專利名稱：甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白的受體的調(diào)節(jié)劑的制作方法
本申請要求2001年2月6日申請的美國臨時申請第60/266,673號、2000年6月28日申請的美國臨時申請第60/60/214,860號和2000年4月27日申請的美國臨時申請第60/200,053號的權(quán)益，所述申請通過引用結(jié)合到本文。
背景技術(shù)：
甲狀旁腺激素(PTH)和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)分別在鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和發(fā)育中起重要的生理學(xué)作用。由于鈣在細(xì)胞代謝中的重要作用，血液中的鈣濃度受嚴(yán)格調(diào)節(jié)。PTH是一種對血清鈣水平降低作出反應(yīng)而從甲狀旁腺分泌的內(nèi)分泌激素。PTH直接起作用，以增加骨吸收和刺激腎的鈣重吸收，因而增加或保存循環(huán)鈣的貯藏。PTH也通過刺激維生素D在腎中的羥基化，間接增加腸中鈣的吸收。
原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)都是與循環(huán)甲狀旁腺激素水平過高相關(guān)的病癥。PTH水平過高，通過上述途徑可以引起高鈣血和骨質(zhì)稀少。骨吸收抑制劑例如二膦酸(bisphosphonates)和OPG可以有效地保護(hù)骨，并且可以抑制血鈣過多對骨骼的影響。然而，目前可利用的療法不能解決甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)對腎和腸的鈣血效應(yīng)的問題。
PTHrP由許多細(xì)胞類型產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育方面起重要作用。出生后，PTHrP的作用不太明確。PTHrP的循環(huán)水平在正常的健康成體中基本上檢測不到。然而，各種各樣胚胎來源的許多腫瘤產(chǎn)生并分泌足以引起血鈣過高的量的PTHrP。事實(shí)上，惡性腫瘤的體液高鈣(HHM)是最為常見的副腫瘤綜合征，是造成顯著的患者病死率的原因。
目前，HHM通過鹽水水合然后用骨吸收抑制劑例如二膦酸治療。這種治療方案通常需要3-4天，以達(dá)到血清鈣的顯著降低，并且其效應(yīng)的持續(xù)時間相對短(不足一個月)。對于循環(huán)PTHrP水平高的患者，當(dāng)前治療選擇的效應(yīng)更加沒有多大作用。常規(guī)療法的重復(fù)給予常常使效力進(jìn)行性地降低。當(dāng)前療法的這些限制顯著強(qiáng)烈地表明，醫(yī)學(xué)上仍需要快速有效且長效的HHM療法。
當(dāng)前HHM療法益處有限的一個主要原因是不能直接抑制已被充分確定為HHM的主要病理生理因子的PTHrP。骨吸收抑制劑例如二膦酸僅抑制骨吸收，而PTHrP對腎和腸也具有顯著的鈣血效應(yīng)。完全中和PTHrP會是治療HHM的理想的輔佐療法。
PTH和PTHrP都與PTH-1受體相互作用，這是造成其大多數(shù)已知效應(yīng)的原因。Mannstadt等(1999)，Am.J.Physiol.277.5Pt2.F665-75(1999)。僅PTH與新發(fā)現(xiàn)的PTH-2受體相互作用。出處同上。然而，PTHrP可以通過將兩個殘基變?yōu)镻TH中那些位置上的殘基，而變?yōu)镻TH-2受體激動劑。Gardella等(1996)，J.Bil.Chem.271(33)19888-93。
PTH的N末端片段已經(jīng)用作治療藥。間斷給予天然的PTH-(1-84)顯示出成骨特性，數(shù)十年來一直認(rèn)為這些特性可以用C末端截短的片段PTH-(1-34)完全實(shí)現(xiàn)。這兩種肽以相似的親和性結(jié)合且激活PTH-1受體，引起腺苷酸環(huán)化酶(AC)以及磷脂酶C(PLC)的活化。通過PTH-1受體的AC活化產(chǎn)生cAMP，而通過PTH-1受體的PLC活化產(chǎn)生PKC和胞內(nèi)鈣暫留(transients)。PTH-(1-34)可以最大激活A(yù)C和PLC途徑。已經(jīng)證明，PTH-(1-34)的合成作用需要短間斷(每日)的暴露Dobnig(1998)，Endocrinol.1384607-12。在絕經(jīng)后婦女的人體試驗(yàn)中，表明每日皮下注射低劑量的PTH-(1-34)導(dǎo)致令人印象深刻的脊柱和股骨頸中骨生成，顯著降低脊椎骨折的發(fā)生率。這些臨床數(shù)據(jù)揭示，PTH是所測試的骨質(zhì)疏松的最有效的藥物之一。
截短的PTH片段的AC/cAMP活化減弱，其合成代謝活性同樣減弱。Rixon等(1994)，J.Bone Min.Res.91179-89；Hilliker等(1996)，Bone19469-477；Lane等(1996)，J.Bone Min.Res.11614-25。這類截短的PTH片段的這種活性減弱(Rixon等(1994)；Hilliker等(1996)；Lane等(1996))，即使它們保留對PKC的全部激動作用。Rixon等，(1994)。這些觀測結(jié)果導(dǎo)致提出AC/cAMP途徑對于PTH的骨合成代謝特性是重要的，而PLC/PKC途徑在這一方面卻不是必要的。Rixon等，(1994)；Wbitfield等(1996)，Calcified Tissue International5381-7。
一種相反但不是相互排斥的理論提出，PLC的活化(除激活A(yù)C外)也可能是合成代謝PTH片段的一個重要的特性。Takasu(1998)，Endocrinol.1394293-9。表面上缺乏某些合成代謝的C末端截短PTH肽對PLC活化，可能是測定方法不靈敏以及受體結(jié)合較低的人為現(xiàn)象。Takasu(1998)。從PTH-(1-34)的C末端漸進(jìn)截短，導(dǎo)致對PTH1R的結(jié)合親和性逐步降低。Takasu(1998)。通過PTH-1受體的PKC活化看來對結(jié)合親和性以及對受體密度非常敏感(Guo等(1995)，Endocrinol1363884-91)，而cAMP活化對這些變量卻不大敏感。因此，與hPTH-(1-34)相比，hPTH-(1-31)對PTH-1受體的親和性略微降低(1-6倍)，而hPTH-(1-30)的親和性顯著降低(10-100倍)。Takasu(1998)。也許由于這種降低的PTH-1受體親和性，PTH-(1-30)是通過大鼠PTH-1受體激活PLC的弱且不完全的激動劑。
與PTH-(1-34)相比，PTH-(1-31)的合成潛能(Rixon等(1994)；Whitfield等(1996)，Calcified Tissue International5381-7；Whitfield等(1996)，Calcified Tissue International65143-7)、對PTH1R的結(jié)合親和性以及cAMP誘導(dǎo)(Takasu(1998))相似或略微降低。PTH-(1-31)的PLC激活也略微降低。Takasu(1998)。在健康人體中，輸注PTH-(1-31)和PTH-(1-34)對血漿和尿cAMP濃度有相似的刺激效應(yīng)，但與PTH-(1-34)不同，PTH-(1-31)不能升高血清鈣、血漿1，25(OH)2D3或尿N-TX水平。Fraher等(1999)，J.Clin.Endocrin.Met.842739-43。這些數(shù)據(jù)提示，PTH-(1-31)誘導(dǎo)骨吸收和刺激維生素D合成的能力減弱，這對于骨合成代謝藥是合適的分布型(profile)。
PTH-(1-30)最初表明缺乏合成特性。Whitfield等(1996)，CalcifiedTissue International5381-7。然而，最近已經(jīng)證明，PTH-(1-30)當(dāng)以非常高劑量(400-2,000μg/kg，而PTH-(1-34)為80μg/kg)給予時是一種合成代謝藥。根據(jù)其對PTH-1受體的結(jié)合親和性較低、對cAMP的活化減弱和/或其對PKC的活化大大減弱，可以預(yù)測PTH-(1-30)的功效較低。Takasu(1998)。有待確定PTH-(1-30)的表觀骨吸收活性是否相似或甚至更為理想地降低。
PTH-(1-28)是所報道的完全激活cAMP的最小片段。Neugebauer等(1995)，Biochem.348835-42。然而，最初報道hPTH-(1-28)在OVX大鼠中沒有成骨效應(yīng)。Miller等(1997)，J.Bone Min.Res.12S320(Abstact(摘要))。最近，表明非常高劑量的PTH-(1-28)(1,000μg/kg天)在OVC大鼠中具有合成代謝活性，而200μg/kg/天無效。Whitfield等(2000)，J.Bone Min.Res.15964-70。某些截短的PTH片段的合成作用減弱或缺乏已經(jīng)歸因于在體內(nèi)被快速清除。Rixon等(1994)。
重組和經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)是剛出現(xiàn)的一類治療藥。蛋白治療藥的有用修飾包括與抗體的“Fc”區(qū)結(jié)合以及與諸如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖之類的聚合物連接。這類修飾在美國順序號為09/428,082、PCT申請?zhí)枮閃O99/25044的題為“Modified Peptides as Therapeutic Agents，”的專利申請有詳細(xì)的討論，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文。
研制治療藥的一種相當(dāng)不同的方法是肽文庫篩選。蛋白配體與其受體的相互作用通常發(fā)生在相對大的界面上。然而，正如人生長激素及其受體所表現(xiàn)的，在界面上僅少數(shù)關(guān)鍵殘基影響大部分結(jié)合能。Clackson等(1995)，Science267383-6。大多數(shù)蛋白配體僅以適當(dāng)?shù)耐負(fù)浣Y(jié)構(gòu)展示結(jié)合表位，或者用于與結(jié)合無關(guān)的功能。因此，僅“肽”長度(2-40個氨基酸)的分子可以與特定大蛋白配體的受體蛋白結(jié)合。這類肽可以模擬所述大蛋白配體的生物活性(“肽激動劑”)，或者通過競爭性結(jié)合，抑制所述大蛋白配體的生物活性(“肽拮抗劑”)。
噬菌體展示肽文庫作為鑒定這類肽激動劑和拮抗劑的有效方法出現(xiàn)。參見例如Scott等(1990)，Science249386；Devlin等(1990)，Science249404；1993年6月29日授予的美國專利第5,223,409號；1998年3月31號授予的美國專利第5,733,731號；1996年3月12日授予的美國專利第5,498,530號；1995年7月11日授予的美國專利第5,432,018號；1994年8月16日授予的美國專利第5,338,665號；1999年7月13日授予的美國專利第5,922,545號；1996年12月19日公布的WO96/40987；以及1998年4月16日公布的WO98/15833(每篇文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文)。在這類文庫中，隨機(jī)肽序列通過與絲狀噬菌體的外殼蛋白融合而被展示出來。通常，將已展示的肽從受體的抗體固定化胞外域中親和洗脫下來。通過連續(xù)多輪的親和純化和重新繁殖，可以富集所保留的噬菌體?？梢詫ψ罴呀Y(jié)合肽進(jìn)行測序，以鑒定一個或多個結(jié)構(gòu)相關(guān)肽家族內(nèi)的關(guān)鍵殘基。參見例如Cwirla等(1997)，Science2761696-9，其中鑒定出兩個不同的家族。所述肽序列也提示哪些殘基可以通過丙氨酸掃描或通過誘變在DNA水平上被安全取代?？梢詷?gòu)建誘變文庫，并對其進(jìn)行篩選以進(jìn)一步優(yōu)化所述最佳結(jié)合物的序列。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24。
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)分析也可以用來提示模擬大蛋白配體結(jié)合活性的肽。在這種分析中，晶體結(jié)構(gòu)可以提示大蛋白配體中關(guān)鍵殘基的身份和相對取向，據(jù)此可以設(shè)計肽。參見例如Takasaki等(1997)，Nature Biotech.151266-70。這些分析方法也可以用來研究受體蛋白和通過噬菌體展示選擇的肽之間的相互作用，這可以提示可提高結(jié)合親和性的肽的進(jìn)一步修飾。
其它方法在肽的研究方面與噬菌體展示競爭?？梢詫㈦奈膸炫clac阻抑蛋白的羧基末端融合，并在大腸桿菌中表達(dá)。另一種基于大腸桿菌的方法允許通過與肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)融合而展示在細(xì)胞外膜上。此后，這些方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“大腸桿菌展示”。在另一種方法中，在核糖體釋放之前停止隨機(jī)RNA的翻譯，產(chǎn)生仍連接有其相關(guān)RNA的多肽的文庫。此后，這種方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“核糖體展示”。其它方法利用與RNA結(jié)合的肽；例如PROfusion technology，Phylos，Inc。參見例如Roberts和Szostak(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-303。此后，這種方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“RNA-肽篩選”。已經(jīng)開發(fā)了化學(xué)衍生肽文庫，其中肽被固定化在穩(wěn)定的非生物材料上，例如在聚乙烯棒或溶劑可滲透的樹脂上。另一種化學(xué)衍生肽文庫利用光刻法掃描固定在載玻片上的肽。此后，這種方法和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“化學(xué)-肽篩選”?；瘜W(xué)-肽篩選的優(yōu)勢可能在于，它允許應(yīng)用D-氨基酸和其它非天然類似物以及非肽成分。生物法和化學(xué)法都在Wells和Lowman(1992)，Curr.Opin.Biotechnol.3355-62中有綜述。在概念上，人們可以利用噬菌體展示、RNA-肽篩選以及其它上述方法發(fā)現(xiàn)任何蛋白質(zhì)的肽模擬物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)PTH和PTHrP活性的治療藥。按照本發(fā)明，PTH和PTHrP的調(diào)節(jié)劑包含a)一個PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，最好是PTH和/或PTHrP的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，或是通過噬菌體展示、RNA-肽篩選或其它上述技術(shù)由其衍生的序列；和b)一個載體，例如聚合物(例如PEG或葡聚糖)或優(yōu)選Fc區(qū)；其中所述載體與所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的羧基末端共價連接。優(yōu)選的載體是Fc區(qū)，優(yōu)選的Fc區(qū)是IgG Fc區(qū)。優(yōu)選PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含下文描述的PTH和PTHrP衍生氨基酸序列。其它PTH/PTrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可以通過噬菌體展示、RNA-肽篩選和本文所述的其它技術(shù)構(gòu)建。這類肽通常是PTH和PTHrP兩者的拮抗劑，雖然這類技術(shù)可以用來構(gòu)建用作選擇性抑制劑(例如PTH的抑制劑，而非PTHrP的抑制劑)的肽序列。
按照本發(fā)明的再一方面是制備PTH和PTHrP調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)選擇至少一種與PTH-1或PTH-2受體結(jié)合的肽；和b)將所述肽與載體共價連接。優(yōu)選的載體是Fc區(qū)。步驟(a)最好通過從下文的表1和表2中的肽序列中選擇、或者用噬菌體展示、RNA-肽篩選或本文所述的其它技術(shù)來進(jìn)行。
本發(fā)明的化合物可以用標(biāo)準(zhǔn)合成法、重組DNA技術(shù)或制備肽和融合蛋白的任何其它方法來制備。包括非肽部分的本發(fā)明的化合物除適用時用標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)反應(yīng)合成外，還可以通過標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)來合成。
本發(fā)明化合物的設(shè)想的主要用途是作為治療藥或預(yù)防藥。所述載體連接的肽可以具有與所述肽所模擬的天然配體相當(dāng)或甚至更高的活性。
本發(fā)明的化合物可以通過用合適的藥用載體材料配制，并且給予患者例如有其需要的人類(或其它哺乳動物)有效量的所述化合物，用于治療目的或預(yù)防目的。其它相關(guān)方面也包括在本發(fā)明中。
在本發(fā)明中特別感興趣的是包含PTH C末端序列縮短的PTH/PTHRP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域例如PTH-(1-28)或(1-34)的分子。現(xiàn)有技術(shù)沒有介紹采用持續(xù)給予這類C末端截短的PTH片段的合成代謝研究。雖然現(xiàn)有技術(shù)沒有提示這一點(diǎn)，但包含較小片段的分子例如PTH-(1-30)-Fc可以獨(dú)自合成代謝。盡管它們對PLC的激動作用弱(參見發(fā)明背景部分)，但hPTH-(1-30)在刺激cAMP方面幾乎與hPTH-(1-34)一樣有效。雖然不希望受理論的限制，但本發(fā)明人注意到，PTH片段的合成代謝特性可能選擇性地與其cAMP激活相關(guān)，而非與PLC激活相關(guān)，使得受體親和性降低的PTH片段將具有有利的合成代謝分布型。與Fraher等(1999)已經(jīng)在人體中證明的連續(xù)暴露于PTH-(1-34)或PTH-(1-84)相比，有可能連續(xù)暴露于截短的PTH片段對骨有不同的更為有利的效應(yīng)。
考慮附圖和發(fā)明詳述，本發(fā)明的許多其它方面和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
附圖簡述

圖1顯示示例性的Fc二聚體，所述Fc二聚體可以來源于IgG1抗體。圖中的“Fc”代表本文“Fc區(qū)”含義中的任何Fc變異體?！癤1”和“X2”代表下文定義的肽或接頭-肽組合。具體的二聚體如下A單二硫鍵結(jié)合的二聚體。IgG1抗體通常在恒定區(qū)和可變區(qū)之間的鉸鏈區(qū)有兩個二硫鍵。圖1A中的Fc區(qū)可以通過在所述兩個二硫鍵位點(diǎn)之間截短、或者通過用非反應(yīng)性殘基(例如丙氨酰)取代半胱氨酰殘基來形成。在圖1A中，F(xiàn)c區(qū)連接于所述肽的C末端。
B雙二硫鍵結(jié)合的二聚體。這種Fc區(qū)可以通過截短母體抗體以保留F區(qū)鏈中的兩個半胱氨酰殘基、或者通過從包含編碼這種Fc區(qū)的序列的構(gòu)建體表達(dá)來形成。在圖1B中，F(xiàn)c區(qū)連接于所述肽的C末端。
C非共價二聚體。這種Fc區(qū)可以通過或者截短或者取代消除所述半胱氨酰殘基而形成。人們可能希望消除所述半胱氨酰殘基，以避免由于所述半胱氨酰殘基與宿主細(xì)胞中存在的其它蛋白的半胱氨酰殘基之間反應(yīng)而生成雜質(zhì)。所述Fc區(qū)的非共價結(jié)合足以使所述二聚體保持在一起。其它二聚體可以通過利用得自不同類型抗體(例如IgG2，IgM)的Fc區(qū)來形成。
圖2顯示了本發(fā)明其它化合物的結(jié)構(gòu)。圖2A顯示了一種單鏈分子，也可以代表所述分子的DNA構(gòu)建體。圖2B顯示了一種二聚體，其中所述接頭-肽部分僅存在于所述二聚體的一條鏈中。圖2C顯示了一種在兩條鏈上都具有肽部分的二聚體。圖2C的二聚體在編碼圖3所示單鏈的DNA構(gòu)建體表達(dá)時，在某些宿主細(xì)胞中自發(fā)形成。在其它宿主細(xì)胞中，可以將細(xì)胞置于適合于形成二聚體的條件下，或者可以在體外形成所述二聚體。
圖3顯示了可以用于本發(fā)明的示例性的人IgG1 Fc核酸序列和氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
圖4顯示正常小鼠對PTH-(1-34)和對PTH-(1-34)-Fc的鈣血反應(yīng)。小鼠用溶媒(PBS，-X-)或PTH-(1-34)(空心符號)或PTH-(1-34)-Fc(實(shí)心符號)攻擊。劑量為156nmo/kg(圓形)、469nmol/kg(三角形)或1,560nmol/kg(方形)。數(shù)據(jù)代表組的平均值，n＝6只小鼠/組。
圖5表明，[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc抑制正常小鼠對PTHrP的鈣血反應(yīng)。給正常雄性小鼠皮下注射溶媒(PBS，圓形)、或0.5mg/kg人PTHrP-(1-34)(方形)。然后立即給PTHrP攻擊的小鼠皮下注射10mg/kg(三角形)或30mg/kg(菱形)[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc。數(shù)據(jù)代表組的平均值，n＝6只小鼠/組。
圖6顯示[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc對PTH-(1-34)-Fc誘發(fā)的慢性高鈣血的效應(yīng)。正常雄性小鼠通過皮下注射PTH-(1-34)-Fc(30mg/kg)(空心圓形)或溶媒(PBS，空心方形)進(jìn)行攻擊。某些PTH-(1-34)-Fc攻擊的小鼠在攻擊時用10(實(shí)心三角形)、30(實(shí)心圓形)或100mg/kg(實(shí)心方形)的[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc治療一次。所有劑量的[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc都引起對PTH-(1-34)-Fc介導(dǎo)的高鈣血的顯著抑制。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，n＝5只小鼠/組。
圖7顯示ROS 17/2.8大鼠成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中的cAMP積累。培養(yǎng)物用磷酸二酯酶抑制劑IBMX處理，然后用各種PTH片段攻擊15分鐘。通過ELISA測定cAMP。
圖8顯示單一療法對臨床化學(xué)的影響。每日在一次皮下注射所示化合物后獲取外周血達(dá)3天。圖8A顯示總血清鈣；圖8B，堿性磷酸酶(AP)，一種成骨細(xì)胞活性標(biāo)記；圖8C，酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)，一種破骨細(xì)胞活性標(biāo)記；和圖8D，AP∶TRAP比值，一種相對成骨細(xì)胞破骨細(xì)胞活性的指標(biāo)。
圖9顯示PTH構(gòu)建體對骨鹽密度的影響。在第0天、第5天和第10天注射PTH構(gòu)建體后，在第15天對小鼠近端脛骨干骺端進(jìn)行外周定量計算機(jī)體層攝影(pQCT)。
圖10顯示每周兩次PTH-(1-34)-Fc相對于每日PTH-(1-34)對脛骨小梁和皮質(zhì)骨鹽密度(BMD)的影響。每日給予80μg/kg/天(20nmol/kg/天)PTH[PTH-(1-34)]。
圖11顯示每周兩次治療對年老卵巢切除(OVX)大鼠BMD和血清鈣的影響。OVX后11個月，大鼠每周兩次用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，溶媒)或APD(0.5mg/kg)或PTH-(1-34)-Fc(50nmol/kg)治療。每周進(jìn)行DEXA。第二次每周注射后24小時取血，此時PTH-Fc的鈣血效應(yīng)通常最大。
圖12顯示給OVX獼猴一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc的效應(yīng)。給猴子注射1-30μg/kg(n＝1/組)或100-1000μg/kg(n＝2/組)劑量的PTH-(1-34)-Fc。分析血清中的總鈣。虛線表示高鈣血閾值，該閾值基于在兩個或多個連續(xù)時間點(diǎn)高于正常平均值三個標(biāo)準(zhǔn)偏差的鈣升高。
發(fā)明詳述術(shù)語的定義在本說明書中使用的術(shù)語如下定義，除非在具體情況下另有限定。
術(shù)語“包含”是指化合物可以在給定序列的N末端或C末端或這兩端包含額外的氨基酸。當(dāng)然，這些額外的氨基酸應(yīng)該不會顯著干擾所述化合物的活性。
術(shù)語“酸性殘基”是指其側(cè)鏈包含酸性基團(tuán)的D型或L型氨基酸殘基。示例性的酸性殘基包括D和E。
術(shù)語“芳族殘基”是指其側(cè)鏈包含芳族基團(tuán)的D型或L型氨基酸殘基。示例性的芳族殘基包括F、Y和W。
術(shù)語“堿性殘基”是指其側(cè)鏈包含堿性基團(tuán)的D型或L型氨基酸殘基。示例性的堿性殘基包括H、K和R。
術(shù)語“親水性殘基”和“Haa”是指其側(cè)鏈包含至少一個親水性官能團(tuán)或極性基團(tuán)的D型或L型氨基酸殘基。示例性的親水性殘基包括C、D、E、H、K、N、Q、R、S和I。
術(shù)語“親脂性殘基”和“Laa”是指其側(cè)鏈包含不帶電脂族或芳族基團(tuán)的D型或L型氨基酸殘基。示例性的親脂性側(cè)鏈包括F、I、L、M、V、W和Y。丙氨酸(A)是兩親性的-它能夠用作親水性或親脂性殘基。因此，丙氨酸既包括在“親脂性殘基”的定義中，也包括在“親水性殘基”的定義中。
術(shù)語“非官能性殘基”是指其側(cè)鏈缺乏酸性、堿性或芳族基團(tuán)的D型或L型氨基酸殘基。示例性的非官能性氨基酸殘基包括M、G、A、V、I、L和異亮氨酸(Nle)。
術(shù)語“載體”是指防止治療蛋白降解和/或增加其半壽期、降低其毒性、降低其免疫原性或提高其生物活性的分子。示例性的載體包括Fc區(qū)(這是優(yōu)選的)以及線性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚賴氨酸、葡聚糖等)；支鏈聚合物(參見例如1981年9月15日授予Denkenwalter等的美國專利第4,289,872號；1993年7月20日授予Tam的5,229,490；1993年10月28日公布的Frechet等的WO 93/21259)；脂質(zhì)；膽固醇基團(tuán)(例如類固醇)；糖類或寡糖(例如葡聚糖)；人血清白蛋白(HSA)和相關(guān)分子；甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transtheratin)(TTR)和相關(guān)分子；或與補(bǔ)救受體結(jié)合的任何天然或合成蛋白質(zhì)、多肽或肽。載體在下文中有進(jìn)一步的描述。
術(shù)語“天然Fc”是指包含通過消化全抗體產(chǎn)生的非抗原結(jié)合片段序列的分子或序列，無論是單體形式還是多聚體形式。天然Fc的原始免疫球蛋白來源最好來源于人類，可以是任何免疫球蛋白，雖然優(yōu)選IgG1和IgG2。天然Fc由單體多肽構(gòu)成，可以通過共價連接(即二硫鍵)和非共價連接將其連接為二聚體或多聚體形式。天然Fc分子單體亞單位之間的分子間二硫鍵數(shù)目范圍1-4，取決于類別(例如IgG，IgA，IgE)或亞類(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgAl，IgGA2)。天然Fc的一個實(shí)例是通過木瓜蛋白酶消化IgG產(chǎn)生的二硫鍵連接的二聚體(參見Ellison等(1982)，Nucleic Acids Res.104071-9)。本文所用的術(shù)語“天然Fc”一般為單體、二聚體和多聚體形式。
術(shù)語“Fc變異體”是指由天然Fc經(jīng)修飾、但仍包含所述補(bǔ)救受體FcRn的結(jié)合部位的分子或序列。國際申請WO97/34631(1997年9月25日公布)和WO96/32478描述了示例性的Fc變異體以及與補(bǔ)救受體的相互作用，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。因此，術(shù)語“Fc變異體”包括由非人類天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被除去的位點(diǎn)，因?yàn)檫@些位點(diǎn)提供的結(jié)構(gòu)特征或生物活性并非本發(fā)明融合分子所需的。因此，術(shù)語“Fc變異體”包括缺乏影響或涉及以下特性的一個或多個天然Fc位點(diǎn)或殘基的分子或序列(1)二硫鍵形成，(2)與所選宿主細(xì)胞不匹配，(3)在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)時的N末端異質(zhì)性，(4)糖基化，(5)與補(bǔ)體相互作用，(6)與非補(bǔ)救受體的Fc受體結(jié)合，或(7)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。Fv變異體在下文中有進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
術(shù)語“Fc區(qū)”包括以上限定的天然Fc和Fc變異體分子和序列。對于Fc變異體和天然Fc，術(shù)語“Fc區(qū)”包括單體或多聚體形式的分子，無論它是通過全抗體消化而來還是用其它方法生產(chǎn)的。
用于Fc區(qū)或包含F(xiàn)c區(qū)的分子的術(shù)語“多聚體”是指具有共價、非共價或共價和非共價相互作用兩者結(jié)合的兩條或更多條多肽鏈的分子。IgG分子通常形成二聚體；IgM，五聚體；IgD，二聚體；以及IgA，單體、二聚體、三聚體或四聚體。通過利用Fc的天然Ig源的序列以及所得活性，或通過將這種天然Fc衍生化(如上限定的)，可以形成多聚體。
用于Fc區(qū)包含F(xiàn)c區(qū)的分子的術(shù)語“二聚體”是指具有共價或非共價結(jié)合的兩條多肽鏈的分子。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)的示例性二聚體示于圖1和圖2。
術(shù)語“衍生化”和“衍生的”或“衍生化的”分別包括方法和所得的化合物，其中(1)所述化合物具有一個環(huán)部分；例如所述化合物內(nèi)半胱氨酰殘基之間的交聯(lián)；(2)所述化合物是交聯(lián)的或者具有一個交聯(lián)位點(diǎn)；例如，所述化合物具有一個半胱氨酰殘基，并且因此在培養(yǎng)中或在體內(nèi)形成交聯(lián)二聚體；(3)一個或多個肽鍵被非肽鍵取代；(4)N末端被-NRR1、NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、NHC(O)NHR、琥珀酰亞胺基、或者取代或未取代的芐酯基-NH-取代，其中R和R1以及所述環(huán)取代基如下文定義；(5)C末端被-C(O)R2或-NR3R4取代，其中R2、R3和R4如下文定義；和(6)其中各個氨基酸部分通過用能夠與所選側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的試劑處理而修飾的化合物。衍生物在下文有進(jìn)一步的描述。
術(shù)語“肽”是指具有1-85個氨基酸的分子，優(yōu)選具有5-34個氨基酸的分子。示例性的肽可以包含天然存在的分子的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域或者包含隨機(jī)化序列。
用于指肽序列的術(shù)語“隨機(jī)化”是指完全隨機(jī)的序列(例如通過噬菌體展示法或RNA-肽篩選選擇的)和其中天然存在的分子的一個或多個殘基被在所述天然存在分子中的該位置中不存在的氨基酸殘基所取代的序列。用于鑒定肽序列的示例性方法包括噬菌體展示、大腸桿菌展示、核糖體展示、RNA-肽篩選、化學(xué)篩選等等。
術(shù)語“PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域”是指與PTH-1受體和/或PTH-2受體結(jié)合、并且包含天然存在的序列或隨機(jī)化序列的任何氨基酸序列。示例性的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可以如表1和表2中所列文獻(xiàn)中描述的方法鑒定或衍生化，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
術(shù)語“PTH激動劑”是指與PTH-1或PTH-2受體結(jié)合并且如全長天然人甲狀旁腺激素一樣提高或降低一種或多種PTH活性測定參數(shù)的分子。一種示例性的PTH活性測定公開于實(shí)施例1中。
術(shù)語“PTH拮抗劑”是指與PTH-1或PTH-2受體結(jié)合并且阻斷或阻止全長天然人甲狀旁腺激素對那些參數(shù)的正常影響的分子。一種示例性的PTH活性測定公開于實(shí)施例2中。
術(shù)語“骨吸收抑制劑”是指通過WO97/23614的實(shí)施例4和實(shí)施例11的測定確定的這類分子；所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。示例性的骨吸收抑制劑包括OPG和OPG-L抗體，所述抗體分別在WO97/23614和WO98/46751中有描述，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
另外，本發(fā)明化合物的生理上可接受的鹽也包括在此中。所謂“生理上可接受的鹽”是指已知或者以后被發(fā)現(xiàn)為藥學(xué)上可接受的任何鹽。某些具體實(shí)例是乙酸鹽；三氟乙酸鹽；氫鹵酸鹽，例如鹽酸鹽和氫溴酸鹽；硫酸鹽；檸檬酸鹽；酒石酸鹽；乙醇酸鹽；和草酸鹽。
化合物的結(jié)構(gòu)一般概述.PTH和PTHrP受體結(jié)合氨基酸序列描述于表1和表2中。關(guān)于PTH和PTHrP的其它信息可在Mannstadt等(1999)，Am.J.Physiol.277.5Pt 2F66575；和Gardella(1996)，J.Biol.Chem.271(33)19888-93中找到。這些文獻(xiàn)中的每篇通過引用全部結(jié)合到本文中。
根據(jù)上述序列，本發(fā)明人鑒定了由PTH和PTHrP衍生的特別優(yōu)選的序列。這些序列可以通過將一個或多個氨基酸改變而保留或甚至改進(jìn)所述肽的結(jié)合親和性的上述技術(shù)來隨機(jī)化。
在按照本發(fā)明制備的主題組合物中，可以將所述肽通過所述肽的C末端與載體連接。因此，本發(fā)明的載體-肽分子可以用以下式I描述IP1-(L1)a-F1及其多聚體，其中F1是載體(優(yōu)選Fc區(qū))并且連接于P1-(L1)a的C末端；P1是PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域序列；L1是接頭；且a是0或1。
肽.任何數(shù)目的肽都可以與本發(fā)明結(jié)合使用。肽可以包含天然存在的蛋白質(zhì)序列的一部分，可以是由所述天然存在的蛋白質(zhì)序列衍生的隨機(jī)化序列，或者可以是全隨機(jī)化序列。噬菌體展示和RNA-肽篩選尤其可用于產(chǎn)生可供用于本發(fā)明的肽。
特別感興趣的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域序列是式II的序列IIXNX8HX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC(SEQ ID NO3)其中XN不存在或?yàn)閄3X4X5X6X7、X2X3X4X5X6X7、X1X2X3X4X5X6X7，或YX1X2X3X4X5X6X7；X1為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性、親水性或芳族殘基；優(yōu)選A、S或Y)；X2為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選V)；X3為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性殘基，最優(yōu)選S)；X4為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性殘基，最優(yōu)選E)；X5為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或堿性殘基，最優(yōu)選H或I)；X6為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性或親水性殘基，最優(yōu)選Q或E)；X7為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或芳族殘基，最優(yōu)選L或F)；X8為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選M或Nle)；X10為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性或親水性殘基，最優(yōu)選N或D)；X11為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或堿性殘基，最優(yōu)選L、R或K)；X12為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或芳族殘基，最優(yōu)選G、F或W)；X14為一個氨基酸殘基(優(yōu)選堿性或親水性殘基，最優(yōu)選H或S)；X15為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選L或I)；X16為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或親水性殘基，最優(yōu)選Q、N、S或A)；X17為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性、親水性或非官能性殘基，最優(yōu)選S、D或L)；
X18為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選M、L、V或Nle)；X19為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性或堿性殘基，最優(yōu)選E或R)；X21為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基或堿性殘基；最優(yōu)選V、M、R或Nle)；X22為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性、酸性或芳族殘基，最優(yōu)選E或F)；X23為一個芳族或親脂性殘基(優(yōu)選W或F)；X24為一個親脂性殘基(優(yōu)選L)；X25為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或堿性殘基，最優(yōu)選R或H)；X26為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或堿性殘基，最優(yōu)選K或H)；X27為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親脂性、堿性或非官能性殘基，最優(yōu)選K或L)；X28為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親脂性或非官能性殘基，最優(yōu)選L或I)；XC不存在或?yàn)閄29、X29X30、X29X30X31、X29X30X31X32、X29X30X31X32X33、X29X30X31X32X33X34、X29X30X31X32X33X34X35或X29X30X31X32X33X34X35X36；X29為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或非官能性殘基，最優(yōu)選Q或A)；X30為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或酸性殘基，最優(yōu)選D或E)；X31為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親脂性或非官能性殘基，最優(yōu)選V或I)；X32為一個氨基酸殘基(優(yōu)選堿性殘基，最優(yōu)選H)；X33為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性殘基，最優(yōu)選N或T)；X34為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或芳族殘基，最優(yōu)選A、F或Y)；X35為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性殘基，最優(yōu)選E)；且
X36為一個氨基酸殘基(優(yōu)選芳族殘基，最優(yōu)選Y)。
一種優(yōu)選的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域序列分子式為IIIJNJ7J8HNLJ12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJc(SEQ ID NO4)其中JN不存在或選自J1J2J3J4J5J6、J2J3J4J5J6、J3J4J5J6；J1為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性、親水性或芳族殘基；最優(yōu)選A、S或Y)；J2為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選V)；J3為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性殘基，最優(yōu)選S)；J4為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性殘基，最優(yōu)選E)；J5為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選I)；J6為一個氨基酸殘基(優(yōu)選堿性殘基，優(yōu)選Q)；J7為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或芳族殘基，最優(yōu)選L或F)；J8為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選M或Nle)；J12為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或芳族殘基，最優(yōu)選G或W)；J16為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性或親水性殘基，最優(yōu)選N、S或A)；J18為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選M、Nle、L或V)；J19為一個酸性或堿性殘基(優(yōu)選E或R)；J21為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選V、M或Nle)；Jc不存在或?yàn)镴29、J29J30、J29J30J31、J29J30J31J32、J29J30J31J32J33或J29J30J31J32J33J34；J29為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或非官能性殘基，最優(yōu)選Q或A)；
J30為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或酸性殘基，最優(yōu)選D或E)；J31為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親脂性或非官能性殘基，最優(yōu)選V或I)；J32為一個氨基酸殘基(優(yōu)選堿性殘基，最優(yōu)選H)；J33為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性殘基，最優(yōu)選N)；J34為一個氨基酸殘基(優(yōu)選芳族殘基，最優(yōu)選F或Y)。
從SEQ ID NO4的式中，最優(yōu)選以下表1中出現(xiàn)的肽。
另一種優(yōu)選的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域序列為IVONLHO10O11O12KSIO15O16LRRRFO23LHHLIOC(SEQ ID NO5)其中ON不存在或?yàn)閅O1O2O3O4O5O6O7、O1O2O3O4O5O6O7、O2O3O4O5O6O7、O3O4O5O6O7、O4O5O6O7、O5O6O7、O6O7或O7；O1為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選A)；O2為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選V)；O3為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性殘基，最優(yōu)選S)；O4為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性殘基，最優(yōu)選E)；O5為一個氨基酸殘基(優(yōu)選堿性或非官能性殘基，優(yōu)選H或I)；O6為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性殘基，最優(yōu)選Q)；O7為一個氨基酸殘基(優(yōu)選非官能性殘基，最優(yōu)選L)；O10為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性或親水性殘基，最優(yōu)選N或D)；O11為一個氨基酸殘基(優(yōu)選堿性或非官能性殘基，最優(yōu)選K或L)；O12為一個氨基酸殘基(優(yōu)選芳族或非官能性殘基，最優(yōu)選G、F或W)；O15為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性或非官能性殘基，最優(yōu)選I或S)；
O16為一個氨基酸殘基(優(yōu)選親水性殘基，最優(yōu)選Q或N)；O17為一個氨基酸殘基(優(yōu)選酸性或非官能性殘基，最優(yōu)選D或L)；O23為一個氨基酸殘基(優(yōu)選芳族殘基，最優(yōu)選F或W)；OC不存在或?yàn)镺29，O29O30，O29O30O31，O29O30O31O32，O29O30O31O32O33、O29O30O31O32O33O34，O29O30O31O32O33O34O35或O29O30O31O32O33O34O35O36；且O29-O36分別獨(dú)立地為氨基酸殘基。
根據(jù)SEQ ID NO5的分子式，最優(yōu)選以下表2中出現(xiàn)的肽。
本發(fā)明的示例性肽序列示于以下表1和表2中。這些肽可以如所引用的參考文獻(xiàn)中或美國專利第4,423,037、4,968,669、5,001,22和6,051,686號中所述的方法制備，每篇所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。摻入這些肽序列的本發(fā)明的分子可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。使用單字母氨基酸縮寫。任何這些肽可以與接頭串連(即順序)連接或不與接頭連接。含有半胱氨酰殘基的任何肽可以與另一含Cys肽交聯(lián)，兩者中的一個或兩個可以與載體連接。具有不止一個Cys殘基的任何肽也可以形成肽內(nèi)二硫鍵。任何這些肽可以如下文所述衍生化。
表1-基于PTH的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
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表2-基于PTHrP的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
18Moseley等(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845048；Suva等(1987)，Science237893；Kemp等(1987)，Science2381568；Paspaliaris等(1995)，Bone16141S(abstract 225，Conference，Melbourne 1995).19基于JP 07316195，May25，1994(Nippon Kayaku).20Nagasaki等(1989)，Biochem.Biophys.Res.Commun.1581036；Nutt等；Endocrinology127，491(1990).21Williams等(1998)，J.Reproduction & Fertility11259-67.22Gardella等(1996)，Endocrinol.1373936-41；Fukayama等(1998)，Am.J.Physiol.274E297-E303.23Li等(1996)，Endocrinology.
24摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO26。25摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO28。26摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO29。27摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO30。28摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO26。29摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO5。
30基于得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NOS8，931摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1032摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1133摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1234摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1235摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1436摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1537摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1638摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO17和1839摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO1940摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO2041摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO2142摻入得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO2243由得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO23修飾而來
44由得自美國專利第6,051,686號的SEQ ID NO24修飾而來
另一種有用的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域具有稱為TIP39的肽序列SLALADDAAFRERARLLAALERRHWLNSYMHKLLVLDAP(SEQ ID NO160)TIP39描述于Usdin等(1999)，Nature Neurosci.2(11)941-3；Usdin等(1996)，Endocrinology137(10)4285-97；Usdin等(1995)，J.Biol.Chem.270(26)15455-8；Usdin等(1999)，Enddocrinol.140(7)3363-71。
其它有用的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域序列可以通過SEQ ID NO3、4、5、TIP39的氨基酸序列或表1和表2中所列序列的保守和/或非保守修飾而產(chǎn)生。
保守修飾將產(chǎn)生其功能特性和化學(xué)特性與由其進(jìn)行這類修飾的PTH或PTHrP肽相似的肽。相反，通過選擇在對保持以下特性的影響顯著不同的氨基酸序列中的取代(a)取代區(qū)中分子骨架的結(jié)構(gòu)，例如為折疊片或螺旋的構(gòu)象，(b)所述分子的靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，或(c)所述分子的大小，可以完成所述肽的功能特性和/或化學(xué)特性的顯著修飾。
例如，“保守氨基酸取代”可以涉及用非天然殘基取代一個天然氨基酸殘基，使得對該位置的氨基酸殘基的極性或電荷影響很小或沒有影響。此外，所述多肽中的任何天然殘基也都可以用丙氨酸取代，正如先前關(guān)于“丙氨酸掃描誘變”所述的(參見例如MacLennan等，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等，1998，Adv.Biophys.351-24，所述文獻(xiàn)討論了丙氨酸掃描誘變)。
所需的氨基酸取代(無論是保守的還是非保守的)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在需要這類取代時決定。例如，氨基酸取代可以用來鑒定所述肽序列中的重要?dú)埢?，或提高或降低所述肽或本文所述載體-肽分子的親和性(參見前述分子式)。示例性的氨基酸取代示于表3中。
表3-氨基酸取代
在某些實(shí)施方案中，保守氨基酸取代也包括非天然存在的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基通過化學(xué)肽合成摻入，而非通過在生物系統(tǒng)中合成而摻入。
如以上“術(shù)語的定義”一節(jié)中所述，天然存在的殘基可以根據(jù)可用于序列修飾的共同側(cè)鏈特性分為多個類別。例如，非保守取代可能涉及這些類別之一的一個成員交換為另一類別的一個成員?？梢詫⑦@類取代的殘基引入所述分子中與非人類直向同源物同源的肽區(qū)域中，或者引入所述分子的非同源區(qū)中。另外，人們也可以用P或G進(jìn)行修飾，以影響鏈的取向。
在制備這類修飾時，可以考慮氨基酸的疏水指數(shù)。每種氨基酸根據(jù)其疏水性和電荷特性被賦予一個疏水指數(shù)，這些是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域理解所述氨基酸疏水指數(shù)對于賦予蛋白質(zhì)相互作用生物功能方面的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被取代為具有相似疏水指數(shù)或分值的其它氨基酸，但仍保留相似的生物活性。在基于疏水指數(shù)進(jìn)行改變時，優(yōu)選疏水指數(shù)在±2之內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選疏水指數(shù)在±1之內(nèi)的氨基酸取代，更特別優(yōu)選疏水指數(shù)在±0.5之內(nèi)的氨基酸取代。
在本領(lǐng)域也明白，類似氨基酸的取代可以根據(jù)親水性來有效地進(jìn)行。由其相鄰氨基酸的親水性決定的蛋白質(zhì)的最高局部平均親水性與其免疫原性和抗原性即所述蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性相關(guān)。
以下親水性數(shù)值賦予氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似親水性數(shù)值進(jìn)行改變時，優(yōu)選親水性數(shù)值在±2之內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選親水性數(shù)值在±1之內(nèi)的氨基酸取代，甚至更特別優(yōu)選親水性數(shù)值在±0.5之內(nèi)的氨基酸取代。人們也可以根據(jù)親水性從一級氨基酸序列鑒定表位。這些區(qū)域也稱為“表位核心區(qū)”。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠采用眾所周知的技術(shù)，確定如前述序列中所示多肽的合適變異體。為了鑒定所述分子中可以被改變而不破壞活性的合適區(qū)域，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以靶向據(jù)認(rèn)為對于活性不重要的區(qū)域。例如，當(dāng)已知有得自同一物種或其它物種的活性相似的相似多肽時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將肽的氨基酸序列與相似肽的序列進(jìn)行比較。通過這種比較，人們可以鑒定出在相似多肽中保守的殘基和分子部分。人們會認(rèn)識到，肽中相對于這類相似肽不保守的區(qū)域的改變不大可能負(fù)面影響所述肽的生物活性和/或結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道，即使在相對保守的區(qū)域中，人們也可以用化學(xué)上相似的氨基酸取代天然存在的殘基，而保留其活性(保守的氨基酸殘基取代)。因此，即使對于生物活性或結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域也可以進(jìn)行保守氨基酸取代，而不會破壞所述生物活性，或者不會負(fù)面影響所述肽的結(jié)構(gòu)。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考察鑒定相似肽中對于活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基的結(jié)構(gòu)-功能研究。根據(jù)這種比較，人們可以預(yù)測肽中與相似肽中對于活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸殘基有重要性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇所述肽中這類預(yù)測重要的氨基酸殘基的化學(xué)相似氨基酸取代。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以分析與相似多肽中結(jié)構(gòu)有關(guān)的三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。根據(jù)該信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測一種肽的氨基酸殘基在其三維結(jié)構(gòu)中的排列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不對預(yù)測位于所述蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基的基團(tuán)改變，因?yàn)檫@類殘基可能參與與其它分子的重要相互作用。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以產(chǎn)生在每個所需氨基酸殘基上含單氨基酸取代的試驗(yàn)變異體。然后所述變異體可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的活性測定來篩選。這種數(shù)據(jù)可以用來綜合關(guān)于合適變異體的信息。例如，如果人們發(fā)現(xiàn)對特定氨基酸殘基的改變導(dǎo)致被破壞的、不希望有地被降低的或不合適的活性，則應(yīng)該避免具有這種改變的變異體。換句話說，根據(jù)從這類常規(guī)實(shí)驗(yàn)綜合而來的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定應(yīng)該單獨(dú)或結(jié)合其它突變避免進(jìn)一步取代的氨基酸。
許多科學(xué)出版物致力于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。參見Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem，47251-276以及Chou等，Biophys.J.，26367-384(1979)。此外，目前可利用計算機(jī)程序輔助預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。一種預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的方法是基于同源性建模。例如，序列同一性高于30％、或相似性高于40％的兩種多肽或蛋白質(zhì)常常具有相似的結(jié)構(gòu)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。最近蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)的增長提供了對二級結(jié)構(gòu)可預(yù)測性的加強(qiáng)，包括多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的潛在折疊數(shù)。參見Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)244-247(1999)。已經(jīng)提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)369-376(1997))，在給定多肽或蛋白質(zhì)中折疊數(shù)目有限，并且一旦分辨出關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)數(shù)目，則將顯著達(dá)到精確的結(jié)構(gòu)預(yù)測。
預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的其它方法包括“穿線(threading)”(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)15-9(1996))、“輪廓分析(profile analysis)”(Bowie等，Science，253164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)4355-8(1987))，和“進(jìn)化連鎖(evolutionarylinkage)”(參見Home，見上文，和Brenner，見上文)。
載體.本發(fā)明需要存在至少一種通過C末端或所述氨基酸殘基之一側(cè)鏈與肽連接的載體(F1)。也可以使用多種載體；例如在C末端使用Fc而在側(cè)鏈?zhǔn)褂肞EG基團(tuán)。
Fc區(qū)是優(yōu)選的載體。Fc區(qū)可以融合于所肽的C末端。
如上所述，F(xiàn)c變異體是本發(fā)明范圍內(nèi)的合適載體。天然Fc可以被廣泛修飾，而形成按照本發(fā)明的Fc變異體，條件是保持與所述補(bǔ)救受體的結(jié)合；參見例如WO97/34631和WO96/32478。在這類Fc變異體中，人們可以除去天然Fc中提供本發(fā)明融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或功能活性的一個或多個位點(diǎn)。人們可以通過例如取代或缺失殘基、在該位點(diǎn)中插入殘基或截短含所述位點(diǎn)的部分，除去這些位點(diǎn)。所插入或取代的殘基也可以是經(jīng)改變的氨基酸，例如肽模擬物或D-氨基酸。Fc變異體由于多種原因可能是需要的，下文描述了其中某些原因。示例性的Fc變異體包括這樣的分子和序列，其中1.除去參與二硫鍵形成的位點(diǎn)。這種除去可以避免與用來生產(chǎn)本發(fā)明分子的宿主細(xì)胞中存在的其它含半胱氨酸蛋白質(zhì)反應(yīng)。為此，可以在N末端截短所述含半胱氨酸的區(qū)段，或者可以缺失半胱氨酸殘基或用其它氨基酸(例如丙氨?；蚪z氨酰)取代。特別是，人們可以截短SEQ ID NO2的N末端20個氨基酸的區(qū)段，或缺失或取代SEQ ID NO2中位置7和10的半胱氨酸殘基。即使除去半胱氨酸殘基，所述單鏈Fc區(qū)仍可以形成非共價保持在一起的二聚Fc區(qū)。
2.修飾天然Fc，使其與所選宿主細(xì)胞更為匹配。例如，人們可以除去典型天然Fc N末端附近的PA序列，該序列在大腸桿菌中被例如脯氨酸亞氨基肽酶的消化酶所識別。人們也可以添加一個N末端甲硫氨酸殘基，尤其是當(dāng)所述分子在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌中重組表達(dá)時。SEQ ID NO2的Fc區(qū)是一種這樣的Fc變異體。
3.除去天然Fc N末端的一部分，以在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)時防止N末端異質(zhì)性。為此，人們可以缺失N末端前20個氨基酸殘基中的任何殘基，特別是位置1、2、3、4和5的殘基。
4.除去一個或多個糖基化位點(diǎn)。通常被糖基化的殘基(例如天冬酰胺)可能賦予溶細(xì)胞反應(yīng)。這類殘基可以缺失或者用非糖基化殘基(例如丙氨酸)取代。
5.除去參與與補(bǔ)體相互作用的位點(diǎn)，例如C1q結(jié)合部位。例如，人們可以缺失或取代人IgG1的EKK序列。補(bǔ)體募集對于本發(fā)明的分子可能并不有利，因此這種Fc變異體可以避免這類位點(diǎn)。
6.除去影響與非補(bǔ)救受體的Fc受體結(jié)合的位點(diǎn)。天然Fc可能具有與某些白細(xì)胞相互作用的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對于本發(fā)明的融合分子并不需要，因此除去這類位點(diǎn)。
7.除去ADCC位點(diǎn)。ADCC位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的；參見例如Molec.Immunol.29(5)633-9(1992)關(guān)于IgG1中的ADCC位點(diǎn)的內(nèi)容。這些位點(diǎn)也是本發(fā)明融合分子不需要的，因此可以將其除去。
8.當(dāng)所述天然Fc來源于非人類抗體時，可以將所述天然Fc人源化。通常，為了將天然Fc人源化，人們會用正常在人類天然Fc中存在的殘基取代在所述非人類天然Fc中的所選殘基。用于抗體人源化的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
優(yōu)選Fc變異體包括以下變異體。在SEQ ID NO2(圖4)中，位置15的亮氨酸可以用谷氨酸取代；位置99的谷氨酸可以用丙氨酸取代；且位置101和103的賴氨酸可以用丙氨酸取代。另外，可以用苯丙氨酸殘基取代一個或多個酪氨酸殘基。
一種替代的載體可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、抗體、抗體片段或能夠與補(bǔ)救受體結(jié)合的小分子(例如肽模擬化合物)。例如人們可以使用1998年4月14日授予Presta等的美國專利第5,739,277號中描述的多肽作為載體。也可以通過噬菌體展示或RNA-肽篩選，選擇與FcRn補(bǔ)救受體結(jié)合的肽。這種補(bǔ)救受體結(jié)合化合物也包括在“載體”含義中，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類載體應(yīng)該根據(jù)半壽期增加(例如通過避免被蛋白酶識別的序列)和免疫原性降低(例如通過給予非免疫原性序列，如在抗體人源化中發(fā)現(xiàn)的)來選擇。
如上所述，也可以使用供F1和F2用的聚合物載體。目前可利用用于連接可用作載體的化學(xué)部分的各種方法，參見例如專利合作條約(“PCT”)國際公開說明書WO96/11953，題為“N末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組合物和方法”，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。該P(yáng)CT公開說明書其中公開了水溶性聚合物與蛋白質(zhì)N末端的選擇性連接。
一種優(yōu)選的聚合物載體是聚乙二醇(PEG)。PEG基團(tuán)可以具有任何方便的分子量，可以是直鏈或支鏈的。PEG的平均分子量的范圍優(yōu)選為約2千道爾頓(“KD”)至約100kD，更優(yōu)選為約5 kD至約50kD，最優(yōu)選為約5kD至約10kD。PEG基團(tuán)一般通過?；蜻€原烷基化通過PEG部分上的反應(yīng)基(例如醛、氨基、硫羥基或酯基)連接于本發(fā)明化合物上的反應(yīng)基(例如醛、氨基或酯基)，而與本發(fā)明化合物連接。
將合成肽PEG化的一個有用的策略包括通過在溶液中形成綴合連接使分別帶有一個相互反應(yīng)的特殊官能團(tuán)的肽和PEG部分化合。所述肽可以容易地用常規(guī)固相合成法制備。所述肽用合適的官能團(tuán)在特定位點(diǎn)“預(yù)活化”。前體在與PEG部分反應(yīng)之前進(jìn)行純化和全面表征。所述肽和PEG的連接通常發(fā)生在水相中，并且可以容易地通過反向分析型HPLC監(jiān)測。PEG化肽可以容易地通過制備型HPLC純化，并且通過分析型HPLC、氨基酸分析和激光解附吸譜法來表征。
多糖聚合物是另一種類型的水溶性聚合物，它們可以用于蛋白修飾。葡聚糖是由單獨(dú)的葡萄糖亞單位組成的多糖聚合物，所述葡萄糖主要通過α1-6鍵合連接。葡聚糖本身可有多種分子量范圍，容易得到分子量為約1kD至約70kD的葡聚糖。葡聚糖是在本發(fā)明中本身可用作載體或者結(jié)合其它載體(例如Fc)用作載體的合適的水溶性聚合物。參見例如WO96/11953和WO96/05309。與治療性或診斷性免疫球蛋白綴合的葡聚糖的應(yīng)用已有報道；參見例如歐洲專利公布號0 315456，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。當(dāng)葡聚糖用作按照本發(fā)明的載體時，優(yōu)選約1kD至約20kD的葡聚糖。
接頭.可隨意選擇任何“接頭”基團(tuán)。當(dāng)存在接頭時，其化學(xué)結(jié)構(gòu)并不重要，因?yàn)樗饕米鏖g隔區(qū)。所述接頭最好由通過肽鍵連接在一起的氨基酸組成。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述接頭由通過肽鍵連接的1-20個氨基酸組成，其中所述氨基酸選自20種天然存在的氨基酸。這些氨基酸中的某些可以被糖基化，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在一個更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述1-20個氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。甚至更優(yōu)選接頭由大部分為非位阻的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸組成。因此，優(yōu)選的接頭為聚甘氨酸(特別是(Gly)4、(Gly)5)，聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。接頭的其它具體實(shí)例為(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO6)；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO7)；(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO8)；和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO9)。為了解釋上述命名，例如(Gly)3Lys(Gly)4是指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。也優(yōu)選Gly和Ala的組合。本文所示的接頭是示例性的；本發(fā)明范圍內(nèi)的接頭可以長得多，并且可以包括其它殘基。
非肽類接頭也是可行的。例如可以使用烷基接頭如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。這些烷基接頭可以用任何非位阻基團(tuán)例如低級烷基(例如C1-C6)低級?；?、鹵素(例如Cl，Br)、CN、NH2、苯基等進(jìn)一步取代。一個示例性的非肽類接頭為PEG接頭， 其中n使得所述接頭的分子量為100-5000kD，優(yōu)選100-500kD?？梢砸耘c上述相同的方式改變所述肽接頭，以形成衍生物。
衍生物.本發(fā)明人也考慮了將所述化合物的肽和/或載體部分衍生化。這類衍生物可以改進(jìn)所述化合物的溶解性、吸收、生物半壽期等。所述部分或者可以消除或減弱所述化合物的不希望有的副作用等。示例性的衍生物包括這樣的化合物，其中1.所述化合物或其某一部分是環(huán)狀的。例如，所述肽部分可以經(jīng)修飾，以含有兩個或更多個Cys殘基(例如在接頭中)，所述Cys殘基可以通過形成二硫鍵而環(huán)化。
2.所述化合物是分子間交聯(lián)的或者使其能夠在分子間交聯(lián)。例如可以修飾所述肽部分，以含有一個Cys殘基，從而能夠與類似的分子形成分子間二硫鍵。所述化合物也可以通過其C末端交聯(lián)，如在以下所示的分子中。 3.一個或多個肽鍵[-C(O)NR-]被非肽鍵取代。示例性的非肽鍵為-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-OC(O)NR-]膦酸酯、-CH2-氨磺酰[-CH2-S(O)2NR-]脲[-NHC(O)NH-]-CH2-仲胺和烷基化肽[-C(O)NR6-，其中R6為低級烷基]。
4.將N末端衍生化。通常，可以將N末端?；蛐揎棡槿〈贰Ｊ纠缘腘末端衍生基團(tuán)包括-NRR1(不是-NH2)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR1、琥珀酰亞胺或芐酯基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1各自獨(dú)立地為氫或低級烷基，并且所述苯環(huán)可以用1-3個選自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氯和溴的取代基取代。
5.將游離C末端衍生化。通常，將C末端酯化或酰胺化。示例性的C末端衍生基團(tuán)包括例如-C(O)R2，其中R2是低級烷氧基或-NR3R4，其中R3和R4獨(dú)立地為氫或C1-C8烷基(最好是C1-C4烷基)。
6.一個二硫鍵用另一個、最好是更穩(wěn)定的交聯(lián)部分(例如亞烷基)取代。參見例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9；Alberts等(1993)Thirteenth Am.Pep.Symp.，357-9。
7.對一個或多個單個氨基酸殘基進(jìn)行修飾。已知各種衍生化試劑與所選側(cè)鏈或末端殘基特異性地反應(yīng)，如以下詳述的。
賴氨酰殘基和氨基末端殘基可以與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)，這逆轉(zhuǎn)了賴氨酰殘基的電荷。用于將含α-氨基的殘基衍生化的其它合適試劑包括亞氨酸酯，例如甲基吡啶亞氨酸甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代氫硼化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基可以通過與幾種常規(guī)試劑中的任一種或組合反應(yīng)來修飾，所述常規(guī)試劑包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酰殘基的衍生化要求所述反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜倌軋F(tuán)的pKa高。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團(tuán)以及精氨酸的ε-氨基反應(yīng)。
酪氨酰殘基的具體修飾已有廣泛的研究，特別感興趣的是通過與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)，將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基中。最為常見的是，分別用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷來生成O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。
羧基側(cè)鏈基團(tuán)(天冬氨酰或谷氨酰)可以通過與碳二亞胺(R’-N＝C＝N-R’)例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺反應(yīng)，選擇性地修飾。此外，可以通過與銨離子反應(yīng)，將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化為天冬酰胺酰殘基和谷氨酰胺酰殘基。
可以將谷氨酰胺酰殘基和天冬酰胺酰殘基脫酰氨基為相應(yīng)的谷氨酰殘基或天冬氨酰殘基?；蛘?，可以將這些殘基在溫和的酸性條件下脫酰氨基。任一種形式的這些殘基落在本發(fā)明范圍內(nèi)。
半胱氨酰殘基可以被或者消除二硫鍵或者相反穩(wěn)定交聯(lián)的氨基酸殘基和其它部分取代。參見例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9。
用雙官能試劑衍生化可用于將所述肽或其官能衍生物與水不溶性支持基質(zhì)或其它大分子載體交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑包括例如1，1-雙(疊氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯例如與4-疊氮水楊酸形成的酯、同雙官能亞氨酸酯(包括二琥珀酰亞胺酯，例如3，3′-二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)和雙官能馬來酰亞胺(例如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷)。衍生化劑例如甲基-3-[(p-疊氮苯基)二硫代]丙亞胺酸酯產(chǎn)生能夠在光存在下形成交聯(lián)的光活化中間體?；蛘?，使用美國專利第3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440號中所述的反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)例如溴化氰活化的糖類和反應(yīng)性底物進(jìn)行蛋白質(zhì)固定化。
糖類(寡糖)基團(tuán)可以方便地連接于蛋白質(zhì)中已知被糖基化的位點(diǎn)。一般而言，O聯(lián)寡糖連接于絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基，而當(dāng)天冬酰胺殘基作為序列Asn-X-Ser/Thr(其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸)的一部分時，N聯(lián)寡糖連接于天冬酰胺(Asn)殘基。X最好是除脯氨酸之外的19種天然存在的氨基酸之一。N聯(lián)寡糖和O聯(lián)寡糖的結(jié)構(gòu)以及在每種類型中發(fā)現(xiàn)的糖殘基是不同的。在兩種類型中共同存在的一種類型的糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸(也稱為唾液酸)。唾液酸一般是N聯(lián)和O聯(lián)寡糖中的末端殘基，借助其負(fù)電荷，可以賦予糖基化化合物酸性特性。這類位點(diǎn)可以摻入到本發(fā)明化合物的接頭中，并且最好在所述多肽化合物的重組生產(chǎn)(例如在哺乳動物細(xì)胞例如CHO、BHK、COS中)期間被細(xì)胞糖基化。然而，這類位點(diǎn)可以通過本領(lǐng)域已知的合成法或半合成法進(jìn)一步糖基化。
其它可能的修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化；Cys中硫原子的氧化；賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化。Creighton，ProteinsStructure and MoleculeProperties(W.H.Freeman & Co.，San Francisco)，pp.79-86(1983)。
本發(fā)明化合物也可以在DNA水平上改變。所述化合物任何部分的DNA序列可以改變?yōu)榕c所選宿主細(xì)胞更匹配的密碼子。對于作為優(yōu)選的宿主細(xì)胞的大腸桿菌而言，優(yōu)化的密碼子是本領(lǐng)域已知的。密碼子可以被取代，以消除限制位點(diǎn)或以包括沉默的限制位點(diǎn)，這可能有助于所述DNA在所選宿主細(xì)胞中的加工。所述載體、接頭和肽DNA序列可以經(jīng)修飾，以包括任何上述序列改變。
制備方法本發(fā)明化合物主要可以采用重組DNA技術(shù)，在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。為此，制備編碼所述肽的重組DNA分子。制備這類DNA分子的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可以用合適的限制性酶，從DNA切下編碼所述肽的序列?；蛘撸梢圆捎没瘜W(xué)合成技術(shù)，例如亞磷酰胺法，合成所述DNA分子。此外，可以使用這些技術(shù)的組合。
本發(fā)明也包括能夠在合適的宿主中表達(dá)所述肽的載體。所述載體包含與合適的表達(dá)控制序列有效連接的編碼所述肽的DNA分子。在將所述DNA分子插入所述載體之前或之后實(shí)施這種有效連接的方法是眾所周知的。表達(dá)控制序列包括啟動子、激活子、增強(qiáng)子、操縱基因、核糖體結(jié)合部位、起始信號、終止信號、加帽信號、聚腺苷酸化信號和涉及轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的其它信號。
用具有所述DNA分子的所得載體轉(zhuǎn)化合適的宿主。這種轉(zhuǎn)化可以采用本領(lǐng)域眾所周知的方法來進(jìn)行。
許多可利用且熟知的宿主細(xì)胞中的任一種可以用來實(shí)施本發(fā)明。具體宿主的選擇取決于本領(lǐng)域熟知的多種因素。這些因素包括例如與所選表達(dá)載體的匹配、所述DNA分子編碼的肽的毒性、轉(zhuǎn)化率、所述肽回收的容易程度、表達(dá)特性、生物安全性和成本。這些因素必須取得平衡，由于人們理解，不是所有的宿主都可以同樣有效地表達(dá)特定DNA序列。在這些通用指南中，有用的微生物宿主包括細(xì)菌(例如大腸桿菌菌種)、酵母(例如酵母屬菌種(Saccharomyces sp.)和其它真菌、昆蟲、植物、培養(yǎng)中的哺乳動物(包括人類)細(xì)胞或本領(lǐng)域已知的其它宿主。
下一步，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主，并且進(jìn)行純化。宿主細(xì)胞可以在常規(guī)發(fā)酵條件下培養(yǎng)，使得所需化合物得以表達(dá)。這類發(fā)酵條件是本領(lǐng)域眾所周知的。最后，用本領(lǐng)域熟知的方法，從培養(yǎng)物中純化所述肽。
所述化合物也可以通過合成法制備。例如，可以使用固相合成技術(shù)。合適的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，包括描述于以下文獻(xiàn)中的技術(shù)Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis和Panayotis編著)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149；Davis等(1985)，Biochem.Intl.10394-414；Stewart和Young(1969)，Solid PhasePeptide Synthesis；美國專利第3,941,763號；Finn等(1976)，The Proteins(3rd ed.)2105-253；和Erickson等(1976)，The Proteins(3rd ed.)2257-527。固相合成是制備各種肽的優(yōu)選技術(shù)，因?yàn)樗侵苽湫‰牡淖罱?jīng)濟(jì)成效的方法。
含有衍生肽或者含有非肽基團(tuán)的化合物可以通過眾所周知的有機(jī)化學(xué)技術(shù)來合成。
所述化合物的應(yīng)用本發(fā)明化合物由于其與PTH-1受體或PTH-2受體相互作用而具有藥理活性。Mannstadt等(1999)，Am.J.Physiol.277.5Pt 2.F665-75。PTH及其激動劑增加骨吸收、增加腎的鈣重吸收、減少表皮增殖并且減少毛發(fā)生長。Holick等(1994)Proc.Natl.Sci.USA91(17)8014-6；Schilli等(1997)，J.Invest.Dermatol.108(6)928-32。因此，PTH-1受體和/或PTH-2受體的拮抗劑可用于治療●原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)；●高鈣血，包括由實(shí)體瘤(乳房、肺和腎)引起的高鈣血和血液惡性腫瘤(多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)；特發(fā)性高鈣血以及與甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)和腎功能障礙相關(guān)的高鈣血；●腫瘤轉(zhuǎn)移瘤，特別是轉(zhuǎn)移至骨的轉(zhuǎn)移瘤，尤其是與乳癌和前列腺癌相關(guān)的轉(zhuǎn)移瘤；●惡病質(zhì)和食欲缺乏，特別是與癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)和食欲缺乏；●與異常PTH受體信號相關(guān)或因異常PTH受體行信號惡化的骨質(zhì)稀少，包括各種形式的骨質(zhì)疏松，例如-原發(fā)性骨質(zhì)疏松；-絕經(jīng)后和年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松；-內(nèi)分泌性骨質(zhì)疏松(甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、
庫欣綜合征(Cushing’s syndrome)和肢端肥大癥)；-遺傳性和先天性骨質(zhì)疏松(例如成骨不全、高胱氨酸尿、門克士綜合征(Menkes′syndrome)和賴?yán)?戴綜合征(Riley-Daysyndrome)；-由于肢端固定術(shù)引起的骨質(zhì)疏松；-其它疾病繼發(fā)的骨質(zhì)疏松，其它疾病例如血色素沉著、血促乳素過多、神經(jīng)性食欲缺乏、甲狀腺毒癥、糖尿病、腹腔疾病、炎性腸病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴組織增生性疾病和系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生病；-手術(shù)(例如胃切除術(shù))或藥療(例如化療、抗驚厥療法、免疫抑制療法和抗凝劑療法)繼發(fā)的骨質(zhì)疏松；-糖皮質(zhì)類固醇療法繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，所述療法用于諸如以下的疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、一過性動脈炎、脈管炎、慢性阻塞性肺病、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、慢性間質(zhì)性肺?。?在器官移植例如腎、肝、肺、心臟移植后防止器官排斥的糖皮質(zhì)類固醇和/或免疫調(diào)節(jié)療法繼發(fā)的骨質(zhì)疏松；-由于受到微重力(microgravity)作用引起的骨質(zhì)疏松，例如在太空旅行期間觀察到的；-與惡性疾病例如乳癌、前列腺癌相關(guān)的骨質(zhì)疏松；●成人和青少年骨佩吉特病(Paget′s disease)(畸形性骨炎)●骨髓炎或?qū)е鹿莵G失的骨中傳染性病灶●由于給予類固醇誘發(fā)的以及小腸和大腸疾病和慢性肝病和腎病相關(guān)的術(shù)后骨質(zhì)稀少。
●與外傷性損傷或與以下病癥相關(guān)的非外傷性壞死相關(guān)的骨壞死或骨細(xì)胞死亡戈謝病(Gaucher′s disease)、鐮狀細(xì)胞性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周病、溶骨性轉(zhuǎn)移瘤和其它病癥；●脫發(fā)(頭發(fā)生長缺陷或者頭發(fā)部分或完全喪失)，包括雄激素性脫發(fā)(男性型脫發(fā)(male pattern baldness))、中毒性脫發(fā)、老年脫發(fā)、斑形脫發(fā)、斑禿(alopecia pelada)和拔毛發(fā)癖等等。
有患者可以從PTH或PTHrP活性獲益的其它病癥。對于這些適應(yīng)癥，PTH受體激動劑可用作治療性療法。具體地說，這類適應(yīng)癥包括骨折修復(fù)(包括骨不連合性骨折的愈合)、骨質(zhì)稀少包括各種形式的骨質(zhì)疏松，例如-原發(fā)性骨質(zhì)疏松；-絕經(jīng)后和年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松；-內(nèi)分泌性骨質(zhì)疏松(甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、庫欣綜合征(Cushing’s syndrome)和肢端肥大癥)；-遺傳性和先天性骨質(zhì)疏松(例如成骨不全、高胱氨酸尿、門克士綜合征(Menkes′syndrome)和賴?yán)?戴綜合征(Riley-Daysyndrome)；-由于肢端固定術(shù)引起的骨質(zhì)疏松；-其它疾病繼發(fā)的骨質(zhì)疏松，其它疾病例如血色素沉著、血促乳素過多、神經(jīng)性食欲缺乏、甲狀腺毒癥、糖尿病、腹腔疾病、炎性腸病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴組織增生性疾病和系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生??；-手術(shù)(例如胃切除術(shù))或藥療(例如化療、抗驚厥療法、免疫抑制療法和抗凝劑療法)繼發(fā)的骨質(zhì)疏松；-糖皮質(zhì)類固醇療法繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，所述療法用于諸如以下的疾病RA、SLE、哮喘、一過性動脈炎、脈管炎、慢性阻塞性肺病、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、慢性間質(zhì)性肺??；-在器官移植例如腎、肝、肺、心臟移植后防止器官排斥的糖皮質(zhì)類固醇和/或免疫調(diào)節(jié)療法繼發(fā)的骨質(zhì)疏松；
-由于受到微重力作用引起的骨質(zhì)疏松，例如在太空旅行期間觀察到的；-與惡性疾病例如乳癌、前列腺癌相關(guān)的骨質(zhì)疏松；半壽期延長的PTH激動劑(例如與Fc區(qū)連接的PTH激動劑)可以與骨吸收抑制劑一起使用。骨吸收抑制劑包括OPG和OPG衍生物、OPG-L(RANKL)抗體、降鈣素(例如Miacalcin，Calcimar)、二膦酸(例如APD、阿侖膦酸、利塞膦酸、依替膦酸、帕米膦酸、替魯膦酸、氯膦酸、奈立膦酸、ibandronate、zoledronate)、雌激素(例如Premarin，Estraderm、Prempro、Alora、Climara、Vivelle、Estratab、Ogen)、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(例如雷洛昔芬、屈洛昔芬、lasofoxifene)、替勃龍等等。示例性骨吸收抑制劑描述于WO98/46751和WO97/23614，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
本發(fā)明化合物作為治療骨質(zhì)疏松的單一療法可能是合適的，有可能將抗吸收藥加入PTH-Fc療法中將增加其功效和治療窗。PTH和PTH-Fc都引起骨生成和骨吸收兩者的增加。抗吸收藥阻斷破骨細(xì)胞反應(yīng)的能力可能限制PTH-Fc的高鈣血效應(yīng)，也可能增加骨量。
藥用組合物一般介紹.本發(fā)明也提供使用本發(fā)明化合物的藥用組合物的方法。這類藥用組合物可以注射給予，或口服、經(jīng)肺、鼻、經(jīng)皮或其它給藥形式給予。一般而言，本發(fā)明包括包含有效量本發(fā)明化合物與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔料和/或載體的藥用組合物。這類組合物包括各種緩沖劑含量(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)，pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑；添加劑，例如去垢劑和增溶劑(例如Tween 80、Polysorbate 80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物質(zhì)(例如乳糖、甘露醇)；將所述物質(zhì)加入到聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的顆粒制劑中或者加入到脂質(zhì)體中。透明質(zhì)酸也可以使用，這可能具有增進(jìn)在循環(huán)中持續(xù)作用時間的效應(yīng)。這類組合物可能影響本發(fā)明蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除率。參見例如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)第1435-1712頁，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。所述組合物可以以液體形式制備，或者可以以干粉例如凍干形式制備。也考慮了植入型緩釋制劑和經(jīng)皮制劑。
在增加嚙齒動物成骨細(xì)胞數(shù)目、骨體積和骨鹽密度方面，每周兩次給予本發(fā)明化合物，優(yōu)于每日注射PTH(1-34)。在成年小鼠中，與每日給予PTH-(1-34)相比，每周兩次給予PTH-(1-34)-Fc引起骨密度和骨體積的增加更大。(參見圖10)。在骨質(zhì)疏松的老年OVX大鼠模型中，每周兩次給藥能夠逆轉(zhuǎn)超過50％的由于一年缺乏雌激素誘發(fā)的骨丟失。當(dāng)與二膦酸(APD)聯(lián)合時，在老年大鼠模型中觀測到的效應(yīng)甚至更強(qiáng)。在大鼠中，一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc(340nmol/kg)引起持續(xù)72小時的高血鈣反應(yīng)(圖8)。這種持續(xù)時間與PTH-(1-34)-Fc從血清中的清除率一致，與大鼠中最佳的每周兩次給藥方案一致。
靈長類的最佳給藥的頻率可能低于大鼠或小鼠。根據(jù)OVX獼猴對一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc(10-34nmol/kg)持續(xù)約168小時的高鈣血反應(yīng)的觀測結(jié)果(圖11)，每周一次(或更低的頻率)給藥在靈長類中可能是最佳的。這一觀測結(jié)果提示，在靈長類中一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc在約1周內(nèi)被清除，這也可能代表合成代謝效應(yīng)所需的最大給藥頻率。
口服劑型.此中考慮可供應(yīng)用的是口服固體劑型，所述劑型在Remington′s Pharmaceutical Sciences((1990)，18th Ed.，Mack PublishingCo.Easton PA 18042)的第89章中有全面的描述，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。固體劑型包括片劑、膠囊劑、丸劑、糖錠或錠劑、扁囊劑或小糖丸。此外，脂質(zhì)體或類蛋白包封也可以用來配制本發(fā)明的組合物(例如美國專利第4,925,673號中報道的類蛋白微球)?？梢允褂弥|(zhì)體包封，脂質(zhì)體可以用各種聚合物衍生化(例如美國專利第5,013,556號)。在Marshall，K.，Modern Pharmaceutics((1979)，G.S.Banker和C.T.Rhodes編著)的第10章中給出了關(guān)于所述治療藥可能的固體劑型的描述，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。一般而言，所述制劑將包括本發(fā)明的化合物和提供抵抗胃環(huán)境的保護(hù)以及在腸中釋放所述生物活性物質(zhì)的惰性成分。
也具體考慮了上述本發(fā)明化合物的口服劑型。如有必要，所述化合物可以經(jīng)化學(xué)修飾，使得口服給藥是有效的。一般而言，所考慮的化學(xué)修飾是將至少一個部分連接于所述化合物分子本身，其中所述部分使得可以(a)抑制蛋白水解；和(b)從胃或腸中被攝入到血流中。也需要提高所述化合物的總體穩(wěn)定性和增加在機(jī)體中的循環(huán)時間。在本發(fā)明中可用作共價連接載體的部分也可以用于此目的。這類部分的實(shí)例包括PEG、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。參見例如Abuchowski和Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，Enzymes as Drugs(1981)，Hocenberg和Roberts編著，Wiley-Interscience，New York，NY，，pp.367-83；Newmark等(1982)，J.Appl.Biochem.4185-9?？梢允褂玫钠渌酆衔锸蔷?1，3-二氧戊環(huán)和聚-1，3，6-tioxocane。如上所述，優(yōu)選用于藥物應(yīng)用的是PEG部分。
對于口服給藥劑型，使用經(jīng)修飾的脂族氨基酸(例如N-(8-[2-羥基苯甲?；鵠氨基)辛酸鈉(SNAC))作為載體以增強(qiáng)本發(fā)明治療化合物吸收也是可行的。應(yīng)用SNAC的肝素制劑的臨床功效已經(jīng)在EmisphereTechnologies進(jìn)行的II期試驗(yàn)中得到證實(shí)。參見美國專利第5,792,451號，“Oral drug delivery composition and methods”。
本發(fā)明的化合物可以作為粒徑約1mm的顆?；蝾w粒狀物形式的細(xì)微多粒子包括在所述制劑中。用于膠囊給藥的所述物質(zhì)的制劑也可以為散劑、輕壓的塞狀物或甚至片劑。所述治療藥可以通過壓制制備。
著色劑和矯味劑可以全都包括在內(nèi)。例如，可以配制(例如通過脂質(zhì)體或微球包封)所述蛋白(或衍生物)，然后進(jìn)一步包含在食用制品例如冷藏的含著色劑和矯味劑的飲料中。
人們可以用惰性材料稀釋本發(fā)明化合物或增加本發(fā)明化合物的體積。這些稀釋劑可以包括糖類，尤其是甘露醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽也可以用作填充劑，包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。某些市售的稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在將所述治療藥配制為固體劑型時可以包括崩解劑。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商業(yè)崩解劑Explotab。淀粉羥基乙酸鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、超微支鏈淀粉、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素(acid carboxymethyl cellulose)、天然海綿和膨潤土全都可以使用。另一種形式的崩解劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉狀樹膠可以用作崩解劑和粘合劑，這些可以包括粉狀樹膠，例如瓊脂、梧桐膠或西黃蓍膠。藻酸及其鈉鹽也可用作崩解劑。
粘合劑可以用來將所述治療藥保持在一起，以形成硬片劑，包括得自天然產(chǎn)物的材料，例如阿拉伯膠、西黃蓍膠、淀粉和明膠。其它粘合劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可以用于醇溶液中，以將所述治療藥制粒。
抗摩擦劑可以包括在所述治療藥制劑中，以在配制過程中防止附著。潤滑劑可以用作所治療藥和模壁之間的層，這些可以包括但不限于硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。可溶性潤滑劑也可以使用，例如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇Carbowax 4000和6000。
可以加入能夠改進(jìn)配制期間藥物流動特性并且有助于壓片期間重排的助流劑。所述助流劑可以包括淀粉、滑石粉、熱解硅膠和水合硅鋁酸鹽。
為了有助于本發(fā)明化合物溶解于水性環(huán)境中，可以加入表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可以包括陰離子去垢劑，例如十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉?？梢允褂藐栯x子去垢劑，陽離子去垢劑可以包括苯扎氯銨或芐索氯銨。可以作為表面活性劑包括在所述制劑中的潛在的非離子去垢劑一覽表是lauromacrogol 400、硬脂酸-40-聚烴氧基酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油一硬脂酸酯、聚山梨酸酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨(dú)或作為不同比率的混合物存在于所述蛋白或衍生物的制劑中。
添加劑也可以包括所述制劑中，以增強(qiáng)所述化合物的吸收。潛在具有該特性的添加劑例如為脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸。
可能需要控釋制劑。本發(fā)明化合物可以摻入到允許通過擴(kuò)散或浸提機(jī)制釋放的惰性基質(zhì)例如樹膠中。緩慢變質(zhì)的基質(zhì)也可以重?fù)饺氲剿鲋苿┲?，例如藻酸鹽、多糖。本發(fā)明化合物的另一種形式的控釋是通過基于Oros治療系統(tǒng)(Alza Corp.)的方法，即所述藥物封在半透膜中，所述半透膜允許水進(jìn)入，并且由于滲透效應(yīng)而將藥物推過單一小開孔。某些腸溶衣也具有延釋效應(yīng)。
其它包衣可以用于所述制劑。這些包括各種各樣的可以應(yīng)用于包衣鍋的糖。所述治療藥也可以以薄膜衣片劑給出，用于這種情況的材料分為兩組。第一組為非腸溶材料，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚維酮和聚乙二醇。第二組包括通常為鄰苯二甲酸酯的腸溶材料。
材料的混合物可以用來提供最佳薄膜衣的材料。薄膜包衣可以在包衣鍋或在流化床中進(jìn)行，或者通過壓制包衣法來進(jìn)行。
肺部給藥形式.此中也考慮了本發(fā)明蛋白(或其衍生物)的肺部給藥。當(dāng)被吸入并且穿過肺上皮襯層進(jìn)入血流時，所述蛋白(或衍生物)被傳遞至哺乳動物的肺部。(關(guān)于這一點(diǎn)的其它報道包括Adjei等，Pharma.Res.(1990)7565-9；Adjei等(1990)，Internatl.J.Pharmaceutics63135-44(醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate))；Braquet等(1989)，J.Cardiovasc.Pharmaco1.13(suppl.5)s.143-146(內(nèi)皮縮血管肽-1)；Hubbard等(1989)，Annals Int.Med.3206-12(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等(1989)，J.Clin.Invest.841145-6(α1-蛋白酶)；Oswein等(March1990)，″Aerosolization of Proteins″，Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II，Keystone，Colorado(重組人生長激素)；Debs等(1988)，J.Immunol.1403482-8(干擾素-γ和腫瘤壞死因子α)和Platz等，美國專利第5,284,656號(粒細(xì)胞集落刺激因子)。
考慮可供用于實(shí)施本發(fā)明的有各種各樣設(shè)計用于治療藥制品肺部給藥的機(jī)械裝置，包括但不限于粉末霧化器、定量吸入器和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。適用于實(shí)施本發(fā)明的市售裝置的某些具體實(shí)例有Ultravent粉末霧化器，由Mallinckrodt，Inc.制造，St.Louis，Missouri；Acorn II粉末霧化器，由Marquest MedicalProducts制造，Englewood，Colorado；Ventolin定量吸入器，由Glaxo Inc.制造，Research Triangle Park，North Carolina；和Spinhaler粉末吸入器，由Fisons Corp.制造，Bedford，Massachusetts。
所有這類裝置都要求應(yīng)用適合于分配本發(fā)明化合物的制劑。通常，每種制劑對于所用是裝置類型的專用的，除可用于治療的稀釋劑、輔料和/或載體外，還可以包括應(yīng)用合適的拋射劑材料。
為了最有效地傳遞至遠(yuǎn)端肺部，本發(fā)明化合物應(yīng)該最有利地以顆粒劑形式制備，其平均粒徑小于10μm(或微米)，最優(yōu)選為0.5-5μm。
藥學(xué)上可接受的載體包括糖類，例如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。供制劑中應(yīng)用的其它組分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC?？梢允褂锰烊换蚝铣杀砻婊钚詣?。可以使用PEG(甚至除了其應(yīng)用于將所述蛋白或類似物衍生化外)?？梢允褂闷暇厶?，例如環(huán)葡聚糖(cyclodextran)?？梢允褂媚懼}和其它相關(guān)增強(qiáng)劑?？梢允褂美w維素和纖維素衍生物?？梢允褂冒被幔缬糜诰彌_制劑中。
此外，考慮了應(yīng)用脂質(zhì)體、微囊或微球、包藏復(fù)合物或其它類型的載體。
適用于或者射流式或者超聲式粉末霧化器的制劑通常將包含溶于水的本發(fā)明化合物，其濃度約為0.1-25mg生物活性蛋白/ml溶液。所述制劑也可以包括緩沖劑和單糖(例如為了蛋白穩(wěn)定和調(diào)節(jié)滲透壓)。粉霧劑也可以含有表面活性劑，以降低或防止由于在形成氣霧劑時所述溶液霧化引起的表面誘發(fā)的所述蛋白的聚集供定量吸入裝置應(yīng)用的制劑一般將包含借助于表面活性劑而懸浮于拋射劑中的含本發(fā)明化合物的細(xì)微粉末。所述拋射劑可以是用于此目的的任何常規(guī)材料，例如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其組合。合適的表面活性劑包括脫水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。
可供從粉末吸入裝置中分配的制劑將包含含本發(fā)明化合物的細(xì)微粉末，也可以包括填充劑，例如乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，其含量為有助于所述粉末從所述裝置中分配的量，例如所述制劑重量的50-90％。
經(jīng)鼻給藥形式.也考慮了經(jīng)鼻給予本發(fā)明化合物。經(jīng)鼻給藥允許所述蛋白在所述治療藥制品給予鼻后直接進(jìn)入血流，而無需所述制品沉積在肺中。用于經(jīng)鼻給藥的制劑包括具有葡聚糖或環(huán)葡聚糖的制劑。也考慮了通過穿越其它粘膜轉(zhuǎn)運(yùn)的給藥。
劑量.涉及用于治療上述病癥的方法中的給藥方案將由主治醫(yī)師考慮各種可改變藥物作用的因素來決定，所述因素例如為患者的年齡、病癥、體重、性別和飲食、任何感染的嚴(yán)重程度、給藥時間和其它臨床因素。一般而言，每日給藥方案的范圍應(yīng)該為0.1-1000微克本發(fā)明化合物/公斤體重，最好為0.1-150微克/公斤。
具體的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明人已經(jīng)測定了以下表4中所列優(yōu)選肽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。符號“Λ”可以是本文所述的任何接頭，或者可以簡單地表示一個正常的肽鍵(即因此不存在接頭)。為了清楚，串聯(lián)重復(fù)和接頭用破折號分開顯示。
表4-優(yōu)選實(shí)施方案
“F1”是本文先前定義的Fc區(qū)。除了表4中所列的優(yōu)選實(shí)施方案外，本發(fā)明人進(jìn)一步考慮了其中Fc二聚體的每條鏈與不同肽序列連接的異源二聚體；例如其中一條鏈可以描述為SEQ ID NO166、而另一條鏈可以描述為SEQ ID NO170或者與表1和表2中任何序列連接的Fc的分子。
所有本發(fā)明的化合物都可以用PCT申請WO99/25044中描述的方法制備。
本發(fā)明將通過以下工作實(shí)施例進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例是說明性的，而不是限制性的。
實(shí)施例1Fc-綴合PTH/PTHrP受體(PTH-R1)激動劑[PTH-(1-34)-Fc]的生物活性引言甲狀旁腺激素[PTH-(1-34)或天然PTH-(1-84)]當(dāng)每日注射時，引起骨生成增加和骨量增加。這種合成代謝反應(yīng)先前被認(rèn)為需要短暫暴露于PTH，這由半壽期短(不足1小時)的PTH來促進(jìn)。臨床上，PTH療法的合成作用需要每日皮下注射，這對于廣泛應(yīng)用PTH是一個相當(dāng)大的障礙。PTH較低頻率的注射在臨床上會是理想的，可能通過增加PTH的體內(nèi)半壽期而達(dá)到。短期(間斷)暴露于PTH(＜1h/天)刺激成骨細(xì)胞骨生成，而長期(連續(xù))暴露(＞2h/天)刺激破骨細(xì)胞骨吸收(Dobnig等，Endocrinology1384607，1998)?，F(xiàn)有技術(shù)提示，其自身半壽期延長的PTH可能增加骨吸收，并且導(dǎo)致血鈣過高。然而，應(yīng)該有可能用骨吸收抑制劑來防止PTH誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活性。Osteoprotegerin(OPG)可以很好地適合于此目的。用OPG-Fc單一治療大鼠、小鼠或人類，通過基本上根除破骨細(xì)胞群體，引起持續(xù)抑制骨吸收。共同給予有效的骨吸收抑制劑如OPG可能提供更大的效應(yīng)。這種方案在理論上可能允許PTH無對立面地刺激骨生成，導(dǎo)致骨量增加。有可能其它骨吸收抑制劑包括二膦酸或雌激素也可能抑制PTH誘導(dǎo)的骨吸收，因此可以與長效PTH分子聯(lián)合使用。為了這一目標(biāo)，我們克隆、表達(dá)和純化了人PTH-(1-34)-Fc。Fc與蛋白綴合引起其循環(huán)半壽期顯著增加，這可能允許按照與OPG-Fc相似或相同的方案注射PTH-(1-34)-Fc。本發(fā)明的益處包括PTH注射頻率較低，從目前標(biāo)準(zhǔn)的每日一次至不常進(jìn)行如每季度一次。
材料、方法和結(jié)果高鈣血測定我們在鼠類高鈣血模型中測試了PTH-(1-34)-Fc的效力和作用持續(xù)時間。簡而言之，給小鼠皮下注射一次不同劑量的PTH-(1-34)或PTH-(1-34)-Fc，從眶后靜脈竇收集外周血，以供測定血離子化鈣。通過小鼠對前一種藥物的持續(xù)高鈣血反應(yīng)證實(shí)，PTH-(1-34)-Fc的半壽期和效力大于PTH-(1-34)的半壽期和效力(圖4)。PTH-(1-34)誘導(dǎo)的高鈣血持續(xù)6-24h，而等摩爾劑量的PTH-(1-34)-Fc引起更為持續(xù)的高鈣血(48-72h)。這種反應(yīng)時間長度與PTH-(1-34)-Fc構(gòu)建體相對于PTH-(1-34)而言半壽期更長是一致的。PTH-(1-34)-Fc的效力也顯著高于PTH-(1-34)(圖4)。與等摩爾劑量的PTH-(1-34)相比，最高劑量PTH-(1-34)-Fc引起的峰離子化鈣水平的增加更大。曲線下面積的分析(AUC)證明，在所用的最高劑量下，PTH-(1-34)-Fc引起的高鈣血反應(yīng)比等摩爾劑量的PTH-(1-34)高2.6倍。
合成代謝分析已經(jīng)證明了PTH-(1-34)-Fc的藥理學(xué)和半壽期優(yōu)于PTH-(1-34)，我們進(jìn)行了一項(xiàng)先導(dǎo)研究，以確定PTH-(1-34)-Fc與OPG-Fc的共同治療是否增加骨量。簡而言之，將6月齡的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠分為多個組，每組6只。通過雙能量X射線吸收測定法(DEXA)，在所有大鼠的第三腰椎(L3)測量基線骨鹽密度(BMD)(第0天)。然后大鼠按照以下方案進(jìn)行治療。
組1溶媒對照(PBS，皮下注射，第1、3和5天)組2OPG-Fc，在第1天一次皮下注射(1mg/kg)組3PTH-(1-34)，在第1、3和5天皮下注射，20nMoles PTH/kg/注射。這代表最佳合成代謝PTH方案。
組4與組3相同，但在第1天注射一次OPG-Fc。
組5在第1天，皮下注射一次PTH-(1-34)-Fc，60nMoles/kg。這代表與組3接受的PTH-(1-34)的總劑量相同的摩爾劑量，但在一次注射中給予。
組6與組5相同，但在第1天注射一次OPG-Fc(SC，1mg/kg)。
在第7天再次進(jìn)行腰椎的DEXA，以評價BMD的變化。與PBS治療的大鼠相比，注射一次OPG-Fc或注射3次PTH-(1-34)，L3中的BMD中等增加(圖5)。PTH-(1-34)+OPG引起的BMD增加大于單獨(dú)的OPG或PTH-(1-34)。作為單一療法，注射一次PTH-(1-34)-Fc不能增加BMD。然而，注射一次PTH-(1-34)-Fc加上注射一次OPG-Fc引起B(yǎng)MD顯著增加(圖5)。這一結(jié)果提供了下述原理的證明循環(huán)半壽期延長的PTH構(gòu)建體可以與有效的抗吸收藥如OPG-Fc聯(lián)合，引起骨骼合成代謝反應(yīng)。與通過多次注射PTH-(1-34)與OPG-Fc的共同治療或無OPG-Fc共同治療誘導(dǎo)的合成作用相比，用PTH-(1-34)-Fc加上OPG-Fc一次治療的合成作用更大?？偠灾珺MD的最大增加可以通過較少頻率地注射PTH-(1-34)-Fc+OPG-Fc來達(dá)到，與必須每日注射或每隔一天注射的PTH-(1-34)相比，這是優(yōu)越的治療方案。
圖5顯示了PTH-Fc+OPG-Fc對第三腰椎中(L3)骨鹽密度(BMD)的影響。正常的6月齡雄性大鼠用PTH-Fc或PTH或者溶媒一次皮下注射來治療。某些大鼠也接受一次OPG皮下注射。DEXA后7天，測量BMD。數(shù)據(jù)代表平均值±SD，n＝6只大鼠/組。
實(shí)施例2Fc-綴合PTH/PTHrP受體(PTH-R1)拮抗劑([Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc)的生物活性引言一些病狀與PTH或PTHrP循環(huán)水平增高有關(guān)。原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)(分別為PHPT和SHPT)與PTH水平增高有關(guān)，而惡性腫瘤的體液高鈣(HHM)導(dǎo)致PTHrP水平增高。這兩種蛋白都通過共同PTH/PTHrP受體(PTH-R1)發(fā)送信號，引起骨吸收、腎鈣重吸收和維生素D的腎生物合成增加。雖然骨吸收抑制劑已經(jīng)在抑制這些病狀中破骨細(xì)胞骨吸收方面取得了不同程度的成功，但目前沒有一種療法可減輕PTH或PTHrP過量對鈣血癥的腸和腎影響。因此，與吸收抑制劑相比，直接拮抗PTH或PTHrP信號的藥物有可能具有更大的功效。
已研究的大多數(shù)PTH-R1信號拮抗劑基于氨基末端截短。PTH-(7-34)肽是相當(dāng)有效的具有非常溫和激動劑活性的PTH-R1拮抗劑。與PTH-(7-34)相比，PTHrP-(7-34)肽對于PTH-R1的親和性更高，由此是更有效的拮抗劑。然而，與PTH-(7-34)相比，PTHrP-(7-34)也具有更高(但仍是溫和的)激動劑活性(McKee(1990)，Endocrinol.12776)。所述最佳拮抗劑可以將PTH-(7-34)的較弱激動作用與PTHrP-(7-34)的較強(qiáng)的拮抗作用組合在一起。Nutt等(1990)，Endocrinol.127491證明，將PTH的Asn10和Leu11置換成PTHrP序列(取代Asp10和Lys11)，產(chǎn)生最終沒有激動劑活性、但仍具有非常有效拮抗劑活性的肽([Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc)。
同天然PTH一樣，所有基于肽的PTH-R1拮抗劑共享循環(huán)半壽期非常短(＜1h)的特性。此外，除去受體激動作用所需的氨基末端截短也顯著降低這些肽對PTH-R1的親和性。這些特性限制了常規(guī)肽拮抗劑的臨床潛能。Fc-與氨基末端截短的PTH肽或PTHrP肽綴合，應(yīng)該顯著增加其循環(huán)半壽期，使得PTH-R1的連續(xù)拮抗作用可以通過足夠地暴露于這些Fc-拮抗劑來達(dá)到。
材料、方法和結(jié)果我們已經(jīng)克隆、表達(dá)和純化了[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc。我們測試了該化合物在小鼠中拮抗急性和慢性高鈣血反應(yīng)的能力。用PTHrP-(1-34)作為血鈣因子，以評價[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc的急性效應(yīng)。因?yàn)镻THrP是HHM的主要介質(zhì)，所以這項(xiàng)研究也代表誘導(dǎo)高鈣血的腫瘤模型。簡而言之，測量基線的血液離子化鈣(BIC)，然后小鼠通過皮下注射用溶媒(PBS)或PTHrP-(1-34)(0.5mg/kg)攻擊。然后小鼠用不同劑量的[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc或溶媒(PBS)皮下治療一次。在溶媒治療、用PTHrP-(1-34)攻擊的小鼠中，觀測到一過性高鈣血反應(yīng)。峰鈣血反應(yīng)發(fā)生在攻擊后3小時，并且持續(xù)至攻擊后至少6小時。與溶媒治療相比，10mg/kg[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc引起PTHrP-誘導(dǎo)的高鈣血更快地正?；?。30mg/kg的劑量完全阻斷了對PTHrP-(1-34)的鈣血反應(yīng)(圖6)。
為了測試[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc拮抗更為慢性的高鈣血的能力，我們用PTH-(1-34)-Fc作為長效血鈣因子。這項(xiàng)研究也代表特征為PTH水平持續(xù)升高的原發(fā)性和繼發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)模型。在溶媒治療的小鼠中，一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc(30mg/kg)在正常小鼠中引起強(qiáng)高鈣血反應(yīng)，在攻擊后24小時達(dá)到2.75mg/dl的水平(相比之下，正常對照數(shù)值為1.35)。一次皮下注射10-100mg/kg[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc引起在24小時時對PTH-(1-34)-Fc的峰高鈣血反應(yīng)顯著降低(圖6)。
總而言之，我們在急性和慢性高鈣血動物模型中證實(shí)了[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc的拮抗活性。這些模型使用基于PTH和PTHrP兩種序列的血鈣因子。這些數(shù)據(jù)提示，[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc以及其它Fc-綴合PTH-R1拮抗劑對于甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)HHM和與異常PTH-R1信號相關(guān)的其它疾病而言，可能是有效的治療選擇。
實(shí)施例3FC-綴合的和天然的C末端截短PTH片段的成骨特性A.cAMP測定我們用大鼠成骨細(xì)胞樣ROS 17/2.8細(xì)胞測試了PTH-Fc構(gòu)建體刺激cAMP積累的相對能力。培養(yǎng)物用磷酸二酯酶抑制劑IBMX處理，以促進(jìn)cAMP的積累。然后培養(yǎng)物用或者溶媒(PBS)或者各種PTH構(gòu)建體攻擊15分鐘。證實(shí)所有片段都有劑量依賴性cAMP積累。無Fc綴合的PTH-(1-34)的效力略微高于PTH-(1-31)-Fc和PTH-(1-30)-Fc(圖7)。這些數(shù)據(jù)證明，F(xiàn)c-綴合PTH片段保持在成骨細(xì)胞中激活A(yù)C途徑的能力。B.小鼠生物測定然后，我們在小鼠中測試了PTH-(1-34)、PTH-(1-34)-Fc、PTH-(1-31)-Fc和PTH-(1-30)-Fc的效應(yīng)。在第0、5和10天，給4周齡雄性小鼠通過皮下注射，注射溶媒或PTH片段。在24小時、48小時和72小時時，取外周血以供進(jìn)行臨床化學(xué)研究。第15天處死小鼠，收獲椎骨、脛骨和股骨以供組織學(xué)研究，收集一個脛骨以供骨密度測量(外周定量計算機(jī)體層攝影，pQCT)。臨床化學(xué)終點(diǎn)包括總血清鈣、血清堿磷酸酶(AP，一種成骨細(xì)胞活性標(biāo)記)和血清酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP，一種破骨細(xì)胞活性的標(biāo)記)。對于每只動物，計算AP∶TRAP比值，作為與破骨細(xì)胞活性相比的相對成骨細(xì)胞活性的指標(biāo)。較高的AP∶TRAP比值將表示可能更強(qiáng)的合成代謝因子。相對高劑量(高于最適合成代謝劑量15倍)的選擇基于先前的研究，所述研究證實(shí)了在臨床化學(xué)終點(diǎn)的顯著變化。預(yù)期可能需要較低劑量，以證明對骨密度的合成作用，并且也可能需要抗吸收共同治療以達(dá)到合成代謝反應(yīng)。
臨床化學(xué)研究的結(jié)果示于圖8中。血清鈣在注射300nmoles/kg(1.2mg/kg)的PTH-(1-34)后24、48或72小時沒有顯著差異。這一結(jié)果與無Fc綴合的肽的半壽期短是一致的，無Fc綴合的肽通常引起血清鈣的一過性(12h)增加。相反，等摩爾劑量的PTH-(1-34)-Fc引起血清鈣的顯著且持續(xù)的增加，在24小時達(dá)到峰值。PTH-(1-31)-Fc是更為有效的血鈣因子，雖然PTH-(1-30)-Fc的血鈣是3種Fc肽中最低的(圖8A)。血清AP(成骨細(xì)胞標(biāo)記)未因給予PTH-(1-34)而改變，但通過在72小時給予300nmoles/kg的PTH(1-34)-Fc以及給予PTH-(1-31)-Fc而顯著升高。PTH-(1-30)-Fc表現(xiàn)出AP的最高增加，在注射1,000nmoles/kg后72小時達(dá)到峰值(圖8B)。血清TRAP(破骨細(xì)胞標(biāo)記)未因PTH-(1-34)、PTH-(1-34)-Fc或PTH-(1-30)-Fc而顯著改變，但給予PTH-(1-31)-Fc使其顯著增加(圖8C)。計算的AP∶TRAP比值未因PTH-(1-34)而改變，但通過給予PTH-(1-34)-Fc在規(guī)定的時間內(nèi)增加。低劑量的PTH-(1-31)-Fc(100nmoles/kg)提高AP∶TRAP，而高劑量(1,000nmoles/kg)降低AP∶TRAP。AP∶TRAP的最大提高用PTH-(1-30)-Fc(1,000nmoles/kg)實(shí)現(xiàn)(圖8D)。
各種PTH構(gòu)建體對骨鹽密度(近端脛骨干骺端)的效應(yīng)示于圖9中。在15天的研究結(jié)束時，觀測到PTH-(1-34)(300nmoles/kg)當(dāng)在第0、5和10天注射時具有中等的(非顯著的)合成作用。PTH-(1-34)-Fc(300nmoles/kg)對骨密度沒有影響，100nmoles/kg的PTH-(1-31)-Fc也沒有影響。較高劑量的PTH-(1-31)-Fc(300-1,000nmoles/kg)引起顯著的高鈣血相關(guān)毒性，從這些動物中未收集骨以供進(jìn)行pQCT。PTH-(1-30)-Fc引起骨密度的最大增加。有明顯的反向劑量反應(yīng)，其中100nmoles/kgPTH-(1-30)-Fc的效應(yīng)最大，而在1,000nmoles/kg下的效應(yīng)最小，盡管在所有劑量下BMD都高于對照(圖9)。這些反向的劑量反應(yīng)與下述的想法一致所用劑量(根據(jù)臨床化終點(diǎn)選擇的)高于最適合成代謝劑量5-50倍。不能顯著增加血清鈣的低劑量的PTH(或PTH-Fc)對于合成作用是最適的。參見Hock，J.M.(1992)，J.Bone Min.Res.765-72。在目前的研究中，合成作用最大的治療方案(PTH-(1-30)-Fc，100nmoles/kg)也是不能顯著增加血清鈣的唯一PTH-Fc療法(圖8A)。
這些數(shù)據(jù)證明了C末端截短的PTH-Fc肽的潛在的合成作用。通過Fc綴合賦予的半壽期較長結(jié)合通過C末端截短對AC/cAMP選擇性刺激，可能解釋在缺乏有效骨吸收抑制劑時的合成作用。預(yù)期逐步C末端截短PTH-(1-30)-Fc將揭示保留或超過PTH-(1-30)-Fc合成分布型的更短的片段。這些片段可能在更為選擇性地刺激成骨細(xì)胞，可能血鈣作用更低，因此為合成代謝療法提供更寬的治療窗。
實(shí)施例4作為單一療法的PTH-Fc療法在成年小鼠中證明PTH-(1-34)-Fc作為單一療法的功效。簡而言之，雄性BDF1小鼠(4月齡)通過皮下注射各種劑量的PTH-(1-34)-Fc或溶媒(PBS)每周治療兩次。其它小鼠通過皮下注射80μg/kg/天(20nmol/kg/天)劑量的PTH-(1-34)每日進(jìn)行治療，這對于增加嚙齒動物骨量而言是最佳治療方案(M.Gunness-Hey和J.M.Hock，Metab.Bone Dis.& Rel.Res.5；177-181，1984)。3周后，處死小鼠，通過pQCT分析脛骨的骨鹽密度(BMD)(圖10)。
與溶媒治療的對照相比，通過每日注射PTH-(1-34)，總脛骨BMD和骨松質(zhì)(cancelled)BMD都顯著增加(圖1，雙因素ANOVA，p＜0.05)。每周兩次注射PTH-(1-34)-Fc引起總BMD和骨松質(zhì)BMD兩者均劑量依賴性增加，這種增加在兩個最高劑量(50和150nmol/kg)下顯著大于溶媒或者每日注射PTH-(1-34)的效應(yīng)。每日PTH-(1-34)治療，并未使脛骨的骨密質(zhì)BMD顯著增加。每周兩次PTH-(1-34)-Fc引起骨密質(zhì)BMD的劑量依賴性增加，這種增加在最高劑量下顯著大于在用溶媒或每日PTH-(1-34)治療的小鼠中觀測到的增加(p＜0.05)。
作為單一療法每周兩次PTH-(1-34)-Fc在老年卵巢切除(OVX)大鼠中也有效地增加BMD。Sprague Dawley大鼠在3月齡時經(jīng)卵巢切除術(shù)，使得骨丟失達(dá)11個月。其它大鼠進(jìn)行假手術(shù)，每周兩次用溶媒(PBS)治療。OVX大鼠每周兩次通過皮下注射或者溶媒或者二膦酸APD(帕米膦酸，0.5mg/kg)或PTH-(1-34)-Fc(50nmol/kg)或APD+PTH-(1-34)-Fc治療。每周通過雙能量X射線吸收測量法(DEXA)測量BMD。大鼠在治療4周后處死。在治療開始時，與溶媒治療的OVX大鼠相比，OVX大鼠的所分析的所有骨骼部位的BMD都顯著降低(圖11，p＜0.05，雙因素ANOVA)。與溶媒治療的OVX大鼠相比，單獨(dú)的APD沒有顯著增加任何骨骼部位的BMD。單獨(dú)的PTH-(1-34)-Fc在治療4周后引起股骨干骺端BMD顯著增加(p＜0.05)，用PTH+ABD治療OVX大鼠與該部位BMD較早的顯著增加(3周)有關(guān)。APD+PTH-(1-34)-Fc的組合也引起腰椎和股骨干骺端的顯著的BMD增加(p＜0.05)。單獨(dú)的PTH-(1-34)-Fc引起溫和且短暫的高鈣血反應(yīng)，無論是否繼續(xù)治療，這種反應(yīng)在第10天后都自發(fā)消除。共同給予APD完全阻斷了PTH-(1-34)-Fc的血鈣效應(yīng)。
這些數(shù)據(jù)提示，PTH-(1-34)-Fc當(dāng)在成年小鼠和老年OVX大鼠中用作單一療法時，是一種有效的合成代謝藥。我們也證明了，在PTH-(1-34)-Fc療法中加入抗吸收藥(APD)與老年OVX大鼠中BMD相似的或更快的增加相關(guān)。共同給予APD也阻斷由PTH-(1-34)-Fc產(chǎn)生的一過性高鈣血反應(yīng)，這提示PTH-(1-34)-Fc的治療指數(shù)可以通過共同給予有效的抗吸收藥顯著提高。
***現(xiàn)在已經(jīng)全面描述了本發(fā)明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本文所述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出許多變化和修改。
縮寫AC 腺苷酸環(huán)化酶AP 堿性磷酸酶BMD 骨鹽密度cAMP環(huán)腺苷酸DEXA雙能量X射線吸收測量法HHM 惡性腫瘤的體液高鈣OPG osteoprotegerinOVX 卵巢切除的PBS 磷酸緩沖鹽溶液pQCT外周定量計算機(jī)體層攝影PTH 甲狀旁腺激素PTHrP 甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白TRAP酒石酸抗性酸性磷酸酶序列表<110>安姆根有限公司(AMGEN INC.)<120>甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白的受體的調(diào)節(jié)物<130>A-665B<140>PCT/US 01/13528<141>2001-04-27<150>US 09/843,221<151>2001-04-26<150>US 60/266,673<151>2001-02-06<150>US 60/214,860<151>2000-06-28<150>US 60/200,053<151>2000-04-27<160>170<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>684<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(684)<223><400>1atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg48Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1 5 10 15ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc96Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu20 25 30atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc144Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser35 40 45cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 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Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys20 25 30<210>145<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>145Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>146<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>146Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr<210>147<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>147Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>148<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>148Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>149<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>149Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>150<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>150Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>151<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>151Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30<210>152<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>152Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25<210>153<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>153Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 30<210>154<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>154Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 30<210>155<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>155Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala20 25 30<210>156<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>156Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser20 25 30<210>157<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>157Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys20 25 30<210>158<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>158Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>159<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>經(jīng)修飾的人PTHrP<400>159Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Met Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>160<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>TTP39<400>160Ser Leu Ala Leu Ala Asp Asp Ala Ala Phe Arg Glu Arg Ala Arg Leu1 5 10 15Leu Ala Ala Leu Glu Arg Arg His Trp Leu Asn Ser Tyr Met His Lys20 25 30Leu Leu Val Leu Asp Ala Pro35<210>161<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>161Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>162<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>162Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>163<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>163Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Lys Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>164<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>164Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>165<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>165Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30<210>166<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>166Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30<210>167<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>通過任選的接頭于N末端連接的Fc區(qū)<400>167Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln20 25<210>168<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>通過任選的接頭于N末端連接的Fc區(qū)<400>168Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu20 25<210>169<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-PTHrP<220><221>misc_feature<222>(28)..(28)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>169Leu Leu His Asn Leu Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe1 5 10 15Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala20 25<210>170<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>優(yōu)選實(shí)施方案-TIP39<220><221>misc_feature<222>(39)..(39)<223>任選的接頭和在C末端連接的Fc區(qū)<400>170Ser Leu Ala Leu Ala Asp Asp Ala Ala Phe Arg Glu Arg Ala Arg Leu1 5 10 15Leu Ala Ala Leu Glu Arg Arg His Trp Leu Asn Ser Tyr Met His Lys20 25 30Leu Leu Val Leu Asp Ala Pro3權(quán)利要求
1.下式的組合物P1-(L1)a-F1及其多聚體，其中F1是載體并且連接于P1-(L1)a的C末端；P1是PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域；L1是接頭；且a是0或1。
2.權(quán)利要求1的式P1-F1的組合物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中F1為一個Fc區(qū)。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中F1為一個IgG Fc區(qū)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中F1為一個IgG1 Fc區(qū)。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中F1包含SEQ ID NO2的序列。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域具有分子式XNHX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC(SEQ ID NO3)其中XN不存在或?yàn)閄3X4X5X6X7、X2X3X4X5X6X7、X1X2X3X4X5X6X7或YX1X2X3X4X5X6X7；X1-X7、X10、X11、X12、X14-X28分別獨(dú)立地為氨基酸殘基；XC不存在或?yàn)閄29、X29X30、X29X30X31、X29X30X31X32、X29X30X31X32X33、X29X30X31X32X33X34、X29X30X31X32X33X34X35或X29X30X31X32X33X34X35X36；X29-X36分別獨(dú)立地為氨基酸殘基。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中XN為X1X2X3X4X5X6X7；X1為一個親水性或非官能性殘基；X2為V；X3為S；X4為E；X5為一個非官能性或堿性殘基；X6為Q；X7為L；X10為一個酸性或親水性殘基；X11為一個非官能性或堿性殘基；X12為一個非官能性殘基；X14為一個堿性或親水性殘基；X15為一個非官能性殘基；X16為一個非官能性或親水性殘基；X17為一個酸性、親水性或非官能性殘基；X18為一個非官能性殘基；X19為一個酸性或堿性殘基；X21為一個非官能性或堿性殘基；X22為一個親水性、酸性或芳族殘基；X23為一個芳族或親脂性殘基(優(yōu)選L)；X24為一個親脂性殘基；X25為一個親水性或堿性殘基；X26為一個親水性或堿性殘基；X27為一個親脂性、堿性或非官能性殘基；且X28為一個親脂性或非官能性殘基。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中XC為X29X30X31X32X33X34；X29為一個親水性或非官能性殘基；X30為一個親水性或酸性殘基；X31為一個親脂性或非官能性殘基；X32為H；X33為一個親水性殘基；且X34為一個非官能性或芳族殘基。
10.權(quán)利要求8的組合物，其中XC為X29X30X31；X29為一個親水性或非官能性殘基；X30為一個親水性或酸性殘基；且X31為一個親脂性或非官能性殘基。
11.權(quán)利要求8的組合物，其中XC為X29X30；X29為一個親水性或非官能性殘基；且X30為一個親水性或酸性殘基。
12.權(quán)利要求8的組合物，其中Xc為X29；且X29為一個親水性或非官能性殘基。
13.權(quán)利要求8的組合物，其中XC不存在。
14.權(quán)利要求8的組合物，其中X1為A、S或Y；X5為H或I；X10為N或D；X11為L、R或K；X12為G、F或W；X14為H或S；X15為L或I；X16為Q、N、S或A；X17為S、D或L；X18為M、L、V或Nle；X19為E或R；X21為V、M、R或Nle；X22為E或F；X23為W或F；X25為R或H；X26為K或H；X27為K或L；且X28為L或I。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中XC為X29X30X31X32X33X34；X29為Q或A；X30為D或E；X31為V或I；X33為N或T；且X34為A、F或Y。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中XC為X29X30X31；X29為Q或A；X30為D或E；且X31為V或I。
17.權(quán)利要求14的組合物，其中XC為X29X30；X29為Q或A；且X30為D或E。
18.權(quán)利要求14的組合物，其中XC為X29；且X29為Q或A。
19.權(quán)利要求14的組合物，其中XC不存在。
20.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域具有下式JNJ7J8HNJ11J12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJC(SEQ ID NO4)其中JN不存在或選自J1J2J3J4J5J6、J2J3J4J5J6、J3J4J5J6；J1為一個氨基酸殘基；J2為一個氨基酸殘基；J3為一個氨基酸殘基；J4為一個氨基酸殘基；J5為一個氨基酸殘基；J6為一個氨基酸殘基；J7為一個氨基酸殘基；J8為一個氨基酸殘基；J11為一個非官能性或堿性殘基；J12為一個氨基酸殘基；J16為一個氨基酸殘基；J18為一個氨基酸殘基；J19為一個酸性或堿性殘基；J21為一個氨基酸殘基；JC不存在或?yàn)镴29、J29J30、J29J30J31、J29J30J31J32、J29J30J31J32J33或J29J30J31J32J33J34；且J29為一個氨基酸殘基；J30為一個氨基酸殘基；J31為一個氨基酸殘基；J32為一個氨基酸殘基；J33為一個氨基酸殘基；J34為一個氨基酸殘基。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中JN為J1J2J3J4J5J6；J1為一個非官能性或芳族殘基；J2為一個非官能性殘基；J3為一個親水性殘基；J4為一個酸性殘基；J5為一個非官能性殘基；J6為一個堿性殘基；J7為一個非官能性或芳族殘基；J8為一個非官能性殘基；J11為一個堿性或非官能性殘基；J12為一個非官能性或芳族殘基；J16為一個非官能性或親水性殘基；J18為一個非官能性殘基；J19為一個酸性或堿性殘基；而J21為一個非官能性殘基；JC為J29J30J31J32J33J34；J29為一個親水性或非官能性殘基；J30為一個親水性或酸性殘基；J31為一個親脂性或非官能性殘基；J32為一個堿性殘基；J33為一個酸性殘基；且J34為一個芳族殘基。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中J1為A、S或Y；J2為V；J3為S；J4為E；J5為I；J6為Q；J7為L或F；J8為M或Nle；J11為L、R或K；J12為G或W；J16為N、S或A；J18為M、Nle、L或V；J19為E或R；J21為V、M或Nle；J29為Q或A；J30為D或E；J31為V或I；J32為H；J33為N；且J34為F或Y。
23.權(quán)利要求20的組合物，其中JN為J1J2J3J4J5J6；J1為一個非官能性或芳族殘基；J2為一個非官能性殘基；J3為一個親水性殘基；J4為一個酸性殘基；J5為一個非官能性殘基；J6為一個堿性殘基；J7為一個非官能性或芳族殘基；J8為一個非官能性殘基；J1為一個堿性或非官能性殘基；J12為一個非官能性或芳族殘基；J16為一個非官能性或親水性殘基；J18為一個非官能性殘基；J19為一個酸性或堿性殘基；J21為一個非官能性殘基；JC為J29J30J31；J29為一個親水性或非官能性殘基；J30為一個親水性或酸性殘基；且J31為一個親脂性或非官能性殘基。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中J1為A、S或Y；J2為V；J3為S；J4為E；J5為I；J6為Q；J7為L或F；J8為M或Nle；J11為L、R或K；J12為G或W；J16為N、S或A；J18為M、Nle、L或V；J19為E或R；J21為V、M或Nle；J29為Q或A；J30為D或E；且J31為V或I。
25.權(quán)利要求20的組合物，其中JN為J1J2J3J4J5J6；J1為一個非官能性或芳族殘基；J2為一個非官能性殘基；J3為一個親水性殘基；J4為一個酸性殘基；J5為一個非官能性殘基；J6為一個堿性殘基；J7為一個非官能性或芳族殘基；J8為一個非官能性殘基；J11為一個堿性或非官能性殘基；J12為一個非官能性或芳族殘基；J16為一個非官能性或親水性殘基；J18為一個非官能性殘基；J19為一個酸性或堿性殘基；J21為一個非官能性殘基；JC為J29J30；J29為一個親水性或非官能性殘基；且J30為一個親水性或酸性殘基。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中J1為A、S或Y；J2為V；J3為S；J4為E；J5為I；J6為Q；J7為L或F；J8為M或Nle；J11為L、R或K；J12為G或W；J16為N、S或A；J18為M、Nle、L或V；J19為E或R；J21為V、M或Nle；J29為Q或A；且J30為D或E。
27.權(quán)利要求20的組合物，其中JN為J1J2J3J4J5J6；J1為一個非官能性或芳族殘基；J2為一個非官能性殘基；J3為一個親水性殘基；J4為一個酸性殘基；J5為一個非官能性殘基；J6為一個堿性殘基；J7為一個非官能性或芳族殘基；J8為一個非官能性殘基；J11為一個堿性或非官能性殘基；J12為一個非官能性或芳族殘基；J16為一個非官能性或親水性殘基；J18為一個非官能性殘基；J19為一個酸性或堿性殘基；J21為一個非官能性殘基；JC為J29；且J29為一個親水性或非官能性殘基。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中J1為A、S或Y；J2為V；J3為S；J4為E；J5為I；J6為Q；J7為L或F；J8為M或Nle；J11為L、R或K；J12為G或W；J16為N、S或A；J18為M、Nle、L或V；J19為E或R；J21為V、M或Nle；且J29為Q或A。
29.權(quán)利要求20的組合物，其中JN為J1J2J3J4J5J6；J1為一個非官能性或芳族殘基；J2為一個非官能性殘基；J3為一個親水性殘基；J4為一個酸性殘基；J5為一個非官能性殘基；J6為一個堿性殘基；J7為一個非官能性或芳族殘基；J8為一個非官能性殘基；J11為一個堿性或非官能性殘基；J12為一個非官能性或芳族殘基；J16為一個非官能性或親水性殘基；J18為一個非官能性殘基；J19為一個酸性或堿性殘基；J21為一個非官能性殘基；且JC不存在。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中J1為A、S或Y；J2為V；J3為S；J4為E；J5為I；J6為Q；J7為L或F；J8為M或Nle；J11為L、R或K；J12為G或W；J16為N、S或A；J18為M、Nle、L或V；J19為E或R；且J21為V、M或Nle。
31.權(quán)利要求20的組合物，其中所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域選自表1。
32.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域具有下式ONLHO10O11O12KSIO16O17LRRRFO23LHHLIOC(SEQ ID NO5)其中ON不存在或?yàn)?YO1O2O3O4O5O6O7、O1O2O3O4O5O6O7、O2O3O4O5O6O7、O3O4O5O6O7、O4O5O6O7、O5O6O7、O6O7或O7；O1為一個氨基酸殘基；O2為一個氨基酸殘基；O3為一個氨基酸殘基；O4為一個氨基酸殘基；O5為一個氨基酸殘基；O6為一個氨基酸殘基；O7為一個氨基酸殘基；O10為一個氨基酸殘基；O11為一個氨基酸殘基；O12為一個氨基酸殘基；O16為一個氨基酸殘基；O17為一個氨基酸殘基；O23為一個氨基酸殘基；OC不存在或?yàn)?O29，O29O30、O29O30O31、O29O30O31O32、O29O30O31O32O33、O29O30O31O32O33O34、O29O30O31O32O33O34O35或O29O30O31O32O33O34O35O36；且O29-O36分別獨(dú)立地為氨基酸殘基。
33.權(quán)利要求27的組合物，其中ON為O7；O7為一個非官能性殘基；O10為一個酸性或親水性殘基；O11為一個堿性或非官能性殘基；O12為一個芳族或非官能性殘基；O15為一個親水性或非官能性殘基；O16為一個親水性殘基；O17為一個酸性或非官能性殘基；O23為一個芳族殘基；且OC不存在。
34.權(quán)利要求23的組合物，其中ON為O1O2O3O4O5O6O7；O1為一個非官能性氨基酸殘基；O2為一個非官能性氨基酸殘基；O3為一個親水性氨基酸殘基；O4為一個酸性氨基酸殘基；O5為一個堿性或非官能性氨基酸殘基；O6為一個親水性氨基酸殘基；O7為一個非官能性殘基；O10為一個酸性或親水性殘基；O11為一個堿性或非官能性殘基；O12為一個芳族或非官能性殘基；O15為一個親水性或非官能性殘基；O16為一個親水性殘基；且O17為一個酸性或非官能性殘基；且O23為一個芳族殘基。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中O1為A；O2為V；O3為S；O4為E；O5為H或I；O6為Q；O7為L；O10為N或D；O11為K或L；O12為G、F或W；O15為I或S；O16為Q或N；O17為D或L；且O23為F或W。
36.權(quán)利要求27的組合物，其中所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域選自表2。
37.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域具有TIp39的氨基酸序列。
38.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物包含一個選自表4的序列。
39.一種主題組合物，所述組合物包含一種選自SEQ ID NO17、18、19和69的肽。
40.一種編碼權(quán)利要求1的組合物的核酸。
41.一種編碼權(quán)利要求7的組合物的核酸。
42.一種編碼權(quán)利要求20的組合物的核酸。
43.一種編碼權(quán)利要求32的組合物的核酸。
44.一種編碼權(quán)利要求39的組合物的核酸。
45.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求40的DNA。
46.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求41的DNA。
47.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求42的DNA。
48.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求43的DNA。
49.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求44的DNA。
50.一種包含權(quán)利要求45的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
51.一種包含權(quán)利要求46的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
52.一種包含權(quán)利要求47的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
53.一種包含權(quán)利要求48的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
54.一種包含權(quán)利要求49的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
55.權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
56.權(quán)利要求51的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
57.權(quán)利要求52的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
58.權(quán)利要求53的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。
59.一種制備所述PTH/PTHrP受體拮抗劑的方法，所述方法包括a)選擇至少一種與所述受體結(jié)合的肽；且b)制備包含與至少一個所選肽的氨基酸序列共價連接的至少一個Fc區(qū)的藥物。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述肽選自SEQ ID NO3、4或5。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述肽在包括篩選以下文庫的方法中進(jìn)行選擇噬菌體展示文庫、大腸桿菌展示文庫、核糖體文庫。RNA-肽文庫或化學(xué)肽文庫。
62.權(quán)利要求59的方法，其中所述藥物的制備通過以下步驟進(jìn)行a)制備一種基因構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體包含一個編碼所選肽的核酸序列和一個編碼Fc區(qū)的核酸序列；且b)表達(dá)所述基因構(gòu)建體。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述基因構(gòu)建體在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述肽的選擇通過包含下述步驟的方法進(jìn)行a)制備一種基因構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體包含一個編碼第一所選肽的核酸序列和一個編碼Fc區(qū)的核酸序列；b)用所述基因構(gòu)建體和誘變引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中i)一種第一誘變引物包含一個與所述基因構(gòu)建體編碼鏈的5’端或5’端附近的序列互補(bǔ)的核酸序列，和ii)一種第二誘變引物包含與所述基因構(gòu)建體非編碼鏈的3’端互補(bǔ)的核酸序列。
65.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予一種PTH激動劑和一種骨吸收抑制劑，其中所述PTH激動劑包含權(quán)利要求1的組合物。
66.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予一種PTH激動劑和一種骨吸收抑制劑，其中所述PTH激動劑包含權(quán)利要求7的組合物。
67.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予一種PTH激動劑和一種骨吸收抑制劑，其中所述PTH激動劑包含權(quán)利要求20的組合物。
68.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予一種PTH激動劑和一種骨吸收抑制劑，其中所述PTH激動劑包含權(quán)利要求32的組合物。
69.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予一種PTH激動劑和一種骨吸收抑制劑，其中所述PTH激動劑包含權(quán)利要求39的組合物。
70.權(quán)利要求65的方法，其中所述骨吸收抑制劑選自O(shè)PG、OPG-L抗體、降鈣素、二膦酸、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑和替勃龍。
71.權(quán)利要求66的方法，其中所述骨吸收抑制劑選自O(shè)PG、OPG-L抗體、降鈣素、二膦酸、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑和替勃龍。
72.權(quán)利要求67的方法，其中所述骨吸收抑制劑選自O(shè)PG、OPG-L抗體、降鈣素、二膦酸、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑和替勃龍。
73.權(quán)利要求68的方法，其中所述骨吸收抑制劑選自O(shè)PG、OPG-L抗體、降鈣素、二膦酸、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑和替勃龍。
74.權(quán)利要求69的方法，其中所述骨吸收抑制劑選自O(shè)PG、OPG-L抗體、降鈣素、二膦酸、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑和替勃龍。
75.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求1的組合物。
76.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求7的組合物。
77.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求20的組合物。
78.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求32的組合物。
79.一種治療骨質(zhì)稀少的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求39的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)PTH和PTHrP活性的治療藥。按照本發(fā)明，PTH和PTHrP的調(diào)節(jié)劑包含(1)一個PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域；和(b)一個載體，例如聚合物(例如PEG或葡聚糖)或一個Fc區(qū)，優(yōu)選其中所述載體共價連接于所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的C末端。所述載體和所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可以通過如下進(jìn)一步描述的所述PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端連接。優(yōu)選的載體是Fc區(qū)，優(yōu)選的Fc區(qū)是IgGFc區(qū)。優(yōu)選的PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含下文所述的PTH和PTHrP衍生的氨基酸序列。其它PTH/PTHrP調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可以通過噬菌體展示、RNA－肽篩選和本文所述的其它技術(shù)來產(chǎn)生。這類肽通常會是PTH活性和PTHrP活性兩者的調(diào)節(jié)劑，雖然這類技術(shù)可以用來產(chǎn)生用作選擇性調(diào)節(jié)劑(例如PTH活性的激動劑、但不是PTHrP活性的激動劑)的肽序列。
文檔編號A61P21/00GK1439021SQ01811719
公開日2003年8月27日 申請日期2001年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月27日
發(fā)明者P·科斯特努伊克, C·-F·劉, D·L·拉西 申請人:安姆根有限公司