專利名稱：提純生物組合物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從生物組合物(諸如血液)去除分析物(諸如蛋白感染素蛋白)的方法。
背景技術：
在輸入病體以前，細胞血產品(諸如血紅細胞(“RBC”)和血小板)可以經過大量的提純和存儲過程。提純過程包括鈍化、和/或去除污染的病原體(例如，病毒、細菌、原生動物)，以及清除不需要的蛋白和核酸。據(jù)認定，紅細胞的提純能夠影響存儲血產品的保存期，也能夠影響輸血后體內血細胞的成活率。
在存儲期間，血液組合物、諸如血紅細胞，經過形態(tài)學與生化方面的變化，能夠發(fā)生細胞溶解，稱為溶血作用。形態(tài)學與生化方面的變化能夠影響紅細胞膜的流動性，以及紅細胞中血紅蛋白向組織傳遞氧的能力。存儲期間發(fā)生的形態(tài)學變化最終導致細胞上刺狀體的出現(xiàn)(細胞刺狀增多癥echinocytosis)。這些刺狀體能夠以泡囊芽體的形式脫落，從而完全改變細胞表面積與體積的比率，以及其窄通路變形的能力。該非正常與受損的細胞通常應從血流中清除。相應地，如果最小數(shù)量的細胞(通常至少75％紅細胞)在輸血后能夠循環(huán)24小時，那么該細胞會被認為適合輸血。
在某些情況下，人們期望延長血細胞儲存的時間。例如，自體的血產品，也就是手術過程之前從供體取出、并且在手術過程中或之后再輸入供體的血產品，其在手術進行之前也許會過期。人們也計劃，將血液產品存儲數(shù)月，再次測定供體，以獲得由傳染物造成疾病的證據(jù)，該疾病會在感染供體的數(shù)周后顯現(xiàn)。這些疾病包括，AIDS或肝炎病。
發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于發(fā)明了從血細胞去除分析物的方法，該方法制備了明顯減少細胞群體中殘留分析物含量的血細胞。該方法適用大容積的血細胞懸液，此方法制備的細胞經長時間儲存仍保持生活力，并且適用于治療，諸如輸血?？扇〉难毎苽涫呛屑t血細胞(RBC)群體的制備。
本發(fā)明提供了減少血細胞懸液中胞外液的含量(例如原生質)的方法。本方法包括，提供含有血細胞和胞外液的大容積血細胞懸液；用特定清洗溶液清洗血細胞懸液，與初始懸液中胞外液含量相比，血細胞懸液中胞外液含量足以減少了至少103倍。同時，也提供了本發(fā)明清洗方法制備的血細胞組合物。還提供了將本發(fā)明清洗方法制備的血細胞組合物輸入受體的方法。
在優(yōu)選的實施方案中，提供了待清洗的血細胞懸液，其容積大于40毫升、50毫升、75毫升、100毫升、200毫升、300毫升、400毫升或甚至1L。
在優(yōu)選的實施方案中，清洗的血細胞在4℃下適當?shù)膬Υ嫒芤褐薪涢L時間保存，仍保持生活力。例如，在可取實施方案中，清洗的血細胞在1-6℃下(可取的是4℃)儲存24天，仍保持生活力。在可取實施方案中，清洗的血細胞在1-6℃下(優(yōu)選的是4℃)儲存24小時、2天、7天、14天、21天、28天、35天、40天、42天、或更長時間，仍保持生活力。
相對于血細胞初始懸液中分析物濃度，本發(fā)明的清洗方法明顯減少了血細胞懸液中任何殘留分析物的濃度。在一些實施方案中，能夠減少多種分析物的濃度。在一些實施方案中，分析物與細胞質膜有關，例如在質膜的細胞外表面上。在一些實施方案中，分析物出現(xiàn)在血細胞懸液的胞外液中。
在一些實施方案中，分析物是小分子。在本發(fā)明的可取實施方案中，提供了充分減少供體血細胞懸液中非需要小分子濃度的方法，該非需要小分子也許會對受體造成潛在的威脅，諸如藥物、抗病原體或細胞保存劑。如文中所用，“小分子”指的是質量大約小于1000道爾頓的分子。能夠用本發(fā)明方法去除的小分子實例有甘油、二甲亞砜(DMSO)、乙亞胺低聚物及其衍生物、吩噻嗪衍生物、補骨脂素、吖啶衍生物、核黃素或藥物，諸如抗凝劑、或抗生素。在一些實施方案中，分析物是小分子，與血細胞初始懸液中分析物濃度相比，本發(fā)明的清洗方法以至少100的系數(shù)(可取的至少是1000)減少任何殘留分析物的濃度。因此，在可取實施方案中，本發(fā)明的方法充分減少了供體血細胞懸液中非需要小分子的濃度，從而，在保持血細胞懸液治療適用性同時，減少了對受體藥理學、免疫學、毒理學的負面影響及其風險，甚至在輸血前可以經過長期儲存(血小板的儲存期大于3天，血紅細胞的儲存期大于14天)。
在其它實施方案中，分析物是大于1000道爾頓的分子。例如，分析物可以是大分子，諸如核酸或蛋白。在可取實施方案中，本發(fā)明提供了充分減少供體血細胞懸液中非需要大分子濃度的方法，該非需要的大分子也許會給受體帶來潛在危害，諸如，導致神經性失調的蛋白感染素蛋白；酶、抗體、以及能造成受體產生發(fā)炎和發(fā)熱反應的細胞因子；能導致過敏反應的原生質蛋白。在血細胞懸液中，按照本發(fā)明方法減少的蛋白分析物實例有蛋白感染素蛋白、細胞因子(例如，白細胞間質素1β、腫瘤壞死因子α、白細胞間質素6、白細胞間質素8、白細胞間質素10)、炎性酶(嗜中性彈性蛋白酶、組織蛋白酶、絲氨酸蛋白酶)、過敏毒素(例如，C3a、C5a、血管舒緩激肽)；免疫球蛋白(例如，IgG、IgM和IgA)。在可取實施方案中，本發(fā)明的方法充分減少了供體血細胞懸液中非需要大分子的濃度，甚至經長期儲存后，在保持血細胞懸液治療適用性同時，減少了受體非需要的反應及其風險。
在其它實施方案中，待去除、和/或減少的分析物是細胞，例如，細菌、原生動物、或毒粒，特別是細胞外毒粒。在特別可取實施方案中，由本發(fā)明方法去除、和/或減少的細胞是白細胞(包括白細胞膜片段)。在可取實施方案中，本發(fā)明的方法充分減少了供體血細胞懸液中非需要細胞和細胞片段的濃度，甚至經長期儲存后，在保持血細胞懸液治療適用性同時，減少了受體的非需要反應。
相應地，本發(fā)明提供了一種方法，通過減少供體血液制備的血細胞懸液中潛在有害分析物的濃度，減少了受體非需要反應的發(fā)生及其風險。在可取實施方案中，該方法包括，相對于其在血細胞懸液的初始濃度，非需要分析物濃度的減少達到10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、或106倍。非需要分析物可以是小分子或大分子。“小分子”指的是分子量小于1000道爾頓的分子。前述的實例包括甘油、DMSO、乙亞胺低聚物、補骨脂素、基于吩噻嗪的藥劑、基于吖啶的藥劑、核黃素、或由美國血液銀行聯(lián)盟或FDA或美國軍方認定為不適合獻血的任何藥物。
分析物是可替換或添加的大于1000道爾頓的分子。例如，分析物可以是大分子，諸如核酸或蛋白。依據(jù)本發(fā)明方法，在血細胞懸液中其含量減少的蛋白分析物實例是蛋白感染素蛋白，特別是致病的蛋白感染素蛋白。用本發(fā)明方法去除的其它分析物實例有細胞，例如白細胞、微生物病原體(諸如細菌、真菌或原生動物有機體)、或傳染性病毒體。
在優(yōu)選的實施方案中，清洗包括，先離心血細胞懸液，生成粒狀細胞碎片和含有胞外液的上清液；再從粒狀細胞碎片去除上清液；接著，向粒狀細胞碎片加入清洗溶液；最后，在清洗溶液中再懸浮粒狀細胞碎片，生成再懸浮細胞懸液。如果需要，離心和再懸浮步驟可以重復進行，例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、或更多。重復離心和再懸浮步驟的次數(shù)將由胞外液和/或分析物需要減少的倍數(shù)、以及每個清洗步驟所用清洗溶液與胞外液的比率決定。為了達到胞外液的減少倍數(shù)，清洗溶液與胞外液比例越大，所需清洗循環(huán)的次數(shù)就越少。例如，50％血球比率的300毫升血紅細胞濃縮物含有150毫升血紅細胞與150毫升胞外液。如果血液經離心達到80％血球比率的紅細胞沉淀，去除殘留的胞外液，濃縮的血紅細胞中殘留的胞外液是30毫升。如果該血液再次懸浮在另加入的270毫升清洗溶液中，胞外液就稀釋成原來的1/10。該過程可以重復多次。第一、第二、第三次循環(huán)分別實現(xiàn)了10倍、100倍、1000倍的細胞外稀釋效果。
初始的和本發(fā)明方法清洗所得的血細胞懸液可用業(yè)內公知的方法測定，例如，使用特異于分析物的測定方法，測定分析物需要減少的倍數(shù)，和/或血細胞的生活力。
在一些實施方案中，本發(fā)明的清洗溶液是磷酸緩沖鹽溶液。在一些實施方案中，本發(fā)明的清洗溶液含有50mM或更低濃度的磷酸鹽，大約12到30mM磷酸鹽。本發(fā)明的實施方案部分基于發(fā)現(xiàn)，與用非磷酸鹽溶液清洗的細胞懸液相比，用磷酸鹽緩沖液清洗血細胞懸液，造成了分析物(例如，乙亞胺低聚物或其衍生物)的持續(xù)減少。此外，與非緩沖鹽溶液清洗的細胞懸液相比，用磷酸鹽緩沖液清洗的本發(fā)明細胞懸液具有更低的溶血水平，并且維持更高的ATP濃度。
在優(yōu)選的實施方案中，血細胞懸液包括哺乳動物血細胞?？扇〉氖牵@得的血細胞來源于人體、非人類的靈長動物、狗、貓、馬、奶牛、山羊、綿羊、或豬。在可取實施方案中，血細胞懸液包括血紅細胞、和/或血小板、和/或白細胞、和/或骨髓細胞。在特別可取的實施方案中，本發(fā)明方法可用于去除、和/或減少血細胞懸液中胞外液、或胞外液與分析物，該血細胞懸液含有哺乳動物(諸如人)的血紅細胞濃縮物、或血小板濃縮物、或白細胞濃縮物。在可取實施方案中，血細胞懸液含有哺乳動物的無核細胞濃縮物。在特別可取的實施方案中，本發(fā)明方法可用于去除、和/或減少哺乳動物(諸如人)血紅細胞濃縮物中胞外液、或胞外液與分析物。
在優(yōu)選的實施方案中，與初始細胞懸液的含量相比，清洗至少將殘留的胞外液減少了104倍、105倍、或106倍。在更可取的實施方案中，與初始細胞懸液的含量相比，清洗至少將殘留的胞外液減少了107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。在更甚可取的實施方案中，與初始細胞懸液的含量相比，清洗至少將殘留的胞外液減少了1012倍、1013倍、1014倍、1015倍、1016倍、1017倍、或1018倍。
在優(yōu)選的實施方案中，與初始血細胞懸液中其濃度相比，清洗至少將分析物濃度減少了102倍、103倍、或104倍。在可取的實施方案中，與初始血細胞懸液中其濃度相比，清洗至少將分析物濃度減少了105倍、或106倍。在更可取的實施方案中，與初始血細胞懸液中其濃度相比，清洗至少將分析物濃度減少了107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。在附加可取的實施方案中，與初始血細胞懸液中其濃度相比，清洗至少將分析物的濃度減少了1012倍、1013倍、1014倍、1015倍、1016倍、1017倍、或1018倍。
在優(yōu)選的實施方案中，減少的分析物是小分子，本發(fā)明方法用于將分析物濃度減少到藥理學、免疫學、或病毒學鈍化的水平。在可取實施方案中，減少的分析物是抗病原體，諸如乙亞胺低聚物、吩噻嗪衍生物、補骨脂素、吖啶衍生物，核黃素?？扇〉氖?，本發(fā)明方法用于將抗病原體濃度減少到不能在身體中發(fā)揮效力的水平。
在一些優(yōu)選的實施方案中，最終減少的抗病原體濃度大約少于1克/毫升，可取的是大約少于1毫克/毫升。在附加可取的實施方案中，抗病原體減少的最終濃度大約少于10-4克/毫升，大約少于10-5克/毫升，大約少于10-6克/毫升，大約少于10-7克/毫升，大約少于10-8克/毫升，大約少于10-9克/毫升，大約少于10-10克/毫升，大約少于10-11克/毫升，或大約少于10-12克/毫升。
在一些實施方案中，清洗過程是自動的。在一些實施方案中，清洗在密閉系統(tǒng)中進行，以避免導入環(huán)境微生物。
在一些實施方案中，用鈍化病原體的化合物(諸如乙亞胺低聚物或其衍生物)預處理血細胞懸液后，進行清洗過程。
在一些實施方案中，在清洗前后將血細胞懸液通過生物相容的過濾器，可取的是白細胞減少過濾器。
在優(yōu)選的實施方案中，減少的分析物是細胞，諸如白細胞，該血細胞懸液經乙亞胺低聚物處理后，例如二聚體、三聚體、或四聚體、或其衍生物，再進行本發(fā)明的清洗過程。相對于初始細胞懸液中細胞分析物濃度，細胞懸液中其濃度至少減少了100倍、103倍、104倍、或105倍。在更可取的實施方案中，細胞懸液中細胞分析物濃度至少減少了106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。當減少的細胞分析物是白細胞時，本發(fā)明的上述實施方案是部分地基于發(fā)現(xiàn)，用乙亞胺低聚物處理血紅細胞懸液，再結合按照本發(fā)明方法的清洗過程，產生了充分去除白細胞的血紅細胞懸液。
在另一優(yōu)選的實施方案中，減少的分析物是白細胞，先用乙亞胺低聚物處理血紅細胞懸液，再用過濾器減少白細胞，最后依照本發(fā)明方法進行清洗。按照本發(fā)明的上述方法，至少將細胞懸液中的白細胞減少了103倍、104倍、或105倍。在更可取的實施方案中，細胞懸液中的白細胞濃度減少了至少106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍、或1011倍。
在優(yōu)選的實施方案中，血細胞懸液中減少的分析物是蛋白感染素蛋白，與血細胞初始懸液中的含量相比，本發(fā)明方法將蛋白感染素蛋白含量至少減少了10倍，可取的是102倍?？扇〉氖?，與血細胞初始懸液中其含量相比，蛋白感染素蛋白(PrP)至少減少了103倍、104倍、或105倍。更可取的是，與血細胞初始懸液中其含量相比，清洗足以將蛋白感染素蛋白含量減少了至少106倍、107倍、或108倍。更可取的是，與血細胞初始懸液中其含量相比，蛋白感染素蛋白至少減少了109倍、或1010倍。
在本發(fā)明的實施方案中，本發(fā)明的清洗過程減少了血細胞懸液中蛋白感染素蛋白的含量。在另一實施方案中，本發(fā)明的清洗過程減少了血細胞懸液中蛋白感染素蛋白的含量，其中清洗溶液含有親脂性的乳化液。在另一實施方案中，本發(fā)明的清洗過程結合血細胞懸液穿過血液相容過濾器(可取的是白細胞減少過濾器)的操作過程，減少了血細胞懸液中蛋白感染素蛋白的含量。在另一可取實施方案中，本發(fā)明的清洗過程減少了血細胞懸液中蛋白感染素蛋白的含量，其中清洗溶液含有親脂性的乳化液，并且將血細胞懸液穿過血液相容的過濾器。
在優(yōu)選的實施方案中，由本發(fā)明上述方法去除、和/或減少的蛋白感染素蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。雖然沒有理論依據(jù)，但是人們仍認為血液、和/或血產品會在某些情況下傳播蛋白感染素病原體。在特別可取的實施方案中，由本發(fā)明上述方法去除、和/或減少的蛋白感染素蛋白是內生血液運載的蛋白感染素蛋白。在特別可取的實施方案中，由本發(fā)明方法去除、和/或減少的蛋白感染素蛋白是致病的血液運載蛋白感染素蛋白。在特別可取的實施方案中，致病的血液運載蛋白感染素蛋白從哺乳動物紅細胞懸液中去除，特別是從哺乳動物(例如人)全血或紅細胞濃縮物中去除。
在優(yōu)選的實施方案中，血細胞懸液中減少、和/或去除的蛋白感染素蛋白包括，由本發(fā)明清洗過程去除的可溶性蛋白感染素蛋白。在可取實施方案中，血細胞懸液中減少、和/或去除的蛋白感染素蛋白包括與膜相關的蛋白感染素蛋白，親脂性乳化液可加入本發(fā)明的清洗緩沖液，并且/或將血細胞懸液通過血液相容的過濾器。在可取實施方案中，從血細胞懸液中減少、和/或去除的蛋白感染素蛋白含有不溶性蛋白感染素蛋白；親脂性乳化液可加入本發(fā)明的清洗緩沖液，并且/或將血細胞懸液通過血液相溶的過濾器。在可取實施方案中，從血細胞懸液中減少、和/或去除的蛋白感染素蛋白包括其多種物理形式；清洗、過濾、和/或親脂性乳化液的組合可用于實現(xiàn)上述對數(shù)水平的降低。
在優(yōu)選的實施方案中，分析血細胞懸液，測定在本發(fā)明清洗過程、或清洗/過濾結合過程前后是否存在蛋白感染素蛋白。在特別可取的實施方案中，化驗血紅細胞懸液，測定在本發(fā)明清洗過程、或組合的清洗與過濾過程之后是否存在致病的蛋白感染素蛋白、和/或其聚集體。在任意濃縮蛋白感染素蛋白的步驟之后，檢測殘留的蛋白感染素蛋白；在本發(fā)明清洗過程、或組合的清洗與過濾過程后，如果有殘留的話，殘留的蛋白感染素蛋白結合于血紅細胞組合物。
在特別優(yōu)選的實施方案中，減少了血產品對蛋白感染素介質疾病的傳播或其風險，特別是傳染性海綿狀腦病。在另一特別可取的實施方案中，從其通過血產品的潛伏時間來看，蛋白感染素介質疾病(特別是傳染性海綿狀腦病)的發(fā)作明顯延遲。在可取的實施方案中，本發(fā)明下述方法提供了蛋白感染素介質疾病(特別是傳染性海綿狀腦病)發(fā)作中傳染風險的減少或延遲。依據(jù)本發(fā)明方法，清洗、或清洗并過濾血細胞懸液，從而減少了胞外蛋白濃度，可取的是蛋白感染素蛋白，特別可取的是致病蛋白感染素蛋白。將清洗的血細胞懸液輸入受體。在特別可取的實施方案中，受體是一位人類受體，清洗的血細胞懸液是人血細胞濃縮物，諸如RBCC。
本發(fā)明方法任意包括，測定減少的胞外蛋白濃度的步驟。胞外蛋白減少的測定包括，測定胞外免疫球蛋白G、血清白蛋白、蛋白感染素蛋白、和/或致病的蛋白感染素蛋白濃度的降低。
在優(yōu)選的實施方案中，輸入受體、清洗的血細胞懸液含有與第二清洗血細胞單元相關聯(lián)的胞外蛋白濃度，生物測定第二清洗血細胞單元中的傳染性蛋白感染素蛋白。在特別可取的實施方案中，與所觀察未清洗對照發(fā)病率相比的動物生物測定中，第二清洗的血細胞單元造成了蛋白感染素介質疾病的低發(fā)病率，特別是傳染性海綿狀腦病。另一可取的實施方案中，與所觀察未清洗對照發(fā)病率相比的動物生物測定中，第二清洗的血細胞單元造成了蛋白感染素介質疾病的延遲發(fā)作，特別是傳染性海綿狀腦病。在特別可取的實施方案中，用于輸血的清洗血細胞懸液含有胞外免疫球蛋白G、血清白蛋白、蛋白感染素蛋白、和/或一定濃度的致病蛋白感染素蛋白，該濃度與血細胞單元的濃度相關，該血細胞單元未造成生物分析中蛋白感染素介質疾病(特別是傳染性海綿狀腦病)的發(fā)作或導致其延遲發(fā)作。
除非另有說明，文中所用的全部技術和科學名詞都具有本發(fā)明所屬行業(yè)中普通技術人員通常理解的相同含義。盡管與文中所述相似或相同的方法或材料可用于本發(fā)明的實施或測定，但適合的方法與材料將在下文中描述。所有文獻、專利申請、專利、和文中所提的其它參考全部通過在此引述而合并于本文。在矛盾的情況下，將以本說明書和其相關的定義為準。此外，這些材料、方法、和實例僅起到說明的作用，并非對本發(fā)明加以限制。
下文的發(fā)明詳述和權利要求將使本發(fā)明的其它特征與優(yōu)點顯得清晰明了。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于意外發(fā)現(xiàn)，用鹽溶液(特別是磷酸緩沖鹽溶液)大量清洗大容積的血紅細胞后，其仍保持著結構、新陳代謝與功能的特性。經長期儲存后，清洗的血細胞仍保持其特性。本發(fā)明清洗的血細胞適合于輸血。
本發(fā)明的方法通?？捎糜趶纳锝M合物中去除、和/或減少分析物。“生物組合物”指的是含有細胞的組合物，或含有一種或多種生物分子的組合物，或含有細胞與一種或多種生物分子的組合物。含有細胞的組合物包括，例如血液、血紅細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、血漿、富含血小板的血漿、臍血、精液、骨髓、胎盤提取物、哺乳動物的細胞培養(yǎng)或培養(yǎng)介質，發(fā)酵產物和腹水。生物組合物也可以是游離細胞，并且至少含有一種生物分子。
“生物分子”指的是生命有機體中正常出現(xiàn)的任何種類的有機分子，包括，例如大分子，諸如核酸、多肽、翻譯后的修飾蛋白(例如糖蛋白)、多糖、與脂類。含有生物分子的生物組合物包括，例如血清、血細胞蛋白、血漿濃縮物、血漿蛋白片段、提純或部分提純的血蛋白或其它成分、任何分離血漿的上清液或沉淀、提純或部分提純的血液成分(例如蛋白、或脂類)、乳液、尿液、唾液、細胞溶解產物、冷凝沉淀物、冷凝上清液、或其部分、或其衍生物、和含有正?；蜃冃渭毎囵B(yǎng)產物的組合物。
生物組合物來源于任何需要的動物。例如，該方法可用于含有哺乳動物血細胞的細胞懸液(包括人、非人靈長動物、犬、貓、馬、或鼠的血細胞)?？扇〉牟溉閯游镅毎茄t細胞或血小板。
文中“血產品”涉及具有治療作用(例如，給受體輸血)、清洗的生物組合物。
文中定義的“蛋白感染素介質疾病”涉及發(fā)現(xiàn)不正常蛋白感染素蛋白相關的疾病，包括傳染性海綿狀腦病，諸如瘙癢病、牛海綿狀腦病、CJD(Creutzfeldt-Jakob disease)、和變異型CJD。
總之，可以使用具有滲透相容性、并對要清洗的細胞類型無毒害的任何清洗溶液。對于血細胞，可取的清洗溶液包括鹽溶液(0.9％氯化鈉)、磷酸緩沖鹽溶液(0.9％氯化鈉、13mM磷酸鈉，或0.9％氯化鈉、30mM磷酸鈉)、和葡萄糖鹽溶液(0.2％葡萄糖、0.9％氯化鈉)。
按照本發(fā)明方法清洗血紅細胞，可取的清洗效果是，完成清洗過程后，清洗的血紅細胞的血球比在50-70％。可取的是，作為清洗過程的結果，損失掉低于20％的紅細胞。
如上所述，分析物包括小分子?！靶》肿印敝傅氖欠肿恿啃∮?000道爾頓的分子。前述實例包括甘油、DMSO、乙亞胺低聚物、補骨脂素、基于吩噻嗪的藥劑、基于吖啶的藥劑、核黃素、或由美國血液銀行聯(lián)盟或FDA或美國軍方認定為不適合獻血的任何藥物。
如上所述，分析物也包括大于1000道爾頓的分子。例如，分析物可以是大分子，諸如核酸或蛋白。依據(jù)本發(fā)明方法，在血細胞懸液中其含量減少的蛋白分析物實例是蛋白感染素蛋白，特別是致病的蛋白感染素蛋白。用本發(fā)明方法去除的其它分析物實例有細胞，例如白細胞、微生物病原體(諸如細菌、真菌或原生動物有機體)、或傳染性病毒體。
名詞蛋白感染素是造成傳染性海綿狀腦病傳染物的同義詞，例如人變異的CJD、牛海綿狀腦病、和羊瘙癢癥。本發(fā)明方法可用于去除、和/或減少生物組合物(特別是血細胞懸液)中任何形式的蛋白感染素蛋白。文中所用的名詞蛋白感染素蛋白(PrP)包括天然型、非傳染型(通常稱為PrPC)、致病型(通常稱為PrPSc)、β-折疊型、應用DNA重組技術在細菌或真核細胞中制備的PrP(通常稱為重組的PrP或recPrP)、以及主要帶有α-螺旋(α-recPrP)或β-(β-recPrP)第二結構的生命體外重折疊型、或這些類型中一種或多種組合的超分子聚合體(聚合的PrP或PrPAG)。文中所用的名詞蛋白感染素蛋白包括PrP的任何物理形式，例如以可溶、不可溶、蛋白酶敏感、或蛋白酶不敏感、與膜相關、與膜無關、聚集或非聚集為特征的蛋白感染素蛋白。文中所用的致病蛋白作為廣義的傳染性蛋白、和/或單純的疾病產物。因此，本發(fā)明的致病蛋白感染素蛋白包括具有傳染性、和/或作為疾病產物的任何前述蛋白。
蛋白感染素蛋白包括致病的蛋白感染素蛋白、還包括血液運載的致病蛋白感染素蛋白，其可以通過各種方法測定，其中包括使用下列的一種或多種方法使用抗體，參見，例如美國專利5,846,533；DELFIA測定，參見Hemmila，Scand.J.Clin.Lab.Invest，48389-399，1988，和MacGregor等人，Vox Sang，7788-96，1999；核酸分子，參見，例如WO97/15685；應用動物生物測定法，參見，例如Crozet，C，F(xiàn)lamant，F(xiàn)，Bencsik，A，Aubert，D，Samarut，J，和Baron，T(2001)。在表達綿羊蛋白感染素蛋白基因的轉基因鼠中，離析出兩種不同綿羊瘙癢癥的有效傳播，JVirol75，5328-34；Manson，J.C.Barron R，Jamieson，E，Baybutt，H，Tuzi，N，McConnell，I，Melon，D，Hope，J，和Bostock，C.(2000)。鼠蛋白感染素蛋白的單個氨基酸變化顯著改變了TSE的潛伏時間，Arch Virol Suppl95-102；Scott，M.R，Will，R，Ironside，J，Nguyen，H.O，Tremblay，P，DeArmond，S.J，和Prusiner，S.B(1999)。牛海綿狀腦病蛋白感染素傳播給人類的強迫輸異基因的證據(jù)，Proc Natl Acad Sci USA96，15137-42 Moore，R.C和Melton，D.W(1997)。蛋白感染素疾病的轉基因分析，Mol Hum Reprod3，529-44.Race，R.E，Priola，S.A，Bessen，R.A，Ernst，D，Dockter，J.Rall，GF，Mucke，L，Chesebro，B，和Oldstone，M.B.(1995)。在轉基因鼠中，倉鼠蛋白感染素蛋白小基因的神經元特異性表達誘發(fā)了對倉鼠瘙癢癥介質的敏感性，神經元15，1183-91；Telling，G.C，Scott，M，Hsiao，K.K，F(xiàn)oster，D，Yang，S.L，Torchia，M，Sidle，K.C，Collinge，J，DeArmond，S.J，和Prusiner，S.B(1994)。從人向表達嵌合的人-鼠蛋白感染素蛋白的轉基因鼠傳播CJD，Proc NatlAcad Sci USA91，9936-40；7.Westaway，D，Mirenda，C.A，F(xiàn)oster，D，Zebarjadian，Y，Scott，M，Torchia，M，Yang，S.L，Serban，H，DeArmond，S.J，Ebeling C，等人(1991)。通過表達來源于長潛伏期鼠的蛋白感染素蛋白轉基因，奇異性地縮短了瘙癢癥潛伏時間，神經元7，59-68；Prusiner，S.B，Scott，M，F(xiàn)oster，D，Pan，K.M，Groth，D，Mirenda，C，Torchia，M，Yang，S.L，Serban，D，Carlson，G.A，等人(1990)。轉基因研究暗示了瘙癢癥蛋白感染素復制過程中相似的蛋白感染素蛋白異構體之間的相互作用細胞63，673-86，應用基于細胞的生物測定，參見，例如Birkett，C.R，Hennion，R.M，Bembridge，D.A，Clarke，M.C，Chree，A，Bruce，ME，和Bostock，CJ (2001)。在培養(yǎng)的細胞系增殖中，瘙癢癥菌株保持著生物表型，EMBOJ 20，3351-8；Vilette，D，Andreoletti，O，Archer，F(xiàn)，Madelaine，MF，Vilotte，J.L，Lehmann，S，和Laude，H(2001)。在表達綿羊蛋白感染素蛋白的異種上皮細胞中，傳染性綿羊瘙癢癥介質的體外增殖，Proc Natl Acad Sci USA98，4055-9；并依照文中所述的實施例。
通過觀察動物的臨床病征，在動物生物測定中檢測出蛋白感染素介質疾病的發(fā)作，包括傳染性海綿狀腦病。例如，綿羊傳染性海綿狀腦病的臨床病癥是多變的，但是包括普遍的神經性功能失調、行為改變、神經過敏、共濟失調、puritis和調節(jié)能力低下。這些病征能夠在數(shù)小時、數(shù)天或數(shù)周內逐步表現(xiàn)出來，實驗動物需要每天定時觀察。即使未發(fā)現(xiàn)臨床病癥，也應該將死牲畜認為是疾病的潛在受害者?？梢汕闆r的進一步確定可以通過腦病理學的尸檢(post-mortem examination)，尋找TSE損傷的致病三合體—神經纖維網的析稀、神經膠質細胞的肥大與增生、以及神經元的損失。一些情況下，在熒光顯微鏡下也可以發(fā)現(xiàn)可見的淀粉狀沉淀。推薦使用免疫組織化學與蛋白質印跡分析，篩選一些分離的腦切片與外圍淋巴組織切片，測定是否存在不正常的蛋白感染素蛋白，以進一步確定TSE疾病。
雖然沒有特殊的理論依據(jù)，可以假定，受污染的血細胞制劑中傳染粒子的尺寸范圍是從高次序的纖維狀聚集體、到非正常折疊的單體蛋白。相應地，蛋白感染素可以i)出現(xiàn)在環(huán)境液體中，ii)通過離子相互作用或疏水性相互作用非共價連接到紅細胞的表面，或iii)通過其GPI膜錨著點部分地并入RBCC膜。因此，可以假定，通過徹底清洗，依照本發(fā)明可以實現(xiàn)蛋白感染素的降低，在徹底清洗中周圍的致病蛋白感染素蛋白不斷減少，從而改變了RBCC表面的結合平衡。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是，與對應的非清洗細胞懸液相比，清洗的血細胞含有明顯減少的分析物含量。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是，能夠清洗大容積的生物懸液，諸如血細胞。因此，在一些實施方案中，血細胞提供在容量至少50毫升的懸液中。在另一些實施方案中，提供的懸液容積至少是100毫升、125毫升、250毫升、400毫升、甚至1L或更大。
本發(fā)明方法所用的血細胞懸液包括有核細胞或無核細胞?！盁o核細胞”指的是當成熟時缺少細胞核的細胞。無核細胞的實例有血小板與血紅細胞。因為輸血通常涉及無核細胞的遷移，人們期望從其它血液成分中分離出這些細胞，諸如白細胞(例如，淋巴細胞、中性白細胞、和單核細胞)與生物分子(例如，白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子和補體)。例如，輸血以前，全血可以分成血紅細胞部分(含有小部分的白細胞)和血漿(其也含有低百分比的白細胞)?；谄涿芏炔町悾梢允褂脴藴史椒?，諸如Ficoll或Percoll梯度法，實現(xiàn)全血不同成分的分離。實現(xiàn)無核細胞分離的多種系統(tǒng)都是商業(yè)可得的，包括Haemonetics公司(Braintree，MA)的MCS去除系統(tǒng)。按照本發(fā)明的方法，清洗上述血細胞懸液。
在可取的實施方案中，使用離心法，從生物組合物中去除、和/或減少分析物。例如，該方法包括，先離心血細胞，生成包裹的細胞碎片和含有胞外液的上清液。再從包裹的細胞碎片中去除上清液。接著，將清洗溶液加入包裹的細胞碎片中，在清洗溶液中再次懸浮包裹的細胞碎片，生成再懸浮的細胞懸液。再懸浮的細胞可以進行再次的離心與懸浮。在一些實施方案中，細胞經過如文中所述的2次、3次、4次、或5次、或更多次的離心與再懸浮過程。本發(fā)明不限定清洗的特定次數(shù)，相反，離心與再懸浮步驟的次數(shù)將由需要的胞外液減少倍數(shù)、或需要的胞外液與分析物減少倍數(shù)、以及清洗溶液與胞外液的比率決定。與本發(fā)明和材料共同使用的離心系統(tǒng)，包括與離心系統(tǒng)共同使用的一次性裝置，都是商業(yè)可得的。離心系統(tǒng)包括Baxter(Deerfield，Illinois)的Haemonetics V215離心機(Braintree，MA)、CS-30000和Amicus，來自Gambro(Arvada，colorado)的Spectra和Cobe 2991細胞處理機。
可以在1℃-40℃下，采取本發(fā)明的清洗方法，可取的是20-30℃，更可取的是室溫。離心速度可以是5,000-11,000轉/分鐘，可取的是6,000-10,000轉/分鐘。
清洗步驟可以在無菌條件下人工進行，或自動進行。例如，血紅細胞可以放置于無菌容器中，諸如塑料袋。然后，將此塑料袋與機器相連，此機器在無菌條件下將袋中細胞泵出，用清洗溶液任意清洗此塑料袋，并用無菌的清洗溶液稀釋血紅細胞，在所需的溫度下溫和地持續(xù)攪拌溶液，達到所需的時間，通過離心收集血紅細胞，清除用過的清洗溶液(例如，鹽溶液、葡萄糖鹽溶液、磷酸鹽緩沖液)。接著，再加入新鮮的清洗溶液，并將清洗與離心步驟重復需要的次數(shù)。經過最后一輪清洗，細胞再次懸浮在儲存溶液中，并返回初始容器。最后，該細胞可以按照需要立即使用、儲存、或冷凍。
當細胞儲存達到7天時，儲存液可以是，例如葡萄糖鹽溶液、鹽溶液、或磷酸緩沖鹽溶液。當細胞在4℃下儲存超過7天時，儲存溶液是含有葡萄糖與磷酸鹽的儲存營養(yǎng)液，諸如Pall公司的NUTRICEL[AS-3]；Baxter(Deerfield)的AS-1，Terumo的AS-5，Pall公司的CPDA-1、CPD、CP2D。當細胞冷凍貯存時，貯存液含有甘油、或DMSO。
當以自動方式進行本發(fā)明的清洗方法時，血細胞懸液可以泵入離心機的適當管道。選擇泵速率與管道尺寸，在保證泵效率最大化同時，使細胞損傷與總清洗時間最小化。然而，可取的泵速率達到，不需要動力調節(jié)，避免滲透沖擊。相應地，本發(fā)明的泵速率可以在50-200毫升/分鐘。一次性血液管道裝置通常由醫(yī)用級聚氯乙烯制成，并可從多種商業(yè)來源購買，例如Pall公司.EastHills，NY，Baxter International，Deerfield，Illinois，Haemonetics，Braintree，MA和Cobe，Arvada，Colorado。
白細胞懸液可以穿過血液相容過濾器，可取的是白細胞減少過濾器。對于血紅細胞與全血，減少白細胞的商業(yè)過濾器能夠減少99.9％的白細胞含量(大于1000倍的減少)，并可從下列公司獲得，Pall公司、East Hills，NY；Hemasure，Marlborough，MA；和Baxter Healthcare，Deerfield，Illinois。
將親脂的乳化液加入本發(fā)明清洗溶液，特別是，從血細胞懸液中去除、和/或減少的分析物是蛋白感染素蛋白或脂類包裹的病毒。該親脂的乳化液由靜脈營養(yǎng)的組合物構成(reviewed inAdvances in intravenous lipid emulsion.Carpentier YA，Dupont IE，Deloyers World J Surg2000 Dec；24(12)1493-7)，該組合物通常以10-20％組分的長鏈甘油三酸脂(LCT)乳化液配制。在穩(wěn)定的乳化液中，中等長度的鏈狀甘油三酸脂也增強了從血液中脂類可溶性產物的洗出。脂類乳化液作為非溶血溶劑，有利于從血液中去除親脂的溶解劑。在清洗溶液中，脂類乳化劑的可取濃度范圍是0.1％-20％，其有利于從血液中去除毒性的親脂物質。
可取的是，清洗在密閉系統(tǒng)中進行，例如，功能性密閉系統(tǒng)。密閉系統(tǒng)中的清洗允許細胞在清洗后長期貯存(例如，多于1、7、14、21、28、35、40、42、甚至50天)，并且不引入環(huán)境污染物，諸如微生物污染物。
清洗可以在30分鐘到5小時內完成，并且需要大于4升清洗溶液。在可取實施方案中，清洗在4小時內完成，并且使用不到10升清洗溶液。在特別可取實施方案中，清洗在30-60分鐘內完成，并且使用多于3升但少于6升的清洗溶液。在特別可取實施方案中，具有40-98％血球比的140-260毫升，可取的是200-220毫升血紅細胞，用5至5.5升的溶液清洗，用時是170-195分鐘。
在一實施方案中，使用無菌非緩沖鹽溶液(例如，0.9％NaCl)稀釋全血，以離心方式濃縮細胞，離析血紅細胞成分。然后，在無菌鹽溶液中再次懸浮血紅細胞成分，并在22℃下攪拌10分鐘(平緩的機械攪動下)。重復清洗與再懸浮過程，直到達到分析物需要的去除率。相似的過程可用于清洗離析的血小板。
細胞清洗的其它方法包括中空纖維滲析，其中從紅細胞中分離可溶性材料，是通過將紅細胞再循環(huán)穿過帶孔的中空纖維，該孔徑足夠小、能夠保留紅細胞，并且也足夠大、允許大分子穿過(0.2-1微米孔徑)。用清洗液不斷沖洗毛細管外腔室，該沖洗用來置換和去除穿過中空纖維壁擴散的細胞外可溶性物質。該設備與材料可以從下列來源獲得，例如，Mission Medical(SanFrancisco)、Baxter(Deerfield)、Gambro(Lund，Sweden)和Asahi(Tokyo，Japan)。
此外，可以使用自旋膜。將胞外可溶的物質從紅細胞濃縮物中分離，是通過使用多孔膜實現(xiàn)的，該孔徑足夠小、能夠保留紅細胞，并且也足夠大、允許可溶性分子穿過(0.2-1微米)。該膜被封裝成中空圓柱體，當此圓柱體旋轉時，將紅細胞導入。旋轉膜以透膜方式去除紅細胞外液。商業(yè)公司包括Nexell(Santa Ana，CA)，以及Baxter Healthcare的Fenwal部門，提供了基于旋轉膜方法的血漿去除裝置(Auto C System)。
如果需要，增強血細胞穩(wěn)定性或鈍化、去除傳染物的試劑可用于清洗過程。該試劑的實例有抗菌劑與抗病毒劑。舉例包括乙亞胺低聚物，諸如二聚體、三聚體、四聚體和其衍生物。乙亞胺低聚體鈍化劑優(yōu)選應用于清洗無核血細胞之前，諸如血細胞或血小板。在本發(fā)明清洗過程之前和過程中使用乙亞胺低聚物時，優(yōu)選的清洗溶液不含淬滅劑。乙亞胺低聚物和生物組合物中的使用方法參見專利WO00/18969和WO98/51660。
意外地發(fā)現(xiàn)，按照本發(fā)明方法清洗的血紅細胞，表現(xiàn)出體內或體外存活期的延長，或兩者兼有。例如，在一些實施方案中，在清洗和任意貯藏后，紅細胞仍維持其體內的生活力，諸如大于75％清洗細胞在輸血后仍保持循環(huán)24小時。如下文實施例所述，生活力可以用業(yè)內公知的方法測定(例如，使用51Cr放射標記法)。按照本發(fā)明方法清洗的紅細胞表現(xiàn)出細胞外長期的穩(wěn)定性。例如，在一些實施方案中，按照本發(fā)明清洗血細胞制備中的細胞保存期至少達到7天。在一些實施方案中，清洗的血細胞具有14、21、28、40、或42天或更長的保存期?？扇〉氖?，按照本發(fā)明清洗并長期貯存的血細胞平均溶血含量小于，例如5％、2.5％、1％甚至0.5％。優(yōu)選的ATP含量保持在1.5微克/摩爾。
本發(fā)明將在下列非限定實施例中進一步說明。
實施例1從血紅細胞懸液中去除分析物1A.5000毫升血紅細胞的清洗過程在無菌密閉容器中，使用自動系統(tǒng)清洗減少白細胞的血紅細胞懸液。在室溫下完成此清洗過程。該過程在Haemonetics V215(Haemonetics，Braintree，MA)中進行。離心機轉筒的尺寸是275毫升或325毫升。此RBCC清洗循環(huán)使用大約5000毫升鹽溶液，用時大約190分鐘。
血球比為50-70的280-400毫升抗凝結血紅細胞濃縮物放置在培養(yǎng)袋中，并與V215無菌連接。首先，將300毫升清洗溶液(例如，0.2％葡萄糖和0.9％鹽溶液)加入培養(yǎng)袋中，并使其均衡45秒。將培養(yǎng)袋內含物泵入以8000轉/分鐘速度旋轉的離心機轉筒中。泵速度是在50-200毫升/分鐘。用80毫升清洗溶液漂洗此培養(yǎng)袋，再將此漂洗液移入轉筒中。再次用50毫升清洗溶液漂洗轉筒。將轉筒內含物返回上述培養(yǎng)袋中，用300毫升清洗溶液稀釋，并自然均衡45秒。再將培養(yǎng)袋內含物移入轉筒。第二次用80毫升清洗溶液沖洗培養(yǎng)袋。將第二沖洗液加入轉筒。用50毫升清洗溶液作為轉筒第二漂洗液，漂洗此轉筒。將轉筒內含物返回培養(yǎng)袋中，并第三次加入300毫升清洗溶液稀釋，再均衡45秒。如上所述，清洗培養(yǎng)袋和轉筒。十多次地重復上述過程(稀釋、沖洗、漂洗、返回)。在第十二次循環(huán)中，稀釋步驟如上所述，但在移入轉筒后將轉筒停止，再啟動95毫升的清洗循環(huán)。
將30毫升轉筒內含物移入培養(yǎng)袋，經過10秒延遲后，再次啟動離心機，將培養(yǎng)袋中30毫升懸液返回轉筒。轉筒以8000轉/分鐘速度旋轉30秒，再將95毫升清洗溶液移入轉筒。離心機轉筒再次停止，并將30毫升轉筒內含物移入培養(yǎng)袋，經過10秒延遲后，重新啟動離心機，將培養(yǎng)袋中30毫升懸液返回轉筒。轉筒以8000轉/分鐘速度旋轉30秒。該過程另外重復3-5次。經過7次清洗后，向含有血紅細胞的離心機轉筒加入240毫升貯存溶液，再將轉筒內含物移入最終產物袋中。取出最終產物袋，并密封。
因此，清洗過程由12次300毫升清洗溶液的稀釋與7次清洗組成，總共需要大約5L清洗溶液，并清洗用時190分鐘。
1B.5500毫升血紅細胞的清洗過程在無菌密閉系統(tǒng)中，使用自動系統(tǒng)，清洗血紅細胞懸液。在室溫下進行此清洗過程。該過程在Haemonetics V215(Haemonetics，Braintree，MA)中進行。離心機轉筒的尺寸是275毫升或325毫升。RBCC清洗循環(huán)使用大約5500毫升鹽溶液，用時大約190分鐘。
將50-70血球比、通常具有250-450毫升容積的抗凝結血紅細胞濃縮物放置在培養(yǎng)袋中，并與V215無菌連接。為了啟動此過程，用100毫升清洗溶液清洗最終產物袋線路。在此過程中，周期性地使用5毫升清洗溶液沖洗與入口線路相通的T-連接、最終產物袋線路、血液泵線路。沖洗T-連接，以防止分析物對最終產物袋線路的污染。為了啟動預稀釋程序，將培養(yǎng)袋內含物泵入以8000轉/分鐘速度旋轉的離心機轉筒中。泵速度在50-200毫升/分鐘。一旦清空培養(yǎng)袋，將泵反送、輸出150毫升清洗溶液到培養(yǎng)袋中，作為沖洗體積。在傳輸沖洗體積的過程中，使用偏離水平5.5度傾斜的振動臺，攪動培養(yǎng)袋(180赫茲，1.5英寸峰到峰振幅)。當150毫升清洗溶液送入培養(yǎng)袋后，振動器仍繼續(xù)振動45秒后停止。沖洗體積從培養(yǎng)袋中騰空，并泵入離心機轉筒。接著，將5毫升清洗溶液泵出最終產物袋線路，沖洗T-連接(T-沖洗)，再泵入離心機轉筒。T-沖洗后，使用前述步驟過程中移入此線路的沖洗溶液，凈化供體壓力監(jiān)視器(DPM)線路。此步驟的完成是通過打開內部連接供體壓力監(jiān)視器線路的凈化閥，穿過此線路中的抗菌過濾器抽入大約8毫升空氣，將線路駐留的液體抽入轉筒中。在此過程中周期性地進行DPM線路的凈化，以防止DPM線路中捕集分析物，其能夠在處理過程后期污染處理液。在凈化DPM線路后，制動離心機，使其停止。一旦離心機轉筒不再旋轉，就將大約30毫升轉筒內含物泵回培養(yǎng)袋中。再次啟動離心機并加速至8000轉/分鐘之前，將轉筒內含物均衡30秒。以50-100毫升/分鐘速度將30毫升培養(yǎng)袋內含物送回離心機轉筒。接著，當離心機保持轉動時，使泵停止。15秒鐘后，培養(yǎng)袋振動器開始工作，向培養(yǎng)袋泵送傳輸150毫升清洗溶液的沖洗體積。振動器繼續(xù)工作，大約45秒后停止。然后，將沖洗體積從培養(yǎng)袋中泵出，再泵入旋轉的離心機轉筒。如上所述地重復T-沖洗和DPM線路的凈化。接著，以大約50毫升/分鐘速度將清洗溶液泵入轉筒，并使用大約130毫升清洗溶液，漂洗轉筒內含物。然后，關閉離心機，將轉筒內含物送回培養(yǎng)袋中。完成此過程的預稀釋程序。稀釋程序如下開始稀釋程序，啟動振動器，將300毫升清洗溶液(例如，0.2％葡萄糖和0.9％鹽溶液)加入培養(yǎng)袋，稀釋培養(yǎng)袋內含物。10秒鐘后關閉振動器，再將培養(yǎng)袋內含物均衡45秒。接著，將培養(yǎng)袋內含物泵入以8000轉/分鐘旋轉的離心機轉筒。泵速度在50-200毫升/分鐘。重復T-沖洗與DPM線路的凈化。用80毫升清洗溶液沖洗培養(yǎng)袋，并在振動臺上攪動30-45秒，再將沖洗體積轉移至轉筒中。接著，以50-100毫升/分鐘泵速率用50毫升清洗溶液漂洗轉筒。將轉筒內含物返回培養(yǎng)袋中。一旦騰空轉筒，就將系統(tǒng)壓力監(jiān)視器線路(關閉轉筒流出線路)的內含物排凈到轉筒中。使用前述步驟中并入此線路的清洗溶液，凈化系統(tǒng)壓力監(jiān)視器(SPM)線路。此過程的完成是通過打開內部連接系統(tǒng)壓力監(jiān)視器的凈化閥，穿過此線路中的抗菌過濾器抽入大約8毫升空氣，將線路駐留的液體抽入轉筒中。在此過程中，周期性地進行SPM線路的凈化，以防止SPM線路中分析物的捕集，其能夠在處理過程后期污染產品。將轉筒中的SPM凈化體積騰空到培養(yǎng)袋中。
接著，用振動器攪動培養(yǎng)袋的內含物，用300毫升清洗溶液第二次稀釋，并靜置均衡45秒。接著，將培養(yǎng)袋內含物移入轉筒中。重復T-沖洗和DPM路線的凈化。隨后，用80毫升清洗溶液第二次沖洗培養(yǎng)袋。將第二沖洗液加入轉筒。用50毫升清洗溶液第二次漂洗轉筒。將轉筒內含物送回培養(yǎng)袋中。重復SPM線路的凈化。加入第三次稀釋的300毫升清洗溶液，再均衡45秒。將培養(yǎng)袋內含物送回轉筒。重復T-沖洗和DPM線路的凈化。如上所述，漂洗培養(yǎng)袋和轉筒。凈化SPM線路。上述過程(稀釋、T-沖洗、DPM線路凈化、袋沖洗、轉筒漂洗、返回、SPM線路凈化)重復十次以上。只在前十次的稀釋過程中，進行DPM和SPM線路的凈化。在第12次稀釋中的最后T-沖洗將徹底清空產物袋線路的清洗溶液，因此該線路被整理干凈。在第12輪中，稀釋步驟如上所述，但是在移入轉筒和T-沖洗后，開始95毫升清洗循環(huán)程序。
首先，將95毫升清洗溶液以75毫升/分鐘速度泵入轉筒。隨后，離心機停止工作，并將30毫升轉筒內含物移入培養(yǎng)袋中，經過45秒延遲，再次啟動離心機。轉筒以8000轉/分鐘速度旋轉30秒，將培養(yǎng)袋中30毫升懸液送回轉筒。再將第二個95毫升清洗溶液移入轉筒中。再次關閉離心機，并將30毫升轉筒內含物移入培養(yǎng)袋中，經過45秒延遲，再次啟動離心機。轉筒以8000轉/分鐘速度旋轉30秒，再將培養(yǎng)袋中30毫升懸液送回轉筒。此過程另重復5次。在第7次清洗后，關閉離心機，并將30毫升轉筒內含物騰空到產物袋中。以8000轉/分鐘速度再次啟動離心機，并旋轉45秒。接著，以75毫升/分鐘速度將250毫升貯存溶液加入含有血紅細胞的離心機轉筒中。關閉離心機，將轉筒內含物送入最終的產物袋。取出最終產物袋，并密封。
因此，清洗過程由預稀釋程序、12次300毫升清洗溶液的稀釋和7次95毫升清洗溶液的清洗組成，總共需要大約5.5升清洗溶液和190分鐘的用時。
實施2清洗的血紅細胞在生命體外的生化特征與生命體內的生活力在CP2D儲存營養(yǎng)液中，采集健康人類受檢者的對照血液單位，并且在室溫下通過Pall WBF2白細胞減少過濾器減少白細胞含量。采集后4小時，通過強力旋轉(5,000g×5分鐘，20℃)，將細胞轉化為AS-3血紅細胞(Medsep，Covina，CA)。將實驗單元采集到CPD儲存營養(yǎng)液中，并用Sepacell白細胞減少過濾器(Baxter，Round Lake，IL)減少白細胞。室溫下保持4小時后，通過在20℃下以1,615g離心4分鐘，將血紅細胞轉化為包裹的細胞，達到75-80％血球比率。然后，將乙亞胺低聚物以0.1％體積比無菌加入該單元中，使其濃度達到大約920微克/毫升。接著，在密閉系統(tǒng)裝置(Haemonetics215，Braintree，MA)中，依照實施例1A所述的過程，用6升5％葡萄糖和0.9％NaCl清洗，該密閉系統(tǒng)裝置是大約270毫升的轉筒。加入硫代硫酸鹽溶液，獲得0.2mM最終濃度，再將100毫升AS-3儲存營養(yǎng)液加入該單元。
單元在1-6℃監(jiān)控冰箱中放置42天。在此過程前后以及儲存21天、28天、35天、42天后，通過無菌連接裝置(SCD312，Terumo，Elkton，MD)提取等分試樣。應用計算的比重，將單元質量轉化為體積(1412*質量)/(旋轉的血球比率+1436)，參見，例如Halling等人，Transfusion3121S，1991。
儲存28天后，提取等分試樣，應用標準技術，以51Cr作為放射性標記，參見，例如血液學標準化國際委員會推薦的方法，用于放射性同位素血紅細胞生存的研究.Blood；38378-86，1971；以及Moroff等人，Transfusion24109-114，1984。
在同一天早晨，將從人類受檢者采集新鮮的樣品放入肝素中，同時使用99mTc放射性標記確定血紅細胞體積。參見，Bandy等人，J.Nucl.Med，16435-437，1975。同時注射兩種放射性標記后，到30分鐘時多靜脈取樣(通過99mTc測定紅細胞體積)，在24小時取樣為了以51Cr確定其恢復狀況。在培養(yǎng)期結尾的清洗步驟后，經過21天與28天儲存時，基于加入化學品后溶解細胞與上清液的提取樣品，使用敏感度為0.03微克/毫升的高壓液相色譜法，測定乙亞胺低聚物的濃度。
除了減少白細胞過程后的白細胞計數(shù)外，使用自動計數(shù)器(Advia120，Bayer，Norwood，MA)，進行細胞計數(shù)，該白細胞計數(shù)是通過Nageotte容器進行的，參見，Dzik等人，Transfusion33272-273，1993。
此單元的上清液以3600轉/分鐘(MP4R，國際設備公司，Needham Height，MA)，旋轉2次持續(xù)10分鐘，再使用COBASFARA(Roche，Nutley，NJ)自動進行的Drabkin試劑法分析血紅蛋白，并以濁度校正。使用離子特異性電極(Hitachi917，Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，IN)，確定上清液電解質濃度。使用葡萄糖氧化酶(Hitachi917)，測定葡萄糖濃度。乳酸鹽的測定是通過乳酸鹽氧化酶與過氧化酶的終點反應(Hitachi917)。用血氣分析機測定PH值(Model855，Bayer)，并在37℃下讀取數(shù)據(jù)。用3M碳酸鉀中和紅細胞高氯酸的提取物，在COBAS FARA上使用適當?shù)脑噭┖?sigma)分析其ATP含量(在以磷酸甘油酸磷酸激酶消耗ATP后，通過甘油醛磷酸脫氫酶測定NADH的氧化作用)和其DPG含量(通過測定NADH的氧化作用)。在-70-80℃下將加工的樣品存儲至4個月后，分批測定上清液。按雙份樣品進行生化分析，平均所得的結果，并反復分析數(shù)值懸殊很大的雙份樣品。
在儲存期結束時，在各單元上打出ABO和Rh標記。同時，使用標準技術，在抗球蛋白相中，將各單元與受檢者血漿交叉匹配。參見，例如技術手冊，第13期.Bethesda美國血液銀行協(xié)會，1999。
參與研究的受檢者經歷了一系列實驗，在每次再輸血前后，使用醫(yī)學中心臨床實驗室的標準方法。這些分析包括全血計數(shù)、尿分析、血清電解質、磷酸鹽、尿酸、BUN、肌酸酐、天冬氨酸、和丙氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、全膽紅素、葡萄糖、堿性磷酸酶、全蛋白、白蛋白、甘油三酯、和膽固醇。
以雙t實驗進行統(tǒng)計分析，該雙t實驗選擇0.05兩個尾數(shù)的概率，作為丟去無效假說的標準。所有數(shù)據(jù)以平均值±1標準的偏差表示。
加入乙亞胺低聚物，立即達到期望的濃度920微克/毫升。在清洗步驟后立即取樣、以及在存儲的第21天和第28天取樣，其濃度均低于分析系統(tǒng)可測的界限，表明其濃度減少了104倍。
由于對照單元的定義，使對照與實驗單元的處理中出現(xiàn)差別，該對照單元被假設為在受檢者紅細胞儲存中，保證不含非典型的結果，而不是作為識別實驗系統(tǒng)特殊特征效果的平均值。因而，在貯存期開始，對照與實驗單元之間(64.9±1.3％對應50.8±3.4％)，單元的旋轉血球比存在差別(p＜0.05)，在第0天對照組的PH值略高，與實驗組相比(15-16小時)對照組的儲存期更短(5-6小時)。此外，清洗過后，實驗單元幾乎不含有血漿，而對照單元還含有殘留的10-15％血漿。所有單元都儲存在聚氯乙烯袋中，但是清洗的實驗單元儲存在Haemonetics袋中，而對照單元儲存在Medsep袋中。所有單元含有小于1×106個白細胞。
對于經處理和清洗的細胞，血球比率，從強力旋轉產生的“包裹的紅細胞單元”的相似含量，下降到穿過Haemonetics215的含量。由此過程恢復的紅細胞，大約80％，受限于此裝置轉筒的容量(總容量275毫升)。視覺上未發(fā)現(xiàn)溶血作用。維持著清洗溶液電解質、PH、葡萄糖、內含物、以及ATP的變化。DPG降低到大約初始濃度的一半。
存儲過程中，葡萄糖濃度降低，乳酸鹽濃度升高。葡萄糖消耗速率相接近(對照0.37±0.09對應0.26±0.09毫摩爾/106個紅細胞)，但統(tǒng)計上并不明顯，然而，對照單元中生成的乳酸鹽更多(對照0.91±0.12對應0.42±0.09毫摩爾/106個紅細胞)。實驗單元中上清液的鉀含量更低。清洗后第0天紀錄的PH值差別在整個存儲期內一直存在，在第42天最顯著。
在整個存儲期內，所有單元的溶血作用低于1％。在實驗單元中存在溶血增加的趨勢，更長的存儲期內該作用更加明顯(第42天，對照0.23±0.11對應，實驗0.70±0.24％；p＞0.05)。在整個存儲過程中，各組之間ATP含量差別并不明顯(第42天，對照2.89±0.65對應實驗1.79±0.50微摩爾/克Hb；p＞0.05)。
儲存28天后，將紅細胞再注入受檢者體內。應用雙標記技術將對照組與實驗組恢復24小時，兩者之間沒有差別，如表1所示。
表1.紅細胞的恢復與存活24小時51Cr恢復(雙標記法)實驗單元85.0±5.0％對照單元85.9±2.7％實施例3白細胞的減少采集10個抗凝結全血單元，在4℃下使用Pall BPF4B降低白細胞過濾器，減少白細胞。按照實施例1A的過程清洗9個單元。用0.1％體積比的乙亞胺低聚物處理11個血液單元，在23℃下達到大約920微克/毫升濃度并持續(xù)24小時，再按照實施例1A的過程清洗。
在白細胞過濾以前，清洗、或用乙亞胺低聚物處理再清洗，每個血液單元含有2.4-4.7×109個白細胞。單獨的白細胞過濾將白細胞含量減少到0.4-56×106個白細胞/血液單元。單獨的清洗將白細胞含量減少到11-1100×106個白細胞/血液單元。用乙亞胺低聚物處理和清洗，但不進行白細胞過濾，將白細胞含量減少到1.3-4.1×106個白細胞/血液單元。
實施例4磷酸鹽緩沖清洗溶液與非緩沖清洗溶液的比較4A.在清洗與儲存42天后的生化參數(shù)在23℃下用0.1％體積比[920微克/毫升]乙亞胺低聚物處理12對相同的標準抗凝固、過濾白細胞的RBCC單元24小時。將2％體積比的0.25M過濾-無菌NaH2PO4中的乙亞胺低聚物原液加入RBCC單元。按照實施例1A的過程，用磷酸緩沖鹽(PBS)清洗緩沖液(0.9％NaCl，12.5mM磷酸鈉，PH7.7)清洗每對中的一個處理單元，另一個處理單元用標準的非緩沖鹽溶液(0.9％NaCl，0.2％葡萄糖，Baxter)清洗。在1-6℃下，所有單元在AS-3溶液中儲存42天。42天后，測定生化參數(shù)。經過42天儲存，用PBS與鹽溶液清洗單元的平均值分別是溶血作用0.55±0.21％和0.74±0.34％；ATP含量3.28±0.61微摩爾/克血紅蛋白和2.3 3±0.44微摩爾/克血紅蛋白；細胞外K+濃度43±7.4me/L和40±2.8me/L。
4B.分析物的減少在23℃下用0.1％(體積比)[920微克/毫升]乙亞胺低聚物處理7套相同的標準抗凝固、過濾白細胞的RBCC單元。將2％體積比的0.25M過濾-無菌NaH2PO4中的乙亞胺低聚物原液加入RBCC單元。處理的單元按照實施例1A或1B的過程，用清洗的鹽溶液(0.9％氯化鈉，0.2％葡萄糖)，或含有下列三種組合物之一的磷酸緩沖鹽(PBS)清洗0.9％氯化鈉，12.5mM磷酸鈉(PBS)；0.9％氯化鈉，50mM磷酸鈉(PBS-50)；0.9％氯化鈉，75mM磷酸鈉(PBS-75)。清洗后，使用敏感度大于等于30毫微克/毫升的高壓液相色譜法，測定乙亞胺低聚物的濃度。在使用鹽溶液清洗RBCC的通常實驗條件下，檢測出72毫微克/毫升殘留的乙亞胺低聚物；在12.5mM磷酸鹽緩沖液清洗的RBCC中，檢測出54毫微克/毫升殘留的乙亞胺低聚物；在50mM磷酸鹽緩沖液清洗的RBCC中，檢測出36毫微克/毫升殘留的乙亞胺低聚物；在75mM磷酸鹽緩沖液清洗的RBCC中，檢測出15毫微克/毫升殘留的乙亞胺低聚物。所有處理的和清洗的單元在1-6℃下儲存42天。用鹽溶液、PBS、PBS-50、和PBS-75清洗并經42天儲存的單元平均值分別是溶血作用0.8±0.28％，0.42±0.06％，0.43±0.13％，0.68±0.17％；ATP含量2.05±0.06微摩爾/克血紅蛋白，3.42±0.18微摩爾/克血紅蛋白，3.67±0.33微摩爾/克血紅蛋白，4.25±0.41微摩爾/克血紅蛋白；細胞外K+濃度是38.5±5.1mEq/L，36.6±4.3mEq/L，35.7±3.1mEq/L，36.3±3.2mEq/L。
實施例5分析清洗的血紅細胞中蛋白分析物的去除5A.分析人血清白蛋白的去除依照實施例1A的方法不斷反復清洗血紅細胞濃縮物，使用蛋白印跡化學發(fā)光測定法，測定去除的蛋白含量。
將每個待測人血清白蛋白(HSA)含量的樣品分成等分試樣。每個樣品的等分試樣(1毫升)以2500轉/分鐘離心10分鐘，再去除上清液。分析每套中標記A、B、C的3個樣品是否含有白蛋白。樣品A指的是處理前的血液。樣品B是對照清洗的血液，樣品C是在室溫下用0.1％體積比、920毫微克/毫升乙亞胺低聚物處理24小時再清洗的血液。在裝入SDS凝膠前，將預處理試樣(試樣A)稀釋10,000倍。不稀釋試樣B和C。用降低試樣緩沖液的2X SDS凝膠稀釋所有試樣，并煮沸3分鐘。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離10微升的每種試樣，并使用Bio-Rad semi-dry系統(tǒng)將其電泳遷移到硝酸纖維膜上。室溫下(或者，在4℃下放置過夜)在阻塞溶液(3％Dry-Powder mild，made in1X PBS)中放置1小時，通過振動膜阻塞非特異性結合位點。印跡與人血清白蛋白特異性單克隆抗體(克隆#HAS-11，Sigma，lot#127H4847)共同培養(yǎng)。抗體在1X PBS溶液中以1∶2000稀釋，并與膜連接。在膜結合了第一抗體后，用1X PBS/Tween清洗膜兩次，持續(xù)5分鐘，再用大量的DD水清洗。接著，將膜與按1∶30,000比例稀釋的蛋白A-HRP配合物共同培養(yǎng)45分鐘。用1X PBS漂洗印跡，一次5分鐘，接著用水沖洗。使用AmershamPharmacia溶液裝置，應用化學發(fā)光測定法，完成酶標記第二抗體的顯影。
為了制備標準，將來自Alpha Biotech(5％)的純人血清白蛋白緩沖交換到5mM磷酸鈉(PH7.4)中。蛋白濃度是31.1毫克/毫升。
結果表明使用此檢測方法，有可能檢測出試樣中低到10毫微克濃度的人血清白蛋白。檢測7個試樣中每個試樣，4個試樣表明，對照與處理的試樣具有非常相似的白蛋白去除量。殘留的蛋白含量比所用的最低標準低很多，10毫微克。
正常人類血漿中白蛋白濃度在30-50毫克/毫升，因此，按照實施例1A的方法白蛋白去除量應該至少在106倍。
5B.分析人血清白蛋白與免疫球蛋白G的去除依照實施例1A的方法不斷反復清洗去除白細胞的血紅細胞濃縮物，使用蛋白印跡化學發(fā)光測定法，測定去除的蛋白含量。
將每個樣品分成等分試樣。每個樣品的等分試樣(1毫升)以5000g離心5分鐘，去除上清液，以16,000g離心10分鐘，再將上清液從沉淀中移出。定量分析樣品，確定其是否含有人血清白蛋白和免疫球蛋白G。樣品A指的是處理前的血液。為了分別分析人血清白蛋白與免疫球蛋白G，在裝入SDS凝膠前，以1∶2000或1∶10,000稀釋預處理試樣(樣品A)。清洗后的樣品不必稀釋。用不減少樣品緩沖液的2X SDS凝膠進一步稀釋所有樣品，并煮沸3分鐘。
使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離10微升的每種試樣，并將其電泳遷移到硝酸纖維膜上。室溫下(或者，在4℃下放置過夜)在阻塞溶液(3％Dry-Powder mild，made in 1X PBS)中放置1小時，通過振動膜阻塞非特異性結合位點。為了分析人血清白蛋白，印跡與人血清白蛋白特異性單克隆抗體(克隆#HAS-11，Sigma，A8763)共同培養(yǎng)?？贵w在1X阻塞溶液中以1∶2000稀釋，并與膜連接。在膜結合了第一抗體后，用1X PBS/Tween清洗膜4次，持續(xù)5分鐘。將膜與按1∶10,000稀釋的羊抗鼠免疫球蛋白G HRP配合物共同培養(yǎng)60分鐘。用1X TBST漂洗印跡4次，持續(xù)5分鐘。為了檢測免疫球蛋白G，除了用1∶30,000稀釋的蛋白A HRP配合物(Pierce#32400)進行測定外，步驟與上述相同。應用化學發(fā)光測定法(ECL+，Pharmacia Amersham)，完成酶標記第二抗體的顯影。應用Flour S化學發(fā)光成像儀(BioRad)捕捉圖像，進行定量處理，使用第一定量軟件(BioRad)進行分析。
為了制備標準，再次懸浮純人血清白蛋白，主要是來自Sigma(A8763)的免疫球蛋白，并在PBS緩沖液中稀釋至需要的濃度。將純人免疫球蛋白G(Alpha Biotech)作為免疫球蛋白的標準。結論表明，使用此檢測方法，可能在初始樣品中檢測出低至98毫微克/毫升(0.49毫微克)濃度的HAS和小于等于18毫微克/毫升免疫球蛋白G。清洗后殘留的白蛋白與免疫球蛋白G濃度分別是440毫微克/毫升和140毫微克/毫升。
在初始RBCC上清液中，白蛋白和免疫球蛋白G的濃度分別是28±4毫克/毫升和9.7±3.3毫克/毫升，因此，依照實施例1A所述的方法，白蛋白和免疫球蛋白G的去除量大約應是殘留量的104.8倍。
實施例6蛋白感染素蛋白摻合材料的制備A.瘙癢病倉鼠腦組織均漿的制備在冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中將瘙癢病(菌株263K)感染的倉鼠腦攪均，最終達到10％(重量/體積)濃度。組織均漿經聲波處理(Microsonix Cup超聲波儀設置8-10，3×1分鐘)，生成均勻的懸液，用于摻合。
B.瘙癢病倉鼠腦微神經元致病蛋白感染素蛋白的制備如上所述，攪均、并用超聲波處理瘙癢病(菌株263K)感染的倉鼠腦。將此制備物低速(5,000g，持續(xù)10分鐘)離心，沉淀粗碎片。去除上清液，超離心(200,000g，持續(xù)30分鐘)沉淀致病的蛋白感染素蛋白。小心去除并丟棄上清液和脂外皮。在PBS中再懸浮此沉淀，將其聲波處理致均勻，再用于摻合。
C.正常牛腦組織均漿的制備使用超聲波處理，攪均正常的牛腦。用2％Triton X100從組織均漿中抽提非傳染性蛋白感染素蛋白。使用SP-瓊脂糖凝膠色譜法、與金屬螯合色譜法，部分地提純抽提的混合物。含有非傳染性蛋白感染素蛋白的片段用于摻合。
D.來自人血小板的正常蛋白感染素蛋白(huPltPrPC)1.984毫微克/毫升的制備物用HEPES緩沖液清洗來自一個去除單元的血小板。加入CaCl2和鈣離子載體，誘導血小板的活性。將活化的血小板以230,000g超離心1小時，沉淀出不可溶的蛋白。將含有984毫微克/毫升可溶非傳染蛋白感染素蛋白的上清液用于摻合。
2.5400毫微克/毫升的制備物用HEPES緩沖液清洗來自6個去除單元的血小板。加入CaCl2和鈣離子載體，誘導血小板活性。加入蛋白酶抑制劑，阻止蛋白水解。在230,000g下，超離心活化的血小板1小時，沉淀出細胞碎片和非可溶的蛋白。使用10KDa公稱分子量分界的離心濃縮器，將含有可溶的非傳染蛋白感染素蛋白的上清液濃縮大約10倍，并將濃縮物用于摻合。該45毫升摻合液(spike)含有5400毫微克/毫升非傳染性蛋白感染素蛋白。
E.敘利亞倉鼠重組的蛋白感染素蛋白(Sha rPrP)從動物健康研究所TSE資源中心(Compton，Berkshire，UK)獲得重組α和β型的全長蛋白感染素蛋白。主要在大腸桿菌中表達該蛋白，并且在還原和變性條件下，應用IMAC和陽離子交換色譜法，提取并提純。使用Jackson和其同事的CuCl2滲析法，將此蛋白氧化、并重折疊成其α型(Jackson，G.S.等人(1999)。不同表達人蛋白感染素蛋白的多種折疊途徑，Biochim Biophys Acta1431，1-13。從重組的蛋白感染素蛋白α型制備重組的蛋白感染素蛋白β型(Jackson，G.S.等人，1999)。由SDS凝膠分析、質譜分析、和循環(huán)二色性提供了重組蛋白α和β型的質量控制數(shù)據(jù)。在摻合實驗中使用以前，用100,000g離心重組的蛋白1小時，去除在存儲或冷凍中形成的不溶蛋白，并用紫外光譜法測定其濃度。
實施例7使用自動清洗過程去除蛋白感染素蛋白A.從RBCC中去除瘙癢病感染的倉鼠腦組織均漿使用白細胞過濾器，例如PALL RCXL11，降低抗凝結RBCC單元的白細胞。以5％體積比，將按照實施例6制備的10％瘙癢癥感染的倉鼠腦組織均漿加入RBCC(大約2個腦或200微克致病蛋白感染素蛋白)，再人工混合此單元1分鐘。室溫下攪拌培養(yǎng)此RBCC單元1小時。接著，按照實施例1A清洗此RBCC單元。
從清洗的RBCC單元提取0.5毫升樣品，再用等體積的10％sarkosyl溶解。室溫下以130,000g旋轉此樣品30分鐘。內生的非傳染蛋白感染素蛋白是可溶的，并與保留在上清液中的其它血液成分共同傾析。然后，用5％sarkosyl清洗一次沉淀，再在室溫下以130,000g超離心30分鐘。用PBS溶液清洗一次沉淀，去除殘留的sarkosyl，再在室溫下以130,000g超離心30分鐘。將最后的沉淀再次懸浮在PH7.4、小容積的6M胍鹽酸、50mM Tris溶液中，用聲波處理使其均勻，再煮沸10分鐘。然后，使用時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法(DELFIA，參見，HemmilaScand.J.Clin.lab Invest，48389-399，1988，和MacGregor等人，Vox Sang，7788-96，1999)，直接化驗樣品的蛋白感染素蛋白、或致病的蛋白感染素蛋白(在GdnCl中變性后)。
與未清洗的摻合對照中瘙癢癥腦組織均漿濃度相比，瘙癢癥倉鼠腦組織均漿的濃度降低了101.2-103.0倍。通過將樣品與標準曲線比較，測定了文中所述自動和人工清洗過程中以對數(shù)表示的去除率，該標準曲線的生成是通過將最初摻合的WB有限地稀釋到非摻合的類似WB中。此外，使用由非傳染性蛋白感染素蛋白校驗劑血小板生成的標準曲線，量化非傳染的蛋白感染素蛋白含量。先使用洗滌劑(1.0％Triton X100)處理清洗的血小板，隨后以2000g離心20分鐘，去除粗糙的細胞碎片，得到非傳染性蛋白感染素蛋白校驗劑。校驗劑參照SHa重組蛋白感染素蛋白公知濃度的標準曲線，進行校準，并測定為709毫微克/毫升。
B.從全血中去除瘙癢病感染的倉鼠腦組織均漿按實施例6所述，制備10％倉鼠瘙癢病腦組織均漿(菌株263K)。用5％體積的10％SBH(大約3個腦或300微克致病的蛋白感染素蛋白)摻合全血(WB)單元，并在22℃下培養(yǎng)1小時。將該單元分離成RBCC成分(1300g，4分鐘)，該RBCC成分再懸浮在AS-3溶液中，并通過Pall RCXL1白細胞降低過濾器減少白細胞。按照實施例1A清洗白細胞減少的單元。在白細胞減少前、后和清洗過程之后，提取試樣用于分析。去除內生非傳染的蛋白感染素蛋白，利用超離心過程從樣品中獲得致病蛋白感染素蛋白，并按實施例7A所述測定。
致病的蛋白感染素蛋白的減少量大于10-102.9倍。100.1-100.8的清除率歸因于減少白細胞的過程，101.6-102.1的清除率歸因于所述的清洗過程。
C.去除人內生非傳染的蛋白感染素蛋白應用標準血液存儲技術(1300g，4分鐘)，將全血單元分離成RBCC。將該RBCC穿過PALL RCXL1白細胞減少過濾器，過濾白細胞。按照實施例1A的過程，清洗過濾了白細胞的RBCC單元(LR-RBCC)。
使用實施例7A所述的時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法，量化與RBCC連接的殘留非傳染蛋白感染素蛋白。人內生蛋白感染素蛋白的濃度降低到分析測定的水平。與未清洗對照中人內生非傳染蛋白感染素蛋白的濃度相比，人內生蛋白感染素蛋白的濃度降低了102(101.8-102)。
D.去除人內生非傳染性蛋白感染素蛋白和摻合的人血小板派生的非傳染性蛋白感染素蛋白使用標準的血液存儲技術(1300g，4分鐘)，將兩個相容的全血單元分離成RBCC。將兩個單元合并，再分配到兩個相同的單元中。將實施例6D2所述制備的人血小板派生的非傳染性蛋白感染素蛋白(240ug)摻合到一個RBCC單元中，并培養(yǎng)1小時。第二個單元容納了等體積的HEPES緩沖液。將RBCC單元通過PALL RCXL1白細胞減少過濾器，過濾其白細胞。按照實施例1A的過程(n＝5)清洗白細胞減少的RBCC單元。使用實施例7A所述的時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法，測定細胞片段和游離細胞片段中內生和摻合的蛋白感染素蛋白濃度。通過標準曲線測定游離細胞樣品中蛋白感染素蛋白的濃度，該標準曲線是由血小板派生的非傳染性蛋白感染素蛋白校準劑產生的。細胞片段的減少是基于，將摻合原材料連續(xù)地稀釋到非摻合的清洗血液中。
對細胞片段的分析表明，單獨的清洗過程造成了huPltPrPC的103倍降低。此外，在減少白細胞以前，內生PrPC和huPltPrPC的含量分別是32.4毫微克/毫升和1140毫微克/毫升；清洗前分別是16.3毫微克/毫升和850毫微克/毫升；清洗后，分析出的非細胞成分小于等于0.14毫微克/毫升。內生非傳染性蛋白感染素蛋白減少總量達到大于102.35倍，其中100.3是由白細胞過濾去除的，清洗進一步減少了大于102倍內生非傳染蛋白感染素蛋白的含量。同樣，huPltPrPC減少總量達到大于103.9倍，其中100.13倍是由白細胞過濾去除的，清洗進一步減少了大于等于103.7倍內生非傳染蛋白感染素蛋白的含量。
E.去除敘利亞倉鼠重組的蛋白感染素蛋白使用標準的血液存儲技術(1300g，4分鐘)，將兩個相容的全血單元分離成RBCC。將兩個單元合并，再分配到兩個相同的單元中。將RBCC單元通過PALL RCXL1白細胞降低過濾器，過濾白細胞。按實施例6E所述制備來源于大腸桿菌的敘利亞倉鼠rPrP重組體(400毫微克)，將其摻合到一個RBCC單元之中，并培養(yǎng)1小時。第二個單元容納了等體積的HEPES緩沖液。按照實施例1A的過程，清洗過濾了白細胞的RBCC單元。使用實施例7A所述的時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法，測定細胞和游離細胞片段中摻合的蛋白感染素蛋白濃度。通過與標準曲線相比較，測定游離細胞樣品中蛋白感染素蛋白的濃度，該標準曲線是由血小板派生的非傳染性蛋白感染素蛋白校準劑生成的。細胞片段的減少是基于，將摻合的原材料連續(xù)地稀釋到非摻合的清洗血液中。
在清洗前，游離細胞懸液中α型Sha重組蛋白感染素蛋白的含量是1405毫微克/毫升，清洗后小于等于0.12毫微克/毫升，蛋白感染素蛋白減少量大于等于104倍。對細胞片段的分析證明了大于等于103倍的減少量。
實施例8通過人工清洗過程去除蛋白感染素蛋白使用白細胞過濾器，例如PALL RCXL1，減少抗凝結RBCC單元的白細胞。將含有或不含摻合劑的25毫升樣品移入50毫升圓錐管中。再向此圓錐管中加入等體積的鹽溶液和葡萄糖溶液，混合2分鐘。離心此材料，沉淀出紅細胞(2000g，持續(xù)4分鐘)。在不攪混紅細胞層的情況下，輕輕倒出上清液。加入鹽溶液與葡萄糖溶液，將試管內含物恢復到其初始體積(25毫升)。重復此過程，共清洗11次。將最后的RBCC沉淀再懸浮在AS-3貯存介質中。
當RBCC不含摻合劑時，使用實施例7A所述的時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法，測定內生非傳染性的蛋白感染素蛋白。與未清洗對照的人內生非傳染性蛋白感染素蛋白的濃度相比，清洗的樣品中人內生非傳染蛋白感染素蛋白的濃度至少減少了100倍。
將如實施例6所述制備的牛非傳染蛋白感染素蛋白或huPltPrPC以10％體積比摻入25毫升RBCC樣品，使用實施例7A所述的時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法，測定非傳染的蛋白感染素蛋白。與未清洗對照的牛非傳染性蛋白感染素蛋白或huPltPrPC的濃度相比，清洗的樣品中牛非傳染蛋白感染素蛋白或huPltPrPC濃度降低。
將如實施例6所述制備的瘙癢病倉鼠腦組織均漿的致病蛋白感染素蛋白或瘙癢病倉鼠腦微神經元的致病蛋白感染素蛋白，以10％體積比摻入25毫升RBCC樣品，采取離心樣品的步驟，并使用實施例7A所述的時間增強的溶解性分解熒光免疫分析法，測定致病的蛋白感染素蛋白。與未清洗對照中其濃度相比，瘙癢病倉鼠腦組織均漿的致病蛋白感染素蛋白或瘙癢病倉鼠腦微神經元的致病蛋白感染素蛋白的濃度降低。
實施例9-將HSA和IgG的去除與PrP去除相比較將RBCC單元與實施例7D和E所述的huPlt PrPc或α型SHarPrP摻合，并按照實施例1A的方法清洗。在每次清洗循環(huán)后移出樣品，使用實施例5B的方法，定量分析游離細胞片段，測定是否存在HSA和IgG，并且如實施例7A所述，定量蛋白感染素蛋白。HAS(n＝5)、IgG(n＝5)、huPltPrPc(n＝5)、和rPrP(n＝2)的平均初始含量分別是27.9毫克/毫升、9.67毫克/毫升、850毫微克/毫升、和1405毫微克/毫升。在初始的4次清洗循環(huán)中，蛋白感染素蛋白的去除率與人血清白蛋白和免疫球蛋白G的去除率相同，在這4次清洗循環(huán)后，蛋白感染素蛋白含量降低到DELFIA測定法的敏感含量之下。第一次清洗循環(huán)結束時，人血清白蛋白和免疫球蛋白G、huPltPrPc、rPrPc的全部去除率分別是101.63、101.58、101.60和101.52。第二次清洗循環(huán)結束時分別是102.78、102.69、102.76、102.71；第三次清洗循環(huán)結束時分別是103.60、103.39、103.61、103.13；第四次清洗循環(huán)結束時分別是104.17、103.88、103.88、103.62。在最后清洗的樣品中，人血清白蛋白和免疫球蛋白G的含量分別進一步降低到0.44ug/毫升和0.14ug/毫升，說明總減少量分別是104.8和104.83。由于含量降低到分析法敏感度水平以下(0.14ng/毫升)，因此不可能在第四次清洗后定量蛋白感染素蛋白。
實施例10對減少海綿狀腦病血液介質傳播的分析10A.對減少傳染性海綿狀腦病血液介質傳播的羊生物鑒定用上述多倍計量的牛海綿狀腦病傳染的牛腦組織均漿，喂食1-5只VRQ/VRQ北英格蘭切維厄特綿羊，例如Houston，F(xiàn)；Foster，J.D；Chong，A；Hunter，N，和Bostock，C.J.通過輸血在羊中傳播牛海綿狀腦病.Lancet.2000年9月16日；356(9234)999-1000。優(yōu)選的是，在前三個月中，以每月間隔喂食1-2克劑量。在10天、六個月、12個月、18個月和所選時間，從每只羊，采集兩個或多個血液單元。依照實施例1A或1B的過程，在每個時間點清洗采集的血液，剩余的單元在室溫下保存，作為對照。按照實施例5、7、或9任一所述，測定通過實施例1A或1B過程中胞外蛋白的減少，例如，免疫球蛋白G、和/或血清白蛋白、和/或細胞蛋白感染素蛋白、和/或傳染的蛋白感染素蛋白的減少。
用至少來自一個時間點(組A受體羊)的清洗RBCC單元，輸入NZ切維厄特羊受體(ARQ/ARQ)，并用來自相同時間點未清洗對照的未清洗全血、或天然的血漿衰竭紅細胞片段輸入第二受體(組B受體羊)。
觀察受體羊5年，尋找本發(fā)明詳細說明所述的傳染性海綿狀腦病的病征，并且/或測定該疾病的生化指標。例如，在第二次傳染一組近交實驗鼠后，采用蛋白感染素蛋白甘油型(Hope，J Wood，S.C Birkett，CR，Chong，A，Bruce，M.E，Cairns，D，Goldmann，W，Hunter，N和Bostock，CJ(1999)。對綿羊蛋白感染素蛋白的分子分析鑒別出牛海綿狀腦病與天然瘙癢病實驗離析物之間的相似性，CH1641.J Gen Virol80(Pt1)，1-4)或傳統(tǒng)的損傷輪廓印跡型操作法，獲得將牛海綿狀腦病傳染給輸血受體的有力證據(jù)。
與組B受體相比，作為傳染性海綿狀腦病通過輸血傳播風險的正向降低，記錄下了組A受體中發(fā)病率或疾病生化指標的明顯降低。與組B受體相比，作為通過輸血疾病從潛伏到發(fā)作所需時間的正向延長，紀錄下了組A受體中疾病發(fā)作的明顯延遲或疾病的生化指標。
10B.對減少傳染性海綿狀腦病血液介質傳播的鼠生物鑒定將按照實施例1A或1B(受體組A)清洗的20uL潛在傳染的RBCC注入受體鼠腦內，并將20ul對應的未清洗全血、或天然血漿衰竭的紅細胞片段對照(受體組B)注入第二組受體鼠。測定潛在傳染的清洗RBCC單元和未清洗對照中的胞外蛋白濃度，諸如，免疫球蛋白G或血清白蛋白、如實施例5、7或9所述的細胞蛋白感染素蛋白、和/或致病的蛋白感染素蛋白。受體鼠可以是敏感的轉基因系，諸如公知系Tg101L、或TgHu101L、或Tg BoPrP或常規(guī)的RIII或C57B1鼠(Bruce，M.E，Will，RG，Ironside，J.W，McConnell，I，Drummond，D，Suttie，A，McCardle，L，Chree，A，Hope，J，Birkett，C，Cousens，S，F(xiàn)raser，H，and Bostock，CJ(1997).對鼠的傳播表明CJD的“新型變異”是由牛海綿狀腦病介質造成的.Nature 389,498-501；Bruce，M.E(1993).瘙癢病菌株變異和突變.Br Med Bull49,822-38)。
作為降低傳染性海綿狀腦病通過輸血傳播風險的證據(jù)，與組B受體相比，將明顯降低的組A受體發(fā)病率或疾病生化指標紀錄在案。作為通過輸血疾病從潛伏到發(fā)作所需時間的延長，與組B受體相比，將組A受體疾病發(fā)作的明顯延遲或疾病的生化指標紀錄在案。
實施例11降低了傳染性海綿狀腦病通過輸血的傳播按照實施例1A或1B清洗人RBCC單元。測定人RBCC胞外蛋白的濃度，諸如免疫球蛋白G或血清白蛋白、如實施例5、7、或9所述的蛋白感染素蛋白、和/或致病的蛋白感染素蛋白。含有一定胞外蛋白濃度的RBCC與上述輸入受體實施例10紀錄的RBCC單元相對應。
其它實施方案通過上述描述，業(yè)內技術人員容易確定本發(fā)明的重要特征。在不超出本發(fā)明范圍和思想的情況下，業(yè)內技術人員能夠對本發(fā)明進行多種變化和改進，使其適應不同的用途和條件。其它實施方案也在權利要求范圍之內。
權利要求
1.一種減少血細胞懸液中分析物濃度的方法，該方法包括(i)提供容積大于50毫升血細胞初始懸液，其中含有血細胞和胞外液；(ii)用特定清洗溶液清洗血細胞初始懸液，與血細胞初始懸液的分析物濃度相比，分析物濃度足以減少了至少103倍，其中血細胞懸液的血細胞在4℃下于儲存液中保存超過21天，仍保持生活力。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中清洗包括(i)離心血細胞初始組合物，生成粒狀細胞碎片和上清液；(ii)從粒狀細胞碎片去除上清液；(iii)向粒狀細胞碎片加入清洗溶液；(iv)清洗溶液中再懸浮粒狀細胞碎片，生成再懸浮的細胞懸液；(v)任意重復步驟(i)-(iv)；(vi)在儲存液中再懸浮粒狀細胞碎片。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中分析物是小分子。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中小分子是乙亞胺低聚物，吩噻嗪衍生物、吖啶衍生物、補骨脂素衍生物或核黃素。
5.根據(jù)權利要求3的方法，其中小分子是治療劑。
6.根據(jù)權利要求2的方法，其中分析物是蛋白。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中蛋白是蛋白感染素蛋白。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其中蛋白感染素蛋白是致病蛋白。
9.根據(jù)權利要求2的方法，其中分析物是細胞。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中細胞是白細胞。
11.根據(jù)權利要求10的方法，其中該方法還包括，用抗病原體處理血細胞的初始懸液。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中抗病原體是乙亞胺低聚物，吩噻嗪衍生物、吖啶衍生物、補骨脂素衍生物或核黃素。
13.一種減少血細胞懸液中胞外液濃度的方法，其中包括(i)提供容積大于50毫升血細胞初始懸液，血細胞懸液含有血細胞和胞外液；(ii)用特定清洗溶液清洗血細胞初始懸液，與血細胞初始懸液中胞外液含量相比，血細胞組合物中胞外液濃度足以減少了至少103倍，其中血細胞組合物中的血細胞在4℃下于儲存液中保存至少超過28天，仍保持生活力。
14.根據(jù)權利要求13的方法，其中清洗包括(i)離心血細胞初始組合物，生成粒狀細胞碎片和上清液；(ii)從粒狀細胞碎片去除上清液；(iii)向粒狀細胞碎片加入清洗溶液；(iv)在清洗溶液中再懸浮粒狀細胞碎片，生成再懸浮的細胞懸液；(v)任意重復步驟(i)-(iv)；(vi)儲存液中再懸浮粒狀細胞碎片。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中血細胞組合物中的血細胞在4℃下于儲存液中保存至少35天，仍保持生活力。
16.根據(jù)權利要求14的方法，其中血細胞懸液的胞外液含有分析物，與血細胞初始懸液中分析物濃度相比，清洗減少了分析物的濃度。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中與血細胞初始懸液中分析物濃度相比，分析物濃度至少減少了104倍。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中血細胞懸液主要含有哺乳動物的血紅細胞。
19.根據(jù)權利要求18的方法，其中分析物是小分子。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中小分子是抗病原體。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中抗病原體減少到對哺乳動物血細胞受體無毒害的濃度。
22.根據(jù)權利要求21的方法，其中抗病原體是乙亞胺低聚物，吩噻嗪衍生物、吖啶衍生物、補骨脂素衍生物或核黃素。
23.根據(jù)權利要求19的方法，其中小分子是治療劑。
24.根據(jù)權利要求22的方法，其中抗病原體是乙亞胺低聚物及其衍生物。
25.根據(jù)權利要求18的方法，還包括將哺乳動物血紅細胞懸液穿過血液相容過濾器的步驟。
26.根據(jù)權利要求25的方法，其中血液相容過濾器是白細胞減少過濾器。
27.根據(jù)權利要求18的方法，其中分析物是蛋白。
28.根據(jù)權利要求27的方法，其中蛋白是蛋白感染素蛋白。
29.根據(jù)權利要求28的方法，其中蛋白感染素蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。
30.根據(jù)權利要求29的方法，還包括對致病蛋白感染素蛋白減少的測定。
31.根據(jù)權利要求26的方法，還包括對致病蛋白感染素蛋白減少的測定。
32.根據(jù)權利要求18的方法，還包括，向清洗溶液加入脂類乳化液。
33.根據(jù)權利要求32的方法，還包括對致病蛋白感染素蛋白減少的測定。
34.根據(jù)權利要求26的方法，還包括，向清洗溶液加入脂類乳化液。
35.根據(jù)權利要求34的方法，還包括對致病蛋白感染素蛋白減少的測定。
36.根據(jù)權利要求18的方法，還包括，用乙亞胺低聚體處理血細胞懸液。
37.根據(jù)權利要求36的方法，其中減少的分析物是細胞。
38.根據(jù)權利要求37的方法，其中該細胞是白細胞。
39.根據(jù)權利要求38的方法，包括對蛋白感染素蛋白減少的測定。
40.根據(jù)權利要求39的方法，包括對致病蛋白感染素蛋白減少的測定。
41.根據(jù)權利要求18的方法，其中清洗溶液是磷酸緩沖鹽溶液。
42.根據(jù)權利要求41的方法，其中與用鹽溶液或葡萄糖鹽溶液清洗的血紅細胞相比，血紅細胞保留了更高的ATP含量。
43.根據(jù)權利要求18的方法，其中清洗是在密閉系統(tǒng)中進行。
44.根據(jù)權利要求43的方法，其中清洗自動進行。
45.一種血細胞組合物，其特征在于以權利要求13的方法制備。
46.根據(jù)權利要求45的血細胞組合物，其中血細胞組合物是有效的藥用血產品。
47.一種輸血的方法，包括將權利要求46的血細胞產品輸入受體。
48.一種減少血細胞組合物中致病蛋白感染素蛋白濃度的方法，該方法包括(i)提供含有血紅細胞和胞外液的哺乳動物血細胞初始懸液；(ii)用特定清洗溶液清洗血細胞懸液，與哺乳動物血細胞初始懸液中致病蛋白感染素蛋白濃度相比，充分減少了致病蛋白感染素蛋白的濃度。
49.根據(jù)權利要求48的方法，還包括分析血細胞懸液，測定是否含有致病蛋白感染素蛋白。
50.根據(jù)權利要求49的方法，還包括，與哺乳動物血細胞初始懸液的致病蛋白感染素濃度相比，檢測出致病蛋白感染素蛋白濃度至少減少10倍。
51.根據(jù)權利要求48的方法，還包括分析血細胞組合物，測定是否含有蛋白感染素蛋白。
52.根據(jù)權利要求51的方法，還包括對蛋白感染素蛋白濃度至少減少100倍的檢測。
53.根據(jù)權利要求48的方法，還包括，向清洗溶液加入脂類乳化液。
54.根據(jù)權利要求48的方法，還包括，將血細胞懸液透過血液相容過濾器。
55.根據(jù)權利要求48的方法，還包括，用抗病原體處理血細胞的初始懸液。
56.根據(jù)權利要求55的方法，其中抗病原體是乙亞胺低聚體。
57.一種血紅細胞懸液，其特征在于是依照權利要求50獲得的。
58.根據(jù)權利要求57的血紅細胞懸液，其中血紅細胞組合物是有效的藥用血產品。
59.一種輸血方法，包括將權利要求58的血細胞產品輸入受體。
60.一種減少血產品傳播傳染性海綿狀腦病風險的方法，包括充分減少血產品中可測細胞外蛋白含量的步驟。
61.根據(jù)權利要求60的方法，其中細胞外蛋白的減少是通過清洗血細胞懸液中的血細胞。
62.根據(jù)權利要求61的方法，其中清洗包括(i)提供了含有血細胞與胞外液的血細胞懸液；(ii)離心血細胞初始組合物，生成粒狀細胞碎片和上清液；(ii)從粒狀細胞碎片去除上清液；(iii)向粒狀細胞碎片加入清洗溶液；(iv)在清洗溶液中再懸浮粒狀細胞碎片，生成再懸浮的細胞懸液，并任意重復步驟(ii)-(iv)。
63.根據(jù)權利要求62的方法，其中減少的細胞外蛋白是蛋白感染素蛋白。
64.根據(jù)權利要求63的方法，其中減少的蛋白感染素蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。
65.根據(jù)權利要求62的方法，還包括對細胞外蛋白濃度減少的檢測。
66.根據(jù)權利要求65的方法，其中細胞外蛋白選自血清白蛋白、免疫球蛋白G、細胞因子和蛋白感染素蛋白。
67.根據(jù)權利要求66的方法，其中細胞外蛋白是致病的蛋白感染素蛋白。
68.根據(jù)權利要求62的方法，還包括用乙亞胺低聚物處理血細胞初始懸液的步驟。
69.根據(jù)權利要求62的方法，其中血產品是血紅細胞的濃縮物。
70.根據(jù)權利要求62的方法，其中血細胞產品是人類血紅細胞的濃縮物。
71.一種抑制傳染性海綿狀腦病通過血產品發(fā)作的方法，其中包括充分減少血產品中可測的細胞外蛋白含量的步驟。
72.根據(jù)權利要求71的方法，其中胞外蛋白的減少是通過清洗血細胞懸液中的血細胞。
73.根據(jù)權利要求71的方法，其中清洗包括(i)提供了含有血細胞與胞外液的血細胞懸液；(ii)離心血細胞初始組合物，生成粒狀細胞碎片和上清液；(ii)從粒狀細胞碎片去除上清液；(iii)向粒狀細胞碎片加入清洗溶液；(iv)清洗溶液中再懸浮粒狀細胞碎片，生成再懸浮的細胞懸液，并任意重復步驟(ii)-(iv)。
全文摘要
本發(fā)明是基于發(fā)明了從血細胞去除分析物的方法，該方法制備了明顯減少細胞群體中殘留分析物含量的血細胞。該方法能夠適用大容積血細胞懸液，以此方法制備的細胞經長時間儲存仍保持生活力，并且適用于治療，諸如輸血?？扇〉难毎苽涫呛醒t細胞(RBC)群體的制備。
文檔編號A61K35/18GK1681521SQ02805093
公開日2005年10月12日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權日2001年1月22日
發(fā)明者約翰·查普曼, 安德烈·珀馬爾, 詹姆斯·霍普 申請人:V·I·技術有限公司