專利名稱：三肽類似物,其制備方法,含它們的藥物組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的三肽類似物，其制備方法，含它們的藥物組合物及它們?cè)谥委煱┌Y中的用途。
背景技術(shù)：
多肽類化合物是海洋生物活性成分之一，具有結(jié)構(gòu)新穎，作用專一，活性顯著的特點(diǎn)。經(jīng)過多年的探索和積累，發(fā)現(xiàn)海洋多肽類化合物的生物活性主要集中于抗腫瘤和抗真菌方面。它們常常含有結(jié)構(gòu)特異的氨基酸或氨基酸衍生物，形成特殊的線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有廣泛和強(qiáng)效的生物活性。Hemiasterlin是從自巴布亞新幾內(nèi)亞海綿Cymbastela sp.中分離得到的抗有絲分裂三肽，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，它可能是通過抑制紡錘體微管動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而引起細(xì)胞凋亡。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是尋找新的抗腫瘤多肽類化合物或其先導(dǎo)化合物。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明人經(jīng)研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)式(I)的三肽類似物A-B-C(I)或其立體異構(gòu)體具有良好的抗腫瘤活性，因此式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體有可能作為藥物用于治療癌癥。
本發(fā)明涉及式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體，其包括A-B-C(I)其中A為L(zhǎng)-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個(gè)或多個(gè)取代基的吲哚環(huán)、苯環(huán)、萘環(huán)、蒽環(huán)、菲環(huán)、四氫喹啉環(huán)、四氫異喹啉環(huán)、苯并四氫異喹啉環(huán)，取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環(huán)胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環(huán)胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基。氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、各種氨基保護(hù)基，氨基保護(hù)基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸，或?yàn)镃1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環(huán)上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
本發(fā)明涉及含至少一個(gè)式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體，及藥用載體或賦形劑的藥物組合物，A-B-C(I)其中A為L(zhǎng)-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個(gè)或多個(gè)取代基的吲哚環(huán)、苯環(huán)、萘環(huán)、蒽環(huán)、菲環(huán)、四氫喹啉環(huán)、四氫異喹啉環(huán)、苯并四氫異喹啉環(huán)，取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環(huán)胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環(huán)胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基。氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、各種氨基保護(hù)基，氨基保護(hù)基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸，或?yàn)镃1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環(huán)上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
本發(fā)明還涉及制備式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體的方法，其包括1)將化合物Boc-B-OH與C-OP在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-B-C-OP，其中B，C如上所述定義，P為C1-4烷基；2)將1)中所得產(chǎn)物在鹽酸/二氧六環(huán)中脫去氨基保護(hù)基，生成HCl·B-C-OP；3)將2)中產(chǎn)物HCl·B-C-OP與Boc-A-OH在DMF，DCM，NMM，DCC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-A-B-C-OP；4)將3)中產(chǎn)物Boc-A-B-C-OP在氫氧化鋰/甲醇-四氫呋喃溶液中皂化，然后用檸檬酸酸化，生成Boc-A-B-C-OH；
5)將4)中產(chǎn)物Boc-A-B-C-OH如2)中所述進(jìn)行反應(yīng)，生成脫去氨基保護(hù)基的HCl·A-B-C-OH。
本發(fā)明還涉及式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。涉及的腫瘤細(xì)胞如成纖維細(xì)胞MRC5CV1、膀胱癌細(xì)胞T24、鼠白血病細(xì)胞L1210、鼠白血病細(xì)胞P388、人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO、猴腎成纖維細(xì)胞CV1、人乳腺癌細(xì)胞MCF7、人惡性膠質(zhì)瘤/星形細(xì)胞瘤細(xì)胞U373、人卵巢癌細(xì)胞HEY、表皮樣瘤細(xì)胞系KB、黑素瘤細(xì)胞B16、MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞、HeLa S3子宮頸癌細(xì)胞、人紅白血病細(xì)胞K562、人卵巢癌細(xì)胞OVCA2780、人胃印戒癌細(xì)胞Kato-III等。
發(fā)明詳述術(shù)語“C1-4烷基”指含1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基。
本發(fā)明所用術(shù)語“式(I)三肽類似物立體異構(gòu)體”是指其相應(yīng)的D-或L-立體構(gòu)型。
在本發(fā)明中使用的縮寫具有下面的含義Ala-丙氨酸，Gly-甘氨酸，Ile-異亮氨酸，Nle-正亮氨酸，Tle-叔丁基甘氨酸，Leu-亮氨酸，Val-纈氨酸，MeVal-甲基纈氨酸，Phe-苯丙氨酸，Pro-脯氨酸，mAB-3-氨基苯甲酸，MAB-3-氨基-4-甲基苯甲酸，γ-Abu-γ-氨基丁酸，
BA-苯甲胺，BEA-苯乙胺，DEA-二乙胺，DCHA-二環(huán)己胺，Mpl-嗎啡啉，NMM-N-甲基嗎啡啉，Prd-哌啶，TEA-三乙胺，Thp-四氫吡咯，DCM-二氯甲烷，DMF-二甲基甲酰胺，DCC-二環(huán)己基碳二亞胺，HOBt-1-羥基苯并三唑，Boc-叔丁氧羰基，THF-四氫呋喃。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明化合物的可藥用鹽包括其無機(jī)或有機(jī)酸鹽或堿鹽，其包括但不限于三氟醋酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、草酸鹽、三甲基乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、苦味酸鹽、天冬氨酸鹽、葡萄酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽；堿鹽包括但不限于銨鹽、堿金屬鹽如鈉和鉀鹽、堿土金屬鹽如鈣和鎂鹽、有機(jī)堿鹽如二環(huán)己胺和N-甲基-D-葡糖胺鹽、以及氨基酸鹽如精氨酸和賴氨酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明，式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體可按本領(lǐng)域已知方法、文獻(xiàn)方法或下面所示的反應(yīng)路線1制備 反應(yīng)路線1在反應(yīng)路線1中，化合物Boc-B-OH(B如上所定義)與C-OP(C如上所定義，P為C1-4烷基，其可選自甲基，乙基，異丙基，丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，優(yōu)選甲基和乙基)在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-B-C-OP。將Boc-B-C-OP經(jīng)4摩爾鹽酸/二氧六環(huán)脫保護(hù)基，生成HCl·B-C-OP。將HCl·B-C-OP與Boc-A-OH(A如上所定義)在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-A-B-C-OP。將Boc-A-B-C-OP經(jīng)1摩爾氫氧化鋰/甲醇-四氫呋喃皂化，生成Boc-A-B-C-OH。將Boc-A-B-C-OH經(jīng)4摩爾鹽酸/二氧六環(huán)脫保護(hù)基，生成HCl·A-B-C-OH。
根據(jù)本發(fā)明，式(I)三肽類似物的立體異構(gòu)體包括D-和/或L-構(gòu)型。
根據(jù)本發(fā)明，式(I)三肽類似物及其立體異構(gòu)體在人癌癥細(xì)胞篩選中顯示較好的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。
本發(fā)明涉及含有作為活性成分的有效劑量的至少一種式(I)三肽類似物和/或其立體異構(gòu)體以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1～90％的式(I)三肽類似物和/或其立體異構(gòu)體。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將式(I)三肽類似物和/或其立體異構(gòu)體與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明式(I)三肽類似物及其立體異構(gòu)體或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子，如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鈣、氯化鈉、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中制成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧基化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
實(shí)施例下面的實(shí)例及生物活性實(shí)驗(yàn)用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例化合物熔點(diǎn)由RY-1型熔點(diǎn)儀測(cè)定，溫度未經(jīng)校正；1H NMR圖譜由Bruker ARX 400型或US Varian Unity Inova 600型核磁儀測(cè)定；FAB質(zhì)譜由Zabspect高分辨磁質(zhì)譜儀測(cè)定；元素分析由CarloErba 1106型元素分析儀測(cè)定；紫外光譜由UV-260紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定；紅外光譜由Magna IRTM 550紅外儀測(cè)定。實(shí)施例制備所用反應(yīng)試劑均為商品化產(chǎn)品。
實(shí)施例1L-N-Ac-β-Nal-Val-mAB(QTP-007)N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯的制備2-溴甲基萘的制備2-甲基萘71克(0.5mol)用400毫升四氯化碳溶解，加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS)89克(0.5mol)，攪拌，NBS不溶解。假如偶氮二異丁腈2.5克，油浴緩慢加熱，～95℃時(shí)，反應(yīng)液劇烈沸騰，上沖，立即停止加熱，水浴冷卻，反應(yīng)立即緩和，繼續(xù)油浴加熱，液面上有泡沫狀物質(zhì)懸浮。補(bǔ)加偶氮二異丁腈8.5克，回流3.5小時(shí)(98℃±3)。反應(yīng)液于冰水浴中冷卻，濾除白色固體(丁二酰亞胺)，四氯化碳洗兩次。濾液濃縮，得黃色液體，冰浴，析出黃色結(jié)晶。濾集得淡黃色結(jié)晶78.2克(70.7％)，m.p.48～51℃。
N-乙酰-(2-萘甲基)丙二酸二乙酯的制備將鈉8.14(0.354mol)克在400毫升絕對(duì)無水乙醇中回流(98±3℃)，至鈉完全溶解。冷卻至室溫(為白色混濁液體)后，加入乙酰氨基丙二酸二乙酯76.9克(0.354mol)，攪拌溶解。加入2-溴甲基萘78.2克(0.354mol)，反應(yīng)液中逐漸出現(xiàn)固體，油浴回流(100℃±3)3小時(shí)。減壓蒸出乙醇約300毫升后，于冰水浴條件下，加入500毫升水，立即有淡黃色固體析出。濾集結(jié)晶，水洗三次，室溫干燥，稱重得103.3克(81.7％)，m.p.123～125℃。TLC檢測(cè)石油醚-乙酸乙酯(3∶1)，Rf＝0.30。
N-乙酰-(2-萘甲基)丙二酸單乙酯的制備N-乙酰-(2-萘甲基)丙二酸二乙酯50.0克(0.14mol)，用450毫升乙醇溶解，室溫滴加6N氫氧化鈉30毫升，TLC監(jiān)測(cè)至初始反應(yīng)物消失(2.5小時(shí))。冰水浴條件下，滴加6N鹽酸(～30毫升)調(diào)pH～3，得白色混懸液。濃縮得白色糊狀霧，加入420毫升水，抽濾，得白色粉狀固體，水洗四次，室溫干燥。稱重得35.82克(77.2％)。
N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯的制備N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯17.9克(0.054mol)用150毫升二氧六環(huán)溶解，油浴回流(108℃±3)3.5小時(shí)。反應(yīng)液濃縮得黃色油狀液體，加入100毫升乙酸乙酯和100毫升水，振搖分液，乙酸乙酯層分別用飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉洗兩次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得黃色油狀液體，放置，有結(jié)晶析出。濾集結(jié)晶，石油醚洗兩次，室溫干燥。稱重得12.7克(82.3％)，m.p.123～125℃。TLC檢測(cè)石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)，Rf＝0.56。
拆分稱量N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯11.0克(38.6mmol)，于研缽中研成細(xì)粉，混懸于280毫升水中(含氯化鈉2.0克)，水浴(37℃±1)，飽和碳酸氫鈉調(diào)pH7.60，溶液呈白色混懸狀。加入枯草桿菌蛋白酶A～2.0毫克，pH值迅速下降，用0.5N氫氧化鈉調(diào)pH7.60左右。2.5小時(shí)后，pH值下降緩慢，補(bǔ)加α-糜蛋白酶～5毫克，pH值迅速下降，繼續(xù)用0.5N氫氧化鈉調(diào)pH7.40左右。5.5小時(shí)后，pH值基本保持恒定，繼續(xù)攪拌1.0小時(shí)。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取至紫外燈下(λ＝254nm)無吸收為止，乙酸乙酯層用飽和氯化鈉洗兩次，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得無色塊狀結(jié)晶5.38克(97.8％)(D-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯)，m.p.149.0～149.5℃，[α]D25＝-11.8°(C＝2，MeOH∶DMF＝1∶2)；水層于冰水浴中用濃鹽酸調(diào)pH～2，滴加過程中不斷析出白色固體，濾集得白色針狀結(jié)晶3.85克(77.6％)(L-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸)，m.p.183～184.0℃，[α]D25＝+37.7°(C＝2，MeOH∶DMF＝1∶2)。
L-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸的1H NMR(DMSO)δ7.3～8.1(m，4H，Ar-H)，5.8(d，1H，-NHCO-)，4.9(t，1H，-CHCH2-)，3.5～3.7(m，2H，-CH2CH-)，2.0(s，3H，-COCH3)。
水解對(duì)上述所得(L)-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸、(D)-N-乙酰-(2-萘甲基)丙氨酸乙酯用6N鹽酸回流水解，得到(L)-(2-萘甲基)丙氨酸鹽酸鹽，[α]D25＝-8.0°(C＝2，1M HCl)；(D)-(2-萘甲基)丙氨酸鹽酸鹽，[α]D25＝+7.5°(C＝2，1M HCl)。
3-氨基苯甲酸甲酯鹽酸鹽的制備將無水甲醇30毫升用冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜7.8毫升，滴加過程中保持反應(yīng)液內(nèi)溫-8～-10℃，滴加完畢后，加入3-氨基苯甲酸4.1克(30毫摩爾)，室溫避光攪拌兩天，得到淺紫色透明溶液。減壓蒸去溶劑，得到淺紫色結(jié)晶。用無水乙醇-乙醚重結(jié)晶，得到類白色固體5.58克(99.2％)。TLC檢測(cè)氯仿-甲醇-醋酸(16∶1∶0.5)，Rf＝0.86，F(xiàn)AB-MS[M+H]+＝152，m.p.195.0～200℃。
L-N-Ac-β-Nal-Val-mAB(QTP-007)的制備將3-氨基苯甲酸甲酯鹽酸鹽3.75克(20mmol)，溶于20毫升二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入N-甲基嗎啡啉2.22毫升(20mmol)，10分鐘后，加入Boc-Val-OH 4.35克(20mmol)，溶解。加入HOBt 2.84克(21mmol)的DMF溶液6ml，冰浴10分鐘后，加入DCC 4.33克(21mmol)。繼續(xù)保持冰浴2小時(shí)后，室溫反應(yīng)12小時(shí)。濃縮，加入乙酸乙酯50毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時(shí)。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。于冰水浴中，加入石油醚，刮出固體。取該固體0.35克(1mmol)，加入4M鹽酸/二氧六環(huán)約5毫升，溶解，室溫?cái)嚢?小時(shí)。濃縮，得黃色油狀液體。二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入N-甲基嗎啡啉0.11毫升(1mmol)，10分鐘后，加入L-N-乙酰-(1-萘甲基)丙氨酸0.26克(1mmol)，溶解。加入HOBt 0.14克(1.05mmol)的DMF溶液，冰浴10分鐘，加入DCC 0.22克(1.05mmol)。冰浴2小時(shí)后，室溫反應(yīng)12小時(shí)。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時(shí)。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。加入石油醚20毫升，冰浴條件下研磨，得類白色固體。將此固體用甲醇-四氫呋喃5毫升溶解，冰水浴條件下，滴加1M氫氧化鋰，30分鐘后，室溫反應(yīng)10小時(shí)。冰水浴中，滴加0.5M鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)pH～3.0，乙酸乙酯提取三次(10毫升×3)，乙酸乙酯層用水、飽和氯化鈉洗兩次，用無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濃縮濾液，得到呈白色固體的標(biāo)題化合物。ESI-MS[M+H]+＝476.3，純度95.0％。
依據(jù)與實(shí)施例相同或相似的方法制備得到了以下化合物L(fēng)-N-Ac-β-Nal-Val-Val-mAB(QTP-001)分子量574.6純度95％L-N-Ac-α-Nal-Val-Val-mAB(QTP-002)分子量574.6純度95％L-N-Ac-β-Nal-Val-Leu-mAB(QTP-003)分子量588.6純度95％L-N-Ac-α-Nal-Leu-Leu-mAB(QTP-004)分子量602.6純度92％L-N-Ac-α-Nal-Pro-mAB(QTP-005)分子量473.3純度85％L-N-Ac-β-Nal-Leu-Val-mAB(QTP-006)分子量574.6純度92％L-N-Ac-β-Nal-Val-mAB(QTP-007)分子量475.3純度95％L-N-Ac-α-Nal-Val-mAB(QTP-008)分子量475.3純度92％L-N-Ac-β-Nal-Leu-mAB(QTP-009)分子量489.3純度90％L-N-Ac-α-Nal-Va1-Leu-mAB(QTP-010)分子量574.6純度91％L-N-Ac-α-Nal-Leu-mAB(QTP-011)分子量489.3純度88％L-N-Ac-β-Nal-Leu-Leu-mAB(QTP-012)分子量602.6純度85％L-N-Ac-α-Nal-Gly-mAB(QTP-025)分子量433.3純度98％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-mAB HCl(QTP-026) 分子量616.8純度85％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Val-mAB HCl(QTP-027) 分子量618.8純度88％L-N-Boc-(p-Pym)Phe-Val-mAB HCl(QTP-028) 分子量602.8純度80％L-N-Boc-(p-DiEm)Phe-Val-mAB HCl(QTP-029) 分子量604.8純度80％D-N-Boc-(p-DiEm)Phe-Val-mAB HCl(QTP-030) 分子量604.8純度85％L-N-Boc-(p-DiMm)Phe-Gly-mAB HCl(QTP-031) 分子量571.3純度85％L-N-Ac-β-Nal-Val-Val-MAB(QTP-032)分子量588.6純度90％L-N-Ac-α-Nal-Val-Val-MAB(QTP-033)分子量588.6純度90％L-N-Ac-β-Nal-Val-Leu-MAB(QTP-034)分子量616.6純度85％L-N-Ac-α-Nal-Pro-MAB(QTP-035)分子量487.3純度85％L-N-Ac-β-Nal-Val-MAB(QTP-036)分子量489.3純度90％L-N-Ac-α-Nal-Val-MAB(QTP-037)分子量489.3純度92％L-N-Ac-β-Nal-Leu-MAB(QTP-038)分子量503.3純度85％L-N-Ac-α-Nal-Leu-MAB(QTP-039)分子量503.3純度85％L-N-Ac-α-Nal-Gly-MAB(QTP-040)分子量447.3純度95％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-MAB HCl(QTP-041)分子量630.8純度80％L-N-Boc-(p-Pym)Phe-Val-MAB HCl(QTP-042)分子量616.8純度85％D-N-Boc-(p-DiEm)Phe-Val-MAB HCl(QTP-043)分子量630.8純度85％L-N-Boc-(p-DiMm)Phe-Gly-MAB HCl(QTP-044)分子量585.3純度85％L-N-Boc-(p-Chfm)Phe-Pro-MAB HCl(QTP-045)分子量580.3純度80％L-N-Ac-α-Nal-Gly-ABE(QTP-046)分子量445.3純度95％L-N-Boc-Tic-Tle-ABE(QTP-047)分子量473.6純度90％實(shí)施例2L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-(m)Abu(QTP-024)L-N-Boc-(對(duì)-嗎啉甲基)苯丙氨酸鹽酸鹽的制備將L-N-Ac-PheOEt白色結(jié)晶10克(43.5毫摩爾)溶于80毫升氯甲醚中，冰水浴控制反應(yīng)液內(nèi)溫0℃，加入新炒制的氯化鋅25克(180毫摩爾)，攪拌，使氯化鋅分散均勻。保持反應(yīng)液內(nèi)溫0℃，反應(yīng)50小時(shí)。減壓抽盡溶劑后，冰水浴條件下加入水100毫升，乙酸乙酯萃取(25毫升×4)液合并后，分別用飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉、水洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得到淡黃色油狀液體。加入少量乙醚，于冰水浴中析出白色針狀結(jié)晶。取該結(jié)晶1.0克(3.52毫摩爾)，無水乙醇3.5毫升溶解，加入嗎啡啉0.70毫升(7.04毫摩爾)，室溫反應(yīng)過夜。濾除固體，濃縮濾液，加入水10毫升，乙酸乙酯萃取(10毫升×3)，乙酸乙酯層分別用水、飽和氯化鈉洗兩次，無水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，濾液濃縮，得到無色粘稠液體，放置后析出白色固體。m.p.78～81℃。該白色固體用6M鹽酸水溶液回流6小時(shí)，濃縮，得到白色固體。取該白色固體0.34克(1.0毫摩爾)，用水-二氧六環(huán)(1∶1)10毫升溶解，加入碳酸鉀0.30克(2.2毫摩爾)，溶解，加入叔丁氧酐0.24克(1.1毫摩爾)。室溫反應(yīng)22小時(shí)。濃縮反應(yīng)液，加入水10毫升，乙醚萃取(10毫升×4)。水相于冰水浴條件下，用檸檬酸酸化至pH～2.0，用正丁醇萃取(15毫升×4)，正丁醇層用水洗兩次，濃縮，得到油狀液體，加入乙醚，冰水浴條件下刮出固體，[α]D25＝+17.5°(C＝0.6，95％EtOH)。元素分析(％)C 56.54，H 7.67，N 6.72。ESI-MS[M+H]+＝365。
4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽的制備將無水甲醇50毫升用冰鹽浴冷卻至-10℃，滴加二氯亞砜13毫升，滴加過程中保持反應(yīng)液內(nèi)溫-8～-10℃，滴加完畢后，加入3-氨基苯甲酸5.16克(50毫摩爾)，室溫?cái)嚢鑳商?，得到無色透明溶液。減壓蒸去溶劑，得到白色結(jié)晶。用無水乙醇-乙醚重結(jié)晶，得到白色固體7.63克(99.3％)，m.p.73～75℃，F(xiàn)AB-MS[M+H]+＝118。
L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-(m)Abu(QTP-024)的制備
將4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽1.54克(10mmol)，溶于10毫升二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入N-甲基嗎啡啉1.11毫升(10mmol)，10分鐘后，加入Boc-Pro-OH 2.17克(10mmol)，溶解。加入HOBt 1.42克(10.5mmol)的DMF溶液2ml，冰浴10分鐘后，加入DCC 2.21克(10.5mmol)。繼續(xù)保持冰浴2小時(shí)后，室溫反應(yīng)12小時(shí)。濃縮，加入乙酸乙酯20毫升，水洗一次后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時(shí)。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。于冰水浴中，加入石油醚，刮出固體2.4克(76.3％)。取該固體0.32克(1mmol)，加入4M鹽酸/二氧六環(huán)約5毫升，溶解，室溫?cái)嚢?小時(shí)。濃縮，得黃色油狀液體。二氯甲烷溶解，冰浴攪拌下，加入N-甲基嗎啡啉0.22毫升(2mmol)，10分鐘后，加入L-N-Boc-(對(duì)-嗎啉甲基)苯丙氨酸鹽酸鹽0.40克(1mmol)，溶解。加入HOBt 0.14克(1.05mmol)的DMF溶液，冰浴10分鐘，加入DCC 0.22克(1.05mmol)。冰浴2小時(shí)后，室溫反應(yīng)12小時(shí)。濃縮，加入乙酸乙酯10毫升，水洗后，分別用10％檸檬酸、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉各洗三次，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥5小時(shí)。濾除干燥劑，濃縮濾液，得黃色油狀物。加入石油醚20毫升，冰浴條件下研磨，得類白色固體。將此固體用甲醇-四氫呋喃5毫升溶解，冰水浴條件下，滴加1M氫氧化鈉，30分鐘后，室溫反應(yīng)3小時(shí)。冰水浴中，滴加0.5M鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)pH～3.0，正丁醇提取三次(10毫升×3)，正丁醇層用水、飽和氯化鈉洗兩次，濃縮，得到白色固體。ESI-MS[M+]＝546，純度88％。
依據(jù)與實(shí)施例2相同或相似的方法制備得到了以下化合物L(fēng)-N-Ac-α-NAla-Val-Abu(QTP-013)分子量441.4 純度98％L-N-Ac-β-NAla-Val-Abu(QTP-014)分子量441.4 純度95％L-N-Ac-α-NAla-Val-Val-Abu(QTP-015)分子量540.7 純度90％L-N-Ac-β-NAla-Val-Val-Abu(QTP-016)分子量540.7 純度90％L-N-Ac-α-NAla-Val-Leu-Abu(QTP-017)分子量554.7 純度95％L-N-Ac-β-NAla-Val-Leu-Abu(QTP-018)分子量554.7 純度90％L-N-Ac-α-NAla-Leu-Val-Abu(QTP-019)分子量554.7 純度95％L-N-Ac-β-NAla-Leu-Val-Abu(QTP-020)分子量554.7 純度95％L-N-Ac-α-NAla-Leu-Leu-Abu(QTP-021)分子量568.7 純度90％L-N-Ac-β-NAla-Leu-Leu-Abu(QTP-022)分子量568.7 純度95％L-N-Ac-α-Nal-Pro-Abu(QTP-023)分子量439.4 純度88％L-N-Boc-(p-Mm)Phe-Pro-(m)Abu HCl(QTP-024)分子量650.7 純度85％L-N-Boc-Phe-Tle-(m)Abu(QTP-048)分子量463.8 純度95％L-N-Boc-(p-Chf)Phe-Val-Abu(QTP-049)分子量484.3 純度90％L-N-Boc-Tic-Tle-Abu(QTP-050)分子量475.6 純度95％其余各化合物可依據(jù)上述方法和途徑制備而成。
實(shí)施例3MTT顯色法檢測(cè)體外抗癌活性。
腫瘤細(xì)胞懸液的制備取傳代培養(yǎng)72小時(shí)的K562、OVCA2780、Kato-III細(xì)胞株，用0.4％臺(tái)盼蘭與細(xì)胞懸液1∶1(50μl加50μl)混勻，立即按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每毫升的活細(xì)胞數(shù)＝計(jì)數(shù)值×5000。然后用10％小牛血清RPMI1640液將細(xì)胞濃度調(diào)整到3.125×105個(gè)/毫升，備用。
加樣培養(yǎng)在無菌條件下，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入以調(diào)整好的3.125×105個(gè)/毫升K562細(xì)胞懸液80μl和已設(shè)定好的本發(fā)明化合物濃度20μl，每個(gè)化合物濃度設(shè)3～6個(gè)復(fù)孔，然后置37℃，5％CO2，飽和濕度孵溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)，加0.25％MTT液20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后加入10％SDS100μl/孔，置孵溫箱培養(yǎng)過夜。
OD值測(cè)定將上述含有培養(yǎng)物加入SDS在孵溫箱中培養(yǎng)過夜的96孔板置多孔掃描分光光度計(jì)Multiskan MCC/340 MKII中，選用單波長(zhǎng)570nm測(cè)定OD值，計(jì)算OD值的百分率及化合物IC50。
OD值(％)＝給化合組OD/溶劑對(duì)照組OD×100％IC50值是以化合物濃度對(duì)OD百分率的對(duì)數(shù)值做線性回歸后得出的?；衔锾?hào) OD值(x±s)OVCA2780K562Kato-IIIQTP-0010.6303±0.02521.1628±0.05351.2093±0.0436QTP-0020.6705±0.01751.2180±0.07081.2403±0.1051QTP-0030.5930±0.02821.1588±0.07251.2423±0.0398QTP-0040.7128±0.01571.2448±0.03211.2573±0.0691QTP-0050.7183±0.06081.3068±0.03681.2234±0.0773QTP-0060.7070±0.03581.3495±0.02171.3458±0.0959QTP-0070.6835±0.03861.2345±0.08381.2780±0.6092QTP-0080.7165±0.02901.3155±0.03621.3095±0.0179QTP-0090.7025±0.13071.3075±0.05001.2908±0.0917QTP-0100.5800±0.04411.2688±0.01451.2093±0.0466QTP-0110.6700±0.10811.2588±0.02001.1928±0.0474QTP-0120.6860±0.04711.2233±0.06191.2178±0.024權(quán)利要求
1.式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體或可藥用鹽A-B-C(I)其中A為L(zhǎng)-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個(gè)或多個(gè)取代基的吲哚環(huán)、苯環(huán)、萘環(huán)、蒽環(huán)、菲環(huán)、四氫喹啉環(huán)、四氫異喹啉環(huán)、苯并四氫異喹啉環(huán)，取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環(huán)胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環(huán)胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基。氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、各種氨基保護(hù)基，氨基保護(hù)基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸，或?yàn)镃1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環(huán)上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物或其可藥用鹽，其中A為L(zhǎng)-型或D-型芳香性天然或非天然氨基酸，芳香性部分選自有一個(gè)或多個(gè)取代基的吲哚環(huán)、苯環(huán)、萘環(huán)、蒽環(huán)、菲環(huán)、四氫喹啉環(huán)、四氫異喹啉環(huán)、苯并四氫異喹啉環(huán)，這些取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、甲氧基、亞甲二氧基、氨基、胺甲基、N，N-二(C1-C4直鏈或支鏈烷基)胺甲基、C3-C7環(huán)胺甲基、C3-C7含氮、氧、硫雜原子的環(huán)胺甲基、磺酸甲基、磷酸酯甲基，氨基酸中的氨基部分可被取代，取代基包括但不限于C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、各種氨基保護(hù)基，氨基保護(hù)基包括芐基、取代芐基、叔丁氧羰基、苯氧羰基、芐氧羰基、芴甲氧羰基、C1-C5羧酯基、C1-C4直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基；B為選自Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal的天然或非天然親脂性氨基酸；C為C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸，或?yàn)镃1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁酸、C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的γ-氨基丁烯酸及其插烯同系物、一個(gè)或多個(gè)取代基的3-氨基苯甲酸、1-(C1-C4直鏈或支鏈烷基取代的3-氨基環(huán)己烯)甲酸與天然或非天然親脂性氨基酸形成的二肽，氨基上的氫可被C1-C4直鏈或支鏈烷基取代或不被取代；苯環(huán)上的取代基包括但不限于鹵素、硝基、羥基、羧基、三氟甲基、亞甲二氧基、亞甲二硫基、C1-C6直鏈或支鏈烷基、C3-C7環(huán)烷基、C1-C5烷氧基、氨基、C1-C5酰胺基，親脂性氨基酸可為下列氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Nle、Ile、Pro、Tle、MeVal。
3.式(I)三肽類似物或其立體異構(gòu)體的制備方法，其包括1)將化合物Boc-B-OH與C-OP在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-B-C-OP，其中B，C如權(quán)利要求1中定義，P為C1-4烷基；2)將1)中所得產(chǎn)物在鹽酸/二氧六環(huán)中脫去氨基保護(hù)基，生成HCl·B-C-OP；3)將2)中產(chǎn)物HCl·B-C-OP與Boc-A-OH在DMF-DCM，NMM，DCC-HOBt中反應(yīng)，生成Boc-A-B-C-OP；4)將3)中產(chǎn)物Boc-A-B-C-OP在氫氧化鋰/甲醇-四氫呋喃溶液中皂化，然后用檸檬酸酸化，生成Boc-A-B-C-OH；5)將4)中產(chǎn)物Boc-A-B-C-OH如2)中所述進(jìn)行反應(yīng)，生成脫去氨基保護(hù)基的HCl·A-B-C-OH。
4.一種藥物組合物，其包括至少一種式(I)權(quán)利要求1～3任一要求所述的三肽類似物或其立體異構(gòu)體及藥用載體或賦形劑。
5.式(I)三肽類似物在制備用于治療癌癥藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的三肽類似物，其制備方法，含它們的藥物組合物及它們?cè)谥委煱┌Y中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/08GK1467220SQ0212392
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月10日
發(fā)明者劉克良, 郄建坤, 梁遠(yuǎn)軍, 趙修南 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所, 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥