢測治療和劑量效果，然后用線性趨勢檢驗確定每種化合物的顯著性效果。在圖10中，用數(shù)回歸分析估計EC50，該值用于確定相對結(jié)合親和力。根據(jù)雙方ANOVA的結(jié)果，在6月齡和8月齡的雌性小鼠的兩個實驗中，BMD，血清骨鈣素，子宮重量沒有顯著性差異。而且這兩個實驗中的治療效果也沒有顯著性差異。因此，這兩個實驗的數(shù)據(jù)綜合表示在圖11B，13G和14A中。
雖然本發(fā)明中描述了一些特定的優(yōu)選實施方案，根據(jù)本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員獲知其它的實施方案也是顯而易見的。因此本發(fā)明不受優(yōu)選實施方案的限制。
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權(quán)利要求
1.一種以能有效增加或維持骨骼特性的給藥方案給患者施用ANGELS化合物的方法，其中所述骨骼特性選自骨量，骨密度和骨強度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中ANGELS化合物是非酚的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中ANGLES化合物選自雌烯二醇，雄烯二醇，雌烷二醇，雄烷二醇，去雌烯二醇，同雌烯二醇，斷雌烯二醇，去雄烯二醇，同雄烯二醇，斷雄烯二醇，去雌烷二醇，同雌烷二醇，斷雌烷二醇，去雄烷二醇，同雄烷二醇，斷雄烷二醇和雌三烯醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中ANGELS化合物是一種雌烯二醇或一種雄烯二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中雌烯二醇是一種5(10)-雌烯二醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中5(10)-雌烯二醇選自5(10)-雌烯-3α，17α-二醇，5(10)-雌烯-3α，17β-二醇，5(10)-雌烯-3β，17α-二醇和5(10)-雌烯-3β，17β-二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中ANGELS化合物是一種5(6)-雌烯二醇或一種5(6)-雄烯二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中ANGELS化合物選自5(6)-雌烯-3α，17α-二醇，5(6)-雌烯-3α，17β-二醇，5(6)-雌烯-3β，17α-二醇，5(6)-雌烯-3β，17β-二醇，5(6)-雄烯-3α，17α-二醇，5(6)-雄烯-3α，17β-二醇，5(6)-雄烯-3β，17α-二醇和5(6)-雄烯-3β，17β-二醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中ANGELS化合物是一種4-雌烯二醇或一種4-雄烯二醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中ANGELS化合物選自4-雌烯-3α，17α-二醇，4-雌烯-3α，17β-二醇，4-雌烯-3β，17α-二醇，4-雌烯-3β，17β-二醇，4-雄烯-3α，17α-二醇，4-雄烯-3α，17β-二醇，4-雄烯-3β，17α-二醇和4-雄烯-3β，17β-二醇。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中ANGELS化合物是一種雌烷二醇或一種雄烷二醇。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中ANGELS化合物選自雌烷-3α，17α-二醇，雌烷-3α，17β-二醇，雌烷-3β，17α-二醇，雌烷-3β，17β-二醇，雄烷-3α，17α-二醇，雄烷-3α，17β-二醇，雄烷-3β，17α-二醇和雄烷-3β，17β-二醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中ANGELS化合物是一種5α-雌烷二醇或者一種5α-雄烷二醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中ANGELS化合物選自5α-雌烷-3α，17α-二醇，5α-雌烷-3α，17β-二醇，5α-雌烷-3β，17α-二醇，5α-雌烷-3β，17β-二醇，5α-雄烷-3α，17α-二醇，5α-雄烷-3α，17β-二醇，5α-雄烷-3β，17α-二醇和5α-雄烷-3β，17β-二醇。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中ANGELS化合物是一種5β-雌烷二醇或者一種5β-雄烷二醇。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中ANGELS化合物選自5β-雌烷-3α，17α-二醇，5β-雌烷-3α，17β-二醇，5β-雌烷-3β，17α-二醇，5β-雌烷-3β，17β-二醇，5β-雄烷-3α，17α-二醇，5β-雄烷-3α，17β-二醇，5β-雄烷-3β，17α-二醇和5β-雄烷-3β，17β-二醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中ANGELS化合物選自去雌烯二醇，同雌烯二醇，斷雌烯二醇，去雄烯二醇，同雄烯二醇，斷雄烯二醇，去雌烷二醇，同雌烷二醇，斷雌烷二醇，去雄烷二醇，同雄烷二醇和斷雄烷二醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中ANGELS化合物選自去雌烯二醇，同雌烯二醇和斷雌烯二醇。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中ANGELS化合物選自去雄烯二醇，同雄烯二醇和斷雄烯二醇。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中ANGELS化合物選自去雌烷二醇，同雌烷二醇和斷雌烷二醇。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中ANGELS化合物選自去雄烷二醇，同雄烷二醇和斷雄烷二醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中ANGELS化合物是一種雌三烯醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中雌三烯醇選自雌三烯-2-醇，雌三烯-3-醇，雌三烯-4-醇和雌三烯-5-醇。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中雌三烯醇選自斷雌三烯醇，去雌三烯醇和同雌三烯醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中雌三烯醇選自 其中R7，R8，R9，R10，R11，和R13分別選自氫原子，C1-C5烷基和三氟甲基；A和B分別選自CH或N；R12選自氫原子，羥基，和C1-C5烷基。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中R7，R8，R9，R10，R11和R13分別選自氫原子，甲基，乙基和三氟甲基。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中ANGELS化合物選自 其中R是氫原子或C1-C5烷基；其中R’和R”分別選自氫原子，C1-C5烷基，三氟甲基，苯基，和C1-C5烷基取代的苯基。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中R選自氫原子，甲基和乙基，R’和R”分別選自氫原子，甲基，乙基，丙基，三氟甲基，苯基，2-甲苯?；?-甲苯?；?-甲苯?；?。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中ANGELS化合物選自 其中R1選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基，苯基和C1-C5烷苯基；R2選自氫原子；C1-C5烷基和三氟甲基；R3選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基，羥基環(huán)烷基，苯基和C1-C5烷基苯基。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中R1選自氫原子，甲基，乙基，異丙基，環(huán)己基和苯基；R2選自氫原子，甲基，乙基，異丙基和三氟甲基；R3選自氫原子，甲基，乙基，異丙基，苯基，環(huán)己基，環(huán)苯基和4-羥基環(huán)己基。
31.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中患者患有骨障礙。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中骨障礙選自骨質(zhì)疏松癥，佩吉特病，成骨不全，慢性甲狀旁腺功能亢進，甲狀腺功能亢進，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，Gorham-Stout病，麥-奧綜合癥，癌骨轉(zhuǎn)移，多發(fā)性骨髓瘤骨轉(zhuǎn)移和牙槽嵴骨損失。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中骨障礙是骨質(zhì)疏松癥。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中骨質(zhì)疏松癥選自絕經(jīng)后的，男性的，老年的，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的，乙醇誘發(fā)的，與厭食/閉經(jīng)相關(guān)的，骨骼固定術(shù)誘發(fā)的，體重降低誘發(fā)的，移植后的，轉(zhuǎn)移的，先天的，和青少年的骨質(zhì)疏松癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中骨特性是骨量。
36.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中骨特性是骨密度。
37.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中骨特性是骨強度。
38.一種以能有效提供下述治療效果的給藥方案給予患者ANGELS化合物的方法，包括提高性欲，控制血管舒縮障礙，促進血管舒張，減少骨損失，減少情緒波動，降低膽固醇，減少低密度脂蛋白(LDL)，增加高密度脂蛋白(HDL)，減緩動脈硬化，減緩癌癥發(fā)展，減緩心血管疾病發(fā)展，減緩年齡相關(guān)的神經(jīng)退化癥，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，降低癌癥的危險性，降低心血管疾病的危險性，降低中風(fēng)的危險性，降低神經(jīng)退行性疾病的危險性。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效控制血管舒縮障礙或促進血管舒張。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效減緩心血管疾病發(fā)展，減緩動脈硬化，降低心血管疾病的危險性或降低中風(fēng)的危險性。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效降低膽固醇，減少LDL或增加HDL。
42.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效減緩年齡相關(guān)的神經(jīng)退化癥，減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，或降低神經(jīng)退行性疾病的危險性。
43.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效提高性欲。
44.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效減少骨損失。
45.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效減少情緒波動。
46.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給藥方案能有效降低癌癥的危險性或減緩癌癥發(fā)展。
47.一種藥物組合物，其包含一種化合物，所述化合物由選自下組的式表示 其中R1，R3和R6分別選自氫原子或甲基；其中m和n分別是1至3的整數(shù)；和R2和R5分別獨立地選自氫原子，鹵素，巰基，羥基，氰，氨基，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5硫代烷基，C1-C5酯，C1-C5烷氧基，C1-C5?；珻1-C5烷基胺，和C1-C5酰氧基；和R4選自氫原子，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5酯，和C1-C5?；?。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
49.根據(jù)權(quán)利要求48的藥物組合物，其中n為1或3。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的藥物組合物，其中m為1或3。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
52.根據(jù)權(quán)利要求51的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
53.根據(jù)權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
54.根據(jù)權(quán)利要求53的藥物組合物，其中n為1或3。
55.根據(jù)權(quán)利要求53的藥物組合物，其中m為1或3。
56.根據(jù)權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
57.根據(jù)權(quán)利要求56的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
58.根據(jù)權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
59.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，其中n為1或3。
60.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，其中m為1或3。
61.根據(jù)權(quán)利要求58的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
62.根據(jù)權(quán)利要求61的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
63.根據(jù)權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
64.根據(jù)權(quán)利要求63的藥物組合物，其中n為1或3。
65.根據(jù)權(quán)利要求63的藥物組合物，其中m為1或3。
66.根據(jù)權(quán)利要求63的藥物組合物，其中所述化合物由下式表示
67.根據(jù)權(quán)利要求66的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
68.一種藥物組合物，其包含一種化合物，所述化合物由選自下組的式表示 其中R1，R3和R6分別選自氫原子和甲基；R2和R5分別選自氫原子，鹵素，巰基，羥基，氰，氨基，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5硫代烷基，C1-C5酯，C1-C5烷氧基，C1-C5?；?，C1-C5烷基胺，和C1-C5酰氧基；和R4選自氫原子，乙烯基，乙炔基，芳基，C1-C5雜芳基，C1-C5烷基，C1-C5環(huán)烷基，C1-C5鹵代烷基，C1-C5酯，和C1-C5?；?。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
70.根據(jù)權(quán)利要求69的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
71.根據(jù)權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
72.根據(jù)權(quán)利要求71的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
73.根據(jù)權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
74.根據(jù)權(quán)利要求73的藥物組合物，其中R2選自氫原子，C1-C5烷基，苯基，C1-C5烷基取代的苯基；R4選自氫原子，C1-C5烷基和乙炔基；R5選自氫原子和C1-C5烷基。
75.一種藥物組合物，其包含一種化合物，所述化合物由選自下組的式表示 其中R13，R14和R15分別選自氫原子，乙烯基，乙炔基，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基；R16選自氫原子，羥基，和C1-C5羥烷基。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
77.根據(jù)權(quán)利要求76的藥物組合物，其中R13和R14分別選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基；R16是羥基。
78.根據(jù)權(quán)利要求75的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
79.根據(jù)權(quán)利要求78的藥物組合物，其中R13，R14和R15分別選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基。
80.根據(jù)權(quán)利要求75的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
81.根據(jù)權(quán)利要求80的藥物組合物，其中R13，R14和R15分別選自氫原子，C1-C5烷基，環(huán)烷基和苯基。
82.一種藥物組合物，其包含一種化合物，所述化合物的由選自下組的式表示 其中m和n分別是1至4的整數(shù)；R3和R5分別選自羥基，氫原子，C1-C5烷基，C1-C5羥烷基，C1-C5烷氧基，C1-C5硫代烷氧基，苯基和C1-C5烷基取代的苯基；R6選自氫原子和C1-C5烷基。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的藥物組合物，其中所述化合物由選自下組的式表示
84.根據(jù)權(quán)利要求80的藥物組合物，其中R3選自氫原子，甲基和乙基；R5和R6分別選自氫原子和C1-C5烷基。
全文摘要
許多骨合成代謝化合物都可用于維持和/或增加哺乳動物的骨量、骨密度，和/或骨強度。優(yōu)選的化合物能增加骨合成代謝活性，同時使不希望的雌性化或雄性化作用減至最小或消除。
文檔編號A61P9/00GK1545415SQ02815967
公開日2004年11月10日 申請日期2002年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月18日
發(fā)明者斯泰伍羅斯·C·曼拉加斯, 約翰·A·凱特澤樂博戈恩, A 凱特澤樂博戈恩, 斯泰伍羅斯 C 曼拉加斯 申請人:諾維奧斯有限公司, 阿肯色大學(xué)董事會