專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌多糖抗原疫苗，其制備以及這種多糖在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
具體地，本發(fā)明涉及包含肺炎球菌多糖抗原并任選包含Th1誘導(dǎo)型佐劑的疫苗，所述多糖抗原通常是肺炎球菌多糖偶聯(lián)物抗原，與肺炎鏈球菌蛋白抗原一起配制。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是革蘭氏陽性細(xì)菌，由其所致的發(fā)病率和死亡率相當(dāng)高(尤其是在年幼和年邁群體中)。該細(xì)菌可導(dǎo)致侵襲性疾病如肺炎，菌血癥和腦膜炎，以及與菌群定居(colonization)有關(guān)的疾病，如急性中耳炎。在美國60歲以上的人中，肺炎球菌性肺炎的發(fā)病率估計(jì)是每100,000人中約3到8例。有20％的病例可導(dǎo)致菌血癥和其它的表現(xiàn)如腦膜炎，即使在抗菌素治療的情況下其死亡率也接近30％。
肺炎球菌由化學(xué)連接的多糖包裹，所述多糖賦予了該細(xì)菌的血清型特異性。肺炎球菌有90種已知血清型，而莢膜是決定其毒力的主要物質(zhì)，因?yàn)榍v膜不但可以保護(hù)細(xì)菌的內(nèi)表面不受補(bǔ)體的影響，而且其本身的免疫原性極弱。多糖是T非依賴性抗原，不能被加工或在MHC分子上呈遞，從而不能與T細(xì)胞相互作用。然而，它們通過另一機(jī)制刺激免疫系統(tǒng)，所述機(jī)制涉及B細(xì)胞表面受體的交聯(lián)。
多項(xiàng)試驗(yàn)已顯示，抗御侵襲性肺炎疾病的保護(hù)作用與莢膜的特異性抗體極為相關(guān)，且所述保護(hù)是血清型特異性的。
以多糖抗原為基礎(chǔ)的疫苗是本領(lǐng)域熟知的。有四種已獲批準(zhǔn)用于人類，包括傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)的Vi多糖，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的PRP多糖，四價(jià)腦膜炎球菌疫苗(由血清型A，C，W135和Y構(gòu)成)，以及23價(jià)肺炎球菌疫苗(由對應(yīng)于血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F，和33的多糖組成，占肺炎球菌血分離物的至少90％)。
后三種疫苗針對在兒童中引起極高發(fā)病率和死亡率的呼吸道感染細(xì)菌提供對機(jī)體的保護(hù)作用，然而這些疫苗還沒有被批準(zhǔn)用于2歲以下的兒童，因?yàn)槠涿庖咴詫υ撃挲g組而言不足[Peltola er al.(1984)，N.Engl.J.Med.3101561-1566]。肺炎鏈球菌是嬰幼兒和年幼兒童中侵襲性細(xì)菌疾病和中耳炎的最常見的原因。同樣，老年人對肺炎球菌疫苗的應(yīng)答較弱[Roghmann etal.，(1987)，J.Gerontol.42265-270]，因此，在該群體中細(xì)菌性肺炎的發(fā)病率增加[Verghese and Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62271-285]。
已設(shè)計(jì)出解決嬰幼兒中上述免疫原性缺乏的策略，包括將多糖與大的免疫原性蛋白連接，以提供對T細(xì)胞的旁路輔助，并誘導(dǎo)針對所偶聯(lián)的多糖抗原的免疫記憶。目前，正在對肺炎球菌糖蛋白偶聯(lián)物疫苗在各個(gè)年齡組中的安全性，免疫原性和效力進(jìn)行評(píng)估。
已知23價(jià)非偶聯(lián)肺炎球菌疫苗的臨床療效差異較大，從0％到81％不等(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.154；2531-2535)。所述效力似乎與正接受免疫的危險(xiǎn)人群相關(guān)，如老年人，Hodgkin’s患者，脾切除者，鐮刀型細(xì)胞病(sickle cell disease)和無丙種球蛋白血癥(agammaglobulinemics)患者(Fine et al.(1994)Arch Intem Med.1542666-2677)，還與疾病的表現(xiàn)有關(guān)。23價(jià)疫苗沒有顯示出針對肺炎球菌性肺炎(在某些高危人群如老年人中)和中耳炎疾病的保護(hù)作用。
因此需要改進(jìn)的肺炎球菌疫苗組合物，尤其是那些能更有效地預(yù)防或緩解老年人和兒童的肺炎球菌病的疫苗組合物。
本發(fā)明即提供這樣的改進(jìn)的疫苗。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了疫苗組合物，其包括至少一種肺炎鏈球菌多糖抗原(優(yōu)選與一種蛋白載體偶聯(lián))和選自以下的肺炎鏈球菌蛋白抗原多組氨酸三聯(lián)體(Poly Histidine Triad)家族(Pht；如PhtA，PhtB，PhtD，或PhtE)，Lyt家族(例如LytA，LytB，或LytC)，SpsA，Sp128，Sp130，Sp125，Sp101和Sp133，或其截短物或其免疫功能等效物，任選地，還包括Th1佐劑(誘導(dǎo)明顯的Th1型免疫應(yīng)答的佐劑)。優(yōu)選肺炎球菌蛋白和Th1佐劑都包括。有利的組合物包括上述本發(fā)明的肺炎球菌蛋白相互之間的組合，以及與其它的肺炎球菌蛋白的組合。本發(fā)明的組合物尤其適用于對老年肺炎患者的治療。
肺炎球菌多糖疫苗(偶聯(lián)型或非偶聯(lián)型)不能針對老年人群的肺炎起保護(hù)作用，而在該群體中該病的發(fā)病率非常高。抗御肺炎球菌的關(guān)鍵機(jī)制是調(diào)理吞噬作用(通過產(chǎn)生抗肺炎球菌多糖抗體而導(dǎo)致體液B細(xì)胞/中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的事件，細(xì)菌最終被吞噬)，然而所涉及的調(diào)理機(jī)制有一部分在老年人中變?nèi)?，即PMN(多形核細(xì)胞)的超氧化物的產(chǎn)生，其它活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，PMN的移動(dòng)，PMN的凋亡，PMN的變形性減弱。在老年人中抗體應(yīng)答也可能減弱。
與一般認(rèn)識(shí)相反，正常水平的抗莢膜多糖抗體不能有效徹底地清除細(xì)菌，因?yàn)榉窝浊蚓梢郧秩胨拗骷?xì)胞以躲避免疫系統(tǒng)的該種免疫作用。
令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在刺激免疫系統(tǒng)的體液免疫(B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)的同時(shí)刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫(例如T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)能產(chǎn)生協(xié)同作用(或協(xié)作)，它增強(qiáng)肺炎球菌從宿主中被清除。這一發(fā)現(xiàn)在一般意義上可指導(dǎo)對肺炎球菌感染的預(yù)防(或治療)，而對基于多糖的疫苗無效的老年人肺炎的預(yù)防(或治療)尤其重要。
在不受任何理論限制的情況下，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，如果將肺炎球菌多糖(優(yōu)選與蛋白載體偶聯(lián)的)與選自如下的肺炎球菌蛋白PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133(能被加工并呈遞在感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的MHCI和MHCII中)一起給藥，免疫系統(tǒng)的兩種免疫效應(yīng)可協(xié)同。盡管這些肺炎球菌蛋白自身可激發(fā)一種或多種由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，但本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)在疫苗制品中存在Th1誘導(dǎo)型佐劑可幫助免疫系統(tǒng)的該種免疫，并且驚訝地發(fā)現(xiàn)它還可加強(qiáng)免疫系統(tǒng)的兩種免疫之間的協(xié)同作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供改進(jìn)的疫苗，尤其是用于預(yù)防或緩解老年人(和/或嬰幼兒)的肺炎球菌感染疫苗。
在本發(fā)明中，年齡在55或55歲以上的患者可視為是老年患者，主要是60歲，更主要是60歲以上的患者。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了一種疫苗組合物，其適合老年患者(和/或嬰幼兒)應(yīng)用，該疫苗組合物包含至少一種肺炎鏈球菌多糖抗原和至少一種選自下組的肺炎鏈球菌蛋白抗原PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。所述疫苗可任選包含Th1佐劑。
在第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中本發(fā)明提供了一種疫苗(適用于預(yù)防老年患者的肺炎)，其包含至少一種(2，3，4，5，6，7，8，9或10種)肺炎鏈球菌多糖抗原和至少一種選自下組的肺炎鏈球菌蛋白抗原PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133，優(yōu)選還包括Th1佐劑。
在以上實(shí)施方案中，所述疫苗優(yōu)選包括本發(fā)明的上述肺炎球菌蛋白相互之間的組合，以及與其它肺炎球菌蛋白之間的組合，如下所述。
所述疫苗還可以用于治療其它高危人群如嬰幼兒中的肺炎球菌感染(例如中耳炎)。
本發(fā)明的肺炎鏈球菌多糖抗原通常本發(fā)明的肺炎鏈球菌疫苗包含多糖抗原(優(yōu)選與載體蛋白偶聯(lián))，其中所述多糖來源于至少四種肺炎球菌血清型。優(yōu)選，所述四種血清型包括6B，14，19F和23F。更優(yōu)選，所述組合物中至少包括7種血清型，例如來源于血清型4，6B，9V，14，18C，19F和23F的那些。還更優(yōu)選所述組合物中包括至少11種血清型，例如在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包括來源于血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F的莢膜多糖(優(yōu)選與載體蛋白偶聯(lián))。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少包括13種多糖抗原(優(yōu)選與載體蛋白偶聯(lián))，但還可以包括另外的多糖抗原，例如23價(jià)體(如血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F)也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
對于老年人的疫苗接種(例如用于預(yù)防肺炎)而言，優(yōu)選在上述11價(jià)抗原組合物中，包括血清型8和12F(最優(yōu)選還包括血清型15和22)以形成15價(jià)疫苗，而對于嬰幼兒而言(這時(shí)主要考慮中耳炎)，優(yōu)選包括血清型6A和19A以便形成13價(jià)疫苗。
盡管上述多糖可以應(yīng)用其全長天然形式，但應(yīng)該理解，降低了大小但仍然具備免疫原性的多糖也可以應(yīng)用(參見例如EP497524和497525)。
為了預(yù)防/緩解老年患者(+55歲)的肺炎、嬰兒(最大至18個(gè)月)和幼兒(通常是18個(gè)月到5歲)的中耳炎，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案將本發(fā)明所述多價(jià)肺炎鏈球菌多糖組合了選自如下的肺炎鏈球菌蛋白PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133，或其免疫功能等效物。肺炎球菌蛋白的聯(lián)合應(yīng)用還優(yōu)選如下進(jìn)行。
本發(fā)明的肺炎球菌蛋白基于本發(fā)明的目的，“免疫功能等效物”是指包含本發(fā)明所述蛋白的至少一種保護(hù)性表位的蛋白的肽。所述表位的特征是暴露于表面，高度保守，且可在宿主中引發(fā)殺菌性的抗體應(yīng)答或可阻止毒性作用。優(yōu)選，所述功能等效物含有本發(fā)明蛋白的至少15個(gè)，優(yōu)選30個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸。最優(yōu)選，可使用所述蛋白的片段，有缺失的蛋白如其跨膜缺失變體(即應(yīng)用所述蛋白的胞外區(qū))，融合體，通過化學(xué)方法或遺傳學(xué)方法脫毒的衍生物等，只要它們能激發(fā)基本上與天然蛋白等同的免疫應(yīng)答。蛋白序列中潛在的B細(xì)胞表位的位置可通過兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用鑒定既是表面暴露又具抗原性的肽來確定，所述方法是2D結(jié)構(gòu)預(yù)測法和抗原性指數(shù)預(yù)測法。用PSIPRED程序(來自David Jones，Brunel Bioinformatics Group，Dept.Biological Sciences，Brunel University，Uxbridge UB8 3PH，UK)可進(jìn)行2D結(jié)構(gòu)預(yù)測?？乖灾笖?shù)可根據(jù)Jameson和Wolf描述的方法(CABIOS 4181-186)進(jìn)行計(jì)算。
本發(fā)明的蛋白是以下蛋白，它們都暴露于肺炎球菌的外表面(至少能在肺炎球菌生活周期的某一階段被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別)，或它們都是肺炎球菌所分泌或釋放的蛋白。
本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白優(yōu)選選自下組來自多組氨酸三聯(lián)體家族(Pht)的蛋白，來自Lyt家族的蛋白，膽堿結(jié)合蛋白，具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任何氨基酸)，具有II型信號(hào)序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸)，和具有I型信號(hào)序列基序的蛋白。這些種類(或基序)中的優(yōu)選實(shí)例是如下蛋白(或其截短物或免疫功能等效物)Pht(多組氨酸三聯(lián)體)家族包含蛋白phtA，PhtB，PhtD和PhtE。該家族具有以下特征脂質(zhì)化序列(lipidation sequence)，由脯氨酸豐富區(qū)和幾個(gè)組氨酸三聯(lián)體分隔開的兩個(gè)區(qū)(可能與金屬或核苷的結(jié)合或酶的活性有關(guān))，(3-5)卷曲螺旋區(qū)，保守的N末端和異源的C末端。它存在于已檢驗(yàn)的所有肺炎球菌菌株中。其同源蛋白可見于其它鏈球菌和奈瑟氏球菌屬。該家族優(yōu)選的成員包括PhtA，PhtB和PhtD。更優(yōu)選，其包括PhtA或PhtD?？梢岳斫?，術(shù)語PhtA，B，D和E是指具有在以下引用文獻(xiàn)中公開的序列的蛋白，以及其天然(和人工制備的)變體，所述變體與參考蛋白有至少90％的序列同源性，優(yōu)選至少95％相同，最優(yōu)選至少97％相同。
對于Pht蛋白而言，PhtA公開于WO98/18930，還可稱作Sp36。如上所述，其是一種多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白，且具有II型信號(hào)基序LXXC。
PhtD公開于WO 00/37105，也可稱作Sp036D。如上所述，它也是多組氨酸三聯(lián)體家族的一種蛋白，也具有II型信號(hào)基序LXXC。
PhtB公開于WO 00/37105，也稱作Sp036B。PhtB家族的另一成員是降解C3的多肽，公開于WO 00/17370。該蛋白也是多組氨酸三聯(lián)體家族成員，具有？型信號(hào)基序LXXC。優(yōu)選的免疫功能等效物是蛋白Sp42，公開于WO98/18930。PhtB截短物(約79kD)公開于WO 99/15675，它也被認(rèn)為是PhtX家族成員。
PhtE公開于WO00/30299，稱作BVH-3。
SpsA是膽堿結(jié)合蛋白(Cbp)，公開于WO98/39450。
Lyt家族是膜結(jié)合蛋白，與細(xì)胞裂解有關(guān)。N末端區(qū)包含膽堿結(jié)合區(qū)，而Lyt家族不包含在膽堿結(jié)合蛋白家族(Cbp)發(fā)現(xiàn)的如下所述所有特征，因此，本發(fā)明中，Lyt家族被認(rèn)為不同于Cbp家族。與Cbp家族不同，C末端區(qū)包含Lyt蛋白家族的催化區(qū)。該家族包括LytA，B和C。對于Lyt家族而言，LytA公開于Ronda et al.，Eur J Biochem，164621-624(1987)。LytB公開于WO98/18930，也稱作Sp46。LytC也公開于WO98/18930，也稱作Sp91。該家族的優(yōu)選成員是LytC。
另一優(yōu)選實(shí)施方案是Lyt家族截短物，其中“Lyt”如上定義，“截短物”是指缺失膽堿結(jié)合區(qū)的50％或更多部分的蛋白。優(yōu)選這類蛋白缺失整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)。
Sp125是肺炎球菌表面蛋白的一個(gè)實(shí)例，具有細(xì)胞壁錨定基序LPXTG(其中X是任何氨基酸)。已發(fā)現(xiàn)，這類肺炎球菌表面蛋白中具有該基序的任何蛋白在本發(fā)明中是有用的，從而被認(rèn)為是本發(fā)明的另一蛋白。Sp125本身公開于WO 98/18930，也稱作ZmpB，即一種鋅金屬蛋白酶。
Sp101公開于WO 98/06734(其參考名稱為#y85993)。其特征在于I型信號(hào)序列。
Sp133公開于WO 98/06734(其參考名稱為#y85993)。其特征也是I型信號(hào)序列。
Sp128和Sp130公開于WO 00/76540。
本發(fā)明所使用的蛋白優(yōu)選選自PhtD和PhtA，或者是這兩種蛋白的組合。
本度明的一種或多種肺炎球菌蛋白與其它肺炎球菌蛋白的有利組合在本發(fā)明的疫苗中，還優(yōu)選將本發(fā)明上述蛋白中的每一種蛋白(優(yōu)選PhtD和/或PhtA)與來自下組的一種或多種肺炎球菌蛋白組合肺炎球菌溶血素(也稱為Ply；優(yōu)選通過化學(xué)處理或突變而脫毒)[WO96/05859，WO90/06951，WO99/03 884]，PsaA和其跨膜缺失變體(Berry and Paton，InfectImmun 1996 Dec；64(12)5255-62)，PspA和其跨膜缺失變體(US 5804193，WO92/14488，WO99/53940)，PspC和其跨膜缺失變體(WO97/09994，WO99/53940)，膽堿結(jié)合蛋白(Cbp)家族成員[例如CbpA和其跨膜缺失變體(WO97/41151；WO99/51266)]，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Infect.Immun.1996643544)，HSP70(WO96/40928)，PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS MicrobiolLett 1998，164207-14)，M樣蛋白(SB專利申請?zhí)朎P0837130)，和粘附素18627(SB專利申請?zhí)朎P0834568)。本發(fā)明還包含上述蛋白的免疫功能等效物或截短物(如上定義)。
關(guān)于膽堿結(jié)合蛋白家族，該家族的成員最初被鑒定為可通過膽堿親和層析純化的肺炎球菌蛋白。所有膽堿結(jié)合蛋白都是非共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸和膜結(jié)合型脂磷壁酸的磷脂酰膽堿部分。在結(jié)構(gòu)上，有數(shù)個(gè)區(qū)域在整個(gè)家族所有成員中是共有的，但這些蛋白的實(shí)際特性(氨基酸序列，長度等等)是不同的。通常，膽堿結(jié)合蛋白家族包含N末端區(qū)(N)，保守重復(fù)區(qū)(R1和/或R2)，脯氨酸豐富區(qū)(P)和保守的膽堿結(jié)合區(qū)(C)，這些區(qū)域多倍重復(fù)，約構(gòu)成該蛋白的一半。正如本申請中所用的，術(shù)語“膽堿結(jié)合蛋白家族(Cbp)”選自在WO97/41151中鑒定的下組膽堿結(jié)合蛋白PbcA，SpsA，PspC，CbpA，CbpD，和CbpG。CbpA公開于WO/41151，CbpD和CbpG公開于WO00/29434。PspC公開于WO97/09994。PbcA公開于WO98/21337。優(yōu)選膽堿結(jié)合蛋白選自CbpA，PbcA，SpsA和PspC。
如果Cbp是上文所述的另一種蛋白，那么它可以是Cbp截短物，其中“Cbp”如上定義，“截短物”是指缺失膽堿結(jié)合區(qū)(C)的50％或更多的蛋白。優(yōu)選這類蛋白缺失整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)。更優(yōu)選，這類蛋白截短物缺失(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)該蛋白的N末端一半的一部分，但仍保留至少一個(gè)重復(fù)區(qū)(R1或R2)。還更優(yōu)選，所述截短物具有2個(gè)重復(fù)區(qū)(R1和R2)。這類優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例是NR1xR2和R1xR2，描述于WO99/51266或WO99/51188，但缺失類似膽堿結(jié)合區(qū)的其它膽堿結(jié)合蛋白也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
Cbp截短物-Lyt截短物嵌合蛋白(或融合體)也可用于本發(fā)明的疫苗中。優(yōu)選其包括Cbp的NR1xR2(或R1xR2)和Lyt的C末端區(qū)(Cterm，即缺失了膽堿結(jié)合區(qū))(例如，LytCCterm或Sp91Ctem)。更優(yōu)選Cbp選自CbpA，PbcA，SpsA或PspC。還更優(yōu)選，其是CbpA。優(yōu)選Lyt是LytC(也可稱作Sp91)。
也可應(yīng)用PspA或缺失了膽堿結(jié)合區(qū)(C)并表達(dá)為與Lyt的融合蛋白的PsaA截短物。優(yōu)選，Lyt是LytC。
用于本發(fā)明目的的肺炎球菌蛋白的優(yōu)選組合優(yōu)選本發(fā)明蛋白的組合選自2種或多種(3或4種)不同種類，如具有？型信號(hào)序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如，多組氨酸三聯(lián)體家族(Pht))，膽堿結(jié)合蛋白家族(Cbp)，具有I型信號(hào)序列基序的蛋白(例如，Sp101)，具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如，Sp128，Sp130)，毒素(例如，Ply)，等等。在這些種類(或基序)中優(yōu)選的實(shí)例是以上所提到的蛋白，或其免疫功能等效物。毒素+Pht，毒素+Cbp，Pht+Cbp，和毒素+Pht+Cbp是優(yōu)選的種類組合。
優(yōu)選的有利的組合包括，但不限于PhtD+NR1xR2，PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白，PhtD+Ply，PhtD+Sp128，PhtD+PsaA，PhtD+PspA，PhtA+NR1xR2，PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白，PhtA+Ply，PhtA+Sp128，PhtA+PsaA，PhtA+PspA，NR1xR2+LytC，NR1xR2+PspA，NR1xR2+PsaA，NR1xR2+Sp128，R1xR2+LytC，R1xR2+PspA，R1xR2+PsaA，R1xR2+Sp128，R1xR2+PhtD，R1xR2+PhtA。優(yōu)選，NR1xR2(或R1xR2)來自CbpA或PspC，更優(yōu)選它來自CbpA。
肺炎球菌蛋白的尤其優(yōu)選組合包括Ply(或其截短物或免疫功能等效物)+PhtD(或其截短物或免疫功能等效物)+NR1xR2(或R1xR2)。優(yōu)選NR1xR2(或R1xR2)來自CbpA或PspC，更優(yōu)選它來自CbpA。
不希望受任何理論的限制，在組合物中，本發(fā)明的肺炎球菌蛋白(或上述組合)可幫助誘導(dǎo)抗御肺炎球菌疾病，尤其是抗御肺炎所需的T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，該應(yīng)答與免疫系統(tǒng)的體液免疫協(xié)同作用，抑制肺炎球菌的侵襲，所述蛋白還可幫助刺激調(diào)理吞噬作用。將蛋白抗原包括在內(nèi)的另一優(yōu)點(diǎn)是呈遞其它抗原以便進(jìn)行調(diào)理吞噬。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了肺炎鏈球菌疫苗，其包括肺炎球菌多糖偶聯(lián)疫苗，該偶聯(lián)疫苗包括來自至少4種血清型的多糖抗原，優(yōu)選至少7種血清型，更優(yōu)選至少11種血清型，還包括至少一種，優(yōu)選2，3或4種選自下組的肺炎鏈球菌蛋白PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133(或如上所述的肺炎球菌蛋白組合)。優(yōu)選所述蛋白中的一種蛋白是PhtA(或其免疫功能等效物)。更優(yōu)選所述蛋白中的一種蛋白是PhtD(或其免疫功能等效物)。
如上所述，與接種多糖的方法有關(guān)的問題是多糖本身免疫原性弱。為克服這一問題，可將多糖與蛋白載體偶聯(lián)，所述載體可對T細(xì)胞提供旁路輔助。所以，優(yōu)選本發(fā)明所用的多糖與這樣的蛋白載體偶聯(lián)。目前常用來制備多糖免疫原的這類載體的實(shí)例包括白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素(分別為DT，DT CRM197和TT)，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，來自腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的OMPC，以及結(jié)核菌素的純蛋白衍生物(PPD)。
基于肺炎球菌多糖的免疫原性組合物(或疫苗)的優(yōu)選載體是來自流感嗜血菌的蛋白D(EP594610-B)，或其片段。適合應(yīng)用的片段包括包含T輔助細(xì)胞的表位的那些片段。具體地，蛋白D片段優(yōu)選包含所述蛋白的N末端1/3。令人驚奇的是蛋白D載體可作為載體用在偶聯(lián)了多價(jià)肺炎球菌多糖抗原的疫苗中。如果每種多糖都用同樣的載體，通?？赡軙?huì)發(fā)生表位的抑制。令人驚奇的是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在組合疫苗中蛋白D尤其適合減小這種表位抑制作用。在組合中一種或多種肺炎球菌多糖可有利地偶聯(lián)到蛋白D上，且優(yōu)選所有抗原在這種組合疫苗中都偶聯(lián)到蛋白D上。
用于肺炎球菌多糖的另一種優(yōu)選載體是肺炎球菌蛋白本身(如上在“本發(fā)明的肺炎球菌蛋白”章節(jié)中定義的)。
所述多糖可通過任何已知方法與載體蛋白偶聯(lián)(例如，通過Likhite，美國專利號(hào)4,372,945和Armor et al.，美國專利號(hào)4,474,757)。優(yōu)選可進(jìn)行CDAP偶聯(lián)(WO95/08348)。
優(yōu)選，所述偶聯(lián)物的蛋白多糖的比例(重量∶重量)是0.3∶1到1∶1，更優(yōu)選0.6∶1到0.8∶1，且最優(yōu)選約0.7∶1。
本發(fā)明的疫苗優(yōu)選是含有佐劑的。適當(dāng)?shù)淖魟┌ㄤX鹽如氫氧化鋁膠(明礬)或磷酸鋁，但也可以是鈣鹽，鎂鹽，鐵鹽或鋅鹽，或可以是不溶性的酰化酪氨酸懸浮物，或酰化的糖，多糖的陽離子或陰離子衍生物或聚磷腈。
優(yōu)選所述佐劑是TH1型應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)劑，以幫助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的TH1佐劑高水平的Th1型細(xì)胞因子針對給定抗原更傾向于誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的Th2型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)針對該抗原的體液免疫應(yīng)答。
重要的是記住Th1型和Th2型免疫應(yīng)答之間的不同并不是絕對的。實(shí)際上，個(gè)體的免疫應(yīng)答可以以Th1為主，或以Th2為主。但通常為方便起見以Mosmann和Coffman針對鼠CD4+T細(xì)胞克隆的描述來判斷細(xì)胞因子家族(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)Th1 and TH2 cellsdifferentpatterns of lymphocine secretion lead to different functional properties.AnnualReview of Immunology，7，p145-173)。通常，Th1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。一般情況下直接同Th1型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有關(guān)的其它細(xì)胞因子不是由T細(xì)胞產(chǎn)生的，如IL-12。相反，Th2型應(yīng)答與IL-4，IL-5，IL-6，IL-10的分泌有關(guān)。促進(jìn)顯著的Th1應(yīng)答的適當(dāng)佐劑系統(tǒng)包括單磷脂酰脂質(zhì)A或其衍生物，特別是3-脫氧酰化單磷脂酰脂質(zhì)A(3D-MPL)(其制備參見GB2220211A)；以及單磷脂酰脂質(zhì)A，優(yōu)選3-脫氧?；瘑瘟字Ｖ|(zhì)A，與鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)的組合，或者與水包油乳劑組合。在所述組合中，抗原和3D-MPL共同包含在同一微粒結(jié)構(gòu)中，使抗原信號(hào)和免疫刺激性信號(hào)的傳輸更為有效。研究顯示，3D-MPL能進(jìn)一步提高吸附了明礬的抗原的免疫原性[Thoelen et al.Vaccine(1998)16708-14；EP689454-B1]。
一個(gè)提高系統(tǒng)涉及單磷脂酰脂質(zhì)A與皂苷(saponin)衍生物的組合，尤其是QS21和3D-MPL的組合，其公開于WO94/00153，或者涉及一種低反應(yīng)性的組合物，其中QS21用膽固醇淬滅，見WO96/33739。
一種特別強(qiáng)效的佐劑制品涉及在水包油乳劑中含有QS21，3D-MPL和生育酚(tocopherol)，描述于WO95/17210，該種制劑是優(yōu)選的制劑。
優(yōu)選，疫苗還包含皂苷，更優(yōu)選QS21。所述制劑還可包含水包油乳劑和生育酚(WO95/17210)。
本發(fā)明還提供一種制備疫苗制劑的方法，該方法包含將本發(fā)明的蛋白與可藥用賦形劑，如3D-MPL混合。
包含非甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)也是TH1應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)劑，適合用于本發(fā)明。
本發(fā)明特別優(yōu)選的組合物包含一種或多種偶聯(lián)的肺炎球菌多糖，一種或多種本發(fā)明的肺炎球菌蛋白和Th1佐劑。不希望受任何理論的限制，肺炎球菌蛋白對細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的誘導(dǎo)(如上所述)和免疫系統(tǒng)兩種免疫之間的協(xié)作可采用上述Th1佐劑進(jìn)行輔助，從而產(chǎn)生抗御一般性肺炎球菌疾病，更重要的是抗御老年患者肺炎球菌性肺炎的特別有效的疫苗。
本發(fā)明另一方面提供了如本文所述的用于醫(yī)學(xué)的免疫原或疫苗。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或緩解老年人(+55歲)肺炎的方法，該方法包含對所述老年患者給藥安全和有效的量的疫苗(如本文所述)，所述疫苗包含肺炎鏈球菌多糖抗原和選自下組的肺炎球菌蛋白，還任選包含Th1佐劑PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或緩解嬰兒(最大至18月)或幼兒(通常是18個(gè)月到5歲)的中耳炎的方法，其包含對所述嬰兒或幼兒給藥安全和有效的量的疫苗，所述疫苗包含肺炎鏈球菌多糖抗原和選自下組的肺炎鏈球菌蛋白，還任選包含Th1佐劑PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
優(yōu)選在本發(fā)明上述方法中，所述多糖抗原以多糖蛋白偶聯(lián)物的形式存在。
本發(fā)明疫苗的制備本發(fā)明的疫苗制品可通過全身或粘膜途徑給藥來保護(hù)或治療易受感染的哺乳動(dòng)物。這些給藥方式包括肌肉內(nèi)注射，腹膜內(nèi)注射，皮內(nèi)或皮下途徑；或通過粘膜給藥到口腔/消化道，呼吸道，生殖道。用于治療肺炎或中耳炎的疫苗的鼻內(nèi)給藥是優(yōu)選的(因?yàn)榭梢愿行ьA(yù)防鼻咽部攜帶肺炎球菌，因此在最早期便可減輕感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可以單劑給藥，但其成分也可同時(shí)聯(lián)合給藥，或在不同時(shí)間聯(lián)合給藥(例如，為了使免疫應(yīng)答之間能更好地協(xié)調(diào)，肺炎球菌多糖抗原可以在疫苗的細(xì)菌蛋白成分給藥的同時(shí)或1-2周后分別給藥)。在聯(lián)合給藥時(shí)，任何一次或每一次給藥時(shí)都可以有備選的Th1佐劑，但優(yōu)選其與疫苗的細(xì)菌蛋白成分進(jìn)行組合。除了單一給藥途徑以外，還可以應(yīng)用2條不同的給藥途徑。例如，任何病毒抗原都可以通過皮內(nèi)給藥(ID)，而細(xì)菌蛋白可通過肌肉內(nèi)給藥(IM)或鼻內(nèi)給藥(IN)。多糖可以肌肉內(nèi)給藥(或皮內(nèi)給藥)，細(xì)菌蛋白可以鼻內(nèi)給藥(或皮內(nèi)給藥)。另外，本發(fā)明的疫苗可以肌肉內(nèi)給藥進(jìn)行初次免疫，鼻內(nèi)給藥進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
每劑典型疫苗中偶聯(lián)的抗原的量應(yīng)能誘導(dǎo)出免疫保護(hù)性應(yīng)答，而沒有明顯的副作用。該量將根據(jù)所使用的特異性免疫原和給藥途徑的不同而變化。通常，每劑應(yīng)包含多糖0.1-100μg，優(yōu)選0.1-50μg，優(yōu)選0.1-10μg，最優(yōu)選1-5μg。
疫苗中蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范圍內(nèi)，優(yōu)選5-50μg，通常最優(yōu)選5-25μg。
對具體的疫苗來說，各成分的最佳的量可通過標(biāo)準(zhǔn)研究確定，所述研究涉及觀察受試者的相應(yīng)免疫應(yīng)答。第一次接種后，以充足的時(shí)間間隔對受試者進(jìn)行一次或多次的加強(qiáng)免疫。
疫苗制品通常描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(eds Powell M.F.and Newman M.J.)(1995)Pleun Press New York)。Fullerton描述了用脂質(zhì)體進(jìn)行膠囊化(美國專利號(hào)4235877)。
盡管本發(fā)明的疫苗可通過任何途徑給藥，但所描述的疫苗進(jìn)行皮內(nèi)(ID)給藥構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。人皮膚包含外部“角質(zhì)”表皮層，稱為角質(zhì)層，它覆蓋了表皮。此表皮下是真皮層，真皮層覆蓋了皮下組織。研究者發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)注射疫苗，特別是真皮內(nèi)注射疫苗可刺激免疫應(yīng)答，還伴隨其他多種優(yōu)點(diǎn)。此處所述的皮內(nèi)接種疫苗構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選特征。
皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)“芒圖試驗(yàn)(mantoux procedure)”包括以下步驟清潔皮膚，展開一只手，然后使小號(hào)針頭(26-31號(hào))的斜面朝上，以10-15度的角度將針插入。一旦針的斜面插入后，針筒下降，進(jìn)一步推進(jìn)的同時(shí)略施壓力使其在皮下抬起。然后將液體非常緩慢地注入，在皮膚表面形成包或隆起，然后緩慢將針退出。
近來，皮內(nèi)或穿皮給與液體制劑的特定裝置已被公開，例如該裝置公開于WO 99/34850和EP 1092444，噴射注射裝置公開于WO 01/13977，US5,480,381，US 5,599,302，US 5,334,144，US 5,993,412，US 5,649,912，US5,569,189，US 5,704,911，US 5,383,851，US 5,893,397，US 5,466,220，US5,339,163，US 5,3 12,335，US 5,503,627，US 5,064,413，US 5,520,639，US4,596,556，US 4,790,824，US 4,941,880，US 4,940,460，WO 97/37705和WO97/13537。該疫苗制劑的真皮內(nèi)給藥替代方法包括常規(guī)注射器和針，或固體疫苗的彈道式給藥裝置(WO 99/27961)，或經(jīng)皮貼劑(WO 97/48440；WO98/28037)；或皮膚表面給藥(經(jīng)皮給藥WO 98/20734；WO 98/28037)。
當(dāng)本發(fā)明的疫苗是給至皮膚時(shí)，更具體地說是真皮時(shí)，給與小量液體疫苗，具體約為0.05ml-0.2ml。
本發(fā)明皮膚或皮內(nèi)疫苗中抗原含量可以類似于肌肉內(nèi)疫苗常規(guī)的劑量(如上所述)。但所述皮膚或皮內(nèi)疫苗為“小劑量”制劑。因此在此“小劑量”疫苗中每劑含有的蛋白抗原量優(yōu)選為0.1-10μg，優(yōu)選每劑含有蛋白抗原0.1-5μg；且每劑含有的多糖(優(yōu)選偶聯(lián)型)抗原的量為0.01-1μg，優(yōu)選0.01-0.5μg。
此處所用的術(shù)語“皮內(nèi)給藥”是指將疫苗給至皮膚的真皮區(qū)域，但疫苗不一定僅存在于真皮內(nèi)。真皮層是距離人體皮膚表面約1.0mm-約2.0mm的皮膚層，但個(gè)體之間和同一個(gè)體的不同部位之間存在差異。一般地，預(yù)計(jì)距離皮膚表面1.5mm的深度達(dá)到真皮層。真皮上面為角質(zhì)層和表皮，下面為皮下層。根據(jù)給藥模式的不同，可以使該疫苗最終僅存在于或主要存在于真皮內(nèi)，或最終分布于表皮和真皮。
本發(fā)明也涉及組合型疫苗，所述疫苗可提供抗御不同病原體的保護(hù)作用。目前，許多兒科疫苗以組合疫苗的形式提供以降低兒童注射的次數(shù)。因此，來源于其他病原體的其他抗原也可以與本發(fā)明的疫苗配制成兒科疫苗。例如，本發(fā)明的疫苗可與以下物質(zhì)一起配制(或同一時(shí)間分別給藥)公知的“三價(jià)”組合疫苗，包含白喉類毒素(DT)，破傷風(fēng)類毒素(TT)，和百日咳成分[通常是脫毒的百日咳類毒素(PT)，絲狀血凝素(FHA)和備選的pertactin(PRN)和/或凝集素1+2]，例如，包含DT，TT，PT，PHA和PRN抗原的市售疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeecham Biologicals)，或百目咳完整細(xì)胞成分，如Smithkline Beecham Biologicals出售的TritanrixTM。所述組合疫苗也可以包含其它抗原，如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原(例如滅活的三價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒-IPV)，粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)外膜蛋白，不能確定型別的(non-typeable)流感嗜血菌的蛋白，腦膜炎奈瑟氏球菌B的外膜蛋白。
可以包含在組合疫苗中的優(yōu)選粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的實(shí)例(尤其對于預(yù)防中耳炎)是OMP106[WO97/417319(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(pmc)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME，et al.(1993)Infect.Immun.612003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO93/03761(得克薩斯大學(xué))]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。可以包含在組合疫苗中的不能確定型別的流感嗜血菌的抗原實(shí)例(尤其用來預(yù)防中耳炎)包括絲束蛋白[(US5766608 Ohio State ResearchFoundation)]和包含來該蛋白的肽的融合體[例如LB1(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(State University of NeW York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；蛋白D(EP594610)；P2；和P5(WO94/26304)。
其它組合是肺炎球菌PS和本發(fā)明蛋白與病毒抗原的組合，所述病毒抗原例如來自流感病毒(減毒型，解體型(split)或其亞單位)[例如，表面糖蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)。參見，例如Chaloupka I.et al.，Eur. JoumalClin.Microbiol.Infect.Dis.1996，15121-127]，RSV(例如F和G抗原或F/G融合體，參見例如，Schmidt A.C.et al，J.Virol，May 2001，p4594-4603)，PIV3(例如，HN和F蛋白，參見Schmidt et al.同上)，水痘病毒(Varicella)(例如減毒型，糖蛋白I-V，等)，和MMR(麻疹病毒，腮腺炎病毒，風(fēng)疹病毒)的任何(或全部)成分。
本發(fā)明用于全球治療或預(yù)防中耳炎的優(yōu)選的兒科組合疫苗包括一種或多種肺炎鏈球菌多糖抗原(優(yōu)選與蛋白D偶聯(lián)的)，一種或多種選自下組的肺炎球菌蛋白PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133(或其免疫功能等效物)，和一種或多種表面暴露的抗原，其來源于粘膜炎莫拉氏菌和/或不能確定型別的流感嗜血菌。蛋白D優(yōu)選用作肺炎球菌多糖的蛋白載體，以克服表位抑制問題(如上所述)，并且該蛋白本身也是免疫原，能產(chǎn)生B細(xì)胞介導(dǎo)的抗御不定型流感嗜血菌(ntHi)的保護(hù)作用。粘膜炎莫拉氏菌或不定型流感嗜血菌抗原可以亞單位的形式包含在疫苗中，或可以是在用細(xì)菌制作的囊泡外膜表面展示的抗原。
優(yōu)選上述抗原組合物(和疫苗)是凍干的，直到使用時(shí)才臨時(shí)用稀釋劑重建。更優(yōu)選它們在3D-MPL的存在下凍干，并在臨用前用鹽水溶液重建。或者，所述蛋白和多糖分別保存在疫苗接種的試劑盒中(任一成分或兩者都被凍干)，臨用前將所述成分重建，并混合或分別給予患者。Th1佐劑(優(yōu)選3D-MPL)可與上述任何一種成分一起存在，或可與上述兩種成分一起存在。
疫苗的凍干是本領(lǐng)域公知的。通常在抗結(jié)塊劑如蔗糖或乳糖等糖類物質(zhì)(最初的濃度為10mg/ml到200mg/ml)的存在下凍干液體疫苗。凍干通常需要一系列步驟，例如需進(jìn)行這樣一個(gè)循環(huán)開始時(shí)的溫度為69℃，3小時(shí)內(nèi)逐漸調(diào)至-24℃，維持6小時(shí)，然后1個(gè)小時(shí)內(nèi)逐漸將溫度調(diào)節(jié)到-16℃，然后維持該溫度6個(gè)小時(shí)，在3小時(shí)內(nèi)將溫度漸漸上調(diào)到+34℃，最后保持該溫度9小時(shí)。
凍干使組合物更加穩(wěn)定(例如它可阻止多糖抗原的降解)。令人驚奇的是，這個(gè)過程還可以提高抗肺炎球菌多糖的抗體滴度。這對PS 6B偶聯(lián)物尤其明顯。因此本發(fā)明的另一方面提供凍干的抗原組合物，其包含以3D-MPL(優(yōu)選不使用以鋁為基礎(chǔ)的佐劑)為佐劑并與其偶聯(lián)的PS 6B偶聯(lián)物，還包含選自下組的肺炎球菌蛋白PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
實(shí)施例以下實(shí)施例用來對本發(fā)明進(jìn)行說明，而非用以限制本發(fā)明。
實(shí)施例1肺炎鏈球菌莢摸多糖11價(jià)的候選疫苗包括莢膜多糖血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F，它們的制備基本上如EP72513中所述。每種多糖都用CDAP化學(xué)法活化和衍生(WO95/08348)，并偶聯(lián)到蛋白載體上。所有的多糖都以它們的天然形式進(jìn)行偶聯(lián)，只有血清型3例外(為降低粘度，需降低其大小)。
蛋白載體所選的蛋白載體是重組蛋白D(PD)，其來自不定型流感嗜血菌，在大腸桿菌中表達(dá)。
蛋白D的表達(dá)流感嗜血菌蛋白D用于蛋白D表達(dá)的基因構(gòu)建起始物質(zhì)編碼蛋白D的DNA蛋白D在流感嗜血菌的所有血清型和不定型菌株中是高度保守的。包含編碼整個(gè)蛋白D基因的DNA序列的載體pHIC348從Dr.A.Forsgren，Department of Medical Mecrobiology，University of Lund，Malmo GeneralHospital，Malmo，Sweden獲得。蛋白D的DNA序列已由Janson等(1991)Infect.Immun.59119-125公布。
表達(dá)載體pMG1表達(dá)載體pMG1由pBR322衍生而來(Gross et al.，1985)，其中插入了噬菌體λ來源的轉(zhuǎn)錄和翻譯外來插入基因的調(diào)控序列(Shatzman et al.，1983)。另外，氨芐青霉素抗性基因被更換為卡那霉素抗性基因。
大腸桿菌菌株AR58大腸桿菌菌株AR58通過用P1噬菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99而制備，所述噬菌體原種以前培養(yǎng)在SA500衍生物(galE∷TN10，λKil-cI857ΔH1)。N99和SA500是大腸桿菌K12菌株，來源于國立健康研究所(the National Institute ofHealth)的Dr.Martin Rosenberg實(shí)驗(yàn)室。
表達(dá)載體pMG1為制備蛋白D，將編碼該蛋白的DNA克隆到表達(dá)載體pMG1中。該質(zhì)粒利用來自λ噬菌體DNA的信號(hào)驅(qū)動(dòng)插入的外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。所述載體包含啟動(dòng)子PL，操縱子OL和兩個(gè)利用位點(diǎn)(Nutl和NutR)以解除有N蛋白時(shí)的轉(zhuǎn)錄極性效應(yīng)(Gross et al.，1985)。將包含PL啟動(dòng)子的載體導(dǎo)入到大腸桿菌溶原性宿主中，以穩(wěn)定質(zhì)粒DNA。溶原性宿主菌株包含已整合到基因組中的復(fù)制缺陷型λ噬菌體DNA(Shatzman et al.，1983)。染色體上的λ噬菌體DNA指導(dǎo)cI抑制物蛋白的合成，該蛋白結(jié)合所述載體的OL抑制物，阻止RNA聚合酶與PL啟動(dòng)子的結(jié)合，從而阻止插入基因的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)菌株AR58的cI基因包含溫度敏感性突變體，這樣PL指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可通過溫度的變化得到控制，即提高培養(yǎng)溫度可滅活抑制物，啟動(dòng)外來蛋白的合成。這種表達(dá)系統(tǒng)能夠在控制下合成外源蛋白，尤其是那些對細(xì)胞可能有毒性的蛋白(Shimataka和Rosenberg，1981)。
大腸桿菌菌株AR58AR58溶原性大腸桿菌菌株用于制備蛋白D載體，其是標(biāo)準(zhǔn)NIH大腸桿菌K12菌株N99的衍生物(F-su-galK2，lacZ-thr-)。它包含缺陷的溶原性λ噬菌體(galE∷TN10，λKil-cI857ΔH1)。其中Kil-表型阻止宿主大分子合成的關(guān)閉。cI857突變對cI抑制物賦予溫度敏感性損傷。ΔH1缺失除去了λ噬菌體右側(cè)的操縱子和宿主的bio，uvr3，和chlA基因座。AR58菌株是用P1噬菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99而制備的。所述原種以前培養(yǎng)在SA500衍生物(galE∷TN10，λKil-cI857ΔH1)上。N99中缺陷型溶原體的導(dǎo)入用四環(huán)素來篩選，是根據(jù)在鄰近的galE基因中編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子的存在而進(jìn)行的。
載體pMGMDPPrD的構(gòu)建包含編碼流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白S1的基因的pMGI載體(pMGNSI)被用來構(gòu)建pMGMDPPrD。蛋白D基因用PCR從pHIC348載體擴(kuò)增(Janson et al.，1991)，所用的PCR引物在5’和3’末端分別包含NcoI和XbaI限制性位點(diǎn)。然后將NcoI/XbaI片段導(dǎo)入到pMGNS1中NcoI和XbaI之間，從而產(chǎn)生包含NS1蛋白的N末端81個(gè)氨基酸，其后是PD蛋白的融合蛋白。該載體稱作pMGNSIPrD。
在上述構(gòu)建體的基礎(chǔ)上構(gòu)建用于蛋白D表達(dá)的最終的構(gòu)建體。從pMGNSIPrD除去BamHI/BamHI片段。這種DNA水解除去了NS1編碼區(qū)，而留下最開始的三個(gè)N末端殘基。通過再次連接載體，產(chǎn)生編碼融合蛋白的基因，所述蛋白具有以下的N末端氨基酸序列......MDP SSHSSNMANT.........
NS1 蛋白D蛋白D不包含前導(dǎo)肽或和通常連接有脂質(zhì)鏈的N末端半胱氨酸。所以，該蛋白既不能分泌到周質(zhì)，又不能脂質(zhì)化，只能以可溶形式存在于細(xì)胞漿中。
將最后的構(gòu)建體pMG-MDPPrD通過37℃熱休克導(dǎo)入到AR58宿主菌株中。包含質(zhì)粒的細(xì)菌在有卡那霉素的條件下篩選。用選定的內(nèi)切核酸酶對分離出的質(zhì)粒DNA進(jìn)行消化來證明編碼蛋白D的DNA插入子的存在。該重組大腸桿菌菌株稱作ECD4。
蛋白D的表達(dá)受λPL啟動(dòng)子/OL操縱子的控制。宿主菌株AR58在基因組中包含溫度敏感性cI基因，它可通過結(jié)合OL來阻止在低溫下從λPL啟動(dòng)表達(dá)。一旦溫度升高，cI從OL釋放，蛋白D表達(dá)。發(fā)酵后將細(xì)胞濃縮并凍存。
從收獲的細(xì)胞中提取和純化蛋白D，操作如下進(jìn)行融化冰凍的培養(yǎng)細(xì)胞，將其重懸在細(xì)胞破碎液中(檸檬酸鹽緩沖液pH6.0)，至OD650＝60。在p＝1000巴的條件下，使該懸液兩次通過高壓勻漿器。離心澄清上述細(xì)胞培養(yǎng)物的勻漿物，過濾除去細(xì)胞碎片。在第一個(gè)純化步驟中，將過濾后的裂解物上樣至陽離子交換層析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD通過離子間相互作用結(jié)合到凝膠基質(zhì)上，通過逐步增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度將其洗脫下來。
在第二步純化中，雜質(zhì)仍保留在陰離子交換基質(zhì)(Q Sepharose Fast Flow)上。PD不結(jié)合凝膠，因而能在流出液中將其收集。
在上述兩個(gè)柱層析步驟中，可用OD值監(jiān)測所收集的級(jí)分。包含純化的蛋白D的陰離子交換柱層析流出液，通過超濾濃縮。
最后使包含超濾滯留物的蛋白D過0.2μm的膜。
化字反應(yīng)活化和偶聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)活化和偶聯(lián)的條件對每一多糖是特異性的。這些條件在表1中列出。將天然多糖(除了PS3)溶解在NaCl2M或用于注射的水中。評(píng)估所有血清型的最佳多糖濃度。
將100mg/ml CDAP的乙腈儲(chǔ)存液(CDAP/PS的比例是0.75mg/mg PS)加入多糖溶液中。1.5分鐘后，加入0.2M三乙基胺，以獲得特定的活化pH值。在25℃2分鐘內(nèi)，在該pH條件下活化多糖。向被活化的多糖中加入蛋白D(它的量根據(jù)最初的PS/PD的比值決定)，在該pH偶聯(lián)1小時(shí)。然后用甘氨酸在25℃30分鐘且4℃過夜淬滅該反應(yīng)。
用0.2M NaCl平衡過的Sephacryl 500HR凝膠過濾柱通過凝膠過濾純化上述所得偶聯(lián)物。
確定洗脫級(jí)分中的糖和蛋白含量。收集偶聯(lián)物并用0.22μm的無菌膜過濾除菌。確定偶聯(lián)物制品中的PS/蛋白比例。
鑒定對每一偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定，它們都符合表2所列的所有條件。用Resorcinol檢測法檢測多糖的含量(μg/ml)，用Lowry檢測法檢測蛋白的含量(μg/ml)。用濃度比值確定最終的PS/PD的比值(w/w)。
DMAP的殘余量(ng/μgPS)用CDSP活化多糖會(huì)在多糖中引入氰酸根基團(tuán)，釋放出DMAP(4-二甲基氨基吡啶)。用SB開發(fā)的特異性檢測法檢測DMAP的殘余量。
游離多糖的含量(％)將一直在4℃保存或在37℃儲(chǔ)存了7天的偶聯(lián)物與α-PD抗體和飽和硫酸銨溫育后進(jìn)行離心，得到上清液，確定該上清液中的游離多糖的含量。
用α-PS/α-PS ELISA對上清液中的游離多糖定量。偶聯(lián)物的缺乏也通過α-PD/α-PS ELISA控制。降低游離多糖的量可改進(jìn)偶聯(lián)疫苗。
抗原性用夾心ELISA分析同一偶聯(lián)物的抗原性，其中抗體的捕獲和檢測分別用α-PS和α-PD進(jìn)行。
游離蛋白含量(％)“游離的”蛋白D的殘余水平在用SDS處理樣品后檢測。在0.1％的SDS存在的情況下，在100℃將偶聯(lián)物加熱10分鐘，再注射到SEC-HPLC凝膠過濾柱(TSK3000-PWXL)上。因?yàn)榈鞍譊是二聚體，所以用SDS解離該蛋白的結(jié)構(gòu)有可能會(huì)過高估計(jì)“游離的”蛋白D的水平。
分子大小(Kav)在SEC-HPLC凝膠過濾柱(TSK5000-PWXL)上確定分子的大小。
穩(wěn)定性在HPLC-SEC凝膠過濾柱(TSK6000-PWXL)上檢測一直4℃保存或在37℃儲(chǔ)存了7天的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。
對11價(jià)的鑒定列于表2中。
蛋白偶聯(lián)物可被吸附到磷酸鋁上，并被收集，形成最終的疫苗。
結(jié)論制備出免疫原性偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物顯示可作為具有發(fā)展前景的疫苗的成分。針對11價(jià)的每一價(jià)都找到了最優(yōu)質(zhì)量的最終偶聯(lián)型肺炎球菌多糖產(chǎn)物的最佳CDAP條件。
表1PS肺炎鏈球菌-蛋白D偶聯(lián)物的特定活化/偶聯(lián)/淬滅條件
表211價(jià)肺炎球菌PS-PD疫苗的詳細(xì)說明(第一排批號(hào)代碼表示血清型)
實(shí)施例2添加一種或多種本發(fā)明的肺炎球菌蛋白+/-3D-MPL對PD偶聯(lián)型11價(jià)多糖疫苗抗御小鼠中肺炎球菌肺定居的保護(hù)效力的有利影響免疫指標(biāo)肺炎球菌蛋白特異性血清IgG的ELISA定量將2μg/ml蛋白的PBS液以100μl/孔37℃包被Maxisorp Nunc免疫反應(yīng)板2小時(shí)。用NaCl 0.9％Tween-20 0.05％緩沖液洗板3次。然后將抗蛋白血清參照物(用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)(從670ng/ml IgG開始)和血清樣品(從1/10稀釋液開始)的連續(xù)2倍稀釋液(在PBS/Tween20 0.05％中，每孔100μl)在攪拌下20℃溫育30分鐘。如前述洗板，之后加入PBS/Tween20 0.05％中5000x稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)型山羊抗小鼠IgG(Jackson)(100μl/孔)攪拌下20℃溫育30分鐘。洗板后，加入100μl/孔的顯影緩沖液(revelation buffer)(100mMpH4.5的檸檬酸鹽緩沖液中含OPDA 0.4mg/ml和H2O20.05％)，室溫溫育這些免疫反應(yīng)板15分鐘。加入50μl/孔HCl 1N終止顯影。用Emax immunoreader(Molecular Devices)在490nm和620nm讀取光密度。用SoftMaxPro軟件通過4參數(shù)數(shù)學(xué)計(jì)算法計(jì)算抗體滴度。
調(diào)理吞噬試驗(yàn)該試驗(yàn)的目的是可重現(xiàn)性地檢測待檢血清樣品針對肺炎鏈球菌血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F或23F的調(diào)理能力，所用檢測方法是基于已公開的CDC標(biāo)準(zhǔn)方法(Steiner et al，Clinical and DiagnosticLaboratory Immunology 4415.1997)而修改的。
該試驗(yàn)在體外再現(xiàn)體內(nèi)所發(fā)生的清除入侵的肺炎鏈球菌或肺炎球菌的主要機(jī)制。那就是對肺炎球菌進(jìn)行調(diào)理，然后進(jìn)行吞噬和殺傷?！巴淌伞笔羌?xì)胞吞入物質(zhì)，并將其包裹在細(xì)胞質(zhì)中的囊泡(吞噬體)中的過程。當(dāng)肺炎球菌被健康的哺乳動(dòng)物吞噬細(xì)胞吞噬后便被殺死。“調(diào)理”是通過調(diào)理素如抗體和補(bǔ)體在抗原上沉積而促進(jìn)吞噬的過程。
文獻(xiàn)已報(bào)道過許多調(diào)理吞噬試驗(yàn)。CDC標(biāo)準(zhǔn)檢測法已在多種實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了檢驗(yàn)(Steiner et al，ICAAC，Sept 16-20，2000，Toronto)。這后一種試驗(yàn)在SB得到修改，因?yàn)樗峁┝丝膳c其它實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較的基礎(chǔ)，它使用通?？色@得的試劑和對照，并且其結(jié)果表示為能促進(jìn)殺死50％活肺炎球菌的血清滴度(稀釋度)，這種單位是這類檢測常用的。事實(shí)上，修改后的試驗(yàn)得到的結(jié)果能與其它4個(gè)實(shí)驗(yàn)室極好地吻合(Steiner et al，ICAAC，Sept 16-20，2000，Toronto)。
在上述試驗(yàn)中所用的吞噬細(xì)胞是HL60細(xì)胞系，其來源于有早幼粒細(xì)胞白血病的個(gè)體，由Collins等于1977年建立為連續(xù)傳代的細(xì)胞系(Nature270347-9)。該細(xì)胞系由未分化的造血細(xì)胞組成，即85％的干細(xì)胞和早幼粒細(xì)胞，6％的中幼粒細(xì)胞和9％的已分化的細(xì)胞。極性化合物能誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化成至少二種不同譜系。N，N二甲基甲酰胺誘導(dǎo)粒細(xì)胞分化，產(chǎn)生多形核-樣細(xì)胞(polymorphonuclear-like cells)(44％的中幼粒細(xì)胞和晚幼粒細(xì)胞和53％的帶狀和節(jié)片狀的PMN)。
在本試驗(yàn)的A2版本中，待檢血清經(jīng)過熱滅活，并在96孔微量滴定板中，用包含0.3％BSA的HBSS培養(yǎng)基從1/4開始進(jìn)行8次的連續(xù)2倍稀釋。稀釋后的血清的最終體積為每孔25μl。
4個(gè)體積的HL60細(xì)胞(107細(xì)胞/ml)(用二甲基甲酰胺分化后5或6天)，2個(gè)體積的肺炎鏈球菌(適當(dāng)稀釋的)和1個(gè)體積的幼兔補(bǔ)體在臨用前混合，將25μl的該混合液加入到包含稀釋血清的96孔微量滴定板的每個(gè)孔中。對血清型1和6B，補(bǔ)體的量增加到12.5％的最終濃度，進(jìn)行A3版本的試驗(yàn)。
在環(huán)形搖動(dòng)下37℃溫育2小時(shí)后，將反應(yīng)板放到冰上，以終止調(diào)理吞噬反應(yīng)。
在37℃過夜溫育，評(píng)估每孔中的集落形成單位(CFU)。“調(diào)理滴度”(OT)確定為能使孔中肺炎鏈球菌數(shù)量減少至少50％(即50％殺傷)的血清稀釋度的倒數(shù)。％殺傷通過下面的等式計(jì)算殺傷％＝(CFU對照孔均值-CFU樣品)/CFU對照孔的均值×100在OF1小鼠中肺炎球菌的鼻內(nèi)攻擊用5.105CFU的適合小鼠的肺炎鏈球菌血清型2，4或6B在麻醉下鼻內(nèi)接種7周齡的OF1雌性小鼠。在攻擊后6小時(shí)摘出小鼠的肺臟，在ToddHewith Broth(THB，Gico)培養(yǎng)基中勻漿(Ultramax，24000rpm，4℃)。用連續(xù)10倍稀釋的肺勻漿物鋪板在含補(bǔ)充了酵母提取物的THB瓊脂的Petri盤上，37℃過夜。肺炎球菌的肺感染表示為CFU數(shù)/小鼠，它是對數(shù)權(quán)重的均值(logarithmic weighted-average)。檢測極限是2.14 logCFU/小鼠。
實(shí)施例2A 3D-MPL佐劑針對抗蛋白免疫應(yīng)答的作用在本實(shí)施例中，我們評(píng)估了3D-MPL佐劑對于針對本發(fā)明蛋白的免疫應(yīng)答的影響。
用1μg包含在AAlPO4 100μg；或BAlPO4 100μg+5μg 3D-MPL(3脫氧?；瘑瘟字Ｖ|(zhì)A，由Ribi Immunochem提供)中的蛋白在第0天，14天和21天肌肉內(nèi)免疫6周齡的雌性Balb/c小鼠，每組10只。在post-III血清中用ELISA檢測IgG。
無論是哪一種抗原，用補(bǔ)充有3D-MPL的制劑免疫動(dòng)物都顯示出可誘導(dǎo)最好的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例2B添加本發(fā)明蛋白+/-3D-MPL佐劑對PD偶聯(lián)型11價(jià)多糖疫苗抗御血清型2、4或6B鼻內(nèi)攻擊過的OF1小鼠中肺炎球菌的肺定居的有利影響。
在本實(shí)施例中，同傳統(tǒng)的AlPO4吸附型11價(jià)多糖-蛋白D偶聯(lián)物制品相比較，我們能評(píng)估包含11價(jià)多糖-蛋白D偶聯(lián)物，本發(fā)明蛋白和AlPO4+3D-MPL佐劑的疫苗的預(yù)防效力。
用包含A50μg AlPO4；B0.1μg PS/血清型的PD偶聯(lián)型11價(jià)多糖疫苗+50μg AlPO4；或C0.1μgPS/血清型的PD偶聯(lián)型11價(jià)多糖疫苗+10μg本發(fā)明蛋白+50μg AlPO4+5μg 3D-MPL(由Ribi Immunochem提供)的制劑，在第0天和14天對4周齡的雌性O(shè)F1小鼠皮下免疫，每組12只小鼠，在第21天如上所述進(jìn)行攻擊。
用該方法可發(fā)現(xiàn)，用補(bǔ)充有本發(fā)明蛋白和AlPO4+MPL佐劑的11價(jià)多糖偶聯(lián)物疫苗可得到明顯的保護(hù)作用。相反，用11價(jià)多糖偶聯(lián)物/AlPO4制劑免疫動(dòng)物沒有觀察到明顯的保護(hù)作用。該結(jié)果證明添加本發(fā)明蛋白和3D-MPL佐劑可提高11價(jià)多糖偶聯(lián)物疫苗抗御肺炎的效果。
實(shí)施例2C，免疫與實(shí)施例2B中顯示的保護(hù)作用相關(guān)為確立免疫與實(shí)施例2B中用補(bǔ)充有本發(fā)明蛋白和3D-MPL的11價(jià)多糖偶聯(lián)物疫苗產(chǎn)生的保護(hù)作用相關(guān)，如上所述檢測對多糖2，4或6B和本發(fā)明蛋白的攻擊前血清抗體應(yīng)答。
然后比較抗體滴度與攻擊后6小時(shí)收集的相應(yīng)動(dòng)物的肺臟中檢測到的細(xì)菌集落數(shù)。根據(jù)log/log線性回歸計(jì)算R2。
計(jì)算出的R2顯示體液免疫應(yīng)答與針對兩種抗原的保護(hù)作用之間不存在相關(guān)關(guān)系?？?B(或2或4)抗體滴度在用11價(jià)偶聯(lián)物免疫或用補(bǔ)充有本發(fā)明蛋白和3D-MPL的相同疫苗免疫的組之間沒有明顯差異。所以說，用制劑C所觀察到的保護(hù)作用的改善不僅僅歸因于對多糖6B(或2或4)的較高抗體應(yīng)答。
綜上所述，上述結(jié)果提示所述保護(hù)作用不僅僅是由體液免疫應(yīng)答介導(dǎo)，還有由蛋白抗原所誘導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(優(yōu)選在3D-MPL的存在下)。該結(jié)果為以下做法提供了額外的支持為協(xié)調(diào)免疫系統(tǒng)的兩種免疫以獲得最佳保護(hù)，可向肺炎球菌多糖偶聯(lián)物疫苗中加入蛋白抗原和強(qiáng)效佐劑。
實(shí)施例3-用本發(fā)明蛋白主動(dòng)免疫并用抗肺炎球菌PS的抗體被動(dòng)免疫的小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)的兩種免疫之間的協(xié)調(diào)作用實(shí)施例3A-找出被動(dòng)給予抗-6B-多糖(抗-PS)抗體能抗御肺炎的濃度方法疫苗組4組小鼠，每組16只，在第-1天用100μl未經(jīng)稀釋的大鼠抗多糖抗血清如下進(jìn)行被動(dòng)免疫(i.p.)(共64只小鼠)
動(dòng)物64只雄性CD-1小鼠，來自Charles River，Canada，重約35g(約10周齡)。
麻醉用異氟醚(isoflurane)(3％)加O2(1L/分鐘)麻醉小鼠。
生物肺炎鏈球菌N1387(血清型6)收獲自補(bǔ)充有5％馬血的胰胨豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)物，并懸浮在6ml PBS中。即將進(jìn)行感染時(shí)，將1ml細(xì)菌懸液稀釋在9ml冷卻融化的營養(yǎng)培養(yǎng)基(BBL)中，并維持在41℃。給予小鼠50μl容積中的約6.0 log 10cfu/小鼠。
感染在如上所述麻醉小鼠的當(dāng)天，用非手術(shù)的氣管內(nèi)插管經(jīng)氣管內(nèi)灌輸肺炎鏈球菌N1387(50μl冷卻的細(xì)菌懸液)。該方法由Woodnut和Berry描述(Antimicrob.Ag.Chemotherap.4329(1999))。
樣品感染后的第三天，用過量的CO2處死8只小鼠/組，切下肺臟并在1ml PBS中進(jìn)行勻漿。然后用PBS進(jìn)行連續(xù)的10倍稀釋以產(chǎn)生多個(gè)不同的活細(xì)菌數(shù)。在進(jìn)行評(píng)估前，將樣品一式三份注入(20μl)到補(bǔ)充有5％馬血的TSA培養(yǎng)板上，37℃溫育過夜。其它組小鼠在第7天處死，如上所述制作樣品。
結(jié)果
圓括號(hào)中的數(shù)字表示在制作樣品之前已死的動(dòng)物數(shù)。
結(jié)論總的來說，分離自任何治療組的細(xì)菌數(shù)沒有明顯的區(qū)別。這提示抗多糖抗體在濃度高達(dá)5μg/ml(包括5μg/ml)時(shí)沒有可檢測到的保護(hù)作用。
該結(jié)果與某些人類臨床試驗(yàn)中觀察的結(jié)果類似，即抗多糖抗體不足以預(yù)防某些人群中的肺炎球菌性肺炎。
實(shí)施例3B-確定用或沒用佐劑的情況下主動(dòng)給藥本發(fā)明的蛋白針對肺炎所引起的預(yù)防作用，和與亞最適量抗PS抗體的協(xié)同作用。
方法動(dòng)物128只雄性CD-1小鼠(在6周齡時(shí)免疫，感染時(shí)10周齡)，來自Charles River，St.Constant，Quebec，Canada。6周齡時(shí)動(dòng)物重約20克，10周齡時(shí)38克。
免疫6組，每組16只小鼠用100μl疫苗在第-22天和-14天如下進(jìn)行皮下注射免疫(共128只小鼠)。3D-MPL得自Ribi/Corixa。
在第-1天，用4.26μg/ml(4ml的5μg/ml+1.3ml的2μg/ml)的小鼠抗多糖抗體對特定組(見下表)進(jìn)行被動(dòng)免疫(i.p.100μl)。
感染當(dāng)天對小鼠進(jìn)行麻醉(3％的異氟醚加1L/分鐘O2)。肺炎鏈球菌N1387(血清型6)收獲自補(bǔ)充有5％馬血的胰胨豆胨瓊脂(TSA)培養(yǎng)物，并懸浮在6ml PBS中，得到細(xì)菌接種物。即將進(jìn)行感染時(shí)，在冷卻融化的營養(yǎng)瓊脂中(維持在41℃)制備10倍稀釋液(1m加9ml)。用氣管內(nèi)插管經(jīng)氣管內(nèi)灌輸法感染小鼠，并給予小鼠50μl容積中的約6.0 log 10cfu/小鼠。該方法由Woodnut和Berry描述(Antimicrob.Ag.Chemotherap.4329(1999))。
樣品感染后72小時(shí)，用過量的CO2處死8只小鼠/組，切下肺臟并在1ml PBS中進(jìn)行勻漿。然后用PBS進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋以產(chǎn)生多個(gè)不同的活細(xì)菌數(shù)。在進(jìn)行評(píng)估前，將樣品一式三份接種(20μl)到補(bǔ)充有5％馬血的TSA培養(yǎng)板上，37℃溫育過夜。其它組小鼠在感染后第8天處死，如上所述制作樣品。
數(shù)據(jù)的分析以感染后3天和7天肺臟中的細(xì)菌數(shù)量來比較治療的結(jié)果。所述結(jié)果表示為組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中P值小于0.05認(rèn)為是有顯著性。
如上所述，僅僅使用抗多糖抗體(1-5組)不能針對肺炎球菌在肺臟中的生長提供保護(hù)作用。肺炎球菌蛋白加佐劑AlPO4(1-1組)也不能引起保護(hù)作用，但所述蛋白與3D-MPL組合(1-2組)的情況要好一些。
抗多糖抗體加蛋白組可觀察到最明顯的保護(hù)作用，尤其在有所有三種成分，即蛋白，3D-MPL以及被動(dòng)給藥的抗多糖抗體的組(1-4組)。該結(jié)論也得到死亡率的支持。1-3組，特別是1-4組與其它組相比死亡率低。
結(jié)論正如用被動(dòng)免疫動(dòng)物所作的試驗(yàn)所示，另外用蛋白(+/-MPL)主動(dòng)免疫的協(xié)同效應(yīng)不是由于抗多糖抗原的抗體的水平增加。
在用蛋白加被動(dòng)給予抗多糖抗體進(jìn)行免疫的組，尤其當(dāng)3D-MPL也存在時(shí)，可觀察到對肺炎球菌肺炎有明顯的保護(hù)作用，這提示上述組合的協(xié)同作用。
如果抗多糖免疫是主動(dòng)免疫(優(yōu)選用偶聯(lián)的多糖)，上述作用將更明顯，因?yàn)锽細(xì)胞有記憶效應(yīng)，抗PS抗體在整個(gè)試驗(yàn)過程中的水平保持不變，都導(dǎo)致免疫應(yīng)答的協(xié)作。
實(shí)施例4-通過與保護(hù)作用的相關(guān)性確定協(xié)同作用人體用來清除感染的肺炎球菌的主要保護(hù)機(jī)制是抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用(Bruyn et al.Clin.Infect.Dis.14251(1992))。目前已建立了數(shù)種ELISA方法，以檢測莢膜多糖抗體的濃度，作為保護(hù)作用的相關(guān)指標(biāo)，很明顯，體外調(diào)理吞噬試驗(yàn)是更好的保護(hù)作用相關(guān)指示(Musher et al.J.Infect.Dis.182158(2000))。
本發(fā)明肺炎球菌蛋白可提供針對肺炎球菌感染的保護(hù)作用，其機(jī)制不同于抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用。在實(shí)施例2中，偶聯(lián)物和蛋白共同進(jìn)行主動(dòng)免疫能產(chǎn)生協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用不能用抗體濃度的差異來解釋，因?yàn)樵谒婕暗膬山M試驗(yàn)中，抗體的濃度相同。因此，能觀察到的另一部分保護(hù)作用一定來自協(xié)同效應(yīng)。同樣，因抗體是被動(dòng)加入的，故在實(shí)施例3中也獲得了同樣的結(jié)論。
在許多情況下，本發(fā)明的肺炎球菌蛋白是表面結(jié)合蛋白，預(yù)計(jì)它們本身即可提供一些調(diào)理活性。在這種情況下，通過定量檢測抗肺炎球菌蛋白的調(diào)理活性來區(qū)別保護(hù)機(jī)制是可能的，所述檢測可用來評(píng)估調(diào)理活性對保護(hù)作用的其它協(xié)同機(jī)制所起相對作用。
在小鼠肺定居模型中，每種疫苗的相對保護(hù)可用對肺臟中細(xì)菌的清除來評(píng)估?；蛘?，用通常對疫苗評(píng)估所用的，以病例率(case rates)來評(píng)估疫苗的效力。
％保護(hù)＝(CPU/對照肺臟-CPU/疫苗肺臟)/(CPU/肺臟對照)％效力＝(對照病例-疫苗病例)/(對照病例)
為確定來源于協(xié)同效應(yīng)的保護(hù)或效力所占的部分，關(guān)鍵是確定哪一部分效力是基于調(diào)理滴度的比率而產(chǎn)生的。
在實(shí)施例3中，通過組合產(chǎn)生的％保護(hù)是由于蛋白/抗體成分之間的協(xié)同而產(chǎn)生的，因?yàn)樗龅鞍谆蛩隹苟嗵强贵w單獨(dú)都不能提供更多的保護(hù)。
在相對調(diào)理活性的基礎(chǔ)上評(píng)估協(xié)同效應(yīng)的保護(hù)程度是可能的。如抗莢膜多糖抗體所賦予的調(diào)理活性是X，抗肺炎球菌蛋白抗體所賦予的活性是Y，則總調(diào)理活性可表示為X+Y，蛋白的調(diào)理活性的相對比例可表示為Y/X+Y。將其與疫苗的相對保護(hù)效力相比較，其中疫苗的抗多糖部分提供的保護(hù)效力是A％，多糖加蛋白的疫苗的保護(hù)效力是B％。那些并非由調(diào)理活性所致的額外效力即可計(jì)為剩余保護(hù)活性(協(xié)同作用)＝B％-A％-B％*(Y/X+Y)。
該實(shí)施例無意于限制評(píng)估協(xié)同作用的方式。一旦發(fā)現(xiàn)保護(hù)作用的其它相關(guān)指標(biāo)，便可用這些相關(guān)指標(biāo)來評(píng)估協(xié)同作用。
正如對每篇文獻(xiàn)分別引入作參考的說明一樣，本發(fā)明引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申請都納入本文作參考。
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含至少一種肺炎鏈球菌多糖抗原和至少一種選自下組的肺炎鏈球菌蛋白抗原PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133，或其免疫功能等效物。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述多糖抗原以多糖-蛋白載體偶聯(lián)物的形式存在。
3.權(quán)利要求2的免疫原性組合物，其中所述載體蛋白選自下組白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，CRM197，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，結(jié)核菌素的蛋白衍生物(PPD)和流感嗜血桿菌蛋白D。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述疫苗包含至少4種來源于不同血清型的肺炎球菌多糖抗原。
5.本發(fā)明權(quán)利要求的免疫原性組合物，還包含佐劑。
6.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含鋁鹽。
7.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TH1應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)劑。
8.權(quán)利要求7的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含至少一種選自下組的物質(zhì)3D-MPL，皂苷免疫刺激物，或免疫刺激性CpG寡核苷酸。
9.權(quán)利要求8的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含選自下組的載體水包油乳劑，脂質(zhì)體和鋁鹽。
10.本文權(quán)利要求的免疫原性組合物，其用作藥物。
11.包含權(quán)利要求1-9的免疫原性組合物的疫苗。
12.一種預(yù)防或緩解55歲以上患者的肺炎鏈球菌感染的方法，其包含給藥有效量的疫苗，所述疫苗包含肺炎鏈球菌多糖和至少一種選自下組的肺炎鏈球菌蛋白，還任選包含TH1誘導(dǎo)佐劑PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
13.與肺炎鏈球菌蛋白抗原組合并可選與TH1誘導(dǎo)型佐劑組合的肺炎球菌多糖抗原的用途，用于制備預(yù)防或治療55歲以上患者的肺炎的藥物，所述肺炎鏈球菌蛋白抗原選自PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
14.與肺炎鏈球菌蛋白抗原組合并可選與TH1誘導(dǎo)型佐劑組合的肺炎球菌多糖抗原的用途，用于制備預(yù)防或治療嬰幼兒的中耳炎的藥物，所述肺炎鏈球菌蛋白抗原選自PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
15.一種制備本發(fā)明權(quán)利要求的免疫原性組合物的方法，該方法包含選擇一種或多種肺炎球菌多糖抗原；選擇一種或多種選自下組的肺炎球菌蛋白抗原PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133；和將上述多糖，蛋白抗原和適當(dāng)?shù)馁x形劑混合。
16.一種預(yù)防或緩解嬰幼兒中耳炎的方法，其包含向所述嬰幼兒給藥安全并有效的量的疫苗，所述疫苗包含肺炎鏈球菌多糖抗原和選自下組的肺炎鏈球菌蛋白抗原，并任選包含TH1佐劑PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌多糖抗原疫苗領(lǐng)域。具體是，本發(fā)明涉及包含肺炎球菌多糖抗原并任選包含Th1誘導(dǎo)型佐劑的疫苗，所述多糖抗原主要是肺炎鏈球菌的肺炎球菌多糖偶聯(lián)物抗原，其選自PhtA，PhtD，PhtB，PhtE，SpsA，LytB，LytC，LytA，Sp125，Sp101，Sp128，Sp130和Sp133。
文檔編號(hào)A61K39/09GK1477970SQ01815748
公開日2004年2月25日 申請日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月15日
發(fā)明者克雷格·A·J·拉弗里爾, 簡·普爾曼, 克雷格 A J 拉弗里爾, 爾曼 申請人:史密斯克萊·比奇曼生物公司, 史密斯克萊 比奇曼生物公司