專利名稱：治療自身免疫性疾病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自身免疫性疾病的治療，具體涉及用氟塞米藥物組合物治療自身免疫性疾病。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是因機(jī)體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致的疾病狀態(tài)。其基本特征為可檢測到高效價的自身抗體和/或自身應(yīng)答性T細(xì)胞；自身抗體或應(yīng)答T細(xì)胞作用于自身組織細(xì)胞，造成損傷或功能障礙；可復(fù)制出相似的動物模型，用患者血清或致敏淋巴細(xì)胞可使疾病被動轉(zhuǎn)移；病情轉(zhuǎn)歸與自身免疫應(yīng)答強(qiáng)度密切相關(guān)；疾病的反復(fù)發(fā)作和慢性遷移性；及有遺傳傾向。
正由于自身免疫性疾病是慢性、反復(fù)發(fā)作的，因此需要進(jìn)行長期治療和監(jiān)測。目前常采用的是控制自身免疫性疾病引起的炎癥及抑制機(jī)體免疫應(yīng)答的藥物，例如采用糖皮質(zhì)激素、烷化劑、抗代謝劑等免疫抑制劑。這些藥物包括潑尼松、氨甲喋呤、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢素A等。但是，它們在抑制自身免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)和組織損傷的同時也抑制免疫系統(tǒng)的抗感染作用并可引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。
1981年，美國科學(xué)家Kammerer合成了來氟米特(leflunomide)，1998年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。1990年本發(fā)明者與他的美國導(dǎo)師Dr.Williams，J.W.在進(jìn)行來氟米特抑制同種異體移植皮膚、腎臟、心臟、小腸及近系異種心臟移植的排異反應(yīng)的動物試驗(yàn)中，對來氟米特的代謝產(chǎn)物氟塞米(flucyamide)進(jìn)行了代謝動力學(xué)、長期毒性等試驗(yàn)。本發(fā)明人在這些研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行合成工藝、藥效學(xué)、實(shí)驗(yàn)治療學(xué)和臨床治療等研究，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種低毒、有效的治療自身免疫性疾病的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供這種藥物組合物在制備治療自身免疫性疾病的藥物制劑上的應(yīng)用。
本發(fā)明的藥物組合物包含治療有效量的氟塞米衍生物或其可藥用鹽及藥學(xué)上可接受的輔料。
氟塞米的化學(xué)名稱為N-(對三氟甲苯基)-2-氰基-3-羥基-2-丁烯酰胺，其衍生物具有如下式(I)所示結(jié)構(gòu) 其中，X為H，鹵素，C1-5烷基，被OH、NH2、NHR或NRR取代的C1-5烷基，或C1-5烷氧基。
氟塞米衍生物的可藥用鹽包括但不限于例如下述無機(jī)酸的鹽鹽酸、硫酸、磷酸、焦磷酸、氫溴酸和硝酸；或者例如下述有機(jī)酸的鹽甲酸、檸檬酸、丙二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、2-羥基乙磺酸、水楊酸和硬脂酸。類似地，可藥用的陽離子包括但不限于鈉、鉀、鈣、鋁、鋰和銨。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確認(rèn)很多種無毒的可藥用鹽。
本發(fā)明藥物組合物所包含的氟塞米衍生物或其可藥用鹽的治療有效量為每劑量單位1mg-1g(按氟塞米計(jì))。
本發(fā)明藥物組合物所包含的藥學(xué)上可接受的輔料可以是常規(guī)制劑用的藥用載體、賦形劑及其它添加劑。如果需要的話，本發(fā)明藥物組合物還可包含其它活性成分。
本發(fā)明藥物組合物可以劑量單位制劑口服給藥或非胃腸道給藥。所述非胃腸道給藥包括經(jīng)皮、皮下、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌內(nèi)或鞘內(nèi)注射或輸注等。
適用口服使用的形式可有片劑、膠囊劑、水或油懸浮液、可分散粉末或顆粒劑、糖漿或酏劑?？砂船F(xiàn)有技術(shù)中任何已知方法制備，這樣的組合物可包含一種或多種選自甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑的試劑，以提供藥學(xué)上美觀和適口的制劑。
片劑包含活性成分和適于片劑生產(chǎn)的無毒可藥用賦形劑。這些賦形劑例如可以是惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉、纖維素等；造粒劑和崩解劑，如玉米淀粉或藻酸等；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠等；潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉等。片劑可為未包衣的，或者可采用已知技術(shù)進(jìn)行包衣。這種包衣可以是腸溶或延緩包衣，以延遲在腸道中的崩解和吸收，提供在較長的時間內(nèi)的緩釋作用。
口服制劑可以是硬明膠膠囊，其中，活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或淀粉混合，或者為軟明膠膠囊，其中，活性成分與水或油介質(zhì)例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水懸浮液包含活性成分與適用于制備水懸浮液的賦形劑的混合物。這種賦形劑為懸浮劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或濕潤劑可為天然存在的磷脂，如卵磷脂。水懸浮液也可包含防腐劑、著色劑、矯味劑和甜味劑。
油懸浮液可通過將活性成分懸浮于植物油，如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或者懸浮于礦物油如液體石蠟中而制得。油懸浮液可包含增稠劑，如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可加入甜味劑和矯味劑以提供適口的口服制劑。這些組合物中可加入抗氧化劑如抗壞血酸進(jìn)行防腐。
可分散粉末是將活性成分與分散劑或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合，適于通過添加水而制備適宜的水懸浮液?？煞稚⒎勰┲羞€可包含其它賦形劑如甜味劑、矯味劑和著色劑。
糖漿和酏劑可用甜味劑配制，如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。這樣的制劑也可包含防腐劑、矯味劑和著色劑。
本發(fā)明的藥物組合物可在無菌介質(zhì)中經(jīng)非腸道給藥。根據(jù)所采用的賦形劑和濃度，藥物可懸浮或溶解于賦形劑中。非胃腸道給藥的注射劑可分裝在安瓿、一次性注射器或多劑量玻璃或塑料小瓶中，可以是注射液或粉針劑。
本發(fā)明的藥物組合物也可以按照制劑學(xué)常規(guī)方法制成霜劑，供局部應(yīng)用或經(jīng)皮吸收發(fā)揮全身作用。
本發(fā)明的藥物組合物用于治療自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和腎病綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病。
在治療上述疾病過程中，通常采用的劑量為0.03-5mg/kg/天，一次或分?jǐn)?shù)次給藥，以2-6月為一個療程，一般需持續(xù)2-4個療程。
但是，可以理解，對于特定的患者而言，具體的劑量水平將取決于多種因素，包括接受治療的患者的體重、性別、年齡、一般健康狀況、膳食、給藥時間、給藥途徑、聯(lián)合用藥、所治療的具體疾病及疾病的嚴(yán)重程度。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分氟塞米衍生物是一個相對低毒的新型免疫調(diào)節(jié)劑，對細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，氟塞米衍生物可有效地控制非T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞功能，降低MRL/1pr小鼠自發(fā)產(chǎn)生的高水平抗ds DNA抗體，并有效地控制IgG介導(dǎo)的免疫復(fù)合物在腎小球中的沉積，明顯減輕腎小球腎炎的病理表現(xiàn)，對實(shí)驗(yàn)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡有較明顯的緩解作用，并能緩解并發(fā)的淋巴結(jié)腫大。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床治療中，氟塞米對患者癥狀和體征的改善明顯優(yōu)于MTX，有效率和顯效率均明顯高于MTX，而不良反應(yīng)(尤其是胃腸道反應(yīng))明顯低于MTX。在其它自身免疫性疾病的治療上，一些經(jīng)多種藥物治療仍無效的患者用本發(fā)明的藥物組合物治療后產(chǎn)生了滿意的效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 氟塞米的合成取來氟米特10g(0.037mol)，加入盛有2％氫氧化鈉溶液240ml的燒瓶中，于23-25℃攪拌1小時。然后向反應(yīng)液中加水1300ml，濾去不溶物，在無色濾液中加入濃鹽酸26ml，立即得到白色沉淀物，此時濾液pH=1-2。濾取白色固體，水洗(3×40ml)，40℃真空濃縮，得粗品約10g。
用無水乙醇/乙酸乙酯(1∶8)180ml將粗品重結(jié)晶。析出的結(jié)晶于40℃真空干燥，得針狀結(jié)晶產(chǎn)品8g(熔點(diǎn)230-231.5℃)。用薄層層析(以CH2Cl2/HOAc=3/1為展開劑)和1H-NMR進(jìn)行產(chǎn)品純度檢測。
實(shí)施例2 膠囊劑的制備配方(1000個膠囊)氟塞米 1g-1000g淀粉 2.5g-2500g將氟塞米原料磨成細(xì)粉，過100目篩；將淀粉干燥，過120目篩；采用等量遞加法混合原輔料，過120目篩2-3次，使充分混合；送檢合格后充填膠囊。
實(shí)施例3 片劑的制備配方(1000片)氟塞米 1g-1000g乳糖 5.0g-5000g淀粉 1.5g-1500g滑石粉0.1g-200g5％淀粉漿適量低取代羥丙基纖維素0.1g-1000gOPADRY-OY-GM7305 適量WHITE將氟塞米原料磨成細(xì)粉，過100目篩；將輔料乳糖、淀粉、L-HPC過100目；采用等量遞加法混合原輔料，過80目篩3-4次，使充分混合；在混合物中加入淀粉漿制軟材，過24目制濕顆粒，于55-60℃通風(fēng)烘干箱中干燥；將干燥顆粒經(jīng)20目整粒后加入滑石粉，用直徑6.0mm的淺凹沖壓片，制成片芯。
將OPADRY-OY-GM7305 WHITE溶于25％乙醇水溶液中，攪拌45分鐘，在片床溫度為38-45℃、噴氣壓力為3-4kg的條件下將片芯包衣。包衣完畢(經(jīng)檢測，片芯增重3％左右)后繼續(xù)保溫10分鐘，吹涼。
實(shí)施例4 注射劑的制備配方(1000ml)氟塞米1g-1000g氯化鈉0.1g-900g氫氧化鈉 0.01g-200g注射用水 加至1000ml將氯化鈉先溶解于80ml注射用水；加入氟塞米，使其充分溶解；加入0.1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7左右，再加足量水、攪拌，使最終體積為1000ml。將所得溶液分裝于中性玻璃容器中，用流通蒸汽100℃滅菌30分鐘。
實(shí)驗(yàn)例1 氟塞米對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的影響采用雄性ICR小鼠50只(體重19～21克)，隨機(jī)分為5組，即對照組、環(huán)磷酰胺組(120mg/kg)、氟塞米三個劑量組(2、9、45mg/kg)，每組10只。各組小鼠灌胃給藥5天，每鼠0.5ml，每天一次，對照組給同容量的1％羧甲基纖維素鈉溶液。于給藥第三天，每鼠再腹腔注射0.25％淀粉液0.5ml，第五天給藥后4小時，每鼠腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液0.5ml(無菌操作自雞翼靜脈采血，加5倍量阿氏液，4℃冰箱保存，使用前用無菌生理鹽水離心洗滌三次，配成5％雞紅細(xì)胞生理鹽水懸液)。30分鐘后，頸惟脫臼處死，腹腔注射Hank氏液2.5ml，輕輕揉按小鼠腹部，使Hank氏液充分涮洗腹腔巨噬細(xì)胞。
然后，吸取腹腔洗液，滴于二張載玻片上，放入墊有濕紗布的盒內(nèi)，于37℃孵育30分鐘，孵畢，于生理鹽水中漂洗，除去未貼片的細(xì)胞。晾干，甲醇固定，吉姆薩斯染劑(Giemsa Wright)染色，蒸餾水漂洗，晾干，用油鏡計(jì)數(shù)100個巨噬細(xì)胞，計(jì)算百分率和吞噬指數(shù)，結(jié)果見表1。
表1 氟塞米對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響組別 鼠數(shù) 吞噬百分率(M±SD) 吞噬指數(shù)(M±SD)對照組 1056.1±6.04 1.18±0.20環(huán)磷酰胺120mg/kg/d×5dp.o. 1034.9±6.97 0.75±0.25*氟塞米2mg/kg/g/d×5dp.o. 1050.8±8.09 1.08±0.23氟塞米9mg/kg/d×5dp.o. 1043.5±10.35*0.87±0.19*氟塞米45mg/kg/d×5dp.o. 1032.0±5.25Δ**0.64±0.14Δ**與對照組比較，*P＜0.001**P＜0.01；與環(huán)磷酰胺比較，ΔP＞0.05。
如表1所示，氟塞米能明顯抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，中、高劑量組與對照組相比有顯著性差異。
實(shí)驗(yàn)例2 氟塞米對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響采用ICR小鼠40只(雌、雄各半、體重23±1g)，隨機(jī)分為4組氟塞米二個劑量組(9、45mg/kg)，環(huán)磷酸胺組(120mg/kg)和溶媒對照組。各腹腔注射0.2ml藥液，每天一次，連續(xù)5天后處死小鼠，按常規(guī)3HTdR摻入法定量測定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。
T淋巴細(xì)胞與植物凝素(PHA)一起體外培養(yǎng)時，可轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，并出現(xiàn)旺盛的分裂現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，以反映DNA合成速率的3H-胸腺嘧啶核坩(3HTdR)摻入值為指標(biāo)，可定量表示淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度，從而反映T淋巴細(xì)胞的免疫功能。
表2 氟塞米對小鼠3H-TdR摻入法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果的影響組別 鼠數(shù)3H-TdR摻入量(CPM±SD)對照組 10 292.9±193.0環(huán)磷酰胺120mg/kg/d×5di.p. 10 140.7±108.9*氟塞米9mg/kg/d×5dp.o. 10 139.1±121.8*氟塞米45mg/kg/d×5dp.o.10 127.8±99.5*與對照組比較，*P＜0.01。
從表2結(jié)果可見，腹腔注射氟塞米的小鼠3HTdR摻入值明顯低于對照組(P＜0.05)，表明氟塞米對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能有明顯的抑制作用，即抑制小鼠T細(xì)胞的免疫功能。
實(shí)驗(yàn)例3 氟塞米對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素1(IL-1)試驗(yàn)氟塞米分五個劑量組，以脂多糖(LPS)和環(huán)磷酰胺作為對照組，用1640培養(yǎng)液在無菌條件下配制成不同濃度同等容量的溶液備用。
在無菌操作室內(nèi)取健康純系小鼠70只(體重18～20g)，隨機(jī)分成以上七個試驗(yàn)組，每組10只，脫臼處死，用75％乙醇浸泡片刻，仰臥固定，剪開腹部表皮，注射5ml Hank氏液，挪動腹部，回收腹腔液，離心(500rpm，3分鐘)棄去上清液，沉淀物加1640培養(yǎng)液至3ml，混勻后離心(2000rpm，10分鐘)，計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，用10％小牛血清(FCS)細(xì)胞保存液(PRMI)1640培養(yǎng)液稀釋至2×106/ml細(xì)胞數(shù)。加入24孔培養(yǎng)板中(1ml孔)，置37℃、5％ CO2培養(yǎng)小時，棄去非粘附細(xì)胞，在獲得的巨噬細(xì)胞單層中加入不同濃度的受試物，每孔終容積為1ml，置37℃、5％ CO2培養(yǎng)48小時，收集上清夜(4000rpm，8分鐘)過濾，20℃保存。
在無菌操作室內(nèi)另取純系小鼠10只，眼球放血致死，75％乙醇浸泡片刻，仰臥固定，取出胸腺，剝盡周圍組織，用撕碎法撕碎胸腺至10ml刻度離心管中，離心(500rpm，5分鐘)棄去上清液，沉淀物(胸腺細(xì)胞)加少量1640培養(yǎng)液混勻，勻漿中加1640培養(yǎng)液至70ml，加210μl刀豆素A(ConA)溶液，充分混勻。另取不同濃度的藥液分別加至96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，然后加入con-A胸腺細(xì)胞懸液100μl(con-A終濃度3μg/ml，胸腺細(xì)胞終濃度1.87×108/ml)，置37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束前6小時，每孔加入3H-TdR 20μl(0.2μ Ci/孔)。收集細(xì)胞于49型纖維濾紙上，用LKB自動液體閃爍計(jì)數(shù)器測定放射活性(cpm)。結(jié)果以三份復(fù)管的cpm均值±SD表示，根據(jù)IL-1活性記錄樣品在不同濃度時刺激小鼠胸腺細(xì)胞增殖而摻入3H-TdR的量(cpm±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，評價氟塞米抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的作用。結(jié)果見表3。表3 IL-1試驗(yàn)氟塞米刺激小鼠胸腺細(xì)胞增殖摻入3H-TdR量(cpm)組別 樣本數(shù) cpm±SD氟塞米20μg/ml 10 66.9±52.0**氟塞米15μg/ml 10 39.72±13.71**氟塞米10μg/ml 10 415.41±497.90*氟塞米5μg/ml 10 678.65±293.14*氟塞米1μg/ml 10 1263.55±564.32脂多糖(Lps)1μg/ml 10 1101.98±257.0環(huán)磷酰胺(cy)10μg/ml 10 1199.3±193.3與Lps組比較，*P＜0.01；**P＜0.001。
從表3可見，氟塞米5、10、15、20μg/ml劑量組對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)例4 氟塞米對人體外周淋巴細(xì)胞單向混合反應(yīng)的抑制作用人體外周白細(xì)胞分離取正常人血40ml放入50m試管中，由底部加入Ficoll-Hypague(Pharmacia，Piscataway，NJ)10ml，于1600rpm離心20分鐘，吸取淋巴細(xì)胞層，用PBS洗滌三次后，將分離的淋巴細(xì)胞混懸于含有10％滅活小牛血清(FBS，GLBCO)及100μg/ml青/鏈霉素的RPMI 1644(GIBCO，Grand Lsand，NY)中備用。
T淋巴細(xì)胞分離在進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)前，將白細(xì)胞混懸于含10％滅活人血清(Diognoctic Inc Meguan，WI)的RPMI1644中。以尼龍羊毛柱(nylonwool column)及抗白細(xì)胞11b抗體(Anti-Leu Ab，Becton Dickinson Mountain View，CA)，加補(bǔ)體(Pel-Free，Brown Derr，WL)分別去除巨噬細(xì)胞、B-細(xì)胞、中性殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞，得到的混懸液中95％為CD3陽性T細(xì)胞，其余為B細(xì)胞。
混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)將分離的T細(xì)胞每孔2×105與等量的加碼射線(3000拉德)照射過的同種異體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，并加入不同劑量氟塞米及環(huán)孢素。氟塞米的濃度分別為100μM、75μM、50μM及25μM，環(huán)孢霉素濃度為90nM，以細(xì)胞保存液配制。此實(shí)驗(yàn)用U型底96孔板進(jìn)行，每劑量組試驗(yàn)重復(fù)5次(孔)。培養(yǎng)6天后，于每孔中加入1μCi的3H標(biāo)記胸腺嘧啶，檢測放射活性。
計(jì)算公式％抑制＝[(試驗(yàn)標(biāo)本放射活性—背景放射活性)/(對照標(biāo)本放射活性—背景放射活性)]×100％。
結(jié)果見表4。
表4 氟塞米抑制單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)藥物及濃度 (％)抑制率平均值±SD1 2 3 4 5氟塞米100μM95.85 97.48 86.77 71.27 99.64 90.20±11.6675μM 91.08 77.49 83.69 74.89 93.90 84.21±8.2750μM 54.31 55.08 70.78 58.16 94.15 66.50±16.0225μM-17.69 -23.82 -18.29 31.66 86.00 11.57±47.29CsA90nM 105.28 104.03 73.53 96.41 47.51 85.35±24.70其中，背景為100％抑制，無任何藥物抑制率0％。當(dāng)氟塞米濃度為100M、75μM、50μM、25μM時，單向淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制率分別為90.20±11.66，84.21±8.27，66.50±16.20，11.57±47.29，藍(lán)染色證實(shí)淋巴細(xì)胞無破壞，故以上濃度對淋巴細(xì)胞無毒性作用。
實(shí)驗(yàn)例5 氟塞米對MRL小鼠自發(fā)系統(tǒng)紅斑狼瘡的抑制作用采用10～20周齡雌性MRL/lpr小鼠(由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室提供)，體重25～30g，每組8只。給藥組含量大于99％的氟塞米細(xì)顆粒粉末混懸于1％羧甲基纖維素，劑量為20、35、65mg/kg；及環(huán)孢素A 50mg/kg。對照組等體積1％羧甲基纖維素。各組動物每天經(jīng)胃管灌服一次。63天后采血，分離出血清0.3ml。
用酶聯(lián)反應(yīng)法檢測血清中的抗雙鏈DNA(ds DNA)抗體、酶聯(lián)反應(yīng)法平板以10μg/ml多聚左旋谷氨酸為陰性對照，于小牛胸腺ds DNA 10μg/ml于4℃培養(yǎng)20小時。檢測血清自1∶1000稀釋度開始，雙倍稀釋置入酶聯(lián)反應(yīng)法平板內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)合的抗體以聯(lián)有辣根過氧化酶的抗小鼠IgG或IgM經(jīng)酶聯(lián)反應(yīng)法檢測儀檢測，結(jié)果見表5A、表5B。
表5A 氟塞米(p.o.)對MRL/lpr小鼠ds DNA IgM水平的影響

*與對照組比較，有顯著差異。
表5B 氟塞米(p.o.)對MRL/lpr小鼠ds DNA IgG水平的影響

*與對照組比較，有顯著差異。
給藥63天后，將動物與麻醉下處死，取所有直視下可發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)，以電子秤秤重。未治療組及環(huán)孢素治療組均可見大量腫大淋巴結(jié)，分布于背部、頸部及腹腔內(nèi)。淋巴結(jié)總重量比較見表5C。
表5C 氟塞米(p.o.)抑制MRL/lpr小鼠淋巴結(jié)增生作用

*與對照組比較p＜0.05。
病理檢查結(jié)果氟塞米35及65mg/kg劑量對MRL/lpr小鼠治療9周后明顯減少受累腎小球的數(shù)量，明顯逆轉(zhuǎn)受累腎小球的炎癥損害。IgG免疫復(fù)合物腎小球中的沉積明顯減輕，而環(huán)孢素50mg/kg及氟塞米20mg/kg未能明顯減緩腎小球炎癥損害及IgG沉積。在各組中IgM沉積無明顯變化。
氟塞米35mg/kg/天對MRL/lpr小鼠自身免疫性腎疾病的作用、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)A)未治療組顯示增生性腎小球腎炎(腎小球增大、有大量淋巴細(xì)胞、中性白細(xì)胞浸潤)，并有大量IgG沉積于受累腎小球；B)CsA(50mg/kg/天)治療并未明顯減輕腎炎病變；C)氟塞米治療組明顯減少受累腎小球數(shù)量、明顯逆轉(zhuǎn)受累腎小球損害，在絕大多數(shù)治療鼠中腎小球組織學(xué)正常。
本實(shí)驗(yàn)例結(jié)果表明，氟塞米可有效地控制非T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞功能，降低MRL/lpr小鼠自發(fā)產(chǎn)生的高水平抗ds DNA抗體，并有效地控制IgG介導(dǎo)的免疫復(fù)合物在腎小球中的沉積，明顯減輕腎小球腎炎的病理表現(xiàn)，從而對實(shí)驗(yàn)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡有較明顯的緩解作用，并能緩解并發(fā)的淋巴結(jié)腫大。
治療例1 本發(fā)明的藥物組合物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的療效及其安全性年齡18-65歲的活動性RA患者190例(排除重要臟器疾病者、孕婦及哺乳期婦女、對受試藥過敏或過敏體質(zhì)者、試驗(yàn)前接受過金制劑治療者)，采用隨機(jī)對照盲法試驗(yàn)。試驗(yàn)組123例(男性14例，女性109例)，平均年齡47±11歲，平均病程69±77個月；對照組67例(男性16例，女性51例)，平均年齡50±13均病程39±50個月。
試驗(yàn)組服用氟塞米20mg片劑2片，每天一次；MTX空白藥6片，1次/周。對照組服氟塞米空白藥2片，1次/日；MTX6片，1次/周。試驗(yàn)開始后同時服用非甾體類藥諾德倫(0.4，1次/日)，4～6周后停用。試驗(yàn)前曾服用其它慢作用藥的患者必須有一個月的清洗期。
治療前及服藥后6周、12周對RA各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評估，求得平均改善百分率。平均改善率＜30％為無效；≥30％為有效；≥50％為顯效。結(jié)果見表6。
表6 兩組患者臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)治療前后的變化(X±SD)氟塞米組 MTX組項(xiàng)目治療前 6周 12周 治療前6周 12周休息痛7.1±2.0-3.0±2.1 -4.5±2.3 7.4±1.7 -2.4±1.5*-3.8±2.0*晨僵(分鐘)157±256-99±193 -119±208 110±65-46±44*-74±68*握力(kPa) 10.3±6.34.6±4.6 7.6±6.9 10.5±6.7 3.6±3.4*6.6±5.4*關(guān)節(jié)壓痛數(shù)15.3±6.3 -5.3±4.0 -8.8±5.3 13.9±5.2 -3.7±2.9*-6.7±4.8*關(guān)節(jié)壓痛指數(shù) 24.8±14.3 -12.9±9.6-17.7±12.521.9±12.0 -8.1±5.2*-12.1±8.2*關(guān)節(jié)腫脹數(shù)10.9±5.6 -5.4±5.6 -7.1±5.9 9.7±4.1 -3.0±2.5*-4.6±3.2*關(guān)節(jié)腫脹指數(shù) 14.7±9.2 -8.1±8.6 -10.2±8.8 13.2±6.6 -3.9±3.7*-5.8±4.5*生活能力1.6±0.5-0.7±0.4 -1.1±0.5 1.5±0.4 -0.4±0.3*-0.7±0.4*病人評價7.4±1.9-2.9±1.8 -4.4±2.2 7.4±1.7 -2.3±1.6*-3.8±2.1*醫(yī)生評價7.2±1.9-2.9±1.8 -4.3±2.2 7.2±1.7 -2.3±1.6*-3.6±2.2*血沉(mm/h)47.6±22.0-20.9±17.448.1±24.1 -20.7±20.3CRP(μg/ml) 30.7±32.8-23.2±28.926.5±24.4 -17.8±22.5RF-半定量2.0±0.6 -0.6±0.4 1.8±0.6 -0.3±0.3*注治療前為各項(xiàng)指標(biāo)的基礎(chǔ)值，其它時間點(diǎn)為變化值(治療后值—治療前值)，RF半定量用其倒數(shù)的對數(shù)值；兩樣本均數(shù)比較*P＜0.05。
從表6可見，氟塞米組和MTX于治療6周后均能明顯改善患者的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，提高患者的關(guān)節(jié)功能，但對X射線改變無影響。除握力、血沉、CRP外，氟塞米組對主要療效指標(biāo)的改善明顯優(yōu)于MTX，其12周有效率和顯效率分別為95.9％和80.5％，而MTX組12周有效率和顯效率分別為85.1％和62.7％。兩組臨床療效比較差異有顯著性(P＜0.05＝，見表7。
表7 兩組患者用藥12周時療效比較＜30％30％～50％≥50％有效率組別 例數(shù)例數(shù)(％) 例數(shù)(％) 例數(shù)(％) (％)氟塞米組 123 5(4.1) 19(15.4) 99(80.5) (95.9)MTX組 67 10(14.9) 15(22.4) 42(62.7) (85.1)*注兩組療效比較*P＜0.05。
治療過程中，氟塞米組20例患者發(fā)生不良反應(yīng)，發(fā)生率為16.3％，主要表現(xiàn)為厭食、惡心/嘔吐、皮疹、脫發(fā)，偶有一過性ALT升高和白細(xì)胞降低，其中重度1例(皮疹)，中度1例(ALT升高)，輕度18例。MTX組27例患者發(fā)生不良反應(yīng)，發(fā)生率為40.3％，其中重度1例，中度2例，輕度24例，顯著高于氟塞米組(P＜0.01)。所有不良反應(yīng)均在療程內(nèi)或療程結(jié)束后恢復(fù)，70％在出現(xiàn)后6周內(nèi)恢復(fù)。
典型病例1徐女士，女，47歲?；颊?7年開始四肢大小關(guān)節(jié)腫痛，以雙腕、雙膝關(guān)節(jié)腫痛尤為明顯，雙腕半強(qiáng)直，雙膝關(guān)節(jié)功能明顯障礙，癱瘓臥床三年，生活不能自理。治療前血沉(ESR)92mm/h，類風(fēng)濕因子(RF)1∶160，C-反應(yīng)蛋白(CRP)12.1μg/ml?；颊咴枚喾N藥物，如強(qiáng)的松、MTX、雷公藤及多種非甾體藥物，其中服用雷公藤后于38歲絕經(jīng)，并伴嚴(yán)重脫發(fā)。
患者于98年8月開始服用氟塞米片劑(20mg/日)。服用第二周出現(xiàn)皮疹，經(jīng)抗過敏治療和劑量減半，一周后皮疹消退。重新恢復(fù)原劑量。治療第6周可坐著移動，小關(guān)節(jié)腫痛緩解，第12周可站立并扶行2～3米。12周復(fù)查ESR11mm/h，RF(-)，CRP1.91μg/ml。用藥一年，患者生活可以自理?；颊呖梢陨舷聵翘荩凶咦匀?。其間多次復(fù)查各項(xiàng)生化指標(biāo)均正?！，F(xiàn)病人已服藥近3年，可步行2華里路。
典型病例2劉先生，54歲，江西南昌人。1999年春節(jié)期間患RA，在江西省各家醫(yī)院行中、西醫(yī)治療，服用過大量強(qiáng)的松、“痛痹丸”、螞蟻藥之類的中、西藥，效果均不理想?；颊咴?000年2月至5月期間幾乎癱瘓?jiān)诖?，生活不能自理?000年7月在上海仁濟(jì)醫(yī)院鮑春德教授處求治，多藥無效。2000年12月起，在鮑教授指導(dǎo)下改服氟塞米，服用第2個月就出現(xiàn)效果。經(jīng)過近1年的氟塞米治療，患者的病情明顯改善，不僅生活可以自理，平時還騎白行車上下班，甚至可以遠(yuǎn)距離出差(廣州、深圳)。用藥期間，無明顯不良反應(yīng)。
典型病例3丁女士，49歲，上海莘莊人，RA病程3年余，癱瘓?jiān)诖?，無法行走，不能自己穿衣服、系紐扣、吃飯，靠丈夫服侍。其丈夫每天中午回家為她準(zhǔn)備午飯，工作受影響。2001年8月下旬起服用氟塞米。1個月后起效，手足關(guān)節(jié)腫痛明顯好轉(zhuǎn)，肘部類風(fēng)濕結(jié)節(jié)消失，血沉降到正常范圍內(nèi)，肝功能、血常規(guī)正常。目前用藥4月余，已可以行走，生活能夠自理，可以自己穿衣、燒飯，丈夫恢復(fù)正常工作。
治療例2 本發(fā)明的藥物組合物對銀屑病型關(guān)節(jié)炎的治療典型病例1.宋女士，60歲，遼寧大連人，銀屑病型關(guān)節(jié)炎。銀屑病20余年，2000年起出現(xiàn)四肢關(guān)節(jié)損害，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，活動不利，X線攝片示雙側(cè)腕關(guān)節(jié)骨質(zhì)損害，血沉(ESR)46mm/小時。曾用多藥甲氨蝶呤(MTX)等治療，無顯效，關(guān)節(jié)腫痛無好轉(zhuǎn)，血沉持續(xù)高于正常。自2001年8月16日起服用本發(fā)明的藥物組合物。2周后，血沉(ESR)降至30mm/小時，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動不利好轉(zhuǎn)。用藥40天時，復(fù)查X線片顯示腕關(guān)節(jié)骨質(zhì)損害消失(經(jīng)放射科、風(fēng)濕免疫科聯(lián)合會診證實(shí))。用藥過程中，無明顯不良反應(yīng)，隨訪肝功能、血常規(guī)均正常。目前患者一般情況良好，已停用止痛藥，無活動障礙。
典型病例2.秦先生，男，41歲，江蘇南京人，銀屑病型關(guān)節(jié)炎。2001年9月起病，四肢小關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，活動障礙，影響工作。自2001年10月起服用本發(fā)明的藥物組合物，3周起效，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛好轉(zhuǎn)，活動輕松。服藥3個月時，關(guān)節(jié)腫痛基本消失，活動無障礙，恢復(fù)正常工作。用藥6周時，出現(xiàn)大便次數(shù)增多的副作用，每天3～5次，性質(zhì)無改變，未處理，遂繼續(xù)用藥，2周后，大便次數(shù)恢復(fù)正常。用藥過程中無其他不良反應(yīng)。
治療例3 本發(fā)明的藥物組合物對強(qiáng)直性脊柱炎的治療典型病例1.王先生，男，25歲，遼寧沈陽人，強(qiáng)直性脊柱炎。2001年8月起病，骶髂關(guān)節(jié)疼痛，彎腰活動障礙，經(jīng)X線攝片確診為強(qiáng)直性脊柱炎。確診后經(jīng)柳氮磺胺吡啶、強(qiáng)的松等治療4個月，無明顯療效。2002年1月起服用本發(fā)明的藥物組合物，6周起效，骶髂關(guān)節(jié)腫痛減輕，彎腰活動輕松。用藥3個月時，腫痛基本消失，活動無障礙。不良反應(yīng)表現(xiàn)為大便次數(shù)增多，每日3～4次，性質(zhì)無改變，于用藥4周時出現(xiàn)，未處理，2周后大便次數(shù)恢復(fù)正常。用藥期間無其他不良反應(yīng)。
典型病例2.王先生，男，49歲，湖北武漢人，強(qiáng)直性脊柱炎。1970年1月起病，未正規(guī)治療。2001年起病情加重，雙側(cè)骶髂、膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛明顯，彎腰、走路等活動明顯障礙，影響正常工作和日常生活。2001年8月起服用本發(fā)明的藥物組合物，2周起效，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛好轉(zhuǎn)、活動輕松。用藥6個月時關(guān)節(jié)腫脹、疼痛基本消失，彎腰、走路等活動無障礙，恢復(fù)正常生活和工作。不良反應(yīng)為皮膚瘙癢，在用藥5周時出現(xiàn)，加用抗過敏藥對癥處理2周后消失。用藥期間無其他不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.治療自身免疫性疾病的藥物組合物，包含治療有效量的式(I)所示氟塞米衍生物 其中，X為H，鹵素，C1-5烷基，被OH、NH2、NHR或NRR取代的C1-5烷基，或C1-5烷氧基，或其可藥用鹽及藥學(xué)上可接受的輔料。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述治療有效量為每劑量單位1mg-1g。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述藥物組合物為膠囊劑，每個膠囊包含氟塞米 1mg-1g淀粉 2.5mg-2.5g
4.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述藥物組合物為片劑，每片包含氟塞米 1mg-1g乳糖5mg-5g淀粉 1.5mg-1.5g滑石粉0.1mg-0.2g5％淀粉漿適量低取代羥丙基纖維素 0.1mg-1gOPADRY-OY-GM7305適量WHITE
5.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述藥物組合物為注射劑，每劑量單位包含氟塞米 1mg-1g氯化鈉0.1mg-0.9g氫氧化鈉適量注射用水加至1ml
6.權(quán)利要求1所述藥物組合物在制備治療自身免疫性疾病的藥物制劑上的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和腎病綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病。
全文摘要
治療自身免疫性疾病的藥物組合物,包含治療有效量的式(I)所示氟塞米衍生物，其中,X為H,鹵素,C1－5烷基,被OH、NH2、NHR或NRR取代的C1－5烷基,或C1－5烷氧基,或其可藥用鹽及藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明的藥物組合物是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑,對細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用。在治療自身免疫性疾病,包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎和腎病綜合癥、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病等疾病的臨床實(shí)踐中證明療效顯著,毒性較低。
文檔編號A61P37/02GK1387845SQ0211159
公開日2003年1月1日 申請日期2002年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月30日
發(fā)明者肖飛 申請人:上海欣凱醫(yī)藥發(fā)展有限公司