專利名稱：純化酶的方法和按此產(chǎn)生出的經(jīng)純化的酶以及該酶的用途的制作方法
應(yīng)用領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于純化至少一種在溶組織梭菌(Clostridiumhistolyticum)發(fā)酵上清液中含有的酶的方法，和按此生產(chǎn)經(jīng)純化的酶，以及酶用途。
現(xiàn)有技術(shù)細(xì)菌溶組織梭菌在含有蛋白胨的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)可形成細(xì)胞外的復(fù)合酶混和物，該復(fù)合酶混和物含有膠原酶、不同的蛋白水解酶以及低分子量的組分。具有65-125kD范圍內(nèi)的分子量和5-6.5等電點(diǎn)的I型和II型膠原酶(梭菌肽酶A，EC 3.4.24.3)作為主要組分已有描述(Bond，van Wart；Biochemistry，1984，23，3077-3085)。另外的主要組分為以異二聚體形式出現(xiàn)的SH-蛋白酶梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B，EC 3.4.22.8)，其分子量為大約59kD，和未經(jīng)很好描述的所謂的中性蛋白酶(酪蛋白酶)，用MALDI-TOF測(cè)得其分子量為34.5kD。
膠原酶是切割膠原纖維蛋白的肽鍵的酶。它們用于生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)之中，例如為了分離組織的細(xì)胞或細(xì)胞連結(jié)。I型和II型膠原酶的區(qū)別在于它們對(duì)于高分子量膠原和小的合成底物的活性。I型膠原酶優(yōu)選地切割高分子量膠原，而II型膠原酶主要與合成底物反應(yīng)，例如PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(Wünsch，Heidrich；Z.Physiol.Chem.333，1963，149-151)、His-Pro(Nordwig，Wünsch；Z.Physiol.Chem.316，1959，287)或Phe-Ala-Leu-Gly-Pro-Ala(van Wart，Steinbrink；Anal.Biochem.113，1981，356-365)。這兩種類型的膠原酶也都可以通過反相層析(RPC)來明確地加以區(qū)分。
US 5,332,503描述了用于色譜層析純化溶組織梭菌膠原酶的方法。該層析方法此外包括凝膠過濾步驟以及使用反應(yīng)型紅色瓊脂糖凝膠的染料-配體親和層析。該方法在依照GMP條件下生產(chǎn)用于藥物目的的膠原酶時(shí)顯示出明顯的缺點(diǎn)。因此，在該過程中所使用的反應(yīng)型紅色瓊脂糖凝膠帶來了稱之為層析材料滲漏和相關(guān)的毒理問題的風(fēng)險(xiǎn)。此外，凝膠過濾步驟基本上是消耗時(shí)間和昂貴的，而且較少提供有效的就地清理(cleaning-in-place，CIP)的可能性。這使得難以在工業(yè)規(guī)模上使用該方法。此外，該方法需要使用去污劑，因此必須需要高額費(fèi)用來進(jìn)行純化確認(rèn)，和可能發(fā)生不希望的終產(chǎn)品的變化。最后，該方法無法分離I型和II型膠原酶。
從文獻(xiàn)US 5,830,741和US 5,952,215中，已知用于分離I型和II型膠原酶的純化方法，其包括染料-配體親和層析、陽離子交換層析和陰離子交換層析。此處也有親和層析中所使用的染料滲漏的風(fēng)險(xiǎn)。此外，所使用的層析材料只允許相對(duì)較低的流速。此外，所有的層析步驟是通過梯度洗脫來進(jìn)行的，由此結(jié)合在層析材料上的酶用線性鹽濃度和/或pH梯度洗脫下來。因此，該已知的方法結(jié)果是非常消耗時(shí)間的。
任務(wù)、解決方案、優(yōu)點(diǎn)基于這一背景，本發(fā)明的任務(wù)為形成可用于分離和純化至少一種溶組織梭菌的細(xì)胞外主酶的方法，其克服了所描述的現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。該任務(wù)是通過具有權(quán)利要求1中所提到的特征的方法完成的。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法在于溶組織梭菌發(fā)酵上清液中的酶通過單階段或優(yōu)選多階段的層析方法分離，該層析方法僅使用基于苯乙烯/二乙烯基苯和基于陶瓷羥磷灰石的層析材料，以實(shí)現(xiàn)非?？焖俸土畠r(jià)的酶純化，由此獲得高純度的酶。它們由于沒有毒理上危險(xiǎn)的物質(zhì)從而特別適合在藥學(xué)和生物化學(xué)中使用。本方法不需要任何產(chǎn)品接觸步驟，這使得其在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用特別具有優(yōu)勢(shì)。其可用于生產(chǎn)無菌膠原酶。于此，將苯乙烯/二乙烯基苯理解為由與二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯構(gòu)成的共聚體。通過用最不同的功能基團(tuán)對(duì)該基質(zhì)進(jìn)行置換，使蛋白質(zhì)與材料可能結(jié)合并因此造成其分離。依賴于功能基團(tuán)的選擇，可以使用不同的結(jié)合和分離機(jī)制，例如陽離子交換或陰離子交換機(jī)制。與此相反，羥磷灰石涉及到具有總分子式Ca10(PO4)6(OH)2的磷酸鈣，其由于離子靜電相互作用和較強(qiáng)的離子配位鍵而使得能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)合?？墒?，蛋白質(zhì)結(jié)合于羥磷灰石上的機(jī)制細(xì)節(jié)還不被了解。
所使用的層析材料允許在良好分離特性下設(shè)置高流速，從而導(dǎo)致非常短的純化時(shí)間。如果根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案使用經(jīng)燒結(jié)的(即陶瓷的)羥磷灰石是特別有效的。使用陶瓷羥磷灰石與非燒結(jié)的(結(jié)晶)羥磷灰石相比較具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即材料能夠可再生性產(chǎn)生，并由于其孔結(jié)構(gòu)而只產(chǎn)生非常低的反壓，由此柱損壞的風(fēng)險(xiǎn)變得最小并且形成高的線性流速是可能的。從經(jīng)燒結(jié)的羥磷灰石材料上的洗脫優(yōu)選地以至少200cm/h的流速進(jìn)行，特別是以至少300cm/h的流速。在苯乙烯/二乙烯基苯聚合物材料的情況下，至少500cm/h的流速甚至是優(yōu)選的，特別是至少1000cm/h的流速。以這種方式，操作時(shí)間與已知的方法相比較可顯著地縮短。
采用下面的方法可進(jìn)一步操作時(shí)間的縮短以及操作費(fèi)用的簡化，即至少一個(gè)層析階段，優(yōu)選所有的層析階段以分步洗脫的方式進(jìn)行。與梯度洗脫相比較，由此可以進(jìn)一步節(jié)省洗脫試劑和因此所需的昂貴的緩沖物質(zhì)。此外，在該操作規(guī)模上梯度的產(chǎn)生是個(gè)問題。
根據(jù)本發(fā)明的有利的實(shí)施方案，層析材料以這樣的方式進(jìn)行選擇，即單個(gè)的層析步驟僅基于靜電相互作用和/或離子鍵和/或離子配位鍵。特別有利地，本方法包括至少一個(gè)陰離子交換層析階段和/或至少一個(gè)陽離子交換層析階段和/或至少一個(gè)羥磷灰石層析階段。在一個(gè)三階段層析方法中已經(jīng)獲得了特別好的結(jié)果，其中第一階段在經(jīng)燒結(jié)的羥磷灰石材料上進(jìn)行，第二階段在基于苯乙烯/二乙烯基苯的陰離子交換材料上進(jìn)行，第三層析階段在基于苯乙烯/二乙烯基苯的陽離子交換材料上進(jìn)行，優(yōu)選地以所述次序進(jìn)行，可是其他次序也是可以的；階段的數(shù)目也可以變化。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法因此不包括任何消耗時(shí)間和成本的凝膠過濾步驟，經(jīng)此將待分離的酶的自消化風(fēng)險(xiǎn)減至最小。而且，舍棄凝膠過濾使得能夠在4-25℃的寬溫度范圍內(nèi)進(jìn)行層析階段，即也可以在室溫下進(jìn)行。此外，該方法不包括任何親和層析階段，因此不存在層析材料上親和配體的滲漏和由此將其洗掉的風(fēng)險(xiǎn)。最后，根據(jù)本發(fā)明的方法沒有任何可能引起不希望的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)沉淀步驟。因此，進(jìn)一步存在這樣的優(yōu)點(diǎn)，即沒有使用去污劑或離液序列高的物質(zhì)(硫酸銨、聚乙二醇等等)，隨后去除這些物質(zhì)總是與高額操作費(fèi)用聯(lián)系在一起。
所使用的層析材料進(jìn)一步具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即其在很寬的范圍內(nèi)是化學(xué)惰性的，從而能夠用相對(duì)高濃度的堿液如3摩爾的氫氧化鈉濃溶液來純化。這保證了非常有效的純化，和因此保證材料的功能性維護(hù)，以及保證了該方法的良好重復(fù)性。此外層析材料的高壓穩(wěn)定性使之能夠在高壓液相層析方法(HPCL)中使用。由于不存在由方法條件決定的毒理上有顧慮的物質(zhì)如親和配體或去污劑，因此根據(jù)本發(fā)明純化出的蛋白質(zhì)，尤其是I型和/或II型膠原酶和/或梭菌蛋白酶和/或中性蛋白酶(酪蛋白酶)能夠特別有利地用于藥物或生物化學(xué)目的。
本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案提供其它在從屬權(quán)利要求中所指明的特征。
此外，本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求30和31所述的按照該方法經(jīng)純化的酶，以及根據(jù)權(quán)利要求32所述的按照該方法生產(chǎn)的酶的用途。
附圖的簡短描述本發(fā)明借助于

圖1舉例說明。
本發(fā)明的詳細(xì)描述和實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在動(dòng)物或植物來源的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行溶組織梭菌的培養(yǎng)之后，例如通過離心或過濾從發(fā)酵上清液中分離出細(xì)胞和其他不溶解的組分。該發(fā)酵上清液中含有I型和II型膠原酶、梭菌蛋白酶和酪蛋白酶作為主要組分，其可在這些蛋白質(zhì)的層析分離之前以通常的方式進(jìn)行濃集。
在本發(fā)明的第一步驟中，將該發(fā)酵上清液泵壓流經(jīng)填充I型或II型陶瓷羥磷灰石材料(CHT)的層析柱，在此除了不同的其他成分之外所述酶與磷灰石結(jié)合。在4-25℃和6-9的pH值，采用＞300cm/h的線性流速并以分步洗脫的方式進(jìn)行洗脫。于此，含有0-1000mM堿鹵化物的磷酸緩沖液是適合的，由此磷酸鹽濃度逐漸地由10mM增加至350mM磷酸鹽?？蛇x擇地或附加地，緩沖液的pH值逐漸地由6增加至9。優(yōu)選地進(jìn)行三個(gè)洗脫階段。在第一洗脫階段獲得的級(jí)分1僅僅含有低分子量的組分。第二洗脫階段的級(jí)分2除了低分子量的成分之外還含有中性蛋白酶(酪蛋白酶)。第三洗脫階段的級(jí)分3也含有低分子量的成分、全部的梭菌蛋白酶以及I型和II型膠原酶。
級(jí)分3將會(huì)通過例如超濾/透濾或纖濾或透析進(jìn)行脫鹽，并視需要進(jìn)行濃集。然后，將經(jīng)脫鹽的溶液在第二層析步驟中經(jīng)歷陰離子交換層析。將基于苯乙烯/二乙烯基苯的層析材料用于此，其例如用四元的氨基團(tuán)進(jìn)行功能化。于此，可以使用商購可得的材料(例如Pharmacia公司的Source，PerSeptive公司的POROS，Biorad公司的Makroprep)。當(dāng)將級(jí)分3上載到陰離子交換器上時(shí)，已經(jīng)進(jìn)行了陽離子或非離子低分子量組分的分離。于4-25℃在具有7-9.5的pH范圍的緩沖體系中以分步洗脫的方式進(jìn)行結(jié)合組分的洗脫，其線性流速為大于500cm/h，其中堿鹵化物或堿土鹵化物的濃度從1至1000mM逐漸變化，和/或pH值從9.5至6逐漸變化。優(yōu)選地分離出兩個(gè)級(jí)分，由此第一洗脫階段的級(jí)分4含有梭菌蛋白酶和II型膠原酶，第二洗脫階段的級(jí)分5也含有梭菌蛋白酶，以及I型膠原酶。
將級(jí)分4和5彼此分別在第三層析階段中經(jīng)歷陽離子交換層析。于此，也使用基于苯乙烯/二乙烯基苯材料的柱填充物，可是其在此用陽離子結(jié)合基團(tuán)例如SO3H進(jìn)行功能化。上面提到的商業(yè)材料也可在此處使用。于4-25℃在具有5.7-7的pH范圍的緩沖體系中以分步洗脫的方式進(jìn)行陽離子交換劑的洗脫，其線性流速為至少500cm/h。于此，堿鹵化物或堿土鹵化物的濃度在洗脫緩沖液中于0-300mM之間逐漸調(diào)整，和/或pH值于5-7之間逐漸調(diào)整。洗脫優(yōu)選地以兩個(gè)階段進(jìn)行，由此在第一洗脫階段獲得各自的膠原酶，和在第二洗脫階段獲得梭菌酶。
實(shí)施例根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，溶組織梭菌的培養(yǎng)物通過在液體培養(yǎng)中使用動(dòng)物或植物營養(yǎng)培養(yǎng)基來進(jìn)行發(fā)酵直至所希望的細(xì)胞密度。在用通常的方法例如離心或過濾分離細(xì)胞之后，將2000ml濃縮的發(fā)酵上清液以300cm/h的線性流速泵壓流經(jīng)用1700ml I型陶瓷羥磷灰石填充的層析柱上。于20-25℃用磷酸緩沖液采用300cm/h的線性流速并以三個(gè)階段來洗脫與羥磷灰石柱結(jié)合的成分，其中磷酸鹽濃度逐漸增加。在第一洗脫階段中，用大約10CV(柱體積)的10mM磷酸緩沖液/100mM NaCl進(jìn)行洗脫，由此獲得級(jí)分1，其主要含有低分子量的組分。然后用大約3CV的60mM磷酸緩沖液/100mM NaCl進(jìn)行洗脫，從而獲得級(jí)分2，其含有酪蛋白酶且同樣含有低分子量的成分。對(duì)于第三洗脫階段，用大約5CV的200mM磷酸緩沖液/100mM NaCl進(jìn)行洗脫。以這種方式收集的級(jí)分3含有梭菌蛋白酶和所有的I型和II型膠原酶。將級(jí)分2進(jìn)行脫鹽并凍干。最后視需要用標(biāo)準(zhǔn)方法來完成低分子量組分和酪蛋白酶的分離。
將級(jí)分3通過例如超濾/透濾或纖濾或透析進(jìn)行脫鹽，并視需要濃集。然后將級(jí)分3用適當(dāng)?shù)木彌_液(例如500mM Tris，pH9.0-9.3)調(diào)整至9.0-9.3的pH值。將經(jīng)緩沖的溶液于20-25℃以大約1000cm/h的線性流速泵壓流經(jīng)作為陰離子交換器功能化的苯乙烯/二乙烯基苯柱(PerSeptive公司的POROS 50 PI)。然后用大約5CV Tris-緩沖液洗滌柱。于20-25℃和大約1000cm/h的線性流速在兩個(gè)洗脫階段中以增加的鹽濃度來進(jìn)行洗脫。通過使用40mM Tris-緩沖液/6mMCaCl2/30mM NaCl pH9.0-9.3進(jìn)行洗脫而獲得級(jí)分4，其含有梭菌蛋白酶，以及II型膠原酶。級(jí)分5也含有梭菌蛋白酶以及含有I型膠原酶，其是通過在第二洗脫階段中使用40mM Tris/6mM CaCl2/70mM NaClpH9.0-9.3進(jìn)行洗脫而獲得的。
級(jí)分4和5例如通過逆50升H2O透析24小時(shí)進(jìn)行脫鹽，并用50mMMES緩沖液調(diào)整至5.9-6.1的pH值。這兩個(gè)級(jí)分相互分別在基于苯乙烯/二乙烯基苯材料的陽離子交換柱(例如PerSeptive公司的POROS50HS)上進(jìn)行層析。對(duì)于此目的，將這些級(jí)分以大約700cm/h的線性流速于20-25℃上載到柱上，并在相同的條件下進(jìn)行洗脫。從級(jí)分4中洗脫II型膠原酶或者從級(jí)分5中洗脫I型膠原酶分別于20-25℃在用10mM MES緩沖液/20-40mM NaCl pH5.9-6.1的第一洗脫階段中進(jìn)行。兩個(gè)級(jí)分的梭菌蛋白酶隨后分別用10mM MES緩沖液/90-110mMNaCl pH5.9-6.1洗脫。合并含有梭菌蛋白酶的溶液。將所有的溶液進(jìn)行脫鹽，逆2mM CaAc2進(jìn)行透析，然后凍干。
根據(jù)已知的方法(見表)來測(cè)定所獲得的酶的每個(gè)酶活性。此外，用反相層析測(cè)定了I型膠原酶、II型膠原酶和梭菌蛋白酶的純度。結(jié)果概括在下表中表
a根據(jù)Wünsch E.，Heidrich H.-G.；Z.Physiol.Chem.333，149-151，1963測(cè)定；b根據(jù)Doi Shibata，Matoba；Anal.BioChem.118，173-184，1981測(cè)定；c根據(jù)Mitchel，Harrington；MethodsEnzymol.19，635-642，1970測(cè)定；d根據(jù)Moore，Stein；Biol.Chem.176，367，1948測(cè)定；e根據(jù)RPC測(cè)定。
權(quán)利要求
1.用于部分或完全純化至少一種在溶組織梭菌發(fā)酵上清液中含有的酶的方法，其特征在于，通過僅使用基于苯乙烯/二乙烯基苯和/或基于特別是陶瓷羥磷灰石的層析材料的層析方法來分離發(fā)酵上清液中的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該層析方法以單階段或優(yōu)選地以幾個(gè)階段進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，酶為I型膠原酶和/或I I型膠原酶和/或梭菌蛋白酶和/或中性蛋白酶(酪蛋白酶)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用經(jīng)燒結(jié)的羥磷灰石。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該層析方法只包括基于靜電相互作用和/或離子鍵和/或離子配位鍵的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該層析方法包括至少一個(gè)陰離子交換層析階段和/或至少一個(gè)陽離子交換層析階段和/或至少一個(gè)羥磷灰石層析階段。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)層析階段特別是所有的層析階段以分步洗脫的方式進(jìn)行。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該層析方法為兩階段或三階段方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該層析方法包括在經(jīng)燒結(jié)的羥磷灰石材料上的第一層析階段，在基于苯乙烯/二乙烯基苯的陰離子交換材料上的第二層析階段，和視需要在基于苯乙烯/二乙烯基苯的陽離子交換材料上的第三層析階段。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，第一層析階段以至少兩個(gè)洗脫階段來進(jìn)行，由此將中性蛋白酶(酪蛋白酶)與I型和II型膠原酶和梭菌蛋白酶分離開。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將在第一層析階段基本上無酪蛋白酶的級(jí)分經(jīng)歷具有至少兩個(gè)洗脫階段的第二層析階段，由此I型膠原酶和II型膠原酶相互分離開。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將來自第二層析階段含有I型膠原酶的級(jí)分經(jīng)歷具有至少兩個(gè)洗脫階段的第三層析階段，由此I型膠原酶和梭菌蛋白酶分離開。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將來自第二層析階段含有II型膠原酶的級(jí)分經(jīng)歷具有至少兩個(gè)洗脫階段的第三層析階段，由此II型膠原酶和梭菌蛋白酶分離開。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，以線性流速進(jìn)行洗脫。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，以至少200cm/h特別是至少300cm/h的流速從經(jīng)燒結(jié)的羥磷灰石材料上進(jìn)行洗脫。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，以至少500cm/h特別是至少1000cm/h的流速從苯乙烯/二乙烯基苯材料上進(jìn)行洗脫。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該方法不包括任何凝膠過濾步驟。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該方法不包括任何蛋白質(zhì)沉淀步驟。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，該方法不包括對(duì)于低分子量物質(zhì)、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素和/或核酸尤其是DNA的降解步驟。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，這些層析階段于4-25℃的溫度進(jìn)行。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用具有證明文件的層析介質(zhì)。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用壓力穩(wěn)定層析材料。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，層析材料的純化用濃縮的堿液特別是3摩爾的氫氧化鈉濃溶液來進(jìn)行。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，層析階段以柱層析來進(jìn)行。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，獲得具有至少13000U/g特別是至少18000U/g的特異活性的II型膠原酶。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，獲得具有至少3000U/mg特別是至少5000U/mg的特異活性的I型膠原酶。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，獲得具有至少200U/mg特別是至少300U/mg的特異活性的梭菌蛋白酶。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，獲得具有至少1200U/mg特別是至少1500U/mg的特異活性的中性蛋白酶(酪蛋白酶)。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，獲得分別具有至少70％特別是至少80％的純度的II型膠原酶和/或I型膠原酶和/或梭菌蛋白酶。
30.在溶組織梭菌的發(fā)酵上清液中所含有的并經(jīng)部分或完全純化的酶，如I型膠原酶和/或II型膠原酶和/或梭菌蛋白酶和/或中性蛋白酶(酪蛋白酶)，其特征在于，通過僅使用基于苯乙烯/二乙烯基/二乙烯基苯和/或基于特別是陶瓷羥磷灰石的層析材料的層析方法來分離發(fā)酵上清液中的酶。
31.酶，其特征在于，該酶是按照根據(jù)權(quán)利要求1-30所述的方法生產(chǎn)的。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-29所述的方法純化出的酶在藥物和/或生物化學(xué)目的中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于純化至少一種在溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)發(fā)酵上清液中含有的酶的方法。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵上清液中的酶通過多步驟層析方法來分離，該層析方法包括僅使用基于苯乙烯/二乙烯基苯和/或基于特別是羥磷灰石的層析材料。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1529751SQ02813134
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2002年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月2日
發(fā)明者M·庫菲爾斯特, S·施米德鮑爾, M 庫菲爾斯特, 椎鹵 申請(qǐng)人:諾爾瑪克藥物有限責(zé)任及股份兩合公司