專利名稱：五肽類似物,其制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的五肽衍生物，其制備方法，含它們的藥物組合物及它們在治療癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
多肽類化合物具有結(jié)構(gòu)新穎，活性顯著，作用專一的特點，其生物活性主要集中于抗腫瘤和抗真菌方面。Dolastatin 15是源自西印度洋軟體動物海兔Dolabella auricularia的一個線性天然多肽，經(jīng)美國國家癌癥研究所(NCI)篩選發(fā)現(xiàn)具有很強的抑制細胞生長的活性，對多種惡性腫瘤細胞有抑制作用。作用機制的初步探討發(fā)現(xiàn)，其可作用于微管蛋白，抑制有絲分裂，阻斷細胞周期。因此有必要尋找新的具有抗腫瘤活性的多肽化合物。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是尋找新的具有抗腫瘤活性的多肽化合物或其先導(dǎo)化合物。
發(fā)明簡述本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式(I)的五肽類似物X-Y-Z-L-M-N(I)或其立體異構(gòu)體具有良好的抗腫瘤活性，因此式(I)五肽類似物或其立體異構(gòu)體可作為藥物用于治療癌癥。
本發(fā)明涉及式(I)五肽衍生物或其立體異構(gòu)體，X-Y-Z-L-M-N(I)其中X為L-或D-α-型-N-端單烷基或雙烷基取代的親脂性氨基酸，四氫異喹啉-3-羧酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈或C3-C7元環(huán)狀烷基，親脂性氨基酸選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y為L-或D-α-型親脂性天然或非天然氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z為L-或D-α-型N-端單烷基取代的親脂性氨基酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈或C3-C7元環(huán)狀烷基，親脂性氨基酸為Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M為下列L-或D-α-型氨基酸中的任意兩個或部分自身組合N原子在四～七元環(huán)上的氨基酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，四氫異喹啉-3-羧酸，反式或順式-4-取代-脯氨酸，取代基為羥基、鹵素、硝基、氨基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直鏈或支鏈烷基)胺基、C3-C7環(huán)烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7環(huán)烷胺基；N為脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或肟。
本發(fā)明涉及含至少一個式(I)五肽衍生物或其立體異構(gòu)體，及藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
X-Y-Z-L-M-N(I)其中X為L-或D-α-型-N-端單烷基或雙烷基取代的親脂性氨基酸，四氫異喹啉-3-羧酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈或C3-C7元環(huán)狀烷基；親脂性氨基酸為Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y為L-或D-α-型親脂性天然或非天然氨基酸，Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z為L-或D-α-型N-端單烷基取代的親脂性氨基酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈、C3-C7元環(huán)狀烷基，親脂性氨基酸為Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M為下列L-或D-α-型氨基酸中的任意兩個或部分自身組合N原子在四～七元環(huán)上的氨基酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，四氫異喹啉-3-羧酸，反式或順式-4-取代-脯氨酸，取代基為羥基、鹵素、硝基、氨基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直鏈或支鏈烷基)胺基、C3-C7環(huán)烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7環(huán)烷胺基；N為脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或肟。
本發(fā)明還涉及制備式I五肽衍生物或其立體異構(gòu)體的方法，其包括1)將化合物Boc-L-OH與M-OP在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，其中L，M如權(quán)利要求2中定義，P為C1-5烷基，生成Boc-L-M-OP；2)將1)中所得產(chǎn)物在鹽酸/二氧六環(huán)中脫去氨基保護基，生成L-M-OP；3)將2)中產(chǎn)物L(fēng)-M-OP與Boc-Z-OH在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Z-L-M-OP，所得產(chǎn)物如2)中所述進行反應(yīng)，生成脫去氨基保護基的Z-L-M-OP；4)將3)中產(chǎn)物Z-L-M-OP與Boc-Y-OH在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Y-Z-L-M-OP；5)將4)中產(chǎn)物Boc-Y-Z-L-M-OP在氫氧化鈉/甲醇溶液中皂化，然后用檸檬酸酸化，生成Boc-Y-Z-L-M-OH；6)將5)中產(chǎn)物Boc-Y-Z-L-M-OH與N-NHR在DCM，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Y-Z-L-M-N；7)將6)中產(chǎn)物Boc-Y-Z-L-M-N如2)中所述進行反應(yīng)，生成脫去氨基保護基的Y-Z-L-M-N；8)將7)中產(chǎn)物與X-OH在DCM，TEA，DEPC中反應(yīng)，生成式IX-Y-Z-L-M-N。
本發(fā)明還涉及式(I)五肽類似物或其立體異構(gòu)體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。涉及的腫瘤細胞如成纖維細胞MRC5CV1、膀胱癌細胞T24、鼠白血病細胞L1210、鼠白血病細胞P388、人肺癌細胞A549、人結(jié)腸癌細胞HT29、人結(jié)腸癌細胞LOVO、猴腎成纖維細胞CV1、人乳腺癌細胞MCF7、人惡性膠質(zhì)瘤/星形細胞瘤細胞U373、人卵巢癌細胞HEY、表皮樣瘤細胞系KB、黑素瘤細胞B16、MDA-MB-435乳腺癌細胞、HeLa S3子宮頸癌細胞、人紅白血病細胞K562、人卵巢癌細胞OVCA2780、人胃印戒癌細胞Kato-III等。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中使用的縮寫具有下面的含義Ala-丙氨酸，Gly-甘氨酸，Ile-異亮氨酸，Leu-亮氨酸，Val-纈氨酸，MeVal-甲基纈氨酸，Phe-苯丙氨酸，Pro-脯氨酸，BA-苯甲胺，BEA-苯乙胺，DEA-二乙胺，DCHA-二環(huán)己胺，Mpl-嗎啡啉，Prd-哌啶，TEA-三乙胺，Thp-四氫吡咯，DCM-二氯甲烷，DMF-二甲基甲酰胺，DIC-二異丙基碳二亞胺，HOBt-1-羥基苯并三唑，Boc-叔丁氧羰基，DEPC-氰基磷酸二乙酯，THF-四氫呋喃。
術(shù)語“C1-5烷基”指含1-5個碳原子的直鏈或支鏈烷基，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基。
本發(fā)明所用術(shù)語“式(I)五肽類似物立體異構(gòu)體”是指其相應(yīng)的D-或L-立體構(gòu)型。
根據(jù)本發(fā)明，式(I)五肽類似物或其立體異構(gòu)體可按本領(lǐng)域已知方法、文獻方法或下面所示的反應(yīng)路線1制備反應(yīng)路線1 i.DMF，DCM，TAA，DIC-HOBt ii.4N HCl/1，4-Dioxane iii.1N NaOH/MeOHiv.DCM，DIC-HOBtv.DCM，TAA，DEPC在反應(yīng)路線1中，化合物Boc-L-OH(L如上定義)與M-OP(M如上定義，P為C1-4烷基，其可選自甲基，乙基，異丙基，丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，優(yōu)選甲基和乙基)在DCM，DMF，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-L-M-OP(其中L，M，P如上定義)。將Boc-L-M-OP經(jīng)4摩爾鹽酸/二氧六環(huán)脫保護基，生成Z-M-OP。將L-M-OP與Boc-Z-OH在DCM，DMF，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Z-L-M-OP。將Boc-Z-L-M-OP經(jīng)4摩爾鹽酸/二氧六環(huán)脫保護基，生成Z-L-M-OP。將Z-L-M-OP與Boc-Y-OH在DCM，DMF，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Y-Z-L-M-OP。將Boc-Y-Z-L-M-OP經(jīng)1摩爾氫氧化鈉/甲醇皂化，生成Boc-Y-Z-L-M-OH。將Boc-Y-Z-L-M-OH與N-NHR在DCM，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Y-Z-L-M-N。將Boc-Y-Z-L-M-N經(jīng)4摩爾鹽酸/二氧六環(huán)脫保護基，生成Y-Z-L-M-N。將Y-Z-L-MN與X-OH在DCM，TEA，DEPC中反應(yīng)生成X-Y-Z-L-M-N。
根據(jù)本發(fā)明，式(I)五肽類似物的立體異構(gòu)體包括D-和/或L-構(gòu)型。
根據(jù)本發(fā)明，式(I)五肽類似物及其立體異構(gòu)體在人癌癥細胞篩選中顯示較好的抑制細胞生長的活性。
本發(fā)明涉及含有作為活性成分的有效劑量的至少一種式(I)五肽類似物和/或其立體異構(gòu)體以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1～90％的式(I)五肽類似物和/或其立體異構(gòu)體。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將式(I)五肽類似物和/或其立體異構(gòu)體與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明式(I)五肽類似物及其立體異構(gòu)體或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子，如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鈣、氯化鈉、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分式I五肽衍生物或其立體異構(gòu)體與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分式I五肽衍生物或其立體異構(gòu)體制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中制成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧基化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
實施例下面的實例及生物活性實驗用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例化合物熔點由RY-1型熔點儀測定，溫度未經(jīng)校正；1H NMR圖譜由Bruker ARX 400型或US Varian Unity Inova 600型核磁儀測定；FAB質(zhì)譜由Zabspect高分辨磁質(zhì)譜儀測定；元素分析由CarloErba 1106型元素分析儀測定；紫外光譜由UV-260紫外可見分光光度計測定；紅外光譜由Magna IRTM 550紅外儀測定。實施例制備所用反應(yīng)試劑均為商品化產(chǎn)品。
非天然氨基酸的制備N，N-五亞甲基-L-纈氨酸鹽酸鹽(HCl·PMI-L-Val)的制備L-纈氨酸甲酯鹽酸鹽3.35克(20mmol)，加入叔丁醇300毫升，溶解，加入三乙胺8.35毫升(60mmol)，混濁，加入1，5-二溴戊烷3.0毫升(22mmol)后，補加叔丁醇100毫升，油浴45℃，36小時。濃縮，加入二氯甲烷20毫升，濾除固體。濾液分別用飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗一次，二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮，得棕黃色油狀物，加入10毫升鹽酸乙醇，溶解，濃縮，用無水乙醇-無水乙醚重結(jié)晶，室溫放置，析出針狀結(jié)晶1.7克，m.p.137～139℃。加入4mol/L鹽酸溶液，回流4小時，濃縮得白色固體，得約1.4克，m.p.222～225℃，MS[M+H]+＝186。
N，N-六亞甲基胺甲酰-L-亮氨酸(HIM-L-Leu)的制備L-亮氨酸甲酯鹽酸鹽7.26克(40mmol)，加入二氯甲烷50毫升，溶解，冷卻至-10℃，攪拌加入吡啶8毫升(100mmol)，滴加氯甲酸苯酯6.50克(41.5mmol)/20毫升二氯甲烷，攪拌1小時后，傾入冰水中，分出有機相，水相用二氯甲烷提取兩次(15毫升×2)，合并有機相，以飽和氯化鈉洗兩次(20毫升×2)，無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干，得無色油狀物，加入六亞甲基亞胺32毫升(280mmol)、三乙胺80毫升(575mmol)和氯仿20毫升，50～55℃攪拌反應(yīng)2小時，減壓濃縮，加入乙酸乙酯40毫升和水40毫升，乙酸乙酯層分別用1摩爾鹽酸(20毫升×2)、飽和碳酸氫鈉溶液30毫升和飽和氯化鈉溶液洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得無色油狀物，加入甲醇80毫升和2摩爾氫氧化鈉溶液50毫升，室溫攪拌90分鐘，以2摩爾鹽酸調(diào)pH至8.0，減壓濃縮至40毫升，乙醚萃取(20毫升×2)，水相在冷卻條件下用濃鹽酸酸化至pH2～3，析出白色顆粒狀晶體，濾集干燥，用乙酸乙酯-環(huán)己烷重結(jié)晶，得7.4克(72％)，m.p.92～94.5℃，MS[M+H]+＝242。
N-叔丁氧羰基-N-甲基-L-纈氨酸(Boc-N-Me-L-Val)的制備Boc-L-Val 4.35克(20mmol)，加入無水THF/DMF(10∶1)的混合溶液55毫升，溶解，加入碘甲烷10毫升(160mmol)，氫化鈉固體2.88克(50％，60mmol)，油浴80℃，24小時。濃縮，加入乙醚和水，振搖分液，水相再用乙醚提取三次(40毫升×3)，乙醚層用無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮，得黃色分界不明顯的油狀混合物。加入THF 40毫升，溶解，冰浴攪拌下，滴加1N NaOH 40毫升，冰浴30分鐘后，室溫反應(yīng)12小時。濃縮除THF，加入乙醚萃取兩次(25毫升×2)，水相加入乙酸乙酯5毫升，于冰浴攪拌下用檸檬酸調(diào)pH～2，用乙酸乙酯萃取四次(50毫升×4)，合并乙酸乙酯層，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮，得黃色油狀物4.2克(90％)，MS[M+H]+＝232。
N-乙?；?N-甲基-L-纈氨酸(N-Ac-N-Me-L-Val)的制備L-Val 11.7克(0.1mol)，溶于2N NaOH 110毫升(0.22mol)溶液中，冰浴攪拌下，滴加醋酐11.34毫升，溫度控制在0～5℃，反應(yīng)40分鐘。加入濃鹽酸，調(diào)pH～2，析出白色固體12.7克(80％，80mmol)。取出該固體3.2克(20mmol)，加入無水THF/DMF(10∶1)的混合溶液55毫升，溶解，加入碘甲烷10毫升(160mmol)，氫化鈉固體2.88克(50％，60mmol)，油浴80℃，24小時。濃縮，加入乙醚和水，振搖分液，水相再用乙醚提取三次(40毫升×3)，乙醚層用無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮，得黃色分界不明顯的油狀混合物。加入THF 40毫升，溶解，冰浴攪拌下，滴加1N NaOH 40毫升，冰浴30分鐘后，室溫反應(yīng)12小時。濃縮除THF，加入乙醚萃取兩次(25毫升×2)，水相加入乙酸乙酯5毫升，于冰浴攪拌下用檸檬酸調(diào)pH～2，用乙酸乙酯萃取四次(50毫升×4)，合并乙酸乙酯層，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮，得白色針狀結(jié)晶2.77克(80％)，m.p.112～114℃，MS[M+H]+＝160。
N-甲基-L-脯氨酸(N-Me-L-Pro)的制備
L-Pro 1.0克(8.68mmol)，溶于40毫升水，加入甲醛水溶液(37～40％)0.7毫升(8.68mmol)，鈀炭0.25克，通氫氣450毫升(20mmol)。吸氫完全后，將反應(yīng)液加熱至微沸，趁熱過濾，濃縮濾液，無水乙醇-丙酮重結(jié)晶，4℃冰箱過夜，得白色針狀結(jié)晶1.11克(99％)，m.p.109～112℃，MS[M+H]+＝130。
N，N-二甲基-L-纈氨酸(N，N-Me2-L-Val)的制備方法和途徑同N-甲基-L-脯氨酸。產(chǎn)品為白色針狀結(jié)晶，m.p.152～154℃，MS[M+H]+＝146。
N-叔丁氧羰基-四氫異喹啉-3(R)-羧酸((R)-Boc-Tic)的制備L-Phe 5.0克(33mmol)，加入甲醛水溶液(37～40％)11.5毫升和濃鹽酸38毫升，油浴90℃，3小時后，再加入濃鹽酸10毫升和甲醛水溶液(37～40％)5毫升，油浴95℃，3小時。室溫放置過夜，析出固體。固體在冰浴中用氨水/水(2∶3)溶解，濃鹽酸調(diào)pH～9.0，有白色固體析出，濾集固體5.72克(98.0％)。取該固體3.90克(22mmol)，冰浴攪拌下加入二氧六環(huán)90毫升，水45毫升，1N NaOH45毫升，溶解，加入叔丁氧酸酐5.28克(24.2mmol)，冰浴1.5小時后，室溫反應(yīng)2.5小時。濃縮除二氧六環(huán)，乙醚提取兩次(30毫升×2)，水相冰浴攪拌下用稀硫酸氫鉀溶液調(diào)pH～3，水相用乙酸乙酯萃取三次(40毫升×3)，合并有機相，飽和氯化鈉洗一次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮，得油狀物。加入石油醚冰浴研磨，得到白色固體5.3克(87.0％)，m.p.76～80℃，MS[M+H]+＝278。
N-叔丁氧羰基-順式-4-(N-四亞甲基胺基)-N-芐基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Thp-L-Pro-BA)的制備反式-4-羥基-L-脯氨酸5.24克(40mmol)，冰浴攪拌下加入二氧六環(huán)80毫升，水40毫升，1N NaOH 40毫升，溶解，加入叔丁氧酸酐9.5克(44mmol)，冰浴1小時后，室溫反應(yīng)6小時。濃縮至30毫升，加入乙酸乙酯10毫升，冰浴攪拌下用檸檬酸調(diào)pH～2，水相用乙酸乙酯萃取四次(40毫升×4)，合并有機相，飽和氯化鈉洗一次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮，得白色結(jié)晶。取出該結(jié)晶1.15克(5mmol)，二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入HOBt 0.74毫克(5.5mmol)的DMF溶液3.72毫升，DIC 0.87毫升(5.5mmol)，冰浴30分鐘后，加入芐胺0.55毫升(5.0mmol)。冰浴1小時后，室溫反應(yīng)10小時。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗一次，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥3小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得白色固體1.54克(97％)，m.p.97～101℃。取該白色固體0.64克(2.0mmol)，二氯甲烷溶解，冰鹽浴冷卻，加入甲磺酰氯0.39毫升(4.0mmol)，三乙胺0.56毫升(4.4mmol)，冰鹽浴30分鐘。反應(yīng)液(二氯甲烷)用飽和氯化鈉洗后，無水硫酸鈉干燥3小時，濃縮，得白色固體0.70克(88％)，m.p.151～156℃。取該白色固體0.1克(0.25mmol)，加入THF 35毫升，溶解，加入四氫吡咯82.7微升(1.0mmol)，氫化鈉50毫克，室溫反應(yīng)8小時。反應(yīng)液(二氯甲烷)用飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉各洗兩次，有機相用無水硫酸鈉干燥2小時。濾除干燥劑，濃縮，得黃色油狀物。
N-叔丁氧羰基-順式-4-(N-二乙基胺基)-N-芐基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Dea-L-Pro-BA)方法和途徑同N-叔丁氧羰基-順式-4-(N-四亞甲基胺基)-N-芐基-L-脯氨酰胺。產(chǎn)品為油狀物。
N-叔丁氧羰基-順式-4-(1-嗎啉基)-N-芐基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Mpl-L-Pro-BA)方法和途徑同N-叔丁氧羰基-順式-4-(N-四亞甲基胺基)-N-芐基-L-脯氨酰胺。產(chǎn)品為油狀物。
N-叔丁氧羰基-順式-4-(N-五亞甲基胺基)-N-芐基-L-脯氨酰胺(cis-Boc-Prd-L-Pro-BA)方法和途徑同N-叔丁氧羰基-順式-4-(N-四亞甲基胺基)-N-芐基-L-脯氨酰胺。產(chǎn)品為油狀物。
實施例1Me2Val-Val-MeVal-Tic-Pro-NHCH2C6H5(QPP-024)的制備將L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽3.32克(20mmol)，溶于20毫升二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入三乙胺2.78毫升(20mmol)，10分鐘后，加入Boc-(R)-四氫異喹啉-3-羧酸5.54克(20mmol)，溶解。加入HOBt2.84克(21mmol)的DMF溶液6ml，冰浴10分鐘后，加入DIC3.3毫升(21mmol)。繼續(xù)保持冰浴2小時后，室溫反應(yīng)12小時。濃縮，加入乙酸乙酯50毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥3小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物7.3克。經(jīng)硅膠柱層析(乙酸乙酯-石油醚，1∶1，Rf＝0.62)，得到白色結(jié)晶5.34克(68.8％，13.8mmol)。取該結(jié)晶3.25克(10mmol)，加入4N HCl/二氧六環(huán)約20毫升，溶解，室溫攪拌1小時。濃縮，得黃色油狀液體。二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入三乙胺1.39毫升(10mmol)，10分鐘后，加入Boc-N-甲基-L-纈氨酸2.30克(10mmol)，溶解。加入HOBt 1.49克(11mmol)的DMF溶液3毫升，冰浴10分鐘，加入DIC 1.73毫升(10mmol)。冰浴2小時后，室溫反應(yīng)12小時。濃縮，加入乙酸乙酯40毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥3小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。加入石油醚20毫升，冰浴條件下研磨，得類白色固體2.51克(50％，5mmol)。加入4N HCl/二氧六環(huán)約20毫升，溶解后，室溫攪拌1小時。濃縮，得黃色粘稠狀液體。
所得三肽1.60克(3.2mmol)，二氯甲烷5毫升溶解，冰浴攪拌下加入三乙胺0.45毫升(3.2mmol)，10分鐘后，加入Boc-L-纈氨酸0.70克(3.2mmol)，溶解。HOBt 0.45克(3.36mmol)用少量DMF溶解后，加入反應(yīng)液中。冰浴10分鐘后，加入DIC 0.53毫升(3.36mmol)。冰浴2小時后，室溫反應(yīng)7小時。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物1.5克(86.2％，2.75mmol)。加入甲醇溶解，冰浴攪拌下逐滴加入2N NaOH 2.8毫升(5.6mmol)，冰浴反應(yīng)30分鐘后，保持反應(yīng)液pH9～10，室溫反應(yīng)3小時。濃縮，加入乙醚和飽和碳酸氫鈉，振搖分液，水相再用乙醚提取一次，于冰浴攪拌下加入檸檬酸調(diào)pH～4，用乙酸乙酯萃取三次(25毫升×3)，合并乙酸乙酯層，飽和氯化鈉洗后，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮，得黃色油狀物1.08克(2.05mmol)。
所得四肽黃色油狀物0.216g(0.41mmol)，二氯甲烷10毫升溶解，冰浴攪拌下，加入HOBt 60毫克(0.451mmol)的DMF溶液0.3毫升，DIC 71微升，冰浴30分鐘后，加入苯乙胺51.7微升。冰浴1小時后，室溫反應(yīng)11小時。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物0.22克(0.35mmol)。加入4N HCl/二氧六環(huán)約5毫升，溶解，室溫攪拌1小時。濃縮，得黃色油狀液體0.22克(0.35mmol)。
上述四肽酰胺0.11克(0.175mmol)，二氯甲烷5毫升溶解，冰鹽浴攪拌下加入三乙胺60.9微升(0.44mmol)，10分鐘后，加入N，N-二甲基纈氨酸25.4毫克(0.175mmol)，DEPC 40.0微升(0.26mmol)。冰鹽浴1小時后，室溫反應(yīng)24小時。濃縮，加入二氯甲烷10毫升，水洗，分別用飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗兩次，二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得淡黃色油狀液體。MS[M+H]+＝703，純度85％。
實施例2Me2Val-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2C6H5(QPP-018)的制備將L-脯氨酸甲酯鹽酸鹽2.48克(15mmol)，溶于20毫升二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入Boc-甲基纈氨酸二環(huán)己胺鹽6.18克(15mmol)，溶解。10分鐘后，加入HOBt 2.23克(17.5mmol)的DMF溶液3ml，冰浴10分鐘后，加入DIC 2.60毫升(17.5mmol)。繼續(xù)保持冰浴2小時后，室溫反應(yīng)12小時。濃縮，加入乙酸乙酯50毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥3小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得淡黃色油狀物。經(jīng)硅膠柱層析(乙酸乙酯-石油醚，1∶1，Rf＝0.50)，得到白色固體2.46克(48％，7.2mmol)。加入4N HCl/二氧六環(huán)約15毫升，溶解，室溫攪拌1小時。濃縮，得白色固體。二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入三乙胺0.98毫升(7.0mmol)，10分鐘后，加入Boc-L-纈氨酸1.52克(7.0mmol)，溶解。加入HOBt 1.04克(7.7mmol)的DMF溶液3毫升，冰浴10分鐘，加入DIC 1.22毫升(7.7mmol)。冰浴2小時后，室溫反應(yīng)12小時。濃縮，加入乙酸乙酯20毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥3小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得淡黃色油狀物3.06克(6.94mmol)。加入4N HCl/二氧六環(huán)約20毫升，溶解后，室溫攪拌1小時。濃縮，得黃色油狀液體。加入甲醇溶解，冰浴攪拌下逐滴加入2N NaOH 6.94毫升(13.88mmol)，冰浴反應(yīng)30分鐘后，保持反應(yīng)液pH9～10，室溫反應(yīng)5小時。加入檸檬酸調(diào)pH～7，濃縮，加入乙酸乙酯5毫升，水相于冰浴攪拌下加入檸檬酸調(diào)pH～4，用乙酸乙酯萃取三次(25毫升×3)，合并乙酸乙酯層，飽和氯化鈉洗后，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮，得淡黃色油狀物2.30克(5.39mmol)。
所得三肽0.11克(0.25mmol)，二氯甲烷5毫升溶解，冰浴攪拌下加入三乙胺69.6微升(0.25mmol)，10分鐘后，加入Boc-順式-4-(N，N-四亞甲基胺基)-L-脯氨酸-芐酰胺93.7毫克(0.25mmol)，溶解。HOBt 37.1微克(0.275mmol)用少量DMF溶解后，加入反應(yīng)液中。冰浴10分鐘后，加入DIC 43.3微升(0.275mmol)。冰浴2小時后，室溫反應(yīng)7小時。濃縮，加入二氯甲烷10毫升，水洗一次后，分別用飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。加入4N HCl/二氧六環(huán)約20毫升，溶解后，室溫攪拌1小時。濃縮，得淡黃色油狀液體。
所得四肽酰胺淡黃色油狀物40毫克(0.059mmol)，二氯甲烷10毫升溶解，冰鹽浴攪拌下，加入三乙胺41.0微升(0.35mmol)，10分鐘后，加入N，N-二甲基纈氨酸8.6毫克(0.295mmol)，DEPC 27微升(0.177mmol)。冰鹽浴1小時后，室溫反應(yīng)24小時。濃縮，加入二氯甲烷5毫升，水洗，分別用飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮濾液，得淡黃色油狀液體。MS[M+H]+＝710，純度80％。
依據(jù)與實施例1或?qū)嵤├?相同或相似的方法制備得到了以下化合物PMI-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-001)分子量680純度85％PMI-Val-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-002)分子量652純度90％PMI-Val-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-003)分子量694純度85％PMI-Val-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-004)分子量694純度85％HIM-Leu-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-005)分子量766純度80％HIM-Leu-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-006)分子量738純度80％HIM-Leu-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-007)分子量780純度90％HIM-Leu-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2CH2Ph(QPP-008)分子量780純度95％HIM-Leu-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-009)分子量752純度90％HIM-Leu-Ala-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-010)分子量724純度90％HIM-Leu-Leu-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QTP-011)分子量766純度90％HIM-Leu-Ile-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QTP-012)分子量766純度90％Ac-N-MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-013)分子量668純度95％Boc-MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-014)分子量726純度95％HCl·MeVal-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-015)分子量762.5純度95％Me2Val-Val-MeVal-Pro-Tic-NHCH2Ph(QPP-016)分子量702純度80％Me2Val-Val-MeVal-Pro-DeaPro-NHCH2Ph(QPP-017)分子量711純度85％Me2Val-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2Ph(QPP-018)分子量709純度85％CMe2Val-Val-MeVal-Pro-MplPro-NHCH2Ph(QPP-019)分子量725純度80％Me2Val-Val-MeVal-Pro-PrdPro-NHCH2Ph(QPP-020)分子量707純度82％N-MePro-Val-MeVal-Pro-Pro-NHCH2Ph(QPP-021)分子量624純度95％N-MePro-Val-MeVal-Pro-DeaPro-NHCH2Ph(QPP-022)分子量695純度80％N-MePro-Val-MeVal-Pro-ThpPro-NHCH2Ph(QPP-023)分子量693純度80％Me2Val-Val-MeVal-Tic-Pro-NHCH2C6H5(QPP-024)分子量702純度95％
其余各化合物可依據(jù)上述方法和途徑制備而成。
實施例3MTT顯色法檢測體外抗癌活性。
腫瘤細胞懸液的制備取傳代培養(yǎng)72小時的K562、OVCA2780、Kato-III細胞株，用0.4％臺盼蘭與細胞懸液1∶1(50μl加50μl)混勻，立即按白細胞計數(shù)法計數(shù)活細胞數(shù)，每毫升的活細胞數(shù)＝計數(shù)值×5000。然后用10％小牛血清RPMI1640液將細胞濃度調(diào)整到3.125×105個/毫升，備用。
加樣培養(yǎng)在無菌條件下，向96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入以調(diào)整好的3.125×105個/毫升K562細胞懸液80μl和已設(shè)定好的本發(fā)明化合物濃度20μl，每個化合物濃度設(shè)3～6個復(fù)孔，然后置37℃，5％CO2，飽和濕度孵溫箱中培養(yǎng)48小時，加0.25％MTT液20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后加入10％SDS100μl/孔，置孵溫箱培養(yǎng)過夜。
OD值測定將上述含有培養(yǎng)物加入SDS在孵溫箱中培養(yǎng)過夜的96孔板置多孔掃描分光光度計Multiskan MCC/340 MKII中，選用單波長570nm測定OD值，計算OD值的百分率及化合物IC50。
OD值(％)＝給化合組OD/溶劑對照組OD×100％IC50值是以化合物濃度對OD百分率的對數(shù)值做線性回歸后得出的?；衔锾朞D值(x±s)K562OVCA2780 Kato-IIIQPP-0010.8063±0.0609* 0.5713±0.0040* 0.9523±0.0327*QPP-0021.3020±0.00350.6473±0.05911.0975±0.0542QPP-0031.0557±0.08790.3513±0.07350.9887±0.0139QPP-0041.3570±0.07310.6927±0.03981.1170±0.0165QPP-0050.9370±0.04060.4080±0.00890.8840±0.0056QPP-0060.9670±0.04790.3886±0.00550.9007±0.0193QPP-0070.8667±0.01880.4223±0.01960.8440±0.0271QPP-0080.8967±0.02110.4303±0.00970.8583±0.0323QPP-0090.9517±0.02910.6267±0.01100.9720±0.0426QPP-0100.9483±0.01530.5693±0.02750.9853±0.0133QPP-0110.7923±0.07920.6247±0.07131.0207±0.0753QPP-0120.8380±0.02880.6267±0.02041.0793±0.0392QPP-0130.7953±0.0110* 0.6572±0.1308* 0.9670±0.0118*QPP-0140.7613±0.01510.5230±0.00820.9377±0.0457QPP-0150.6933±0.02150.5853±0.00400.8610±0.0101QPP-0161.0653±0.01800.6413±0.00931.0007±0.0250QPP-0170.7290±0.03600.4953±0.01990.8350±0.0240QPP-0180.6743±0.0290* 0.6423±0.0475* 0.7327±0.0121*QPP-0191.3343±0.02810.6980±0.05441.1840±0.0225QPP-0201.2533±0.07650.6560±0.01051.2130±0.0216QPP-0250.6713±0.03220.4803±0.01270.6340±0.0248*p＜0.05，顯示抑制腫瘤細胞生長的活性。
權(quán)利要求
1.式(I)五肽類似物或其立體異構(gòu)體X-Y-Z-L-M-N(I)其中X為L-或D-α-型-N-端單烷基或雙烷基取代的親脂性氨基酸，四氫異喹啉-3-羧酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈或C3-C7元環(huán)狀烷基，親脂性氨基酸選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y為L-或D-α-型親脂性天然或非天然氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z為L-或D-α-型N-端單烷基取代的親脂性氨基酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈或C3-C7元環(huán)狀烷基，親脂性氨基酸為Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M為下列L-或D-α-型氨基酸中的任意兩個或部分自身組合N原子在四～七元環(huán)上的氨基酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，四氫異喹啉-3-羧酸，反式或順式-4-取代-脯氨酸，取代基為羥基、鹵素、硝基、氨基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直鏈或支鏈烷基)胺基、C3-C7環(huán)烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7環(huán)烷胺基；N為脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代的肼或肟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X為L-或D-α-型-N-端單烷基或雙烷基取代的親脂性氨基酸，四氫異喹啉-3-羧酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈，或為C3-C7元環(huán)狀烷基；親脂性氨基酸為Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Y為L-或D-α-型親脂性天然或非天然氨基酸，且選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；Z為L-或D-α-型N-端單烷基取代的親脂性氨基酸，烷基為C1-C5的直鏈或支鏈、C3-C7元環(huán)狀烷基，親脂性氨基酸為Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal等；L和M為下列L-或D-α-型氨基酸中的任意兩個或部分自身組合N原子在四～七元環(huán)上的氨基酸，3，4-二氫異喹啉-3-羧酸，四氫異喹啉-3-羧酸，反式或順式-4-取代-脯氨酸，取代基為羥基、鹵素、硝基、氨基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基、二(C1-C6直鏈或支鏈烷基)胺基、C3-C7環(huán)烷胺基、含氧、硫、氮原子的C3-C7環(huán)烷胺基；N為脂肪胺或芳香胺衍生物，取代或未取代肼或肟。
3.式(I)五肽類似物或其立體異構(gòu)體衍生物的制備方法，其包括1)將化合物Boc-L-OH與M-OP在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，其中L，M如權(quán)利要求2中定義，P為C1-4烷基，生成Boc-L-M-OP；2)將1)中所得產(chǎn)物在鹽酸/二氧六環(huán)中脫去氨基保護基，生成L-M-OP；3)將2)中產(chǎn)物L(fēng)-M-OP與Boc-Z-OH在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Z-L-M-OP，所得產(chǎn)物如2)中所述進行反應(yīng)，生成脫去氨基保護基的Z-L-M-OP；4)將3)中產(chǎn)物Z-L-M-OP與Boc-Y-OH在DMF，DCM，TEA，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Y-Z-L-M-OP。5)將4)中產(chǎn)物Boc-Y-Z-L-M-OP在氫氧化鈉/甲醇溶液中皂化，然后用檸檬酸酸化，生成Boc-Y-Z-L-M-OH；6)將5)中產(chǎn)物Boc-Y-Z-L-M-OH與N-NHR在DCM，DIC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-Y-Z-L-M-N；7)將6)中產(chǎn)物Boc-Y-Z-L-M-N如2)中所述進行反應(yīng)，生成脫去氨基保護基的Y-Z-L-M-N；8)將7)中產(chǎn)物與X-OH在DCM，TEA，DEPC中反應(yīng)，生成式IX-Y-Z-L-M-N；
4.一種藥物組合物，其包括至少一種式(I)五肽類似物或其立體異構(gòu)體及藥用載體或賦形劑。
5.式(I)五肽類似物在制備用于治療癌癥藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的五肽衍生物，其制備方法，含它們的藥物組合物及它們在治療癌癥中的用途。
文檔編號A61K38/08GK1467219SQ0212392
公開日2004年1月14日 申請日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月10日
發(fā)明者劉克良, 郄建坤, 梁遠軍, 趙修南, 孟慶國 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥