專利名稱：包括編碼抗－血管生成蛋白或者其部分的基因的用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物，包括一種編碼抗-血管生成蛋白或者其部分的基因，并且更具體地，本發(fā)明提供了一種用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療方法，其通過構(gòu)建包括一種表達(dá)編碼抗-血管生成蛋白或者其部分的基因的重組載體，并且將該重組載體或者用該重組載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞移植入患者的受侵襲的區(qū)域，并且還提供了用于該基因治療的組合物。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的一個(gè)主要的意圖是防止滑液組織增生，因?yàn)槠湫纬刹豢赡嫫茐牡厥芮忠u的關(guān)節(jié)的軟骨和骨的關(guān)節(jié)翳。迄今為止，依然沒有研發(fā)出可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效的藥物，而已經(jīng)研發(fā)出的藥物只呈現(xiàn)出有限的效果。一旦發(fā)生關(guān)節(jié)炎，它將會(huì)引起經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的痛苦。
目前采用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的醫(yī)療方法如下。起始治療通常使用的藥物是非甾類抗炎癥藥物(NSAID)。這些NSAID有限地改善患者的疾病狀況，但是不能防止關(guān)節(jié)區(qū)域的軟骨破壞或者疾病的發(fā)展。此外，半數(shù)的使用這種療法的患者會(huì)在一年之內(nèi)因?yàn)閲?yán)重的副作用而終止該治療。接下來，使用金藥物，例如硫代蘋果酸金鈉和硫代硫酸金鈉，或者病情改善抗風(fēng)濕藥(DMARD)，例如青霉胺和抗瘧藥。這些藥物也會(huì)減少類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步發(fā)展，但是在用DMARD治療5年后，只有5-15％的患者還在使用該藥物，這是因?yàn)槠浒橛袊?yán)重的副作用。如果上述的藥物不再有效，應(yīng)該通過外科手術(shù)用人工關(guān)節(jié)代替受類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎侵襲的關(guān)節(jié)。
如此，迄今為止使用的大多數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療法并非設(shè)計(jì)為具有特定的靶分子并且還有在大多數(shù)的病例中只表現(xiàn)出輕微的效果的限制。同時(shí)，已經(jīng)報(bào)道了通過注意到炎癥-誘導(dǎo)的細(xì)胞因子，例如TNF作為用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的靶分子以及導(dǎo)入一種對(duì)TNF特異性的抗體或者一種可溶性的TNF-受體到患者的受侵襲的區(qū)域?qū)е耇NF的失活而出現(xiàn)的治療效果(Maini，R.N.等，免疫學(xué)研究(Immunol.Rev.)144195，1995；Moreland，15 L.W.等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl.J.Med.)337141，1997)。與此相伴，各種體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)正在連續(xù)地表達(dá)具有免疫抑制功能的分子的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中日益發(fā)展。因此，大多數(shù)的目前的療法針對(duì)矯正按照推測(cè)地驅(qū)動(dòng)滑液細(xì)胞增殖的免疫異常。
血管生成作用，形成新的血管，是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中最早的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)并且似乎是關(guān)節(jié)翳發(fā)展的需要。據(jù)信這種新血管化不僅通過釋放所需的血管生成因子到該關(guān)節(jié)翳而維持該慢性的結(jié)構(gòu)改變，而且在炎癥中起著細(xì)胞因子和蛋白酶活性的來源的有效作用。來自血管生成作用的擴(kuò)展的血管-床體積可以為炎性細(xì)胞提供增加的浸潤該滑液的機(jī)會(huì)。盡管依然沒有鑒定出特異性地促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的血管生成作用的因子，但是滑液組織和滑液均富集有血管生成作用-促進(jìn)分子。這些包括細(xì)胞因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，白細(xì)胞介素-8(IL-8)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，和可溶性的粘附分子，例如E-選擇蛋白。這些資料提示使用抗血管生成過程對(duì)于有意地改變類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)程的治療潛能。
迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多抑制血管生成作用的因子。其中的大多數(shù)產(chǎn)生自原蛋白(protoprotein)的切割，并且已知代表性的制管張素(angiostatin)，內(nèi)抑制素(endostatin)和血小板因子-4等等。
制管張素是由血纖蛋白溶酶原的98th到440th位氨基酸所構(gòu)成的。制管張素起始地分離自帶有Lewis肺癌的小鼠并且被鑒定為血纖蛋白溶酶原的38-kDa的內(nèi)片段，其包括該分子的頭四個(gè)kringle(O’Relly，M.等，細(xì)胞(Cell)79715，1994)。據(jù)報(bào)道在六個(gè)癌癥模型實(shí)驗(yàn)中皮下注射純化的制管張素可以有效地抑制原發(fā)的腫瘤的生長(O’Relly，M.等，自然醫(yī)學(xué)分冊(cè)(Nat.Med.)2689，1996)。
內(nèi)抑制素是由膠原蛋白XVIII的C-末端的183個(gè)氨基酸所構(gòu)成的。據(jù)報(bào)道在四個(gè)癌癥模型實(shí)驗(yàn)中皮下注射純化的內(nèi)抑制素可以有效地抑制原發(fā)的腫瘤的生長(O’Relly，M.等，細(xì)胞(Cell)88277，1997)。
血小板因子-4屬于CXC細(xì)胞因子家族，其是由低于10kDa的趨化多肽構(gòu)成，并且具有抗-血管生成活性。據(jù)報(bào)道血小板因子-4抑制腫瘤的生長，例如B-16黑素瘤和HCT-116結(jié)腸癌(Maion，T.E.等，癌癥研究(CancerResearch)，512077，1991)。
已知血管生成作用與各種疾病有關(guān)，例如腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，視網(wǎng)膜炎，血管瘤，慢性炎癥，腸粘連，動(dòng)脈硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等，但是依然沒有證實(shí)抗血管生成因子實(shí)際上是對(duì)所有列舉的疾病是有效的。只報(bào)道了這些因子與特定的疾病有關(guān)的腫瘤抑制效應(yīng)(USP 5,856,315，USP 5,733,876，USP 5,792,845，USP 5,854,205，USP 6,024,688)。這些美國專利公開了通過注射重組蛋白類型的抗血管生成因子鑒定了對(duì)于各種類型的疾病，例如卵巢癌(HTB161，A2780S)，結(jié)腸癌(MIP，CACO2)，Lewis肺癌(LLC)，纖維肉瘤(T241)，前列腺癌(PC-3)和乳腺癌(MDA-MB)的治療效果。
同時(shí)，不象直接應(yīng)用對(duì)細(xì)胞的毒性的一般的治療方法，這種通過利用供給如上所述的抗血管生成因子抑制血管生成作用來治療疾病的治療方法是基于抑制細(xì)胞生長的原理，因此，在一定的濃度下的抗血管生成因子應(yīng)該連續(xù)地供給以便在體內(nèi)表現(xiàn)效果。但是，供給重組蛋白型的抗血管生成因子的方法在連續(xù)地給藥蛋白時(shí)費(fèi)用太高，是麻煩的并且具有將毒性傳遞給患者的問題。因此，已經(jīng)需要研發(fā)出一種連續(xù)地和局部地供給抗血管生成因子到受侵襲的區(qū)域的方法。
因此，本發(fā)明人努力嘗試一種新的方法，以便探索通過抗血管生成作用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎從而取代現(xiàn)有技術(shù)中的集中于解決免疫學(xué)問題的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。更具體地，本發(fā)明人獲得了用于生產(chǎn)代表性的抗-血管生成因子，例如制管張素(angiostatin)，內(nèi)抑制素(endostatin)和血小板因子-4的細(xì)胞系，其是通過將它們的基因插入病毒載體，并且然后，將它們移植到誘導(dǎo)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的受侵襲的區(qū)域。我們還進(jìn)行了滑液細(xì)胞內(nèi)的增生水平和軟骨破壞的組織學(xué)檢查和與該關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的濃度的免疫學(xué)檢驗(yàn)，以及關(guān)節(jié)膨脹的肉眼檢查以便獲得類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展水平的結(jié)果。這些結(jié)果顯示在我們的治療中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率與對(duì)照組相比被明顯地減少了。這表明我們使用抗血管生成基因的基因治療對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是有效的。
為了完成該目的，本發(fā)明提供了用于基因治療的組合物，包括一種編碼一種抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA，其對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎顯示出治療活性。
按照本發(fā)明的組合物，可以以在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺-伴隨病毒，單純皰疹病毒載體或者質(zhì)粒(在動(dòng)物細(xì)胞中可以表達(dá))中的插入的形式，或者是通過用包含該DNA的重組載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)一種細(xì)胞而收集的重組細(xì)胞的形式提供該編碼抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA，以便連續(xù)地和局部地供給抗-血管生成因子到受侵襲的區(qū)域。
并且，本發(fā)明提供了一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療方法，其通過遞送該組合物到患者的受侵襲的區(qū)域而進(jìn)行。
在本文中使用時(shí)，術(shù)語“抗-血管生成基因”指編碼一種抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA。它不限于天然的DNA，可以包括任何形式的能夠保持抗-血管生成活性的合適的修飾以及用于表達(dá)調(diào)控的元件的加入(如果其可以合適地用于本發(fā)明的目的的話)，無論其是否是通過遺傳工程或者化學(xué)方法獲得的。
在下文中，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明的特征在于用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物包括包括一種編碼抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA作為活性成分。按照本發(fā)明，該治療關(guān)節(jié)炎的基因治療中使用的抗-血管生成基因優(yōu)選地是一種編碼至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的基因制管張素，內(nèi)抑制素和血小板因子-4，血小板反應(yīng)蛋白-1，血小板反應(yīng)蛋白-2，METH-1，METH-2(具有金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域的抗-血管生成蛋白；Vanzquez F.等，生物化學(xué)雜志(J.BioL Chem.)274(33)23349-57，1999)和肝細(xì)胞生長因子。
特別地，按照本發(fā)明，該在用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物包含的抗-血管生成基因優(yōu)選地是編碼包括人血纖蛋白溶酶原的98th到440th位氨基酸的制管張素和四個(gè)kringle的基因，編碼包括人膠原蛋白XVIII的1334th～1516th位氨基酸的內(nèi)抑制素的基因，或者編碼鼠血小板因子-4蛋白的基因。
盡管整個(gè)的氨基酸序列可以用作為抗-血管生成因子，但是也可以使用已知具有抗-血管生成活性的片段。例如，制管張素kringle 1-3片段可以用于此目的。
按照本發(fā)明，該在用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物中包含的抗-血管生成基因優(yōu)選地可以是衍生自人類，鼠，獼猴，豬，或者牛血纖蛋白溶酶原的DNA，并且更優(yōu)選地，人制管張素的cDNA。內(nèi)抑制素基因也優(yōu)選地可以是衍生自人類，鼠，獼猴，豬，或者牛膠原蛋白XVIII，并且更優(yōu)選地，人內(nèi)抑制素的cDNA。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案鑒定出克隆自人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)的制管張素和內(nèi)抑制素基因在治療關(guān)節(jié)炎的基因治療中是有效的。
在按照本發(fā)明的用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物中包含的重組載體也包括抗-血管生成基因。優(yōu)選的是，該重組載體進(jìn)一步在上游或者下游包括編碼分泌所需的信號(hào)肽的核苷酸序列，以便將該基因表達(dá)的蛋白分泌出該細(xì)胞。
該信號(hào)肽可以包括任何已知的與在真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分泌有關(guān)的信號(hào)肽，并且優(yōu)選地可以是SEQ ID No.2所代表的人血纖蛋白溶酶原的18個(gè)氨基-末端氨基酸或者是由SEQ ID No.13所代表的核苷酸序列編碼的鼠免疫球蛋白κ鏈的信號(hào)肽。
例如，如下文中在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中所述，該信號(hào)肽可以通過合成包括編碼人血纖蛋白溶酶原的18個(gè)氨基-末端氨基酸的核苷酸序列和具有限制性酶切位點(diǎn)的序列的核苷酸，將它雜交到雙螺旋的DNA中，并且用限制性酶處理它以便將它插入到靶載體的某一個(gè)位點(diǎn)從而功能上連接到抗-血管生成基因。但是，具有產(chǎn)生分泌型抗-血管生成蛋白的信號(hào)肽的載體的構(gòu)建不限于上述的方法，其可以通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法完成。
在按照本發(fā)明的用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物中使用的載體是其中可以插入抗-血管生成基因以便連續(xù)地提供抗-血管生成因子到受侵襲的區(qū)域的載體。該載體可以包括病毒衍生的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺-伴隨病毒，和單純皰疹病毒載體，能夠在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的質(zhì)粒，pCXN2(基因(Gene)，108193-200，1991)和PAGE2O7(日本專利公開號(hào)(Japan Patent Laid-Open)No.昭(Sho)6-4684)，及其修飾的載體。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例中，使用已經(jīng)由本發(fā)明人提交給韓國工業(yè)產(chǎn)權(quán)局(KIPO)的MT5逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(韓國專利申請(qǐng)(Korean Patent Appl.)No.9748095；KCCM-10205)制備了用于生產(chǎn)作為抗-血管生成因子的制管張素，內(nèi)抑制素和血小板因子-4的病毒載體，并且通過使用該病毒載體對(duì)于鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了治療關(guān)節(jié)炎的效果。該MT5逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基于鼠白血病病毒(MLV)的載體，包括人延伸因子(EF 1)的突變型非編碼區(qū)，沒有衍生自病毒的編碼序列，并且在外基因表達(dá)效率和病毒滴度方面都是良好的。那就是說，該載體通過完全除去MLV的gag，pol和env序列而增強(qiáng)穩(wěn)定性，在外部基因插入的位點(diǎn)的上游包括EF 1a的非編碼序列的一部分作為衍生自異源基因的非編碼序列用于提供剪接受體，并且合適地控制剪接效率以便維持高度的基因表達(dá)和維持高的病毒產(chǎn)生濃度。
特別地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，編碼SEQ ID No.2所代表的人血纖蛋白溶酶原的93th到368th位氨基酸的制管張素DNA片段通過PCR獲自人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)，并且被插入到pGEM T easy載體中以便構(gòu)建pGEM T easy-hASTi載體。將編碼SEQ ID No.2的血纖蛋白溶酶原的18個(gè)氨基-末端氨基酸的序列合成為信號(hào)序列，并且被插入到pGEM Teasy-hAST1載體中以便構(gòu)建pGEM T easy-hAST載體。用BamH I切割所獲得的載體以便制備與該信號(hào)序列相連的人制管張素DNA片段，將其插入MT5載體。同時(shí)，為了制備表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系，將MT5-hAST載體DNA轉(zhuǎn)染入具有表達(dá)鼠白血病病毒的gag-pol和env基因的質(zhì)粒293T細(xì)胞中，并且然后，從該細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得非細(xì)胞的病毒。
將該獲得的病毒導(dǎo)入NIH3T3，并且選擇并培養(yǎng)引入逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞系以便制備表達(dá)人制管張素蛋白的NIH3T3細(xì)胞。利用相同的方法，分別制備表達(dá)人內(nèi)抑制素和鼠血小板因子-4的NIH3T3細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例證實(shí)了分別用表達(dá)抗-血管生成蛋白，例如人制管張素蛋白，人內(nèi)抑制素蛋白和鼠血小板因子-4蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行關(guān)節(jié)炎的基因治療的效果。
特別地，在膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎鼠模型中進(jìn)行了對(duì)小鼠的沒有任何肉眼可見的炎癥病征的基因治療。也就是說，將與PBS混合的抗-血管生成蛋白-產(chǎn)生NIH3T3細(xì)胞系移植到該關(guān)節(jié)炎-小鼠的后腿的膝關(guān)節(jié)區(qū)域，并且然后，通過檢測(cè)關(guān)節(jié)腫脹，滑液增生，軟骨的破壞，以及關(guān)節(jié)炎癥-相關(guān)的細(xì)胞因子水平研究關(guān)節(jié)炎的漸進(jìn)性水平。
結(jié)果表明較之與僅僅注射了PBS或者移植僅僅用MT5載體轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系的情況下的對(duì)照組的47％或者67％，在移植制管張素-產(chǎn)生NIH3T3細(xì)胞系的情況下的膝關(guān)節(jié)中腫脹水平顯著地降低到27％。表現(xiàn)出顯著水平的IL-1的頻率也被顯著地降低了。在膝關(guān)節(jié)區(qū)域中的滑液增生和軟骨的破壞也被顯著地降低了。并且，當(dāng)移植內(nèi)抑制素產(chǎn)生NIH3T3細(xì)胞系和血小板因子-4產(chǎn)生NIH3T3細(xì)胞系時(shí)，獲得了類似于制管張素-產(chǎn)生NIH3T3細(xì)胞系的移植體的結(jié)果。這些結(jié)果表明使用根據(jù)本發(fā)明的抗-血管生成基因的基因治療對(duì)于抑制和治療關(guān)節(jié)炎是有效的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)了治療效果的持續(xù)時(shí)間。結(jié)果表明單次注射的治療效果在治療后持續(xù)14天。
按照本發(fā)明的用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物可以通過制備包括編碼抗-血管生成蛋白的重組DNA的病毒顆?；蛘哂迷摬《绢w粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系并且將它們與用于基因治療的載體混合而制備(Crystal RG等，自然遺傳學(xué)分冊(cè)(Nature Genet.)842-51，1994)。
用于基因治療的載體可以包括通常用于注射液的任何載體。例如，該載體可以包括蒸餾水，氯化鈉溶液，氯化鈉和無機(jī)鹽的混合物或者它們的類似的混合物，諸如甘露醇，乳糖，右旋糖苷，和葡萄糖的材料的溶液，氨基酸溶液，例如甘氨酸和精氨酸，有機(jī)酸溶液或者鹽溶液和葡萄糖溶液的混合物，以及它們的類似的溶液。該注射液可以通過加入滲透壓調(diào)節(jié)劑，pH控制劑，植物油，例如芝麻油，或者豆油，卵磷脂或者表面活性劑，例如非離子型表面活性劑以常規(guī)的方式加入到該載體中而制成溶液，混懸劑或者膠體溶液的形式。該注射劑可以以粉末或者凍干的形式制備并且然后在使用前溶解成溶液的形式。
按照本發(fā)明的用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物在固相的情況下，必要時(shí)，在基因治療前，可以溶解在無菌的載體中，或者在液相的情況下，無需進(jìn)一步處理直接使用。
按照本發(fā)明的用于治療關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物可以通過注射方式吸收在靶區(qū)域的血管的滑液細(xì)胞中，局部給藥給患者的有效成分的總的每日劑量可以從1ng到1g的范圍或者在外科手術(shù)后通過導(dǎo)管給藥一次。
包括抗-血管生成因子-產(chǎn)生載體的細(xì)胞系可以是任何的具有與患者的相同的或者相似的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)抗原的細(xì)胞，使得它在移植的過程中不產(chǎn)生組織不相容。為了徹底地排除組織不相容，分離患者的滑液細(xì)胞并且用于基因治療是優(yōu)選的。
附圖2是一個(gè)示意圖，顯示了通過雜交兩個(gè)被制備為具有SEQ.ID.NO5和SEQ.ID.NO6所代表的核苷酸序列的合成的核苷酸而產(chǎn)生的雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)，以及由此所編碼的信號(hào)肽的氨基酸序列，以便獲得編碼由人血纖蛋白溶酶原的N-末端18個(gè)氨基酸所組成的信號(hào)肽的基因。
附圖3是說明增生水平的照片，其是通過用蘇木精/曙紅染色，膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠中的膝關(guān)節(jié)區(qū)域，其中對(duì)小鼠分別注射表達(dá)制管張素的NIH3T3細(xì)胞系(B)和只用不包括制管張素基因的MT5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH3T3對(duì)照細(xì)胞系(A)。
附圖4是說明軟骨破壞水平的照片，其是通過用藏紅花O(SafraninO)/固綠染色，膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠中的膝關(guān)節(jié)區(qū)域，其中對(duì)小鼠分別注射表達(dá)制管張素的NIH3T3細(xì)胞系(B)和只用不包括制管張素基因的MT5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH3T3對(duì)照細(xì)胞系(A)。
附圖5是說明通過使用對(duì)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面蛋白的CD31特異性的抗體研究的新血管化水平的照片，其是通過免疫學(xué)染色膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠中的膝關(guān)節(jié)區(qū)域，其中對(duì)小鼠分別注射表達(dá)制管張素的NIH3T3細(xì)胞系(B)和只用不包括制管張素基因的MT5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH3T3對(duì)照細(xì)胞系(A)。
附圖6是說明表達(dá)制管張素的NIH3T3細(xì)胞的治療效果的持續(xù)時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果的圖表。
■對(duì)照組●用1×105個(gè)表達(dá)制管張素的NIH3T3細(xì)胞移植的組*P＜0.05**P＜0.06
實(shí)施例1構(gòu)建導(dǎo)入了編碼抗-血管生成蛋白的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體
(1-1)構(gòu)建導(dǎo)入了人制管張素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(1-1-1)克隆人制管張素基因(構(gòu)建pGEM T easy-hASTi載體)通過從人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)提取RNA，獲得cDNA，并且進(jìn)行PCR克隆人制管張素基因。首先，通過使用Tryzol方法(Gibco BRL，USA)從人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)提取RNA，并且通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合反應(yīng)從該提取的RNA獲得cDNA。然后，通過PCR獲得包括人制管張素基因的DNA片段，其中的PCR使用該cDNA作為PCR模板，以及SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO4所代表的合成的核苷酸作為引物。為了進(jìn)行PCR，通過混合1μl的模板DNA，各1μl的10pmol/μl引物，10μl的10mM dNTP，3.5單位的擴(kuò)展高保真酶(Gibco BRL，USA)和10μl的酶緩沖液制備總共100μl的混合溶液。PCR的反應(yīng)條件如下94℃，1分鐘，50℃，1分鐘，72℃，1分鐘30秒。該P(yáng)CR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。該擴(kuò)增的制管張素基因包括編碼SEQ ID No.2所代表的人血纖蛋白溶酶原的93rd到368th位氨基酸的DNA。將該約800bp的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pGEM T easy載體(Promega，WI，USA)以便構(gòu)建pGEM T easy-hASTi載體(參見附

圖1)。
(1-1-2)連接信號(hào)序列并且構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒MT5-hAST載體為了使該蛋白在從上述的實(shí)施例(1-1-1)克隆的人制管張素基因表達(dá)后從細(xì)胞中分泌出來，將編碼信號(hào)肽的核苷酸序列功能上連接到制管張素基因的上游。將該信號(hào)序列導(dǎo)入到pGEM T easy-hASTi載體中。特別地，為了制備編碼人血纖蛋白溶酶原的N-末端的18個(gè)氨基酸作為信號(hào)肽，合成了SEQ.ID.NO5和SEQ ID.NO6所代表的核苷酸。混合該合成的核苷酸，在94℃下溫育1分鐘，并且接著在50℃下溫育1分鐘30秒以便通過該兩個(gè)合成的核苷酸的彼此配對(duì)形成雙鏈的DNA。如附圖2所示，該雙鏈的合成的核苷酸在一端具有HindIII和BamHI位點(diǎn)，并且在另一端具有NheI位點(diǎn)。將該核苷酸導(dǎo)入到pGEM T easy-hASTi載體的HindIII和NheI位點(diǎn)以便構(gòu)建pGEM T easy-hAST載體。并且然后，用BamHI消化該pGEM T easy-hAST載體以便獲得連接到該信號(hào)序列上的人制管張素基因，并且將該獲得的人制管張素基因?qū)氲組T5載體(KCCM-10205)的BamH I位點(diǎn)以便構(gòu)建MT5-hAST載體(附圖1)。
(1-2)構(gòu)建導(dǎo)入了人內(nèi)抑制素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(1-2-1)克隆人內(nèi)抑制素基因(構(gòu)建pGEM T easy-hESTi載體)通過從人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)提取RNA，獲得cDNA，并且進(jìn)行PCR克隆人內(nèi)抑制素基因。通過與上述的實(shí)施例(1-1-1)中相同的方法并且在相同的PCR條件下，除了使用SEQ.ID.NO9和SEQ.ID.NO10所代表的合成的核苷酸作為引物，獲得包括人內(nèi)抑制素基因的DNA片段。該擴(kuò)增的內(nèi)抑制素基因包括編碼SEQ.ID.NO8所代表的人膠原蛋白XVIII的1334th～1516th位氨基酸的DNA。將該約550bp的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pGEM T easy載體(Promega，WI，USA)以便構(gòu)建pGEM T easy-hESTi載體。
(1-2-2)連接信號(hào)序列并且構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒MT5-hEST載體為了使該蛋白在從上述的實(shí)施例(1-2-1)中克隆的人內(nèi)抑制素基因表達(dá)后從細(xì)胞中分泌出來，將編碼信號(hào)肽的核苷酸序列功能上連接到內(nèi)抑制素基因的上游。將該信號(hào)序列導(dǎo)入到pGEM T easy-hESTi載體中。特別地，為了制備編碼鼠免疫球蛋白κ鏈的N-末端的25個(gè)氨基酸作為信號(hào)肽，通過使用pSecTag質(zhì)粒(Invitrogen)DNA作為PCR模板，以及SEQ.ID.NO11和SEQ.ID.NO12所代表的合成的核苷酸作為引物進(jìn)行PCR。為了進(jìn)行PCR，通過混合1μl的模板DNA，各1μl的10pmol/μl引物，10μl的10mM dNTP，3.5單位的擴(kuò)展高保真酶(Gibco BRL，USA)和10μl的酶緩沖液制備總共100μl的混合溶液。PCR的反應(yīng)條件如下94℃，1分鐘，50℃，1分鐘，72℃，1分鐘30秒。該P(yáng)CR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。該擴(kuò)增的鼠免疫球蛋白κ鏈的信號(hào)序列由SEQ.ID.NO13代表。將該大約120bp的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pGEM T easy載體(Promega，WI，USA)以便構(gòu)建pGEM T easy-SigPep載體。并且然后，用NheI/BamHI消化該pGEM Teasy-hESTi載體以便獲得人內(nèi)抑制素基因，并且將該獲得的人內(nèi)抑制素基因?qū)氲絧GEM T easy-SigPep質(zhì)粒的NheI/BamHI位點(diǎn)以便構(gòu)建pGEMT easy-hEST載體。隨后，用BglII/BamHI消化該pGEM T easy-hEST質(zhì)粒以便獲得連接到信號(hào)序列上的人內(nèi)抑制素基因，并且將該獲得的人內(nèi)抑制素基因?qū)隡T5載體(KCCM-10205)的BamHI位點(diǎn)以便構(gòu)建MT5-hEST載體。
(1-3)構(gòu)建導(dǎo)入了鼠血小板因子-4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(1-3-1)克隆鼠血小板因子-4基因(構(gòu)建pGEM T easy-mPF4載體)通過從C57BL16小鼠(日本SLC，Hamamatsu，日本)的脾臟提取RNA，獲得cDNA，并且進(jìn)行PCR克隆鼠血小板因子-4基因。首先，通過使用Tryzol方法(Gibco BRL，USA)從小鼠的脾臟組織提取RNA，并且通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合反應(yīng)從該提取的RNA獲得cDNA。然后，通過PCR獲得包括鼠血小板因子-4基因的DNA片段，其中的PCR使用該cDNA作為PCR模板，以及SEQ.ID.NO15和SEQ.ID.NO16所代表的合成的核苷酸作為引物。為了進(jìn)行PCR，通過混合1μl的模板DNA，各1μl的10pmol/μl引物，10μl的10mM dNTP，3.5單位的擴(kuò)展高保真酶(GibcoBRL，USA)和10μl的酶緩沖液制備總共100μl的混合溶液。PCR的反應(yīng)條件如下94℃，1分鐘，50℃，1分鐘，72℃，1分鐘30秒。該P(yáng)CR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。該擴(kuò)增的鼠血小板因子-4由SEQ ID No.14所代表。將該約380bp的擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pGEM T easy載體(Promega，WI，USA)以便構(gòu)建pGEM T easy-mPF4載體。
(1-3-2)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒MT5-mPF4載體用EcoRV消化上述的實(shí)施例(1-3-1)中所制備的pGEM T easy-mPF4載體以便獲得血小板因子-4基因。用BamHI消化該獲得的血小板因子-4基因，用Klenow片段處理，并且然后被導(dǎo)入平端的MT5載體(KCCM-10205)中以便構(gòu)建MT5-mPF4載體。
實(shí)施例2制備表達(dá)抗-血管生成蛋白的細(xì)胞系(2-1)制備表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系為了制備表達(dá)制管張素的細(xì)胞系，生產(chǎn)了包括MT5-hAST載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒。首先，將在實(shí)施例(1-1-2)中所制備的MT5-hAST載體DNA轉(zhuǎn)染到具有表達(dá)鼠白血病病毒(MLV)的gag-pol和env基因的質(zhì)粒(逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝試劑盒ampho catalogue #6161；TAKARA SHUZO CO.，LTD.，SHIGA，日本)的293T細(xì)胞中，并且在8小時(shí)后，調(diào)換新的培養(yǎng)基。48小時(shí)后，用0.45μm的濾紙過濾該細(xì)胞培養(yǎng)基以便獲得非-細(xì)胞的病毒。
將產(chǎn)生的MT5-hAST逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞(ATCCCRL1658)，并且然后，用G418(1μg/μl，Gibco BRL，USA)處理該細(xì)胞14天(24小時(shí)后)以便選擇和培養(yǎng)導(dǎo)入了該逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞系。收集該選擇和培養(yǎng)的細(xì)胞組導(dǎo)致表達(dá)人制管張素蛋白的NIH3T3細(xì)胞系的制備。
(2-2)制備表達(dá)人內(nèi)抑制素的細(xì)胞系按照與實(shí)施例(2-1)的相同的方法制備表達(dá)人內(nèi)抑制素蛋白的NIH3T3細(xì)胞系，除了使用在實(shí)施例(1-2-2)中制備的MT5-hEST載體代替MT5-hAST載體。
(2-3)制備表達(dá)鼠血小板因子-4的細(xì)胞系按照與實(shí)施例(2-1)的相同的方法制備表達(dá)血小板因子-4蛋白的NIH3T3細(xì)胞系，除了使用在實(shí)施例(1-3-2)中制備的MT5-mPF載體代替MT5-hAST載體。
實(shí)施例3在小鼠膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中使用抗-血管生成因子的效果(3-1)制備小鼠膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型小鼠膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型是一種自身免疫型的關(guān)節(jié)炎模型，其表現(xiàn)出許多與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎共有的特征。通過下述的方法制備膠原蛋白-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。將在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)9-10周齡的DBA/1小鼠(Jackson Laboratory，Maine，USA)尾基部皮內(nèi)免疫接種在弗氏完全佐劑(Gibco BRL，NY，USA)中乳化的牛II型膠原蛋白(100μg；Chondrex，WA，USA)。在第21天，通過皮內(nèi)注射100μg II型膠原蛋白強(qiáng)化免疫該動(dòng)物。正常地，關(guān)節(jié)炎的逐漸發(fā)作在起始免疫后大約4周開始。在此實(shí)施例中，在起始免疫后的30天，挑選依然沒有任何的肉眼可見的關(guān)節(jié)炎病征的小鼠進(jìn)行基因治療。
(3-2)檢測(cè)關(guān)節(jié)炎進(jìn)展水平通過以下的方式進(jìn)行用于檢測(cè)關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展水平的指標(biāo)的檢測(cè)和詳細(xì)的判斷。首先，對(duì)于其中移植了表達(dá)抗-血管生成蛋白(制管張素，內(nèi)抑制素和血小板因子-4)的細(xì)胞系的膝關(guān)節(jié)腔進(jìn)行組織學(xué)分析。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要的病理學(xué)可以總結(jié)為由關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞的增生和由于該增生所致的軟骨組織的不可逆轉(zhuǎn)性的破壞。組織學(xué)分析是判定滑液細(xì)胞的增生和軟骨破壞的進(jìn)展水平的最有效的方法。對(duì)于這種分析，解剖小鼠的膝關(guān)節(jié)，并且將其固定在10％磷酸鹽緩沖的福爾馬林中，在10％EDTA中進(jìn)行脫鈣作用，并且然后包埋在石蠟中。制備7μm的標(biāo)準(zhǔn)的冠狀逢切面并且用蘇木精/曙紅或者藏紅花O(Safranin O)/固綠染色(Bakker A.C.等，關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病(Arthritis and Rheumatism)40893-900，1997；Apparailly florence等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1605213-5220，1998)。
根據(jù)公開發(fā)表的論文(Apparailly florence等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1605213-5220，1998；Lubberts Erik等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)16345464556，1999)中建議的標(biāo)準(zhǔn)，基于蘇木精/曙紅染色的結(jié)果，將滑液細(xì)胞的增生水平評(píng)分。評(píng)分如下正常的狀況為0，輕微的炎癥和微弱的滑液增生為1，而形成關(guān)節(jié)翳并且比嚴(yán)重的水平更嚴(yán)重的滑液增生是2。如果滑液細(xì)胞的增生水平是2或者更高，則判定在該膝中發(fā)生了關(guān)節(jié)炎。
根據(jù)公開發(fā)表的論文(Lubberts Erik等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1634546-4556，1999)中建議的標(biāo)準(zhǔn)，基于藏紅花O(Safranin O)/固綠染色的結(jié)果，對(duì)軟骨破壞的水平進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分如下正常的狀況為0，軟骨細(xì)胞的空泡形成以及蛋白聚糖的輕微的丟失是1，除了前述的外，還觀察到軟骨侵蝕是2，而在兩個(gè)或者更多個(gè)區(qū)域的軟骨侵蝕以及軟骨下的層的破壞是3。如果軟骨破壞的水平是2或者更高，則判定在該膝中發(fā)生了關(guān)節(jié)炎。
通過使用CD31(一種血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面蛋白)的特異性的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色研究了在該關(guān)節(jié)中的新血管化水平(Xu，M.等，分子遺傳學(xué)和新陳代謝(Molecular Genetics and Metabolism)63103-109，1998)。
用肉眼可見的征兆，例如關(guān)節(jié)膨脹，和免疫學(xué)指標(biāo)，例如炎癥-相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)量確定踝區(qū)域中關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展水平。根據(jù)公開發(fā)表的論文(Apparailly florence等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1605213-5220，1998)中建議的標(biāo)準(zhǔn)，基于肉眼可見的征兆的結(jié)果，對(duì)關(guān)節(jié)膨脹的水平進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分如下正常的狀況為0，腫脹和輕微的紅斑是1，明顯的腫脹和紅斑是2，而伴隨有傷口的嚴(yán)重的水腫是3。如果關(guān)節(jié)膨脹的水平是2或者更高，則判定在該踝中發(fā)生了關(guān)節(jié)炎。并且，如果關(guān)節(jié)膨脹的水平是3或者更高，則判定是嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。通過用ELISA(R&D systems，Minneapolis，USA)，根據(jù)制造商的使用說明，在踝關(guān)節(jié)檢測(cè)已知在關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展過程中起著主要的作用的小鼠白細(xì)胞介素-1(IL-1)的表達(dá)量進(jìn)行炎癥-相關(guān)的細(xì)胞因子的檢測(cè)。如果白細(xì)胞介素-1(IL-1)的表達(dá)量是每1克關(guān)節(jié)組織中的蛋白10ng或者更多，則判定發(fā)生了關(guān)節(jié)炎。
(3-3)進(jìn)行基因治療并且分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果(3-3-1)在移植表達(dá)人制管張素蛋白的NIH3T3細(xì)胞系的情況下一組中選擇15只小鼠。通過在無菌條件下混合1×105個(gè)NIH3T3細(xì)胞系與25μl的PBS溶液并且使用30號(hào)(gauge)的注射器將該混合物注射入小鼠的膝關(guān)節(jié)腔而移植表達(dá)人制管張素蛋白的NIH3T3細(xì)胞系。在一個(gè)陰性對(duì)照組中，移植入只用MT5載體轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞，并且在另一個(gè)陰性對(duì)照組中，只注射移植入PBS。此后，觀察關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。在該細(xì)胞系的移植后的第10天，通過研究肉眼可見的征兆，例如關(guān)節(jié)膨脹，組織學(xué)征兆，例如關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞增生和軟骨破壞，和免疫學(xué)指標(biāo)，例如關(guān)節(jié)炎癥-相關(guān)的細(xì)胞因子的水平確定關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展水平。還使用免疫組織化學(xué)染色研究了在該關(guān)節(jié)區(qū)域中的新血管化。結(jié)果在表1和附圖3-5中給出。
表1.各項(xiàng)目的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率

如表1中所示，在小鼠后腿的踝中的關(guān)節(jié)腫脹的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)腫脹水平被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于關(guān)節(jié)腫脹研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是27％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系和只注射移植PBS的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率分別是67％和47％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)制管張素的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。
在如附圖3所示的通過研究在小鼠的后腿的膝關(guān)節(jié)中的滑液細(xì)胞增殖而獲得的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的滑液細(xì)胞的生長被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于滑液細(xì)胞增殖研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是47％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系和只注射移植PBS的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率分別是93％和65％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)制管張素的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。
在如附圖4所示的通過研究在小鼠的后腿的膝關(guān)節(jié)中的軟骨組織的破壞而獲得的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的軟骨組織的破壞被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于軟骨組織的破壞研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是33％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系和只注射移植PBS的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率分別是67％和53％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)制管張素的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。
在如附圖3所示的通過使用對(duì)CD31，一種血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表面蛋白，特異性的抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色而獲得的小鼠的后腿的膝關(guān)節(jié)中的新血管化水平研究的結(jié)果中，與用對(duì)照細(xì)胞系移植的情況中的相比，在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的新血管化水平被顯著地降低了。
與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系到相同的腿的膝中的情況下的小鼠的后腿的踝關(guān)節(jié)中的IL-1的濃度被顯著地降低了。也就是說，在通過研究IL-1的濃度是每1克關(guān)節(jié)組織10ng或者更多的情況的頻率而獲得的結(jié)果中，在移植表達(dá)人制管張素的細(xì)胞系的情況下的頻率是27％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系的情況下的頻率是67％，并且在只注射移植PBS的情況下的頻率是41％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)制管張素的細(xì)胞中的顯示出顯著水平的IL-1的頻率被顯著地降低了。
上述的所有的結(jié)果表明移植表達(dá)制管張素的細(xì)胞到發(fā)生關(guān)節(jié)炎的膝中不但顯著地降低了膝關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率，而且也顯著地降低了相同的腿的踝關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。這些結(jié)果可以提示當(dāng)在諸如膝關(guān)節(jié)的大的關(guān)節(jié)中進(jìn)行基因治療時(shí)，該治療效果還可以通過炎癥-誘導(dǎo)或者炎癥-抑制因子隨著連接關(guān)節(jié)之間的體液的流動(dòng)的運(yùn)動(dòng)而在相同的腿的小關(guān)節(jié)，例如踝關(guān)節(jié)中表現(xiàn)出來。
(3-3-2)在移植表達(dá)人內(nèi)抑制素蛋白的NIH3T3細(xì)胞系的情況一組中選擇15只小鼠。通過在無菌條件下混合1×105個(gè)NIH3T3細(xì)胞系與25μl的PBS溶液并且使用30號(hào)(gauge)的注射器將該混合物注射入小鼠的膝關(guān)節(jié)腔而移植表達(dá)人內(nèi)抑制素的NIH3T3細(xì)胞系。在一個(gè)陰性對(duì)照組中，移植入只用MT5載體轉(zhuǎn)移的NIH3T3細(xì)胞。此后，觀察關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，并且研究肉眼可見的征兆，例如關(guān)節(jié)膨脹。結(jié)果在表2中給出。
表2.關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率

如表2中所示，在小鼠后腿的踝中的關(guān)節(jié)腫脹的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)內(nèi)抑制素的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)腫脹水平被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于關(guān)節(jié)腫脹研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)內(nèi)抑制素的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是23％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是75％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)內(nèi)抑制素的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。這些結(jié)果還提示使用內(nèi)抑制素的基因治療可以有效地抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
(3-3-3)在移植表達(dá)鼠血小板因子-4蛋白的NIH3T3細(xì)胞系的情況一組中選擇15只小鼠。通過在無菌條件下混合1×105個(gè)NIH3T3細(xì)胞系與25μl的PBS溶液并且使用30號(hào)(gauge)的注射器將該混合物注射入小鼠的膝關(guān)節(jié)腔而移植表達(dá)血小板因子-4蛋白的NIH3T3細(xì)胞系。在一個(gè)陰性對(duì)照組中，移植入只用MT5載體轉(zhuǎn)移的NIH3T3細(xì)胞。此后，觀察關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。通過研究肉眼可見的征兆，例如關(guān)節(jié)膨脹，組織學(xué)征兆，例如關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞增生和軟骨破壞，和免疫學(xué)指標(biāo)，例如關(guān)節(jié)炎癥-相關(guān)的細(xì)胞因子的水平確定關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展水平。結(jié)果在表3中給出。
表3.各項(xiàng)目的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率

如表3中所示，在小鼠后腿的踝中的關(guān)節(jié)腫脹的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)腫脹水平被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于關(guān)節(jié)腫脹研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是29％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是64％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。
在通過研究在小鼠的后腿的膝關(guān)節(jié)中的滑液細(xì)胞增殖而獲得的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的滑液細(xì)胞的生長被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于滑液細(xì)胞增殖研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是43％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是77％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。
在通過研究在小鼠的后腿的膝關(guān)節(jié)中的軟骨組織的破壞而獲得的結(jié)果中，與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的軟骨組織的破壞被顯著地降低了。也就是說，當(dāng)基于軟骨組織的破壞研究關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率時(shí)，可見在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是36％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系的情況下的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是54％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率被顯著地降低了。
與對(duì)照組的情況中的那些相比，在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系到相同的腿的膝中的情況下的小鼠的后腿的踝關(guān)節(jié)中的IL-1的濃度被顯著地降低了。也就是說，在通過研究IL-1的濃度是每1克關(guān)節(jié)組織10ng或者更多的情況的頻率而獲得的結(jié)果中，在移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞系的情況下的頻率是29％，而在移植對(duì)照細(xì)胞系的情況下的頻率是64％。這些結(jié)果證實(shí)在表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞中的顯示出顯著水平的IL-1的頻率被顯著地降低了。
上述的所有的結(jié)果表明移植表達(dá)血小板因子-4的細(xì)胞到發(fā)生關(guān)節(jié)炎的膝中不但顯著地降低了膝關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率，而且也顯著地降低了相同的腿的踝關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。
實(shí)施例4治療效果的持續(xù)時(shí)間的檢測(cè)為了檢測(cè)表達(dá)人制管張素蛋白的NIH3T3細(xì)胞系的治療效果的持續(xù)時(shí)間，通過在無菌條件下混合1×105個(gè)NIH3T3細(xì)胞系與25μl的PBS溶液并且使用30號(hào)(gauge)的注射器將該混合物注射入小鼠的膝關(guān)節(jié)腔而移植NIH3T3細(xì)胞系。在一個(gè)陰性對(duì)照組中，移植入只用MT5載體轉(zhuǎn)移的NIH3T3細(xì)胞。
在移植日開始一直到第20天，每3或者4天測(cè)定腳中嚴(yán)重-級(jí)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率(踝關(guān)節(jié)腫脹的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是3或者更高)。如附圖6所示，結(jié)果表明嚴(yán)重-級(jí)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生被抑制到移植后的第14天(P＜0.05)。這意味著使用一次注射治療后的治療效果可以維持14天。
工業(yè)實(shí)用性使用本發(fā)明提供的編碼抗-血管生成因子的基因治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療方法不僅可以在肉眼可見的征兆，例如關(guān)節(jié)膨脹，而且還可以在免疫學(xué)和組織學(xué)指標(biāo)，例如炎癥-相關(guān)的細(xì)胞因子水平，滑液細(xì)胞增殖，以及軟骨組織的破壞上顯著地抑制關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展水平。因此，本發(fā)明可以用于有效地治療迄今為止依然沒有有效的治療方法的關(guān)節(jié)炎。
序列表<110>百療醫(yī)株式會(huì)社<120>包括編碼抗-血管生成蛋白或其部分的基因的用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物<130>OPF0208/PCT<150>KR 2001-0000691<151>2001-01-05<160>16<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>2497<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(50)..(2479)<223>編碼具有信號(hào)肽的血纖蛋白溶酶原的基因<400>1catcctggga ttgggaccca ctttctgggc actgctggcc agtcccaaa atg gaa cat 58Met Glu His1aag gaa gtg gtt ctt cta ctt ctt tta ttt ctg aaa tca ggt caa gga 106Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser Gly Gln Gly5 10 15gag cct ctg gat gac tat gtg aat acc cag ggg gct tca ctg ttc agt 154Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser20 25 30 35gtc act aag aag cag ctg gga gca gga agt ata gaa gaa tgt gca gca 202Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala40 45 50aaa tgt gag gag gac gaa gaa ttc acc tgc agg gca ttc caa tat cac 250Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His55 60 65agt aaa gag caa caa tgt gtg ata atg gct gaa aac agg aag tcc tcc 298Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser70 75 80ata atc att agg atg aga gat gta gtt tta ttt gaa aag aaa gtg tat346Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr85 90 95ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg acg atg394Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met100 105 110 115tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc act tct442Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser120 125 130ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag gga ctg490Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu135 140 145gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg ccc tgg538Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp150 155 160tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac att ctt586Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu165 170 175gag tgt gaa gag gaa tgt atg cat tgc agt gga gaa aac tat gac ggc634Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly180 185 190 195aaa att tcc aag acc atg tct gga ctg gaa tgc cag gcc tgg gac tct682Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser200 205 210cag agc cca cac gct cat gga tac att cct tcc aaa ttt cca aac aag730Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys215 220 225aac ctg aag aag aat tac tgt cgt aac ccc gat agg gag ctg cgg cct778Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro230 235 240tgg tgt ttc acc acc gac ccc aac aag cgc tgg gaa ctt tgt gac atc826Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile245 250 255ccc cgc tgc aca aca cct cca cca tct tct ggt ccc acc tac cag tgt874Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys260 265 270 275ctg aag gga aca ggt gaa aac tat cgc ggg aat gtg gct gtt acc gtg922Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val280 285 290tcc ggg cac acc tgt cag cac tgg agt gca cag acc cct cac aca cat 970Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His295 300 305aac agg aca cca gaa aac ttc ccc tgc aaa aat ttg gat gaa aac tac1018Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr310 315 320tgc cgc aat cct gac gga aaa agg gcc cca tgg tgc cat aca acc aac1066Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn325 330 335agc caa gtg cgg tgg gag tac tgt aag ata ccg tcc tgt gac tcc tcc1114Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser340 345 350 355cca gta tcc acg gaa caa ttg gct ccc aca gca cca cct gag cta acc1162Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr360 365 370cct gtg gtc cag gac tgc tac cat ggt gat gga cag agc tac cga ggc1210Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly375 380 385aca tcc tcc acc acc acc aca gga aag aag tgt cag tct tgg tca tct1258Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser390 395 400atg aca cca cac cgg cac cag aag acc cca gaa aac tac cca aat gct1306Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala405 410 415ggc ctg aca atg aac tac tgc agg aat cca gat gcc gat aaa ggc ccc1354Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro420 425 430 435tgg tgt ttt acc aca gac ccc agc gtc agg tgg gag tac tgc aac ctg1402Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu440 445 450aaa aaa tgc tca gga aca gaa gcg agt gtt gta gca cct ccg cct gtt1450Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val455 460 465gtc ctg ctt cca gat gta gag act cct tcc gaa gaa gac tgt atg ttt1498Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe
470 475 480ggg aat ggg aaa gga tac cga ggc aag agg gcg acc act gtt act ggg1546Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly485 490 495acg cca tgc cag gac tgg gct gcc cag gag ccc cat aga cac agc att1594Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile500 505 510 515ttc act cca gag aca aat cca cgg gcg ggt ctg gaa aaa aat tac tgc1642Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys520 525 530cgt aac cct gat ggt gat gta ggt ggt ccc tgg tgc tac acg aca aat1690Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn535 540 545cca aga aaa ctt tac gac tac tgt gat gtc cct cag tgt gcg gcc cct1738Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro550 555 560tca ttt gat tgt ggg aag cct caa gtg gag ccg aag aaa tgt cct gga1786Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly565 570 575agg gtt gta ggg ggg tgt gtg gcc cac cca cat tcc tgg ccc tgg caa1834Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln580 585 590 595gtc agt ctt aga aca agg ttt gga atg cac ttc tgt gga ggc acc ttg1882Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu600 605 610ata tcc cca gag tgg gtg ttg act gct gcc cac tgc ttg gag aag tcc1930Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser615 620 625cca agg cct tca tcc tac aag gtc atc ctg ggt gca cac caa gaa gtg1978Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val630 635 640aat ctc gaa ccg cat gtt cag gaa ata gaa gtg tct agg ctg ttc ttg2026Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu645 650 655gag ccc aca cga aaa gat att gcc ttg cta aag cta agc agt cct gcc2074Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala660 665 670 675gtc atc act gac aaa gta atc cca gct tgt ctg cca tcc cca aat tat2122Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr680 685 690gtg gtc gct gac cgg acc gaa tgt ttc gtc act ggc tgg gga gaa acc2170Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Val Thr Gly Trp Gly Glu Thr695 700 705caa ggt act ttt gga gct ggc ctt ctc aag gaa gcc cag ctc cct gtg2218Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val710 715 720att gag aat aaa gtg tgc aat cgc tat gag ttt ctg aat gga aga gtc2266Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val725 730 735caa tcc acc gaa ctc tgt gct ggg cat ttg gcc gga ggc act gac agt2314Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser740 745 750 755tgc cag ggt gac agt gga ggt cct ctg gtt tgc ttc gag aag gac aaa2362Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys760 765 770tac att tta caa gga gtc act tct tgg ggt ctt ggc tgt gca cgc ccc2410Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro775 780 785aat aag cct ggt gtc tat gtt cgt gtt tca agg ttt gtt act tgg att2458Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile790 795 800gag gga gtg atg aga aat aatt aattggacgg gagacag2497Glu Gly Val Met Arg Asn Asn805 810<210>2<211>810<212>PRT<213>人<400>2Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser1 5 10 15Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser20 25 30Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu35 40 45Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe50 55 60Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg65 70 75 80Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys85 90 95Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg100 105 110Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser115 120 125Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser130 135 140Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln145 150 155 160Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys165 170 175Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn180 185 190Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala195 200 205Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe210 215 220Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu225 230 235 240Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu245 250 255Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr260 265 270Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala275 280 285Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro290 295 300His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp305 310 315 320Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His325 330 335Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys340 345 350Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro355 360 365Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser370 375 380Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser385 390 395 400Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr405 410 415Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp420 425 430Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr435 440 445Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro450 455 460Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp465 470 475 480Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr485 490 495Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg500 505 510His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys515 520 525Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr530 535 540Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys545 550 555 560Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys565 570 575Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp580 585 590Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly595 600 605Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu610 615 620Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His625 630 635 640Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg645 650 655Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser660 665 670Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser675 680 685Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Val Thr Gly Trp690 695 700Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln705 710 715 720Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn725 730 735Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly740 745 750Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu755 760 765Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys770 775 780Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val785 790 795 800Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn805 810<210>3<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人制管張素基因的PCR的hAST 5′引物<400>3aagcttgcta gcttatttga aaagaaagtg tatctctcag agtgcaagac t 51<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人制管張素基因的PCR的hAST 3′引物<400>4ggatcctcat taaggtggtg ctgtgggagc caattgttc 39<210>5<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>hASTsigna15<400>5agcttggatc caaaatggaa cataaggaag tggttcttct acttctttta tttctgaaat60caggtcaag69<210>6<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>hASTsigna13<400>6ctagcttgac ctgatttcag aaataaaaga agtagaagaa ccacttcctt atgttccatt60ttggatcca69<210>7<211>4551<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(4548)<400>7atg gct ccc tac ccc tgt ggc tgc cac atc ctg ctg ctg ctc ttc tgc 48Met Ala Pro Tyr Pro Cys Gly Cys His Ile Leu Leu Leu Leu Phe Cys1 5 10 15tgc ctg gcg gct gcc cgg gcc aac ctg ctg aac ctg aac tgg ctt tgg 96Cys Leu Ala Ala Ala Arg Ala Asn Leu Leu Asn Leu Asn Trp Leu Trp20 25 30ttc aat aat gag gac acc agc cac gca gct acc acg atc cct gag ccc 144Phe Asn Asn Glu Asp Thr Ser His Ala Ala Thr Thr Ile Pro Glu Pro35 40 45cag ggg ccc ctg cct gtg cag ccc aca gca gat acc acc aca cac gtg 192Gln Gly Pro Leu Pro Val Gln Pro Thr Ala Asp Thr Thr Thr His Val50 55 60acc ccc cgg aat ggt tcc aca gag cca gcg aca gcc cct ggc agc cct 240Thr Pro Arg Asn Gly Ser Thr Glu Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ser Pro65 70 75 80gag cca ccc tca gag ctg ctg gaa gat ggc cag gac acc ccc act tct 288Glu Pro Pro Ser Glu Leu Leu Glu Asp Gly Gln Asp Thr Pro Thr Ser85 90 95gcc gag agc ccg gac gcg cca gag gag aac att gcc ggt gtc gga gcc 336Ala Glu Ser Pro Asp Ala Pro Glu Glu Asn Ile Ala Gly Val Gly Ala100 105 110gag atc ctg aac gtg gcc aaa ggc atc cgg agc ttc gtc cag ctg tgg 384Glu Ile Leu Asn Val Ala Lys Gly Ile Arg Ser Phe Val Gln Leu Trp
115 120 125aat gac act gtc ccc act gag agc ttg gcc agg gcg gaa acc ctg gtc432Asn Asp Thr Val Pro Thr Glu Ser Leu Ala Arg Ala Glu Thr Leu Val130 135 140ctg gag act cct gtg ggc ccc ctt gcc ctc gct ggg cct tcc agc acc480Leu Glu Thr Pro Val Gly Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Ser Ser Thr145 150 155 160ccc cag gag aat ggg acc act ctc tgg ccc agc cgt ggc att cct agc528Pro Gln Glu Asn Gly Thr Thr Leu Trp Pro Ser Arg Gly Ile Pro Ser165 170 175tct ccg ggc gcc cac aca acc gag gct ggc acc ttg cct gca ccc acc576Sar Pro Gly Ala His Thr Thr Glu Ala Gly Thr Leu Pro Ala Pro Thr180 185 190cca tcg cct ccg tcc ctg ggc agg ccc tgg gca cca ctc acg ggg ccc624Pro Ser Pro Pro Ser Leu Gly Arg Pro Trp Ala Pro Leu Thr Gly Pro195 200 205tca gtg cca cca cca tct tca gag cgc atc agc gag gag gtg ggg ctg672Ser Val Pro Pro Pro Ser Ser Glu Arg Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu210 215 220ctg cag ctc ctt ggg gac ccc ccg ccc cag cag gtc acc cag acg gat720Leu Gln Leu Leu Gly Asp Pro Pro Pro Gln Gln Val Thr Gln Thr Asp225 230 235 240gac ccc gac gtc ggg ctg gcc tac gtc ttt ggg cca gat gcc aac agt768Asp Pro Asp Val Gly Leu Ala Tyr Val Phe Gly Pro Asp Ala Asn Ser245 250 255ggc caa gtg gcc cgg tac cac ttc ccc agc ctc ttc ttc cgt gac ttc816Gly Gln Val Ala Arg Tyr His Phe Pro Ser Leu Phe Phe Arg Asp Phe260 265 270tca ctg ctg ttc cac atc cgg cca gcc aca gag ggc cca ggg gtg ctg864Ser Leu Leu Phe His Ile Arg Pro Ala Thr Glu Gly Pro Gly Val Leu275 280 285ttc gcc atc acg gac tcg gcg cag gcc atg gtc ttg ctg ggc gtg aag912Phe Ala Ile Thr Asp Ser Ala Gln Ala Met Val Leu Leu Gly Val Lys290 295 300ctc tct ggg gtg cag gac ggg cac cag gac atc tcc ctg ctc tac aca960Leu Ser Gly Val Gln Asp Gly His Gln Asp Ile Ser Leu Leu Tyr Thr305 310 315 320gaa cct ggt gca ggc cag acc cac aca gcc gcc agc ttc cgg ctc ccc1008Glu Pro Gly Ala Gly Gln Thr His Thr Ala Ala Ser Phc Arg Leu Pro325 330 335gcc ttc gtc ggc cag tgg aca cac tta gcc ctc agt gtg gca ggt ggc1056Ala Phe Val Gly Gln Trp Thr His Leu Ala Leu Ser Val Ala Gly Gly340 345 350ttt gtg gcc ctc tac gtg gac tgt gag gag ttc cag aga atg ccg ctt1104Phe Val Ala Leu Tyr Val Asp Cys Glu Glu Phe Gln Arg Met Pro Leu355 360 365gct cgg tcc tca cgg ggc ctg gag ctg gag cct ggc gcc ggg ctc ttc1152Ala Arg Ser Ser Arg Gly Leu Glu Leu Glu Pro Gly Ala Gly Leu Phe370 375 380gtg gct cag gcg ggg gga gcg gac cct gac aag ttc cag ggg gtg atc1200Val Ala Gln Ala Gly Gly Ala Asp Pro Asp Lys Phe Gln Gly Val Ile385 390 395 400gct gag ctg aag gtg cgc agg gac ccc cag gtg agc ccc atg cac tgc1248Ala Glu Leu Lys Val Arg Arg Asp Pro Gln Val Ser Pro Met His Cys405 410 415ctg gac gag gaa ggc gat gac tca gat ggg gca ttc gga gac tct ggc1296Leu Asp Glu Glu Gly Asp Asp Ser Asp Gly Ala Phe Gly Asp Ser Gly420 425 430agc ggg ctc ggg gac gcc cgg gag ctt ctc agg gag gag acg ggc gcg1344Ser Gly Leu Gly Asp Ala Arg Glu Leu Leu Arg Glu Glu Thr Gly Ala435 440 445gcc cta aaa ccc agg ctc ccc gcg cca ccc ccc gtc acc acg cca ccc1392Ala Leu Lys Pro Arg Leu Pro Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Pro Pro450 455 460ttg gct gga ggc agc agc acg gaa gat tcc aga agt gaa gaa gtc gag1440Leu Ala Gly Gly Ser Ser Thr Glu Asp Ser Arg Ser Glu Glu Val Glu465 470 475 480gag cag acc acg gtg gct tcg tta gga gct cag aca ctt cct ggc tca1488Glu Gln Thr Thr Val Ala Ser Leu Gly Ala Gln Thr Leu Pro Gly Ser485 490 495gat tct gtc tcc acg tgg gac ggg agt gtc cgg acc cct ggg ggc cgc1536Asp Ser Val Ser Thr Trp Asp Gly Ser Val Arg Thr Pro Gly Gly Arg500 505 510gtg aaa gag ggc ggc ctg aag ggg cag aaa ggg gag cca ggt gtt ccg1584Val Lys Glu Gly Gly Leu Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Val Pro515 520 525ggc cca cct ggc cgg gca ggc ccc cca gga tcc cca tgc cta cct ggt1632Gly Pro Pro Gly Arg Ala Gly Pro Pro Gly Ser Pro Cys Leu Pro Gly530 535 540ccc ccg ggt ctc ccg tgc cca gtg agt ccc ctg ggt cct gca ggc cca1680Pro Pro Gly Leu Pro Cys Pro Val Ser Pro Leu Gly Pro Ala Gly Pro545 550 555 560gcg ttg caa act gtc ccc gga cca caa gga ccc cca ggg cct ccg ggg1728Ala Leu Gln Thr Val Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly565 570 575agg gac ggc acc cct gga agg gac ggc gag ccg ggc gac ccc ggt gaa1776Arg Asp Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Glu580 585 590gac gga aag ccg ggc gac acc ggg cca caa ggc ttc cct ggg act cca1824Asp Gly Lys Pro Gly Asp Thr Gly Pro Gln Gly Phe Pro Gly Thr Pro595 600 605ggg gat gta ggt ccc aag gga gac aag gga gac cct ggg gtt gga gag1872Gly Asp Val Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Gly Glu610 615 620aga ggg ccc cca gga ccc caa ggg cct cca ggg ccc cca gga ccc tcc1920Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser625 630 635 640ttc aga cac gac aag ctg acc ttc att gac atg gag gga tct ggc ttt1968Phe Arg His Asp Lys Leu Thr Phe Ile Asp Met Glu Gly Ser Gly Phe645 650 655ggg ggc gat ctg gag gcc ctg cgg ggt cct cga ggc ttc cct gga cct2016Gly Gly Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro660 665 670ccc gga ccc ccc ggt gtc cca ggc ctg ccc ggc gag cca ggc cgc ttt2064Pro Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Glu Pro Gly Arg Phe675 680 685ggg gtg aac agc tcc gac gtc cca gga ccc gcc ggc ctt cct ggt gtg2112Gly Val Asn Ser Ser Asp Val Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Val690 695 700cct ggg cgc gag ggt ccc ccc ggg ttt cct ggc ctc ccg gga ccc cca2160Pro Gly Arg Glu Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro705 710 715 720ggc cct ccg gga aga gag ggg ccc cca gga agg act ggg cag aaa ggc2208Gly Pro Pro Gly Arg Glu Gly Pro Pro Gly Arg Thr Gly Gln Lys Gly725 730 735agc ctg ggt gaa gca ggc gcc cca gga cat aag ggg agc aag gga gcc2256Ser Leu Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly His Lys Gly Ser Lys Gly Ala740 745 750ccc ggt cct gct ggt gct cgt ggg gag agc ggc ctg gca gga gcc ccc2304Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Ser Gly Leu Ala Gly Ala Pro755 760 765gga cct gct gga cca cca ggc ccc cct ggg ccc cct ggg ccc cca gga2352Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly770 775 780cca gga ctc ccc gct gga ttt gat gac atg gaa ggc tcc ggg ggg ccc2400Pro Gly Leu Pro Ala Gly Phe Asp Asp Met Glu Gly Ser Gly Gly Pro785 790 795 800ttc tgg tca aca gcc cga agc gct gat ggg cca cag gga cct ccc ggc2448Phe Trp Ser Thr Ala Arg Ser Ala Asp Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly805 810 815ctg ccg gga ctt aag ggg gat cct ggc gtg cct ggg ctg ccg ggg gcg2496Leu Pro Gly Leu Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Ala820 825 830aag gga gaa gtt gga gca gat gga atc ccc ggg ttc ccc ggc ctc cct2544Lys Gly Glu Val Gly Ala Asp Gly Ile Pro Gly Phe Pro Gly Leu Pro835 840 845ggc aga gag ggc att gct ggg ccc cag ggg cca aag gga gac aga ggc2592Gly Arg Glu Gly Ile Ala Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly850 855 860agc cgg gga gaa aag gga gat cca ggg aag gac gga gtc ggg cag ccg2640Ser Arg Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Lys Asp Gly Val Gly Gln Pro865 870 875 880ggc ctc cct ggc ccc ccc gga ccc ccg gga cct gtg gtc tac gtg tcg2688Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Val Tyr Val Ser885 890 895gag cag gac gga tcc gtc ctg agc gtg ccg gga cct gag ggc cgg ccg2736Glu Gln Asp Gly Ser Val Leu Ser Val Pro Gly Pro Glu Gly Arg Pro
900 905 910ggt ttc gca ggc ttt ccc gga cct gca gga ccc aag ggc aac ctg ggc2784Gly Phe Ala Gly Phe Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Asn Leu Gly915 920 925tct aag ggc gaa cga ggc tcc ccg gga ccc aag ggt gag aag ggt gaa2832Ser Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Glu930 935 940ccg ggc agc atc ttc agc ccc gac ggc ggt gcc ctg ggc cct gcc cag2880Pro Gly Ser Ile Phe Ser Pro Asp Gly Gly Ala Leu Gly Pro Ala Gln945 950 955 960aaa gga gcc aag gga gag ccg ggc ttc cga gga ccc ccg ggt cca tac2928Lys Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Phe Arg Gly Pro Pro Gly Pro Tyr965 970 975gga cgg ccg ggg tac aag gga gag att ggc ttt cct gga cgg ccg ggt2976Gly Arg Pro Gly Tyr Lys Gly Glu Ile Gly Phe Pro Gly Arg Pro Gly980 985 990cgc ccc ggg atg aac gga ttg aaa gga gag aaa ggg gag ccg gga gat3024Arg Pro Gly Met Asn Gly Leu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp99510001005gcc agc ctt gga ttt ggc atg agg gga atg ccc ggc ccc cca gga cct3072Ala Ser Leu Gly Phe Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Pro Pro Gly Pro101010151020cca ggg ccc cca ggc cct cca ggg act cct gtt tac gac agc aat gtg3120Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Pro Val Tyr Asp Ser Asn Val1025 103010351040ttt gct gag tcc agc cgc ccc ggg cct cca gga ttg cca ggg aat cag3168Phe Ala Glu Ser Ser Arg Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Asn Gln104510501055ggc cct cca gga ccc aag ggc gcc aaa gga gaa gtg ggc ccc ccc gga3216Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Ala Lys Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly106010651070cca cca ggg cag ttt ccg ttt gac ttt ctt cag ttg gag gct gaa atg3264Pro Pro Gly Gln Phe Pro Phe Asp Phe Leu Gln Leu Glu Ala Glu Met107510801085aag ggg gag aag gga gac cga ggt gat gca gga cag aaa ggc gaa agg3312Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Gln Lys Gly Glu Arg109010951100ggg gag ccc ggg ggc ggc ggt ttc ttc ggc tcc agc ctg ccc ggc ccc3360Gly Glu Pro Gly Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ser Ser Leu Pro Gly Pro1105 111011151120ccc ggc ccc cca ggc cca cgt ggc tac cct ggg att cca ggt ccc aag3408Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Tyr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Lys112511301135gga gag agc atc cgg ggc cag ccc ggc cca cct gga cct cag gga ccc3456Gly Glu Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro114011451150ccc ggc atc ggc tac gag ggg cgc cag ggc cct ccc ggc ccc cca ggc3504Pro Gly Ile Gly Tyr Glu Gly Arg Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly115511601165ccc cca ggg ccc cct tca ttt cct ggc cct cac agg cag act atc agc3552Pro Pro Gly Pro Pro Ser Phe Pro Gly Pro His Arg Gln Thr Ile Ser117011751180gtt ccc ggc cct ccg ggc ccc cct ggg ccc cct ggg ccc cct gga acc3600Val Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr1185 119011951200atg ggc gcc tcc tca ggg gtg agg ctc tgg gct aca cgc cag gcc atg3648Met Gly Ala Ser Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met120512101215ctg ggc cag gtg cac gag gtt ccc gag ggc tgg ctc atc ttc gtg gcc3696Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala122012251230gag cag gag gag ctc tac gtc cgc gtg cag aac ggg ttc cgg aag gtc3744Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val123512401245cag ctg gag gcc cgg aca cca ctc cca cga ggg acg gac aat gaa gtg3792Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu Pro Arg Gly Thr Asp Asn Glu Val125012551260gcc gcc ttg cag ccc ccc gtg gtg cag ctg cac gac agc aac ccc tac3840Ala Ala Leu Gln Pro Pro Val Val Gln Leu His Asp Ser Asn Pro Tyr1265 127012751280ccg cgg cgg gag cac ccc cac ccc acc gcg cgg ccc tgg cgg gca gat3888Pro Arg Arg Glu His Pro His Pro Thr Ala Arg Pro Trp Arg Ala Asp128512901295gac atc ctg gcc agc ccc cct cgc ctg ccc gag ccc cag ccc tac ccc3936Asp Ile Leu Ala Ser Pro Pro Arg Leu Pro Glu Pro Gln Pro Tyr Pro130013051310gga gcc ccg cac cac agc tcc tac gtg cac ctg cgg ccg gcg cga ccc3984Gly Ala Pro His His Ser Ser Tyr Val His Leu Arg Pro Ala Arg Pro131513201325aca agc cca ccc gcc cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc cac4032Thr Ser Pro Pro Ala His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His133013351340ctg gtt gcg ctc aac agc ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc4080Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg1345 135013551360ggg gcc gac ttc cag tgc ttc cag cag gcg cgg gcc gtg ggg ctg gcg4128Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala136513701375ggc acc ttc cgc gcc ttc ctg tcc tcg cgc ctg cag gac ctg tac agc4176Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser138013851390atc gtg cgc cgt gcc gac cgc gca gcc gtg ccc atc gtc aac ctc aag4224Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys139514001405gac gag ctg ctg ttt ccc agc tgg gag gct ctg ttc tca ggc tct gag4272Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu141014151420ggt ccg ctg aag ccc ggg gca cgc atc ttc tcc ttt gac ggc aag gac4320Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp1425 143014351440gtc ctg agg cac ccc acc tgg ccc cag aag agc gtg tgg cat ggc tcg4368Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser144514501455gac ccc aac ggg cgc agg ctg acc gag agc tac tgt gag acg tgg cgg4416Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg146014651470acg gag gct ccc tcg gcc acg ggc cag gcc tcc tcg ctg ctg ggg ggc4464Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly147514801485agg ctc ctg ggg cag agt gcc gcg agc tgc cat cac gcc tac atc gtg4512Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val149014951500ctc tgc att gag aac agc ttc atg act gcc tcc aag ta g 4551Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys1505 15101515<210>8<211>1516<212>PRT<213>人<400> 8Met Ala Pro Tyr Pro Cys Gly Cys His Ile Leu Leu Leu Leu Phe Cys1 5 10 15Cys Leu Ala Ala Ala Arg Ala Asn Leu Leu Asn Leu Asn Trp Leu Trp20 25 30Phe Asn Asn Glu Asp Thr Ser His Ala Ala Thr Thr Ile Pro Glu Pro35 40 45Gln Gly Pro Leu Pro Val Gln Pro Thr Ala Asp Thr Thr Thr His Val50 55 60Thr Pro Arg Asn Gly Ser Thr Glu Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ser Pro65 70 75 80Glu Pro Pro Ser Glu Leu Leu Glu Asp Gly Gln Asp Thr Pro Thr Ser85 90 95Ala Glu Ser Pro Asp Ala Pro Glu Glu Asn Ile Ala Gly Val Gly Ala100 105 110Glu Ile Leu Asn Val Ala Lys Gly Ile Arg Ser Phe Val Gln Leu Trp115 120 125Asn Asp Thr Val Pro Thr Glu Ser Leu Ala Arg Ala Glu Thr Leu Val130 135 140Leu Glu Thr Pro Val Gly Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Ser Ser Thr145 150 155 160Pro Gln Glu Asn Gly Thr Thr Leu Trp Pro Ser Arg Gly Ile Pro Ser165 170 175Ser Pro Gly Ala His Thr Thr Glu Ala Gly Thr Leu Pro Ala Pro Thr180 185 190Pro Ser Pro Pro Ser Leu Gly Arg Pro Trp Ala Pro Leu Thr Gly Pro195 200 205Ser Val Pro Pro Pro Ser Ser Glu Arg Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu210 215 220Leu Gln Leu Leu Gly Asp Pro Pro Pro Gln Gln Val Thr Gln Thr Asp225 230 235 240Asp Pro Asp Val Gly Leu Ala Tyr Val Phe Gly Pro Asp Ala Asn Ser245 250 255Gly Gln Val Ala Arg Tyr His Phe Pro Ser Leu Phe Phe Arg Asp Phe260 265 270Ser Leu Leu Phe His Ile Arg Pro Ala Thr Glu Gly Pro Gly Val Leu275 280 285Phe Ala Ile Thr Asp Ser Ala Gln Ala Met Val Leu Leu Gly Val Lys290 295 300Leu Ser Gly Val Gln Asp Gly His Gln Asp Ile Ser Leu Leu Tyr Thr305310 315 320Glu Pro Gly Ala Gly Gln Thr His Thr Ala Ala Ser Phe Arg Leu Pro325 330 335Ala Phe Val Gly Gln Trp Thr His Leu Ala Leu Ser Val Ala Gly Gly340 345 350Phe Val Ala Leu Tyr Val Asp Cys Glu Glu Phe Gln Arg Met Pro Leu355 360 365Ala Arg Ser Ser Arg Gly Leu Glu Leu Glu Pro Gly Ala Gly Leu Phe370 375 380Val Ala Gln Ala Gly Gly Ala Asp Pro Asp Lys Phe Gln Gly Val Ile385 390 395 400Ala Glu Leu Lys Val Arg Arg Asp Pro Gln Val Ser Pro Met His Cys405 410 415Leu Asp Glu Glu Gly Asp Asp Ser Asp Gly Ala Phe Gly Asp Ser Gly420 425 430Ser Gly Leu Gly Asp Ala Arg Glu Leu Leu Arg Glu Glu Thr Gly Ala435 440 445Ala Leu Lys Pro Arg Leu Pro Ala Pro Pro Pro Val Thr Thr Pro Pro450 455 460Leu Ala Gly Gly Ser Ser Thr Glu Asp Ser Arg Ser Glu Glu Val Glu465 470 475 480Glu Gln Thr Thr Val Ala Ser Leu Gly Ala Gln Thr Leu Pro Gly Ser485 490 495Asp Ser Val Ser Thr Trp Asp Gly Ser Val Arg Thr Pro Gly Gly Arg500 505 510Val Lys Glu Gly Gly Leu Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Val Pro515 520 525Gly Pro Pro Gly Arg Ala Gly Pro Pro Gly Ser Pro Cys Leu Pro Gly530 535 540Pro Pro Gly Leu Pro Cys Pro Val Ser Pro Leu Gly Pro Ala Gly Pro545 550 555 560Ala Leu Gln Thr Val Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly565 570 575Arg Asp Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Glu580 585 590Asp Gly Lys Pro Gly Asp Thr Gly Pro Gln Gly Phe Pro Gly Thr Pro595 600 605Gly Asp Val Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Gly Glu610 615 620Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser625 630 635 640Phe Arg His Asp Lys Leu Thr Phe Ile Asp Met Glu Gly Ser Gly Phe645 650 655Gly Gly Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Pro660 665 670Pro Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Glu Pro Gly Arg Phe675 680 685Gly Val Asn Ser Ser Asp Val Pro Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly Val690 695 700Pro Gly Arg Glu Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro705 710 715 720Gly Pro Pro Gly Arg Glu Gly Pro Pro Gly Arg Thr Gly Gln Lys Gly725 730 735Ser Leu Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly His Lys Gly Ser Lys Gly Ala740 745 750Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Ser Gly Leu Ala Gly Ala Pro755 760 765Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly770 775 780Pro Gly Leu Pro Ala Gly Phe Asp Asp Met Glu Gly Ser Gly Gly Pro785 790 795 800Phe Trp Ser Thr Ala Arg Ser Ala Asp Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly805 810 815Leu Pro Gly Leu Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Leu Pro Gly Ala820 825 830Lys Gly Glu Val Gly Ala Asp Gly Ile Pro Gly Phe Pro Gly Leu Pro835 840 845Gly Arg Glu Gly Ile Ala Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly850 855 860Ser Arg Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Lys Asp Gly Val Gly Gln Pro865 870 875 880Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Val Tyr Val Ser885 890 895Glu Gln Asp Gly Ser Val Leu Ser Val Pro Gly Pro Glu Gly Arg Pro900 905 910Gly Phe Ala Gly Phe Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Asn Leu Gly915 920 925Ser Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Glu930 935 940Pro Gly Ser Ile Phe Ser Pro Asp Gly Gly Ala Leu Gly Pro Ala Gln945 950 955 960Lys Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Phe Arg Gly Pro Pro Gly Pro Tyr965 970 975Gly Arg Pro Gly Tyr Lys Gly Glu Ile Gly Phe Pro Gly Arg Pro Gly980 985 990Arg Pro Gly Met Asn Gly Leu Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp99510001005Ala Ser Leu Gly Phe Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Pro Pro Gly Pro101010151020Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Pro Val Tyr Asp Ser Asn Val1025 103010351040Phe Ala Glu Ser Ser Arg Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Asn Gln104510501055Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Ala Lys Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly106010651070Pro Pro Gly Gln Phe Pro Phe Asp Phe Leu Gln Leu Glu Ala Glu Met107510801085Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Gln Lys Gly Glu Arg109010951100Gly Glu Pro Gly Gly Gly Gly Phe Phe Gly Ser Ser Leu Pro Gly Pro1105 1110 11151120Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Tyr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Lys112511301135Gly Glu Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro114011451150Pro Gly Ile Gly Tyr Glu Gly Arg Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly115511601165Pro Pro Gly Pro Pro Ser Phe Pro Gly Pro His Arg Gln Thr Ile Ser117011751180Val Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr1185 119011951200Met Gly Ala Ser Ser Gly Val Arg Leu Trp Ala Thr Arg Gln Ala Met120512101215Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe Val Ala122012251230Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val123512401245Gln Leu Glu Ala Arg Thr Pro Leu Pro Arg Gly Thr Asp Asn Glu Val125012551260Ala Ala Leu Gln Pro Pro Val Val Gln Leu His Asp Ser Asn Pro Tyr1265 127012751280Pro Arg Arg Glu His Pro His Pro Thr Ala Arg Pro Trp Arg Ala Asp128512901295Asp Ile Leu Ala Ser Pro Pro Arg Leu Pro Glu Pro Gln Pro Tyr Pro130013051310Gly Ala Pro His His Ser Ser Tyr Val His Leu Arg Pro Ala Arg Pro131513201325Thr Ser Pro Pro Ala His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His133013351340Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg1345 135013551360Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala136513701375Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser138013851390Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys139514001405Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu141014151420Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp1425 143014351440Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser144514501455Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg146014651470Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly147514801485Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val
149014951500Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys1505 15101515<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人內(nèi)抑制素基因的PCR的hEST 5′引物<400>9aagcttcgat cgcacagcca ccgcgacttc cagccggtgc tc42<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人內(nèi)抑制素基因的PCR的hEST3′引物<400>10ggatcctcat tacttggagg cagtcatgaa gctgttctca at42<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>鼠IgG(鏈信號(hào)肽基因的PCR的5′引物<400>11aagcttagat ctgacccaag ctggcaagcc accatg 36<210>12<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>鼠IgG(鏈信號(hào)肽基因的PCR的3′引物<400>12ggatccgcta gcggccgcgt caccagtgga acc 33<210>13<211>114<212>DNA<213>鼠<400>13aagcttagat ctgacccaag ctggcaagcc accatggaga cagacacact cctgctatgg60gtactgctgc tctgggttcc aggttccact ggtgacgcgg ccgctagcgg atcc 114<210>14<211>690<212>DNA<213>鼠<400>14atgagcgtcg ctgcggtgtt tcgaggcctc cggcccagtc ctgagctgct gcttctgggc60ctgttgtttc tgccagcggt ggttgctgtc accagcggtg agattgggtg aagggatgct 120agggacagga agacagttca ggagcctcag gtgcggggag gtgaactctg atgacatcgg 180gtcatattgt atgggctttc cacctgcctt ccgaggggaa gccgatgctg taaccaagcc 240tgtggaaagg tccagaggta ccacaccggc agatgatagg gtcatcgcta tctcttctac 300tcccctcttc ttctccccgt ttaccctcag ctggtcccga agaaagcgat ggagatctta 360gctgtgtgtg tgtgaagacc atctcctctg ggatccatct taagcacatc accagcctgg 420aggtgatcaa ggcaggacgc cactgtgcgg ttccccagct catgtgagtc ctgcccacat 480cccccaggcc cgtcctctcc tctgctaccc gttccttccc atctcttccc ttcttccaac 540caaggatctg taatgcaatt ccttcccttt cccctctttc ccctctgaca gagccaccct 600gaagaatggg aggaaaattt gcctggaccg gcaagcaccc ctatataaga aagtaatcaa 660gaaaatcctg gagagttagg tatcagctgc690<210>15<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>鼠血小板因子-4基因的PCR的5′引物<400>15gatatcaagc ttgcaggtct tgacatgagc gtcg34<210>16<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>鼠血小板因子-4基因的PCR的3′引物<400>16gatatcctcg agggcagctg atacctaact ctcc343權(quán)利要求
1.一種用于基因治療的組合物，包括一種編碼一種抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA，其對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎顯示出治療活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的抗-血管生成蛋白是制管張素，內(nèi)抑制素，血小板因子-4，血小板反應(yīng)蛋白-1，血小板反應(yīng)蛋白-2，METH-1，METH-2和肝細(xì)胞生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的DNA編碼血纖蛋白溶酶原蛋白的93rd～368th位氨基酸(SEQ.ID.No2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的DNA編碼膠原蛋白XVIII蛋白的1334th～1516th位氨基酸(SEQ.ID.No8)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的DNA編碼SEQ.ID.No14所代表的血小板因子-4蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的編碼一種抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA與編碼一種信號(hào)肽的核苷酸序列連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中的信號(hào)肽具有人血纖蛋白溶酶原的N-末端的18個(gè)氨基酸(SEQ.ID.No2)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中的信號(hào)肽是由SEQ.ID.No13所代表的核苷酸序列所編碼的鼠免疫球蛋白κ鏈的信號(hào)肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的編碼一種抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA是以在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺-伴隨病毒，單純皰疹病毒載體或者能在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒中的插入的形式提供的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是MT5載體(KCCM-10205)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中的編碼一種抗-血管生成蛋白或者其部分的DNA是以通過用包含該DNA的重組載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)一種細(xì)胞而收集的重組細(xì)胞的形式提供的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中的重組細(xì)胞具有與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的相同的或者相似的MHC抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中的重組細(xì)胞是分離自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液細(xì)胞。
14.一種用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，其通過遞送根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何的用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物到患者的受侵襲的區(qū)域而進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療的組合物，包括一種編碼抗－血管生成蛋白或者其部分的基因。更具體地，本發(fā)明提供了一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的基因治療方法，其通過制備表達(dá)編碼諸如制管張素的抗－血管生成蛋白或者其部分的基因的重組載體，并且將該重組載體或者用該重組載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞移植入患者的受侵襲的區(qū)域，并且還提供了用于該基因治療的組合物。根據(jù)本發(fā)明的用于基因治療的組合物可以有效地用于治療迄今還沒有研發(fā)出有效的治療方法的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其通過連續(xù)地提高抗－血管生成蛋白到患者的膝中以便防止滑液組織增生以及所致的炎癥。
文檔編號(hào)A61K38/39GK1455682SQ02800043
公開日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2002年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月5日
發(fā)明者金種默, 胡成炫, 樸銀珍, 金善榮 申請(qǐng)人:百療醫(yī)株式會(huì)社