專利名稱：表沒食子兒茶素沒食子酸酯在抗腫瘤藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表沒食子兒茶素沒食子酸酯的用途。
MDR的逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，將會大幅度地提高化療藥物對MDR腫瘤的療效。盡管許多化合物或藥物具有體外逆轉(zhuǎn)MDR的作用，但由于毒副作用很大，無臨床應(yīng)用價值。作為臨床應(yīng)用的MDR逆轉(zhuǎn)劑的藥物，至今尚未開發(fā)成功。因此，尋找低毒、不易產(chǎn)生MDR的物質(zhì)或有效的MDR逆轉(zhuǎn)物質(zhì)是腫瘤化療治療領(lǐng)域急需解決的難題，也具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。
技術(shù)方案1，確立EGCG對MDR靶細胞的細胞毒性作用的參數(shù)。
用DMEM培養(yǎng)液稀釋EGCG成10-100μg/ml。采用噻唑藍(MTT)快速比色法測定EGCG對MDR靶細胞的細胞毒性作用。將對數(shù)生長期MDR靶細胞104cell·ml-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，分別加入10-100μg/ml濃度的EGCG處理，每濃度平行4孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4天，實驗終止前4小時每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亞砜)，每孔150μl，振蕩10min，是MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標(biāo)儀，以550nm為實驗波長，655nm為參照波長測定其吸收度，計算MDR靶細胞的存活率和藥物對MDR靶細胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細胞的存活率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)參數(shù)。
2，用EGCG提高MDR靶細胞對治療藥物的敏感性和增加治療藥物效用，參照上述細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，將對數(shù)生長期MDR靶細胞104cell·ml-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，先分別加入半數(shù)抑制濃度以內(nèi)的EGCG處理MDR靶細胞，然后加入作為代表的抗癌藥阿霉素，濃度范圍為0-32μg/ml，每組平行4孔，可以提高多藥抗藥性癌細胞株對化療藥物的敏感性，增強化療藥物的作用效果，本發(fā)明的顯著的優(yōu)點和技術(shù)上的進步本發(fā)明提供的腫瘤化療藥物增敏劑和增效劑，克服了EGCG的傳統(tǒng)用途，將其作為新型的腫瘤化療藥物增敏劑和增效劑，可以提高多藥抗藥性癌細胞株對化療藥物的敏感性，增強化療藥物的作用效果，具有良好的應(yīng)用前景。
EGCG購自Sigma公司，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。采用噻唑藍(MTT)快速比色法測定EGCG對MDR細胞(KB-A-1)和藥物敏感性細胞(KB-3-1)的細胞毒性作用。將對數(shù)生長期細胞104cell·ml-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，分別加入一定濃度的TP和EGCG處理，每濃度平行4孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-4天，實驗終止前4小時每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亞砜)，每孔150μl，振蕩10min，是MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad550型酶標(biāo)儀，以550nm為實驗波長，655nm為參照波長測定其吸收度，計算腫瘤細胞的存活率和藥物對細胞的抑制率，并以藥物的不同濃度和細胞的存活率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度(ICS0)。實驗結(jié)果如下表1.不同濃度EGCG不同作用時間下對KB-3-1的抑制率藥物濃度 抑制率(％)(μg/ml) 24h 48h 72h 96h00±0.082 0±0.094 0±0.097 0±0.12810 7.40±0.095 10.19±0.093 21.54±0.184 32.45±0.11920 30.86±0.106 34.50±0.147 42.02±0.136 44.12±0.15130 43.70±0.127 46.18±0.136 50.06±0.105 69.15±0.13740 49.49±0.108 52.53±0.153 61.32±0.139 74.81±0.15850 52.32±0.117 56.36±0.129 68.38±0.144 82.79±0.15460 54.05±0.135 63.64±0.191 68.91±0.154 83.33±0.08870 55.86±0.118 64.07±0.138 70.25±0.182 86.40±0.173IC50(μ 41.43 36.50 27.49 26.80g/ml)
表2.不同濃度EGCG不同作用時間下對KB-A-1的抑制率EGCG濃度抑制率(％)(μg/ml) 24h 48h 72h 96h0 0±0.099 0±0.166 0±0.091 0±0.16410 2.77±0.184 4.85±0.125 5.33±0.155 5.78±0.14520 3.46±0.192 11.19±0.085 32.03±0.109 33.07±0.13730 15.67±0.135 24.62±0.166 41.35±0.116 52.89±0.11140 16.23±0.146 37.90±0.122 52.84±0.147 65.92±0.15850 18.1±0.132 42.74±0.172 55.21±0.144 67.97±0.12660 26.68±0.055 51.45±0.178 63.03±0.059 80.32±0.142IC50(μ 158.42 59.97 32.66 27.89g/ml)以上實施例說明，EGCG均具有良好的殺滅腫瘤細胞的作用，不論是對多藥抗藥性細胞還是藥物敏感細胞都可產(chǎn)生相同的抑制效果，而且這利抑制效果還具有劑量依賴性，并隨著作用時間的延長而程度加深效果加強。
實施例2EGCG與傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物耐藥倍數(shù)比較。
采用MTT法(具體實驗操作參照實施例1)考察三種臨床上較為常用的抗癌藥物阿霉素、秋水仙素和長春花堿不同濃度一定作用時間下(三天)對KB-3-1和KB-A-1的細胞毒性，以藥物的不同濃度和細胞的存活率作圖，確定細胞的半數(shù)抑制濃度，計算耐藥倍數(shù)(resistance factor，RF＝IC50(KB-A-1)/IC50(KB-3-1))，并將EGCG相同作用時間下與這三種傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物耐藥倍數(shù)進行比較。實驗結(jié)果見圖3、圖4、圖5及下表
表3 EGCG與傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物耐藥倍數(shù)比較IC50(ng/ml) Dox Col Vin EGCGKB-3-169.48 6.89 37.8927490KB-A-18320 770 2610 32660Resistance factor 119.75111.76 68.881.19以上實施例說明，KB-A-1細胞具有非常明顯的抗藥性而KB-3-1對藥物的反應(yīng)卻非常敏感。Ng數(shù)量級濃度的藥物即可起到殺滅KB-3-1的作用，但要達對KB-A-1到同樣的抑制效果藥物濃度卻要至少提高70倍。與之相比較的EGCG，不同濃度的EGCG相同作用時間下對敏感型細胞株和抗藥型細胞株的影響趨勢基本一致。將EGCG不同作用時間下對敏感型細胞株和抗藥型細胞株的半數(shù)抑制濃度對比，發(fā)現(xiàn)它們對兩細胞株的抑制效果無太大區(qū)別，說明EGCG對癌細胞的抑制效果在敏感型菌株和抗藥型菌株都能收到良好的效果，說明在不產(chǎn)生耐藥性方面優(yōu)于傳統(tǒng)藥物。
實施例3EGCG對阿霉素抗癌效果的影響將對數(shù)生長期細胞104cell·ml-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，先分別加入40μg/ml 10μg/ml EGCG處理，然后加入阿霉素，濃度范圍為0-32μg/ml，每組平行4孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)3天，實驗終止前4小時每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亞砜)，每孔150μl，振蕩10min，是MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用BioRad 550型酶標(biāo)儀，以550nm為實驗波長，655nm為參照波長測定其吸收度，求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal index.RI)。實驗結(jié)果見圖6。
從圖6可以看出經(jīng)過10μg/ml的EGCG處理后，耐藥細胞株KB-A-1對阿霉素的IC50從10.35μg/ml降到了5.45μg/ml逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別達到了1.90。經(jīng)過無細胞毒性的EGCG與阿霉素共同作用后，細胞的存活率由單獨使用阿霉素的55.77％分別下降到40.31％，而且這種增敏作用非常明顯而且不是經(jīng)過累加作用得到的。由此可以得出茶類提取物質(zhì)具有提高多藥抗藥性細胞株對抗癌藥物敏感性的作用，即可以逆轉(zhuǎn)多藥抗藥性。
權(quán)利要求
1.表沒食子兒茶素沒食子酸酯在抗腫瘤藥物中應(yīng)用，其特征在于，表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為抗腫瘤藥物的增敏劑和增效劑。
全文摘要
本發(fā)明將茶中提取主要成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯((－)－epigallocatechin gallate，EGCG)應(yīng)用于治療腫瘤藥物中。該提取物不僅能抑制腫瘤細胞增殖、同時具有使腫瘤細胞不易產(chǎn)生耐藥性和提高腫瘤細胞對治療藥物的敏感性作用。本發(fā)明提出該天然提取物可作為抗腫瘤藥物的增敏劑和增效劑。
文檔編號A61P35/00GK1444935SQ0211162
公開日2003年10月1日 申請日期2002年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月9日
發(fā)明者魏東芝, 劉建文, 梅郁盈 申請人:華東理工大學(xué)