專利名稱：：從cDNA中挽救犬熱病病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于重組生產(chǎn)犬熱病病毒——一種非節(jié)段化的負(fù)的單鏈RNA病毒——的方法，以及通過該方法所生產(chǎn)的免疫原性組合物。其他實施方案涉及生產(chǎn)作為減毒和/或傳染性病毒的犬熱病病毒的方法。所述重組病毒是用cDNA克隆制備的，并且相應(yīng)可以獲得在其基因組中具有特定變化的病毒。本發(fā)明還涉及利用由所述方法生產(chǎn)的重組病毒作載體表達(dá)外源遺傳信息，例如外源基因，以便用于多種目的，包括用于除了犬熱病病毒以外的其他病原體的基因治療和細(xì)胞導(dǎo)向的免疫原性或治療用組合物。
背景技術(shù)：
：有外被的負(fù)的單鏈RNA病毒是單一組構(gòu)并且能表達(dá)的。負(fù)的單鏈病毒的基因組RNA在核殼中起著兩種模板的作用作為mRNA合成的模板，以及作為反基因組(+)鏈的模板。負(fù)的單鏈RNA病毒能編碼并包裝它自身的RNA決定型RNA聚合酶。只有當(dāng)這種病毒進(jìn)入受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中之后才能合成mRNA。病毒的復(fù)制是在mRNA合成之后進(jìn)行的，并且需要連續(xù)合成病毒蛋白。新合成的反基因組(+)鏈起著產(chǎn)生其他拷貝的(-)鏈基因組RNA的模板作用。犬熱病病毒(CDV)是麻疹病毒屬的一員(30)。與包括麻疹病毒、牛瘟病毒和Pestedespetits反芻動物病毒在內(nèi)的該屬的其他成員類似，CDV是一種有外被的RNA病毒，它包括大約為16kb的負(fù)的單鏈基因組(4，18，25)。該基因組包括6個非重疊基因區(qū)，排列為3’-N-P-M-F-H-L-5’，它能在受感染的細(xì)胞中編碼8種已知病毒的肽。所述病毒多肽包括核殼蛋白(N)，它能將病毒基因組RNA衣殼化；基質(zhì)蛋白(M)，它是毒粒的結(jié)構(gòu)成分；融合(F)和血凝素(H)外被糖蛋白；催化性聚合酶亞基(L)；和由P基因編碼的三種蛋白。所述P基因通過利用從翻譯起始密碼子下游進(jìn)入的不同讀框(C)或者利用通過mRNA編輯所產(chǎn)生的移碼(V)，編碼磷蛋白(P)聚合酶亞基和非結(jié)構(gòu)蛋白(C和V)。CDV最著名的是能導(dǎo)致犬發(fā)病(4，28)。所述病毒通常是通過空氣傳播的，并且最初的感染發(fā)生在上呼吸道上皮。隨后所述傳染傳播到淋巴組織，導(dǎo)致免疫抑制，并進(jìn)一步將所述病毒傳播到很多器官和細(xì)胞類型。某些動物能從這種病中恢復(fù)過來，但是在數(shù)天至數(shù)周之內(nèi)，有相當(dāng)大數(shù)量的動物會產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主動感染，導(dǎo)致發(fā)生漸進(jìn)性脫髓鞘病，這種病表現(xiàn)出神經(jīng)病癥狀。這種病被作為人脫髓鞘病的模型進(jìn)行研究(52，57)。盡管傳統(tǒng)上是與犬的感染相關(guān)，但是用改良的檢測技術(shù)所做的最新研究業(yè)已證實，CDV能感染多種宿主(4，11，18，52)。所有犬科動物都易感這種病，包括家犬和野狗、狐貍、狼和草原狼。CDV還與非洲和美國動物園中的，包括獅子和虎在內(nèi)的大型貓科動物的死亡相關(guān)。業(yè)已報導(dǎo)過CDV在海豹中的爆發(fā)，并且已知這種病毒會導(dǎo)致諸如水貂、雪貂和浣熊的小型食肉動物發(fā)病。CDV甚至被認(rèn)為與諸如Paget’s病和多發(fā)性硬化的某些人類疾病相關(guān)(14，19，28)。在麻疹病毒屬中，這種相對較寬的宿主范圍是相當(dāng)特殊的，因為該屬的其他成員表現(xiàn)出有限的宿主范圍。業(yè)已實現(xiàn)將活的減毒CDV疫苗用于在家犬群體中控制這種疾病，但是仍然需要其他的疫苗研究。三種流行疫苗不能用于所有易感動物群體(4，18，52)。雪貂、狐貍、某些大型貓科動物、小熊貓、和非洲野狗易感由疫苗菌株導(dǎo)致的疾病，這給試圖防止其動物受到CDV感染的動物園和野生動物園造成了特殊問題。除了CDV的很大的宿主范圍之外，還表明可能存在發(fā)生抗原變異以及適應(yīng)其他新宿主的相當(dāng)大的可能性。因此，能夠給多種動物服用的安全疫苗是有價值的，并且，如果這種疫苗能夠根據(jù)未來的抗原變異而方便地操作的話將是有利的。研究了新的CDV疫苗。例如，業(yè)已用犬和雪貂試驗了能表達(dá)CDV糖蛋白的基于重組痘苗病毒或金絲雀痘的疫苗(34，51)，并且，這些疫苗成功地誘導(dǎo)了預(yù)防性免疫反應(yīng)。不過，尚有待確定這種免疫反應(yīng)的持續(xù)時間是否與由常規(guī)的活的CDV疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相同(4)。業(yè)已用小鼠試驗了基于CDV糖蛋白的DNA疫苗。在用CDV的神經(jīng)毒性菌株進(jìn)行大腦內(nèi)刺激時，所述免疫過的小鼠能存活下來，不過，某些小鼠未能完全避免感染(48)。除了檢驗上述技術(shù)之外，可能還需要改良活的減毒CDV疫苗，以便提高其在多種宿主中的安全性。業(yè)已報導(dǎo)過的現(xiàn)有的活的減毒CDV疫苗在家犬群體中控制犬熱病方面的成功(4，18，52)表明，修飾過的和改良的活的減毒CDV菌株仍然是疫苗開發(fā)的重要選擇。有利于活的減毒CDV疫苗開發(fā)的一種重要技術(shù)是cDNA挽救技術(shù)，該技術(shù)能夠從克隆的DNA中恢復(fù)非節(jié)段化的負(fù)鏈RNA病毒(10，31，40，42)。自從該技術(shù)被首次披露以來(38，44)，這種技術(shù)業(yè)已被越來越頻繁地用于衍生減毒菌株，實施遺傳學(xué)分析，以及將外源基因插入多種負(fù)鏈病毒(10，31，40，42)。簡單地講，這種技術(shù)能夠挽救負(fù)鏈RNA病毒，即使這種病毒的基因組RNA是沒有傳染性的。挽救是通過將病毒基因組cDNA克隆到一種質(zhì)粒載體上而實現(xiàn)的，所述載體被設(shè)計成在能表達(dá)T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞中產(chǎn)生精確拷貝的所述病毒基因組。這種質(zhì)粒通常包括這樣的cDNA在所述正的基因組鏈的5’末端以T7RNA聚合酶啟動子為旁側(cè)序列，而在其3’末端以核酶序列為旁側(cè)序列。由T7RNA聚合酶啟動的轉(zhuǎn)錄形成所述病毒基因組的5’末端，而核酶裂解所述一級T7RNA聚合酶衍生的轉(zhuǎn)錄物，形成3’末端。除了通過質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)合成所述基因組之外，還可以將含有N、P和L基因的T7表達(dá)載體導(dǎo)入所述細(xì)胞，以便提供啟動病毒挽救所必需的反式作用因子的最低互補(bǔ)體。由所述基因組cDNA克隆和N、P和L的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的小百分比的細(xì)胞，能包裝一種基因組轉(zhuǎn)錄物，由N蛋白形成一種核殼顆粒，該顆粒隨后起著由P和L蛋白組成的病毒聚合酶的底物的作用。在該步驟之后，就可以啟動所述病毒的復(fù)制循環(huán)。所述聚合酶復(fù)合物通過接合位于所述基因組3’末端，特別是位于啟動子區(qū)的順式作用信號啟動并完成轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。然后由所述基因組模板從3’到5’末端單向轉(zhuǎn)錄病毒基因。相對相鄰的上游基因(即核蛋白基因(N))而言，通常有較少的來自下游基因(例如，聚合酶基因(L))的mRNA。因此，總是存在根據(jù)有關(guān)基因相對基因組3’末端的位置的mRNA含量的梯度。到目前為止，對所述非節(jié)段化的RNA病毒進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析一直都是困難的，因為由轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的裸露的基因組RNA或RNA是沒有感染力的。目前，有披露可以分離某些重組的非節(jié)段化負(fù)鏈RNA病毒的方法的文獻(xiàn)(Schnelletal.，1994)。這些方法在本文中被稱為“挽救”。用于挽救不同的負(fù)鏈病毒的技術(shù)遵循共同的宗旨；不過，每一種病毒具有決定成功挽救的不同的必需成分(41，43，44，63，64，65，66，67，68，70和73)。在由基因組cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之后，通過噬菌體T7RNA聚合酶和能裂解RNA以便形成3’末端的、由載體編碼的核酶序列的組合作用，產(chǎn)生了精確拷貝的基因組RNA。這種RNA通過最初由共轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒提供的病毒蛋白包裝和復(fù)制。對于犬熱病病毒來說，尚有待建立一種挽救方法，因此，有必要設(shè)計一種犬熱病挽救方法。挽救犬熱病病毒的設(shè)計是復(fù)雜的，因為與對其他RNA病毒的研究相比，還缺少對犬熱病病毒生物學(xué)的深入研究。很顯然，CDV微型復(fù)制子研究尚未公開，而微型復(fù)制子系統(tǒng)必然會提供開發(fā)病毒挽救方法的起點。因此，尚沒有可用于建立一種挽救系統(tǒng)的試劑，如N、P和L蛋白表達(dá)克隆或完整長度的基因組cDNA序列。另外，對于CDV來說，有效進(jìn)行微型復(fù)制子表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)染條件尚屬未知。充分了解上述變數(shù)對于任何重組病毒的成功挽救來說都是重要的。另外，犬熱病病毒的某些菌株在組織培養(yǎng)系統(tǒng)中不能有效生長。盡管事實上從1998年起就可以獲得一種修飾過的基因組序列(GenBank保藏號AF014953，被收作本文參考)，但尚未報導(dǎo)過微型復(fù)制子或病毒挽救系統(tǒng)。為了成功挽救犬熱病病毒的cDNA，在轉(zhuǎn)染之后必須發(fā)生多種分子事件，包括1)通過T7RNA聚合酶精確地、完整地合成基因組或反基因組RNA，并且通過核酶序列進(jìn)行3’末端加工；2)以接近啟動復(fù)制的水平合成病毒N、P和L蛋白；3)從頭開始，將基因組RNA包裝到轉(zhuǎn)錄活性的和復(fù)制感受態(tài)核殼結(jié)構(gòu)中；和4)在足以使復(fù)制進(jìn)行的水平上由新形成的核殼表達(dá)病毒基因。本發(fā)明提供了重組生產(chǎn)犬熱病病毒的挽救方法。挽救的犬熱病病毒具有多種用途，如制備抗體，診斷、預(yù)防和治療用途，細(xì)胞導(dǎo)向和制備突變型病毒，以及制備免疫原性組合物和治療組合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)重組犬熱病病毒的方法，包括在至少一個宿主細(xì)胞中實施挽救組合物的轉(zhuǎn)染，該組合物包括(i)一種轉(zhuǎn)錄載體，該載體包括一種分離的核酸分子，該核酸分子包括編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ii)至少一種表達(dá)載體，它包括編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的至少一種分離的核酸分子。所述轉(zhuǎn)染是在足以實現(xiàn)所述載體共表達(dá)和產(chǎn)生重組病毒的條件下進(jìn)行的。然后回收所述重組病毒。其他實施方案涉及所述核苷酸序列，該序列在進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄時，能表達(dá)以下犬熱病病毒蛋白的一種或多種或其任意組合N、P、M、F、H、L和P、C和V蛋白(它是由上文所述的犬熱病病毒的P基因產(chǎn)生的)。相關(guān)的實施方案涉及包括所述核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案采用了由GenBank保存的犬熱病病毒核苷酸序列(保藏號AF014953-SEQIDNO1)。其他實施方案涉及所述核苷酸，上述犬熱病病毒蛋白的氨基酸序列及其變體。本發(fā)明的蛋白和核苷酸序列具有用于犬熱病病毒的診斷、預(yù)防和治療用途?？蓪⑺鲂蛄杏糜谠O(shè)計篩選系統(tǒng)，用于篩選能夠通過衣殼化、復(fù)制或擴(kuò)增干擾或破壞正常病毒發(fā)育的化合物。所述核苷酸序列還可用于免疫原性組合物中，在用于表達(dá)外源基因時，對犬熱病病毒和/或其他病原體進(jìn)行免疫。在優(yōu)選實施方案中，生產(chǎn)了用于免疫原性組合物中的傳染性重組病毒，并且提供了治療或預(yù)防犬熱病病毒感染和/或其他病原體感染的方法，其中，該方法使用了所述組合物。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)減毒的、傳染性的或具有這兩種特征的重組犬熱病病毒的方法。所述重組病毒是用cDNA克隆制備的，因此，可以獲得在其基因組中具有特定變化的病毒。其他實施方案采用本文所使用的基因組序列來表達(dá)外源基因。由于我們在本文中報導(dǎo)了犬熱病病毒Onderstepoort菌株的完整cDNA克隆的全面克隆和測序，其序列也是本發(fā)明的一種實施方案。本發(fā)明還涉及將通過本發(fā)明所生產(chǎn)的重組病毒用作表達(dá)諸如外源基因的外源遺傳信息的載體用于多種目的，包括除了犬熱病病毒以外的病原體的免疫原性和治療組合物，基因治療，和細(xì)胞導(dǎo)向。對于發(fā)展中的技術(shù)和潛在的治療來說，成功挽救犬熱病病毒是非常重要的，之所以如此，是因為存在若干種強(qiáng)制性原因。制備重組CDV的能力將有利于改良的免疫原性組合物的開發(fā)。制備重組CDV的能力，將有利于開發(fā)CDV載體。另外，存在可以利用的用于研究基于CDV的免疫原性和治療組合物以及基于CDV的病毒載體的途徑的動物模型?？梢詫⑻烊凰拗鳌泛脱跤米髟谔烊凰拗魃镏醒芯緾DV減毒的遺傳學(xué)基礎(chǔ)的實驗?zāi)Ｐ?。重組CDV的另一個優(yōu)點是，由于它是一種神經(jīng)營養(yǎng)病毒，制備重組CDV的能力將允許對神經(jīng)營養(yǎng)進(jìn)行遺傳學(xué)分析。另外，由于CDV能產(chǎn)生急性和持久性感染，人們可以對持久性感染進(jìn)行遺傳學(xué)分析。相應(yīng)地，可以將重組CDV用于剖析所述病毒產(chǎn)生諸如人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病的特征的癥狀的能力。某些實施方案采用了犬熱病病毒的實驗室改良型Onderstepoort菌株(17)。用實驗室改良型菌株作為挽救犬熱病病毒的起始模型具有若干優(yōu)點。首先，實驗室改良型菌株在培養(yǎng)的細(xì)胞中生長良好。這一特征將有助于促進(jìn)成功挽救重組體。其次，所述實驗室改良的菌株能夠在諸如Vero細(xì)胞的可用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系中很好地生長。第三，所述實驗室改良的菌株與業(yè)已在狗體內(nèi)成功使用的疫苗病毒(Onderstepoort)密切相關(guān)，因此，提供了這樣一種可能性，那就是這種重組病毒同樣會具有減毒的表型。第四，如果所述實驗室改良的重組病毒需要進(jìn)一步減毒，可以對所述Onderstepoort菌株的基因組方便地進(jìn)行特征分析，以便鑒定減毒突變。第五，所述實驗室改良的菌株具有在培養(yǎng)的細(xì)胞中生長的能力，這一特征使得人們可以進(jìn)行必要的體外初步研究，而不是完全依賴于動物模型系統(tǒng)。在這里詳細(xì)披露的上述實施方案和其他實施方案體現(xiàn)了本發(fā)明的目的。圖1表示為了用于CDV挽救而制備的質(zhì)粒DNA的組構(gòu)示意圖。圖1A是完整長度CDV克隆pBS-rCDV的示意圖。CDV基因組中的基因區(qū)用黑色方框畫出，方框里面是白色字母和基因邊界。CDV前導(dǎo)序列和尾隨序列在CDV基因組的末端以開放的方框形式畫出。在所述質(zhì)粒載體中對所述基因組進(jìn)行定向，以便指導(dǎo)由位于該基因組5’末端的旁側(cè)T7RNA聚合酶啟動子(灰色方框)合成正的RNA。在所述正的cDNA3’末端旁側(cè)是肝炎Δ病毒核酶序列(在圖1A中用加斜線的方框表示；參見Beenetal.，1997，5)和兩個T7RNA聚合酶終止子(灰色方框)。用于克隆的限制酶消化位點用斜體字母表示。圖1B表示CDV微型復(fù)制子(pCDV-CAT)。該微型復(fù)制子是在用于制備所述病毒cDNA克隆的同一種載體上制備的。將其旁側(cè)為107個核苷酸CDV前導(dǎo)序列和106個核苷酸的尾隨序列(開放的方框)的CAT報導(dǎo)基因插在NotI位點和NarI位點之間(方法)。所述微型復(fù)制子cDNA的取向使得能在通過T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄之后，產(chǎn)生一種負(fù)的微型復(fù)制子RNA。圖1C表示為了指導(dǎo)N、P或L基因在用MVA/T7感染的細(xì)胞(61)中表達(dá)而制備的T7RNA聚合酶決定型質(zhì)粒載體(29)。將所述cDNA插入片段克隆在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)的3’末端，以便有利于T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄物的翻譯。在其3’末端有一個由50個腺苷殘基組成的片段，其后是一個T7RNA聚合酶終止子。圖2A是表示CAT測定結(jié)果的放射性自顯影圖。進(jìn)行該測定是為了對CDV-CAT微型復(fù)制子表達(dá)實驗進(jìn)行定量，正如在例3.1.1中所披露的。在圖2-A中，用20微克微型復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且通過用CDV感染啟動CDV-CAT微型復(fù)制子活性。泳道1中的測定來自沒有用CDV感染的負(fù)對照。泳道2表示由CDV感染啟動的專一性微型復(fù)制子活性的水平。圖2B是表示CAT測定結(jié)果的放射性自顯影圖，進(jìn)行該測定是為了對CDV-CAT微型復(fù)制子表達(dá)實驗進(jìn)行定量，正如在例3.1.2中所披露的。在圖2-B中，用CDV微型復(fù)制子RNA(20微克)和T7表達(dá)質(zhì)粒pCDV-N(1微克)，pCDV-P蛋白(1微克)和pCDV-L(用量如圖所示)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。負(fù)對照如泳道1(無N、P或L表達(dá)載體)和泳道2(無L表達(dá)載體)所示。泳道3-5來自相同的轉(zhuǎn)染，所不同的是，在這些轉(zhuǎn)染中使用用量逐漸提高的L表達(dá)載體。圖3A是表示在轉(zhuǎn)染pCDV-CAT質(zhì)粒DNA之后，CDV-CAT微型復(fù)制子活性的CAT測定結(jié)果的熒光圖象。如例3.1.3所述。圖3A中的結(jié)果證實了培養(yǎng)溫度對微型復(fù)制子活性的影響。圖3A中的相對活性是相對泳道8中所提供的值表達(dá)的。圖3B是表示在轉(zhuǎn)染pCDV-CAT質(zhì)粒DNA之后，CDV-CAT微型復(fù)制子活性的CAT測定結(jié)果的放射性自顯影圖。如例3.1.4所述。圖3B表示熱激對微型復(fù)制子表達(dá)的有利影響。圖3B中的CAT活性值是相對泳道2表達(dá)的。圖4A表示來自重組rCDV挽救的兩個代表性噬斑，如例4.1所述。第一個(左側(cè))噬斑是從Onderstepoort菌株基因組cDNA中挽救的rCDV(Pbs-rCDV)。被標(biāo)明為rCDV-P/Luc/M第二個(右側(cè))噬菌斑是包括圖5A所示熒光素酶基因的重組菌株。圖4B表示通過例4.2所披露的實驗所獲得的挽救菌株的RT/PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析的結(jié)果。泳道1-7表示來自CDV基因組上的1978和2604之間的部分的RT/PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。泳道1中的負(fù)對照(-L)是用源于來自在沒有pCDV-L載體DNA的情況下進(jìn)行的挽救實驗的培養(yǎng)物的RNA所獲得的RT/PCR結(jié)果。泳道3、5和7是負(fù)對照，其中，省略了RT/PCR的RT步驟。泳道8-10表示用BstBI消化與泳道2、4和6中的DNA相同的樣品的結(jié)果。消化PCR片段，得到了兩個大約315bp的片段，而未消化過的片段為630bp。圖5包括6項說明(A-F)。部分(A)表示存在于完整cDNA克隆上的CDV基因組的結(jié)構(gòu)。在部分(B)中，示出了M/F基因間區(qū)的一部分(3320-3380號核苷酸)，用于說明如何改變該區(qū)，以便產(chǎn)生存在于質(zhì)粒prCDV-mcs中的多個克隆位點。改變用粗體表示的核苷酸，以便產(chǎn)生限制位點。部分(C-E)表示如何將外源基因插入prCDV-mcs上的FseI和MluI位點之間。在PCR擴(kuò)增期間，將合成拷貝的M/F基因-末端/基因/起始信號添加到所述外源基因的5’末端。在(F)中，示出了外源基因(X)在CDV基因組上的基因組定位。術(shù)語rCDV表示重組病毒菌株；prCDV表示含有病毒cDNA序列的質(zhì)粒(pBS-rCDV)。圖6表示CDV的cDNA克隆的完整的核苷酸序列(SEQIDNO2)。圖7表示CDV完整長度基因組克隆的完整序列(CDV基因組+載體；CDVSEQIDNO2199-1788；總長度為18826bp)，SEQIDNO3。圖8表示按照例5(c)的對存在于來自用rCDV和rCDV-HBsAg菌株感染過的細(xì)胞的提取物中的蛋白進(jìn)行的Western印跡分析。要指出的是，rCDV-HBsAg-1，2，和3是從用質(zhì)粒prCDV-HBsAg進(jìn)行的獨立的轉(zhuǎn)染中分離的。圖9表示CPVVP2編碼區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO4)。圖10表示CPVVP2的推測的氨基酸序列(SEQIDNO5)。發(fā)明詳述如上文所述，本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組犬熱病病毒(CDV)的方法。在本領(lǐng)域中，此類方法被稱為“挽救”或反向遺傳學(xué)方法。業(yè)已披露了用于不同的非節(jié)段化負(fù)鏈病毒的若干種挽救方法(參見40、41、43、44、63、64、65、66、67、68和70)。有關(guān)挽救的其他文獻(xiàn)包括公開的國際專利申請?zhí)朩O97/06270，該申請涉及麻疹病毒和幅粘液病毒亞科的其他病毒的挽救；以及公開的國際專利申請?zhí)朩O97/12032，該申請涉及RSV挽救。本發(fā)明的其他實施方案涉及編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組或其蛋白的多核苷酸序列以及該序列的變體的挽救方法，和采用了該序列的組合物。所述變體序列優(yōu)選能在高嚴(yán)格條件下，與編碼一種或多種犬熱病蛋白的多核苷酸，如GenBank保藏號AF014953的多核苷酸序列或SEQIDNO1(圖6)雜交。有關(guān)高嚴(yán)格性Southern雜交條件的定義，可以方便地參考Sambrooketal.(1989)，pp.387-389，該文獻(xiàn)被收作本文參考，其中，在第11段上的洗滌步驟被認(rèn)為是高嚴(yán)格性的。本發(fā)明還涉及保守性變體，其中，所述多核苷酸序列通過對核苷酸三聯(lián)體上的第三個核苷酸的改變而與參考序列不同。所述保守性變體優(yōu)選起著犬熱病病毒參考多核苷酸序列的生物學(xué)等同物的作用。本發(fā)明還涉及包括一種或多種所述多核苷酸的核酸分子。如上文所述，特定的核苷酸重組序列可以包括一種或多種犬熱病病毒的不同菌株的基因組。具體的實施方案采用了SEQIDNO1的核苷酸序列，或在轉(zhuǎn)錄時能表達(dá)一種或多種犬熱病病毒蛋白(N、P-P/C/V、M、F、H和L)的核苷酸序列。其他實施方案采用了犬熱病病毒蛋白(N、P-P/C/V、M、F、H和L)的氨基酸序列，它的翻譯的序列在GenBankAF014953中，并且還涉及其片段或變體。所述氨基酸序列的片段和變體以及能表達(dá)犬熱病病毒蛋白的變體核苷酸序列優(yōu)選是生物學(xué)等同物，即它們基本上保留了與所述蛋白相同的功能，以便獲得減毒的、傳染性的或同時具有這兩種特征的需要的重組犬熱病病毒。所述變體氨基酸序列是由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的。所述變體氨基酸序列與犬熱病病毒蛋白的氨基酸序列可以具有大約70％-大約80％，優(yōu)選大約90％的總體相似性。所述變體核苷酸序列與所述核苷酸序列可以具有大約70％-大約80％，優(yōu)選大約90％的總體相似性，它在轉(zhuǎn)錄以后，能編碼犬熱病病毒蛋白的氨基酸序列或犬熱病病毒蛋白的變體氨基酸序列。提供了犬熱病病毒蛋白N、P-P/C/V、M、F、H和L的代表性核苷酸序列，它的翻譯的序列如GenBankAF014953所示，該序列被收入本文。通過制備所述核苷酸序列或蛋白序列的變體，可以獲得生物學(xué)等同物。所述變體可以是模板序列的插入、取代、缺失或重組?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法制備犬熱病多核苷酸序列的變體，如PCR誘變、氨基酸(丙氨酸)篩選、和位點專一性誘變。通過用所述變體進(jìn)行挽救，評估該變體的表型，即如果要評估其干擾挽救犬熱病病毒的能力的能力的話，評估是否獲得了需要的重組犬熱病病毒，或者獲得了需要的生物學(xué)效果。如果預(yù)期的用途是免疫原性組合物的話，還可以評估所述變體的免疫原性?？梢酝ㄟ^改變所述核苷酸序列的密碼子獲得氨基酸序列的改變。眾所周知的是，所述改變可以根據(jù)用其他的氨基酸取代所述氨基酸序列上的某些氨基酸而實現(xiàn)。例如，通過用其他的氨基酸取代，可以使蛋白產(chǎn)生小的構(gòu)象變化，這種變化會導(dǎo)致與犬熱病病毒的其他蛋白結(jié)合或相互作用的能力降低。其他的變化可以改變重組犬熱病病毒的減毒水平。正如Kyte和Doolittle(69)所披露的，人們可以利用氨基酸的親水指數(shù)賦予一種多肽相互作用的生物學(xué)功能，其中，業(yè)已發(fā)現(xiàn)某些氨基酸可以取代具有類似親水指數(shù)的其他氨基酸，并且仍然能保持類似的生物學(xué)活性。另外，類似氨基酸的取代可以以親水性為基礎(chǔ)進(jìn)行，特別是當(dāng)所制備的多肽的預(yù)期的生物學(xué)功能是用于免疫學(xué)實施方案中時尤其如此。例如，參見US4554101(該專利被收作本文參考)，該專利指出，由相鄰氨基酸的親水性決定的“蛋白”的最大局部平均親水性與其免疫原性相關(guān)。因此指出，可以根據(jù)每一種氨基酸的親水性進(jìn)行取代。在使用親水性指數(shù)或親水指數(shù)時(為每一種氨基酸規(guī)定一個值)，優(yōu)選引入氨基酸的取代，其中，所述指數(shù)值為±2，以±1為特別優(yōu)選，以±0.5以內(nèi)為最優(yōu)選的取代。由本發(fā)明的核苷酸序列所編碼的犬熱病病毒蛋白的優(yōu)選特征包括下面特征中的一種或多種(a)是膜蛋白或者是直接與膜結(jié)合的蛋白；(b)能夠作為一種蛋白通過SDS丙烯酰胺(10％)凝膠分離；和(c)保持其在有其他合適的犬熱病病毒蛋白的情況下，導(dǎo)致挽救生產(chǎn)需要的重組犬熱病病毒的生物學(xué)功能。一旦獲得了上述核苷酸和氨基酸序列，人們就可以進(jìn)一步挽救犬熱病病毒。犬熱病挽救是通過用一種挽救組合物對培養(yǎng)基中的至少一個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染、或轉(zhuǎn)化而完成的。所述挽救組合物包括(i)一種轉(zhuǎn)錄載體，該載體包括一種分離的核酸分子，該核酸分子包括編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ii)至少一種表達(dá)載體，它包括編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一種或多種分離的核酸分子；所述轉(zhuǎn)染是在足以實現(xiàn)所述載體共表達(dá)和產(chǎn)生重組病毒的條件下進(jìn)行的。反基因組表示作為合成子代基因組模板的分離的正的信使多核苷酸序列。多核苷酸序列優(yōu)選是一種cDNA，構(gòu)建這種序列是為了在轉(zhuǎn)錄時提供一種相對于復(fù)制型中間RNA的正的版本的犬熱病基因組或反基因組，以便降低與編碼產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄的、復(fù)制的核殼所必需的蛋白的互補(bǔ)序列的正轉(zhuǎn)錄物雜交。所述轉(zhuǎn)錄載體包括一個可操作地連接的轉(zhuǎn)錄單位，該轉(zhuǎn)錄單位包括一個由在犬熱病病毒表達(dá)中具有調(diào)控作用的遺傳因子組成的組件，例如，啟動子、結(jié)構(gòu)基因或被轉(zhuǎn)錄成犬熱病病毒RNA的編碼序列，以及合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。所述轉(zhuǎn)錄載體是與犬熱病病毒蛋白N、P和L共同表達(dá)的，所述蛋白是生產(chǎn)能夠進(jìn)行RNA復(fù)制的核殼所必須的，并且還使得后代核殼成分能夠進(jìn)行RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。所述N、P和L是由編碼所述必需蛋白的一種或多種表達(dá)載體(例如，質(zhì)粒)產(chǎn)生的，不過，所述必需蛋白的一種，或一種或多種可以在特定宿主細(xì)胞中生產(chǎn)，對該宿主細(xì)胞進(jìn)行過工程改造，以便作為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體含有所述病毒專一性基因并表達(dá)基因產(chǎn)物。在一種優(yōu)選實施方案中，N、P和L蛋白是由一種表達(dá)載體表達(dá)的，更優(yōu)選的是，N、P和L分別是由諸如質(zhì)粒的獨立的表達(dá)載體表達(dá)的。在后一種情況下，人們可以更方便地控制在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化期間所提供的每一種蛋白的相對量?？梢杂媚鼙磉_(dá)N、P或L的質(zhì)粒表達(dá)其他犬熱病病毒蛋白，或者用其他質(zhì)粒表達(dá)所述其他蛋白。盡管N、P和L的量會根據(jù)宿主細(xì)胞對其表達(dá)的耐受性而變化，需要對表達(dá)N、P和L的質(zhì)粒進(jìn)行調(diào)整，以便在所述細(xì)胞內(nèi)獲得有效摩爾比的N、P和L。有效摩爾比是足以提供成功挽救所需犬熱病病毒的N、P和L的比例。這種比例可以根據(jù)在微型復(fù)制子(CAT/報導(dǎo)基因)測定中所觀察到的表達(dá)質(zhì)粒的比例獲得。在一種實施方案中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDVNpCDVP的分子比例低于大約5∶1，而pCDVPpCDVL的分子比例低于大約15∶1。優(yōu)選的是pCDVNpCDVP的分子比例為大約3∶1-大約1∶3，而pCDVPpCDVL的分子比例為大約10∶1-大約1∶5，更優(yōu)選的是pCDVNpCDVP的分子比例為大約2∶1，而pCDVPpCDVL的分子比例為大約8∶1-大約1∶1，最優(yōu)選的是pCDVNpCDVP的分子比例為大約1.2∶1，而pCDVPpCDVL的分子比例為大約5∶1。在用基因組cDNA質(zhì)粒與犬熱病病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDVN、pCDVP和pCDVL一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化之后，通過噬菌體T7RNA聚合酶和由載體編碼的能裂解RNA以便形成其3’末端的核酶序列的共同作用下，產(chǎn)生了精確拷貝的基因組RNA。通過最初由共轉(zhuǎn)染的表達(dá)質(zhì)粒提供的病毒蛋白包裝并復(fù)制所述RNA。對于犬熱病病毒挽救來說，將能表達(dá)T7RNA聚合酶的來源連同N、P和L的來源一起添加到所述宿主細(xì)胞(或細(xì)胞系)中。犬熱病病毒的挽救是通過用包括適當(dāng)定位的T7RNA聚合酶啟動子的犬熱病病毒基因組cDNA克隆和編碼犬熱病病毒蛋白N、P和L的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞系而實現(xiàn)的。為了挽救犬熱病病毒，將所需病毒基因組的克隆DNA等同物插在被插入合適的轉(zhuǎn)錄載體(例如細(xì)菌質(zhì)粒)中的DNA決定型RNA聚合酶啟動子(例如，T7RNA聚合酶啟動子)和自我裂解的核酶序列(例如肝炎Δ核酶)之間。該轉(zhuǎn)錄載體提供了可方便操作的DNA模板，所述RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)能轉(zhuǎn)錄具有精確的或接近精確的5’和3’末端的單鏈RNA拷貝的病毒反基因組(或基因組)。所述病毒基因組DNA拷貝的取向以及旁側(cè)的啟動子和核酶序列決定著是否轉(zhuǎn)錄了反基因組或基因組RNA等同物。因此，在所述挽救方法中采用了一種挽救組合物。該挽救組合物可以根據(jù)具體要求或用途加以改變。挽救組合物的一種例子是這樣一種組合物，該組合物包括(i)一種轉(zhuǎn)錄載體，該載體包括一種分離的核酸分子，該核酸分子包括編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ii)至少一種表達(dá)載體，它包括編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的一種或多種分離的核酸分子。對所述轉(zhuǎn)錄和表達(dá)載體進(jìn)行選擇，以便所述挽救組合物在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染會導(dǎo)致所述載體的共表達(dá)，并且產(chǎn)生重組的犬熱病病毒。如上文所述，所述分離的核酸分子包括一種編碼犬熱病病毒的至少一種基因組或反基因組的序列。所述分離的核酸分子可以包括編碼一種基因組、反基因組或其修飾形式的多核苷酸序列。在一種實施方案中，所述多核苷酸編碼一種可操作的連接的啟動子，需要的基因組或反基因組、自我裂解的核酶序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，所述多核苷酸編碼基因組或反基因組，所述基因組或反基因組是通過核苷酸插入、重組、缺失或取代由野生型犬熱病病毒修飾而來的。有人認(rèn)為，通過挽救獲得復(fù)制型病毒的能力，會隨著對編碼天然基因組和反基因組的多核苷酸的修飾的增加而降低。所述基因組或反基因組序列可以來自犬熱病病毒的任何菌株的基因組。所述多核苷酸序列還可以編碼一種通過一種或多種異源來源的基因組或反基因組或基因的重組結(jié)合而形成的嵌合基因組。由于可以將通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的重組病毒用作診斷研究的工具或治療或預(yù)防性免疫原和藥用組合物，所述多核苷酸還可以編碼犬熱病的野生型或任何修飾形式。在很多實施方案中，所述多核苷酸編碼一種減毒的、傳染形式的犬熱病病毒。減毒形式的病毒可以通過發(fā)生在一個或多個基因的編碼區(qū)內(nèi)的，以及發(fā)生在一個或多個非編碼區(qū)，即基因組的基因間區(qū)內(nèi)的突變而產(chǎn)生。若干種減毒突變在上文中作過更詳細(xì)的說明。例如，正如在公開的國際專利申請?zhí)朩O98/13501中所披露的，一種減毒形式可以是這樣一種多核苷酸它編碼的犬熱病病毒的基因組或反基因組在3’基因組啟動子區(qū)具有至少一個減毒突變，并且在RNA聚合酶基因上具有至少一個減毒突變。所述多核苷酸的修飾形式還可以編碼一種缺陷型病毒。所述缺陷型病毒包括在編碼CDV的多核苷酸上的一種改變，使得重組生產(chǎn)的病毒不是復(fù)制感受態(tài)的。所述突變通常發(fā)生在編碼該病毒復(fù)制所必需的蛋白的一個或多個基因內(nèi)或基因上。為了實現(xiàn)復(fù)制，所述缺陷型病毒必須通過宿主細(xì)胞加以補(bǔ)充，該宿主細(xì)胞含有所述核苷酸序列的未修飾過的形式(未改變過的形式)，這種核苷酸序列可以改變，以便使得所述病毒成為缺陷型。所述宿主細(xì)胞和細(xì)胞系，被稱為補(bǔ)償細(xì)胞或補(bǔ)償細(xì)胞系。所述缺陷型細(xì)胞優(yōu)選在補(bǔ)償細(xì)胞系中繁殖，以便產(chǎn)生復(fù)制感受態(tài)的病毒。本發(fā)明還涉及CDV多核苷酸序列的非傳染性改變。對于CDV來說，人們可能希望改變與傳染性病毒生產(chǎn)相關(guān)的基因或核苷酸序列，但是這種改變不會抑制病毒基因組的復(fù)制。這種改變以及包括這種改變的CDV多核苷酸，被稱為“非傳染性改變和非傳染性CDV多核苷酸”。適當(dāng)?shù)母淖?，?fù)制缺陷型或非傳染性，可以根據(jù)預(yù)期的用途而不同，例如，相對犬或馬細(xì)胞而言，在人細(xì)胞中的復(fù)制是缺陷型的。可以通過互補(bǔ)將所述改變過的序列提供給缺陷型或非傳染型重組生產(chǎn)的病毒。還可將所述互補(bǔ)的重組病毒用于藥用目的，如用于基因治療的基因輸送或作為免疫原性組合物的一部分。除了編碼上述需要的犬熱病基因組和反基因組的修飾形式的多核苷酸序列之外，所述多核苷酸序列還可以編碼具有一個或多個異源基因或需要的異源核苷酸序列的需要的基因組或反基因組。異源表示被插入的基因或核苷酸序列不存在于CDV的受體菌株中，或者所述基因或核苷酸序列以不同于正常情況的方式插入所述CDV多核苷酸序列。所述變體是通過將特定的異源核苷酸序列導(dǎo)入編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列中而制備的?？梢詫⑿枰漠愒葱蛄胁迦肴疅岵《嗪塑账嵝蛄械姆潜匦杌蚍蔷幋a區(qū)內(nèi)，或者插入非編碼區(qū)和編碼區(qū)之間，或者插在該多核苷酸序列的任意一個末端。在其他實施方案中，將所需要的異源序列插入所述非編碼區(qū)內(nèi)或者插入非必需基因的編碼區(qū)。所述插入位置可以利用犬熱病病毒的梯度表達(dá)特征(25)。通過將所述外源序列插入不同的基因組位置，利用犬熱病病毒的天然3’→5’減弱梯度，可以在這種類型的挽救系統(tǒng)中方便地檢查外源抗原表達(dá)的不同水平?？梢愿鶕?jù)需要改變所述外源核苷酸序列(例如基因)。根據(jù)所述理想重組病毒的用途，所述異源核苷酸序列可以編碼輔助因子(如白介素)、T輔助表位、限制標(biāo)記、佐劑或不同微生物病原體(例如病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲)的蛋白，特別是能夠引起預(yù)防性免疫反應(yīng)的蛋白。為了增加挽救所需犬熱病病毒或微型復(fù)制子病毒載體的可能性，可能需要選擇編碼輔助因子、細(xì)胞因子(如白介素)、T輔助表位、限制標(biāo)記、佐劑或不同微生物病原體(例如病毒、細(xì)菌或真菌)的蛋白的免疫原性部分的異源序列。例如，在某些實施方案中，選擇編碼諸如白介素-12的細(xì)胞因子的異源基因，以便改善所述重組病毒或由該病毒所表達(dá)的抗原的預(yù)防或治療特征。用于本發(fā)明的抗原，可以選自可用于所需目的的任何抗原?？梢詫⑺隹乖砑拥奖景l(fā)明的組合物中，或者作為異源序列由重組產(chǎn)生的犬熱病病毒表達(dá)，正如上文所述的。人們可以選擇可用于針對諸如病毒、細(xì)菌或真菌的一種或多種病原體的抗原。在下面列舉了潛在的病原體目標(biāo)的詳細(xì)清單。所述病毒的例子包括，但不限于人免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、單純皰疹病毒、人巨噬細(xì)胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、輪狀病毒、杯狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、冠狀病毒、細(xì)小病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、貓白血病病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、禽傳染性粘液病病毒、新城病病毒、Marek’s病病毒、豬呼吸道和生殖綜合癥病毒、馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。所述細(xì)菌的例子包括，但不限于流感嗜血菌(可分型的和不可分型的)、睡眠嗜血菌、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、糞鏈球菌、幽門螺桿菌、腦膜炎萘瑟氏球菌、淋病萘瑟氏球菌、沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、百日咳桿菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌屬、霍亂弧菌、白喉棒桿菌、結(jié)核分支桿菌、鳥分支桿菌-胞內(nèi)分支桿菌復(fù)合體、奇異變形菌、普通變形菌、金色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌、問號螺旋體、布氏疏螺旋體、溶血巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、大葉肺炎放線桿菌和雞敗血枝原體。所述真菌的例子包括，但不限于曲霉屬、芽酵母屬、念珠菌屬、球孢子菌屬、隱球菌屬和組織胞質(zhì)菌屬。所述寄生蟲的例子包括，但不限于利什曼原蟲屬、major、蛔蟲屬、鞭蟲屬、賈第亞原蟲屬、血吸蟲屬、隱孢蟲屬、毛滴蟲屬、兔弓形蟲屬和卡氏肺囊蟲。其他類型的異源序列可以編碼用于消除或減輕病變細(xì)胞的一種或多種肽或多肽，所述肽或多肽包括，但不限于來自癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的肽，過敏原淀粉樣肽、蛋白或其他大分子成分。所述癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的例子包括，但不限于前列腺專一性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA125和MAGE-3。所述過敏原的例子包括，但不限于披露于被收作本文參考文獻(xiàn)的US5830877和公開的國際專利申請?zhí)朩O99/51259中的過敏原，并且包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑、真菌孢子和藥物(如青霉素)。所述成分會干擾IgE抗體的產(chǎn)生，這是一種已知的過敏反應(yīng)誘因。淀粉樣肽蛋白(APP)與多種疾病有關(guān)，如老年性癡呆、淀粉樣變性或淀粉樣生成疾病。β-淀粉樣肽(又被稱為Aβ肽)是APP的一種有42個氨基酸的片段，它是通過β和γ分泌酶加工APP而產(chǎn)生的，并且具有以下序列AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTurGluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValValIleAla.在某些患者體內(nèi)，淀粉樣沉積采用凝聚的Aβ肽形式。令人吃驚的是，業(yè)已發(fā)現(xiàn)服用分離的Aβ肽，可以在脊椎動物宿主體內(nèi)誘導(dǎo)針對淀粉樣沉積物的Aβ肽成分的免疫反應(yīng)(參見公開的國際專利申請?zhí)朩O99/27944)。所述Aβ肽還與其他不相關(guān)的成分連接。因此，本發(fā)明的異源核苷酸序列還包括所述Aβ肽、Aβ肽的片段以及Aβ肽的抗體或其片段的表達(dá)。Aβ肽的一種這樣的片段是具有以下序列的包括28個氨基酸的肽(披露于US466829中)AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLys.通過表達(dá)異源序列，能夠以與表達(dá)載體相同的方式將重組形式的犬熱病病毒用于將各種RNA、氨基酸序列、多肽和蛋白形式的各種活性成分輸送到動物或人體內(nèi)?？蓪⑺鲋亟M犬熱病病毒用于在該病毒轉(zhuǎn)錄啟動子的控制下表達(dá)一種或多種異源基因(甚至是3、4或5種基因)。在其他實施方案中，所述其他外源異源核酸序列可以是最多達(dá)7-10kb的單一序列，它是作為單一的額外轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)的。優(yōu)選遵循rule-of-six(參考文獻(xiàn)6)。在某些優(yōu)選實施方案中，該序列可以長達(dá)4-6kb。人們還能以附加單順反子轉(zhuǎn)錄單位和多順反子轉(zhuǎn)錄單位形式插入異源遺傳信息。所述附加單順反子轉(zhuǎn)錄單位和多順反子轉(zhuǎn)錄單位的使用，應(yīng)當(dāng)可以插入更多的遺傳信息。在優(yōu)選實施方案中，所述異源核苷酸序列是作為至少一個多順反子轉(zhuǎn)錄單位插入犬熱病病毒基因組序列中的，它可以包括一個或多個核糖體進(jìn)入位點。在其他優(yōu)選實施方案中，所述異源核苷酸序列編碼一種多蛋白和足夠數(shù)量的蛋白酶，所述蛋白酶能裂解所述多蛋白，以便產(chǎn)生該多蛋白的單一的多肽。可以對所述異源核苷酸序列進(jìn)行選擇，以便利用犬熱病病毒的正常感染途徑，所述病毒通過呼吸道進(jìn)入體內(nèi)，并且能夠感染多種組織和細(xì)胞，例如，唾液腺、淋巴組織、乳腺、睪丸、甚至是腦細(xì)胞。還可以用所述異源基因提供能被用于基因治療或用于特殊細(xì)胞導(dǎo)向的試劑。作為僅僅利用在犬熱病感染的正常途徑中接觸的正常細(xì)胞的替代方案，所述異源基因或片段可以編碼來自不同病原體的另一種蛋白或氨基酸序列，該異源基因在被用作重組犬熱病病毒的一部分時，能將重組的犬熱病病毒導(dǎo)向不在犬熱病病毒的正常感染途徑上的細(xì)胞或組織。這樣，重組犬熱病病毒就成了一種用于輸送多種外源基因，并相應(yīng)地輸送多種類型的抗原的載體。我們的實施例證明，重組犬熱病病毒可以用作表達(dá)載體。可以將所述重組犬熱病病毒表達(dá)載體用于輸送一種或多種抗原?？梢赃x擇來自多種傳染劑的抗原(1，7)，以便用于需要的用途。人們可以選擇可用于針對下列任意一種病原體的抗原。牛馬BRSV里氏埃里希氏體BVD彎曲菌屬腦脊髓炎睡眠嗜血菌東方IBR西方鉤端螺旋體委內(nèi)瑞拉副流感流感溶血巴斯德氏菌狂犬病多殺巴斯德氏菌鼻肺炎PI3輪狀病毒破傷風(fēng)抗毒素鏈球菌破傷風(fēng)類毒素破傷風(fēng)抗毒素毛滴蟲屬破傷風(fēng)類毒素病毒性動脈炎犬貓博德特氏菌杯狀病毒布氏疏螺旋體衣原體CAV-2白血病冠狀病毒犬小孢子菌熱病貓傳染性粒細(xì)胞缺乏癥鉤端螺旋體狂犬病副流感鼻氣管炎細(xì)小病毒狂犬病豬博德特氏菌布氏疏螺旋體A胸膜肺炎CAV-2博德特氏菌冠狀病毒大腸桿菌熱病丹毒鉤端螺旋體副豬嗜血菌副流感鉤端螺旋體細(xì)小病毒支原體狂犬病細(xì)小病毒多殺巴斯德氏菌假狂犬病毒破傷風(fēng)抗毒素破傷風(fēng)類毒素在優(yōu)選實施方案中，選擇用于獸用目的的抗原，用于抗狂犬病病毒、犬細(xì)小病毒(嚴(yán)重的腸胃道疾病)、犬細(xì)小病毒2(嚴(yán)重的腸胃炎)、犬冠狀病毒(腸胃炎)、犬腺病毒1型(傳染性肝炎)和犬腺病毒2型(犬咳病)、犬幅流感病毒(支氣管炎犬咳病)和多種其他動物病原體。我們的研究結(jié)果表明，CDV的分子遺傳學(xué)操作是可行的，并且可以用cDNA挽救技術(shù)實現(xiàn)未來型簡單CDV菌株和CDV表達(dá)載體的合理化設(shè)計。rCDV的挽救提供了一種尋求開發(fā)犬熱病病毒的更安全的活的減毒免疫原性組合物的途徑。其他的減毒病毒如果保留了對狗進(jìn)行免疫的效力，并且是安全的，而且還能有效用于諸如大型貓科動物、小型食肉動物和海豹的其他動物的話，這種病毒就是理想的。對于采用減毒的犬熱病病毒的實施方案來說，使用傳統(tǒng)方法引入減毒突變，以便產(chǎn)生修飾過的病毒，如病毒在細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物生長期間進(jìn)行的化學(xué)誘變，是向培養(yǎng)物中添加化學(xué)誘變劑，然后篩選業(yè)已在亞最佳溫度下進(jìn)行過傳代的病毒，以便篩選溫度敏感型和/或低溫適應(yīng)型突變，鑒定能在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生小的噬斑的突變型病毒，并且通過異源宿主進(jìn)行傳代，以便篩選宿主范圍突變。另一種引入減毒突變的方法，包括通過定點誘變產(chǎn)生預(yù)定的突變?？梢砸胍粋€或多個突變。通常在動物模型體內(nèi)篩選所述病毒的生物活性的減弱。對減毒的犬熱病病毒進(jìn)行核苷酸測序，以便定位減毒突變的位點。實現(xiàn)這一目的的另一種方法，是使用合理化疫苗設(shè)計方法。有多種研究可能有助于鑒定可以在犬熱病病毒上檢驗的減毒氨基酸取代和順式作用信號改變。例如，對人副流感病毒3型和呼吸道合胞病毒的重組菌株的研究，業(yè)已鑒定了多種減毒突變，這些突變可能與CDV密切相關(guān)。所述突變包括發(fā)生在L蛋白上的氨基酸取代(49、50、60)，以及發(fā)生在前導(dǎo)序列和GE/GS信號上的順式作用序列上的突變(21、50、59)。另外，業(yè)已檢查了麻疹病毒疫苗的基因組序列，并且與野生型分離物進(jìn)行了比較。已經(jīng)有C或V蛋白表達(dá)缺陷型病毒的例子，這種病毒表現(xiàn)出某種程度的減毒作用(12、13、15、22、31、37、53、56)。具體地講，人們可以將相當(dāng)于另一種非節(jié)段化的、負(fù)的單鏈RNA病毒的編碼或非編碼區(qū)上的減毒突變的一種或多種突變插入CDV基因組，所述病毒是單鏈負(fù)病毒綱的病毒，優(yōu)選是副粘液病毒科的病毒，如PIV、RSV、腮腺炎和麻疹。其他病毒的各種突變是眾所周知的，并且在不斷地產(chǎn)生。業(yè)已鑒定的可以對單鏈負(fù)病毒綱的病毒進(jìn)行減毒的突變包括，但不限于以下突變麻疹病毒3’基因組啟動子+RNA聚合酶基因(WO98/13501)、麻疹病毒N、P和C基因、和F基因-末端信號(WO99/49017)、呼吸道合胞病毒3’基因組啟動子+RNA聚合酶基因(WO98/13501)、呼吸道合胞病毒M基因-末端信號(WO99/49017)、呼吸道合胞病毒RNA聚合酶基因(US5993824)、呼吸道合胞病毒N和F基因(WO00/61611)、和副流感病毒3型3’基因組啟動子+RNA聚合酶基因(WO98/13501)。一旦在CDV基因組上產(chǎn)生了所述突變，人們就可以利用本發(fā)明的方法重組生產(chǎn)所述重組病毒。另外，可以使用基因失活方法。最后，可以采用新的基因改組方法(3，58)開發(fā)出犬熱病病毒的更安全、毒性更低的菌株，以便用于免疫原性和治療組合物中。首先通過諸如序列鑒定、序列標(biāo)記的驗證和基于抗體的測定的體外方法，檢驗挽救的重組犬熱病病毒的預(yù)期表型(溫度敏感性、低溫適應(yīng)性、噬斑形態(tài)學(xué)、以及轉(zhuǎn)錄和復(fù)制減弱)。如果挽救的病毒存在減毒表型的話，就可以利用合適的動物模型或靶動物進(jìn)行刺激實驗。首先用所述減毒的、重組生產(chǎn)的病毒對所述動物進(jìn)行免疫，然后用該病毒的野生型形式進(jìn)行刺激。通過比較減毒病毒和野生型CDV或其他標(biāo)準(zhǔn)物(例如，CDV的一種可以接受的減毒形式)的毒力，確定重組生產(chǎn)的CDV的減毒水平。通過所述比較，優(yōu)選能確定減毒的重組病毒與野生型病毒相比在毒力方面具有顯著降低。所述減毒重組病毒的毒力水平，應(yīng)當(dāng)足以滿足將所述重組病毒用于治療人類或治療特定類型的非人動物。表達(dá)載體以及編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的分離的核酸分子的選擇，可以根據(jù)所需病毒的選擇而改變。制備所述表達(dá)載體，是為了能夠在特定條件下，在宿主細(xì)胞中與所述轉(zhuǎn)錄載體共表達(dá)，并且產(chǎn)生重組病毒。犬熱病挽救包括合適的細(xì)胞環(huán)境，其中，存在T7RNA聚合酶，以便啟動由含有病毒基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)錄反基因組(或基因組)單鏈RNA。在轉(zhuǎn)錄同時或者在轉(zhuǎn)錄之后不久，由核殼蛋白將所述病毒反基因組(或基因組)RNA轉(zhuǎn)錄物衣殼化成有功能的模板，并且與由編碼所需病毒專一性反式作用蛋白的共轉(zhuǎn)染的表達(dá)質(zhì)粒同時產(chǎn)生的必需聚合酶成分結(jié)合。以上事件和過程導(dǎo)致了病毒mRNA的必要轉(zhuǎn)錄、新基因組的復(fù)制和擴(kuò)增，并且因此產(chǎn)生了新的病毒后代，即挽救。在本發(fā)明的挽救方法中，T7RNA聚合酶可以由重組痘苗病毒提供。不過，該系統(tǒng)要求挽救的病毒是通過物理或生化方法從痘苗病毒中分離的，或者通過在不是痘病毒的良好宿主的細(xì)胞或組織中充分傳代而分離的。通過使用不能在哺乳動物細(xì)胞中繁殖的痘苗病毒的宿主細(xì)胞限制菌株(例如MVA-T7)可以避免這一前提條件。業(yè)已報導(dǎo)了能表達(dá)噬菌體T7RNA聚合酶的兩種重組MVAs。所述MVA/T7重組病毒含有一個受7.5K弱的早期/晚期啟動子(Sutteretal.，1995)或11K強(qiáng)的晚期啟動子(74)調(diào)控的整合拷貝的T7RNA聚合酶。用于所述挽救組合物轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系，可以根據(jù)所選擇的挽救條件在很大范圍內(nèi)變化。在能夠共表達(dá)所述挽救組合物的載體的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以便產(chǎn)生需要的重組犬熱病病毒。所述宿主細(xì)胞可以從多種細(xì)胞中選擇，包括真核細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動物細(xì)胞?？梢允褂们蓊惣?xì)胞，不過，如果需要的話，宿主細(xì)胞可以來自其他細(xì)胞，甚至是人細(xì)胞，如人胚胎腎細(xì)胞。典型的宿主細(xì)胞有人293細(xì)胞、A549細(xì)胞(肺癌)和HEp2細(xì)胞(宮頸癌)。還可將Vero細(xì)胞(猴腎細(xì)胞)以及很多其他類型的細(xì)胞用作宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞的其他例子有(1)人二倍體原代細(xì)胞系例如，WI-38和MRC5細(xì)胞；(2)猴二倍體細(xì)胞系，例如，F(xiàn)RhL-胎羅猴肺細(xì)胞；(3)準(zhǔn)原代連續(xù)細(xì)胞系例如，AGMK-非洲綠猴腎細(xì)胞；(4)其他潛在的細(xì)胞系，如CHO、MDCK(Madin-Darby犬腎)，DK(狗腎)和原代雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)。某些真核細(xì)胞系比其他細(xì)胞系更適合繁殖病毒，而某些細(xì)胞系對某些病毒來說根本就無法使用。采用能產(chǎn)生可檢測的細(xì)胞病變效應(yīng)的細(xì)胞系，以便能方便地檢測活的病毒的挽救。對于犬熱病來說，可以在Vero細(xì)胞上共培養(yǎng)轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，因為所述病毒能夠在Vero細(xì)胞上迅速擴(kuò)散，并因此產(chǎn)生便于檢測的噬斑。一般，采用允許特定病毒生長的宿主細(xì)胞。在其他優(yōu)選實施方案中，可以添加一種能促進(jìn)轉(zhuǎn)染的試劑，以便增加細(xì)胞對DNA的攝取。有多種這樣的試劑為本領(lǐng)域所公知。常見的例子有LIPOFECTACE(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)和EFFECTENE(Qiagen，Valencia，CA)。Lipofectace和Effectene都是陽離子脂類。它們都能對DNA進(jìn)行包衣，并增強(qiáng)細(xì)胞對DNA的攝取。Lipofectace形成包圍DNA的脂質(zhì)體，而Effectene能對DNA進(jìn)行包衣，但不能形成脂質(zhì)體。所述轉(zhuǎn)錄載體和表達(dá)載體可以是為了在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)而設(shè)計的質(zhì)粒載體。包括至少一個編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白的分離的核酸分子的表達(dá)載體，能夠表達(dá)來自同一種表達(dá)載體或至少兩種不同載體的蛋白。所述載體通常是從基礎(chǔ)挽救方法中了解到的，并且在用于本發(fā)明的改進(jìn)方法中時沒有必要加以改變。在本發(fā)明的方法中，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的挽救溫度范圍(大約32-大約37℃)；不過，業(yè)已證實在較高溫度下進(jìn)行的挽救能改善重組RNA病毒的回收。所述較高的溫度被稱為熱激溫度(參見國際專利公開號WO99/63064，公開日為1999年12月9日，該專利被收作本文參考)。有效的熱激溫度是高于推薦用于實施重組病毒挽救的標(biāo)準(zhǔn)溫度的溫度，在該溫度下，重組病毒的回收水平得到提高。典型的溫度范圍清單如下從38到大約47℃，以大約42到大約46℃為更優(yōu)選。另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，43、44和45℃的熱激溫度是特別優(yōu)選的。采用多種方法測定所需重組犬熱病病毒的回收水平。正如在本文的實施例中所指出的，利用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報導(dǎo)基因監(jiān)測并優(yōu)化挽救重組病毒的條件。所述報導(dǎo)基因的相應(yīng)活性建立了重組病毒表達(dá)的基準(zhǔn)和檢測水平。其他方法包括檢測所獲得的重組病毒的噬斑數(shù)量，并通過測序證實所述挽救病毒的產(chǎn)生。在優(yōu)選實施方案中，對存在于所述宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染的挽救組合物實施一個噬斑擴(kuò)增步驟(即擴(kuò)增步驟)。將所述轉(zhuǎn)染的挽救組合物轉(zhuǎn)移到至少一層噬斑擴(kuò)增細(xì)胞(PE細(xì)胞)上。通過選擇一種犬熱病病毒或重組犬熱病病毒能在其中表現(xiàn)出增強(qiáng)了的生長的噬斑擴(kuò)增細(xì)胞，可以改善從所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中回收重組病毒。優(yōu)選將含有所述挽救組合物的轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)上鋪滿的PE細(xì)胞的單層上。在于1999年12月9日公開的國際專利申請?zhí)朩O99/63064中還提供了包括噬斑在內(nèi)的對挽救技術(shù)的各種改進(jìn)。另外，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在30-35℃的溫度下而不是在37℃下能增強(qiáng)微型復(fù)制子的(參見圖3B)。對于在較低溫度下實施犬熱病病毒挽救實驗來說，這一發(fā)現(xiàn)具有實用價值。盡管較低的培養(yǎng)溫度提高了微型復(fù)制子的活性，但是業(yè)已發(fā)現(xiàn)在較高溫度下進(jìn)行瞬時培養(yǎng)能提高CDV微型復(fù)制子活性。就熱激對微型復(fù)制子活性產(chǎn)生的正面影響來說，優(yōu)選將熱激步驟整合到本發(fā)明的犬熱病病毒挽救方法中。挽救方法優(yōu)選采用用于轉(zhuǎn)染方法的磷酸鈣技術(shù)。與脂質(zhì)體方法相比，磷酸鈣方法通常能將轉(zhuǎn)染實驗中CDV-陽性孔的數(shù)量增加大約2倍(資料未發(fā)表)。在分離高度減毒的菌株時，這一點可能是重要的。并不受以下理論的約束，磷酸鈣對細(xì)胞膜的損傷可能比脂質(zhì)體試劑的小，并且比較健康的細(xì)胞膜能促進(jìn)相對較少的挽救病毒的芽殖。同樣可能現(xiàn)實的是，磷酸鈣沉淀在將多種不同質(zhì)粒導(dǎo)入同一種細(xì)胞方面更為有效，并且它確實產(chǎn)生了更多的含有完整的N、P和L表達(dá)質(zhì)粒組以及基因組cDNA的細(xì)胞。優(yōu)選的病毒挽救方法包括上述技術(shù)中的若干種，如噬斑擴(kuò)增、熱激、鈣沉淀技術(shù)(10、31、40、42)，以及若干種重要改進(jìn)，如低溫培養(yǎng)。通過不同的技術(shù)組合，采用微型復(fù)制子可以嘗試優(yōu)化所述挽救方法，這樣能夠通過瞬時測定快速確定能影響基因表達(dá)水平的多種變數(shù)。例如，可以快速試驗用于挽救的各種因素，包括每一種表達(dá)載體(N、P和L)，以及復(fù)制子載體上的順式作用信號，以便評估其在挽救系統(tǒng)中的活性。人們還可以利用所述微型復(fù)制子系統(tǒng)確定最高微型復(fù)制子表達(dá)所需要的表達(dá)載體的最佳用量(參見圖2和3；資料未發(fā)表)。上述每一個優(yōu)化步驟都能對微型復(fù)制子表達(dá)產(chǎn)生有利的增強(qiáng)，并且綜合在一起之后能夠?qū)ν炀犬a(chǎn)生顯著作用。通過將兩種或兩種以上優(yōu)化的變數(shù)和技術(shù)組合在一起，人們可以顯著提高成功挽救病毒的百分比?？梢酝ㄟ^確定每一個平板上陽性孔的數(shù)量測定成功的比例。成功比例至少為大約50％，甚至高于60％。在其他實施方案中，成功比例至少為75％，更優(yōu)選至少為80％。與業(yè)已公開的挽救技術(shù)相比，這是一種實質(zhì)性的提高(例如，參見公開的國際專利申請?zhí)朩O99/63064)。對于犬熱病病毒來說，采用所述改進(jìn)方案優(yōu)化的挽救方法都能在轉(zhuǎn)染的6孔平板上產(chǎn)生4-6個CDV-陽性孔。相反，由免疫原性組合物形成的候選菌株，特別是含有理想減毒突變的菌株，復(fù)制非常差和/或難于挽救。用于提高挽救效率的特定技術(shù)可用于挽救任何非節(jié)段化的、負(fù)的單鏈RNA病毒。在下面提供了非節(jié)段化的負(fù)的單鏈RNA病毒的現(xiàn)行分類學(xué)分類，同時提供了每一種類型的例子。單鏈負(fù)病毒綱的非節(jié)段化負(fù)的單鏈RNA病毒的分類副粘液病毒科副粘液病毒亞科呼吸道病毒屬(以前稱之為副粘液病毒)仙臺病毒(小鼠副流感病毒1型)人副流感病毒(PIV)1型和3型牛副流感病毒(BPV)3型Rubulavirus屬猴病毒5(SV5)(犬副流感病毒2型)腮腺炎病毒新城病病毒(NDV)禽副粘液病毒1人副流感病毒(PIV-2、4a和4b型)麻疹病毒屬麻疹病毒(MV)海豚麻疹病毒犬熱病病毒(CDV)Pestedespetits反芻動物病毒海豹熱病病毒牛瘟病毒肺炎病毒亞科肺炎病毒屬人呼吸道合胞病毒(RSV)牛呼吸道合胞病毒小鼠肺炎病毒火雞鼻氣管炎病毒棒狀病毒科狂犬病病毒屬狂犬病病毒水皰病毒屬水皰性口炎病毒(VSV)短時病病毒屬牛短時熱病毒纖絲病毒科纖絲病毒屬青猴病病毒為了提高上述任意一種病毒的病毒挽救效率，人們可以改變N、P和L表達(dá)載體的數(shù)量以及完整長度cDNA的微型復(fù)制子的數(shù)量，以便產(chǎn)生使得人們能夠挽救所述重組病毒的量。人們可以采用下面的兩個或兩個以上步驟和/或技術(shù)來提高挽救效率(1)篩選用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型(優(yōu)選Vero細(xì)胞、HEp2或A549細(xì)胞)；(2)選擇轉(zhuǎn)染試劑(優(yōu)選使用磷酸鈣試劑)；(3)篩選用于實施噬斑擴(kuò)增步驟的最佳細(xì)胞類型；和(4)篩選用于改善轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型。另外，通過采用下面的一個或多個步驟和/或技術(shù)，可以進(jìn)一步提高挽救效率(1)改變用于特定細(xì)胞類型和挽救系統(tǒng)的培養(yǎng)溫度；(2)改變所施加的熱激時間(優(yōu)選在轉(zhuǎn)染開始之后大約2-大約4小時開始施加熱激)；(3)改變熱激溫度(優(yōu)選大約42-大約44℃)和(4)改變熱激時間(優(yōu)選大約2-大約3小時)。通過選擇合適數(shù)量的T7聚合酶源，如MVA/T7或重組痘苗病毒，和/或通過細(xì)胞接觸轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染中的DNA的時間，還可以獲得挽救效率的進(jìn)一步提高。用本發(fā)明方法制備的重組犬熱病病毒被用于診斷、預(yù)防和治療目的。用本發(fā)明方法制備的重組病毒優(yōu)選是減毒的。所述減毒的重組病毒與感染人和動物宿主的野生型病毒相比表現(xiàn)出毒力的明顯減弱。減毒的程度是這樣的在大多數(shù)個體上不會出現(xiàn)感染癥狀，不過所述病毒保留了足夠的復(fù)制能力，以便具有感染性并且產(chǎn)生所需免疫原性組合物的理想免疫反應(yīng)?？蓪⑺鰷p毒重組病毒單獨或者作為免疫原性組合物與藥物、抗原、免疫制劑或佐劑結(jié)合用于預(yù)防或減輕疾病。所述活性制劑可以用常規(guī)方法制備和輸送，即通過使用稀釋劑或可以藥用的載體。本發(fā)明的另一種實施方案涉及將未減毒的或減毒的重組生產(chǎn)的犬熱病病毒用于免疫原性組合物中，該組合物包括(i)至少一種重組生產(chǎn)的犬熱病病毒，和(ii)至少一種可以藥用的緩沖劑或稀釋劑、佐劑或載體。所述組合物優(yōu)選具有治療和預(yù)防用途，作為免疫原性組合物用于預(yù)防和/或緩解犬熱病感染。在這種用途中，使用免疫學(xué)有效量的至少一種本發(fā)明的重組犬熱病病毒，以便在正常犬熱病感染的過程中導(dǎo)致明顯的減輕。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，所述免疫原性組合物的配方是眾所周知的。本發(fā)明的免疫原性組合物可以含有其他抗原性成分(例如，多肽或其片段，或編碼一種抗原或其片段的核酸)，并且優(yōu)選含有可以藥用的載體。合適的可以藥用的載體和/或稀釋劑包括常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、填充劑、固體載體、水溶液、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等的任一種和全部。術(shù)語“可以藥用的載體”表示不會在服用它的患者體內(nèi)導(dǎo)致過敏反應(yīng)或其他不希望的效應(yīng)的載體。例如，合適的可以藥用的載體包括以下成分中的一種或多種水、鹽水、磷酸緩沖的鹽溶液、葡萄糖、甘油、和乙醇等及其組合?？梢运幱玫妮d體還可以包括微量輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，這些物質(zhì)能延長所述抗原的貨架壽命或加強(qiáng)其效果。將所述介質(zhì)和試劑用于具有藥理學(xué)活性的物質(zhì)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。任何常規(guī)介質(zhì)或試劑都可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中，除非它與所述活性成分不兼容。所述免疫原性組合物的服用可以通過任何常規(guī)有效方式進(jìn)行，如鼻內(nèi)、腸胃外、口腔或局部用于粘膜表面，如通過氣溶膠噴霧用于鼻腔、口腔、眼睛、肺、陰道或直腸表面。優(yōu)選的服用方法是腸胃外或鼻內(nèi)?？诜苿┌ㄟ@些正常使用的賦形劑，例如，藥用級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂等。本發(fā)明的免疫原性組合物可以包括佐劑，包括，但不限于氫氧化鋁；磷酸鋁；StimulonTMQS-21(AquilaBiopharmaceuticals，Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)；MPLTM(3-O-脫酰化單磷酸脂A；RIBIImmunoChemResearch，Hamilton，MT)；IL-12(遺傳學(xué)研究所，劍橋，MA)；N-乙酰-肉桂酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰-正肉桂酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，被稱為正-MDP)；N-乙酰-正肉桂酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，被稱為MTP-PE)；和霍亂毒素。可以使用的其他成分是霍亂毒素的無毒衍生物，包括它的B甲基(例如，其中位于29號氨基酸位置上的谷氨酸被另一種氨基酸取代，優(yōu)選被組氨酸取代，參見公開的專利申請?zhí)朩O00/18434，該專利被收作本文參考)，和/或非犬熱病多肽與霍亂毒素或其B亞基、procholeragenoid、真菌多糖的結(jié)合物或遺傳工程產(chǎn)生的融合體。本發(fā)明的重組生產(chǎn)的減毒犬熱病病毒可以作為免疫原性組合物中的唯一活性免疫原服用，不過，所述免疫原性組合物還可以包括其他活性免疫原，包括上文所述的針對其他致病物種的其他免疫活性抗原。所述其他免疫活性抗原可以是復(fù)制型抗原或非復(fù)制型抗原。其他免疫活性抗原可以是定向針對多種傳染劑的抗原(1，7)。所述免疫原性組合物可用于治療多種動物，包括陪伴動物，如狗(犬)和貓，并且還可以治療家畜，如牛、豬和馬。本發(fā)明的一個重要方面涉及一種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給所述哺乳動物提供本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟。所述免疫原性組合物是一種在接受治療的動物或人體內(nèi)具有免疫原性的組合物，以便該組合物中所含的免疫有效量的多肽能產(chǎn)生針對犬熱病感染的理想反應(yīng)。優(yōu)選實施方案涉及一種用于治療(包括緩解)或預(yù)防動物感染犬熱病的方法，該方法包括給動物服用免疫有效量的所述抗原性組合物，有關(guān)劑量可以根據(jù)個體的具體情況而改變。該劑量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)實驗來確定?？梢杂帽景l(fā)明的免疫原性組合物治療動物甚至是人。當(dāng)然，可以治療多種動物?？梢灾委煹膭游锇ㄅ惆閯游铮鐚櫸锕?，以及野生動物，如狐貍、狼和草原狼。由于業(yè)已報導(dǎo)了甚至是小熊貓也易感犬熱病病毒，人們可以治療生活在圈養(yǎng)區(qū)或環(huán)境中的任何動物，如在動物園或野生動物園中的動物。業(yè)已報導(dǎo)過犬熱病病毒在海豹和諸如水貂、雪貂和浣熊的食肉動物中爆發(fā)，其中任意一種動物都可以成為本發(fā)明所述治療的目標(biāo)動物。提供下面的實施例是為了說明本發(fā)明的某些實施方案。不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本說明書之后可以理解的是，在不超出本發(fā)明構(gòu)思或范圍的前提下，可以對所披露的具體實施方案進(jìn)行多種改變，而仍然能獲得類似或相似結(jié)果。實施例例1材料和方法細(xì)胞和病毒在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中維持HEp2、A549、Vero、B95-8和雞胚胎成纖維(CEF)細(xì)胞。在補(bǔ)充了5％FBS的改進(jìn)的基本必需培養(yǎng)基(SMEM)中生長HeLa懸浮細(xì)胞。按以前披露的方法(46)在HeLa細(xì)胞中繁殖實驗室改良的OnderstepoortCDV菌株(17)。第二種實驗室改良的Onderstepoort菌株是由蘇黎士大學(xué)的MartinBilleter博士提供的，并且在B95-8細(xì)胞中繁殖。在CEF細(xì)胞中繁殖為了表達(dá)T7RNA聚合酶基因而設(shè)計的重組減毒痘苗病毒菌株MVA/T7(從B.Moss博士處獲得，國家健康研究所，Bethesda，MD；參見Wyatt等，1995；參考文獻(xiàn)61)。在CEFs上滴定MVA/T7母液。在HeLa懸浮細(xì)胞中生長麻疹病毒(MV)的實驗室改良的Edmonston菌株(55)。重組DNA分子克隆方法是按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行的(2，26，71)。1A-完整長度的CDVcDNA克隆完整長度的CDVcDNA克隆是利用出現(xiàn)在有關(guān)基因組中的常見限制位點，由6個RT-PCR片段組裝而成的(圖1A)?？寺∷霾《綾DNA，使T7RNA聚合酶啟動子與正的基因組鏈的5’末端融合，而3’末端的旁側(cè)是肝炎Δ病毒核酶和兩個T7轉(zhuǎn)錄終止子。通過去掉3個G殘基，在3’末端將T7RNA聚合酶啟動子截短。這3個殘基通常提供了優(yōu)選的T7聚合酶轉(zhuǎn)錄起始位點，這樣，轉(zhuǎn)錄物的大部分將始于所述正的基因組鏈上的第一個A殘基。制備含有單一的NotI和NarI位點的質(zhì)粒載體，以便克隆CDV完整長度的基因組克隆。在CDV基因組中缺乏NotI和NarI限制位點，這使得它們成為用于載體主鏈中的方便位點。這種修飾過的載體DNA是通過PCR制備的。設(shè)計引物，以便由以前披露的麻疹病毒微型復(fù)制子質(zhì)粒擴(kuò)增所述載體主鏈(圖1，p802參考文獻(xiàn)45)。所述引物能指導(dǎo)所述載體主鏈擴(kuò)增，并且排除了麻疹病毒微型復(fù)制子序列。擴(kuò)增的DNA保留了位于核酶序列上的NarI位點，并且產(chǎn)生了一個NotI位點(參見圖1A中的NotI和NarI位點)。該引物還包括為了在NotI和NarI位點產(chǎn)生一個多接頭而設(shè)計的5’延伸部分，一旦連接所述擴(kuò)增的DNA，就使所述擴(kuò)增的載體主鏈環(huán)化，以便用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化。所述多接頭所包括SalI、NdeI、DraIII、BsiWI和SgrAI位點有利于克隆由所述病毒基因組擴(kuò)增的片段(圖1A)。將完整長度的基因組cDNA擴(kuò)增到上述載體上(圖1A)。完整的CDVcDNA序列有15690個堿基，這是一個可以用6除盡的數(shù)字，符合rule-of-six(6，23)。所述病毒cDNA在質(zhì)粒pPS-rCDV(圖1A)中的取向允許通過T7RNA聚合酶合成正拷貝的CDV基因組。為了制備基因組cDNA質(zhì)粒，在逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增(RT/PCR)之后，由純化的病毒RNA依次克隆所述CDV基因組的6個片段(CDV)(46)。所擴(kuò)增的第一個基因組cDNA片段與圖1A中的NarI/SgrAI片段相同(CDV，SEQIDNO2的13089-15690號核苷酸)。用于擴(kuò)增CDVcDNA的3’末端的引物互補(bǔ)于CDV的末端，并且包括一個延伸部分，該部分包括跨越NarI位點的核酶序列(cagccggcgccagcgaggaggctgggaccatgccggccACCAGACAAAGCTGGGT，SEQIDNO6，其中CDV序列用大寫字母表示)。第二種引物跨越所述病毒基因組上的SgrAI位點(ATACTCAAGTCAAATACTCAGGGAC，SEQIDNO7)。用NarI和SgrAI消化擴(kuò)增的片段，并且克隆到所述載體主鏈上。然后將該質(zhì)粒用于克隆在跨越SgrAI和BsiWI位點的下一個片段(10136-13088；引物CAGGGGTGCTTTTCTGAGTCACTGC，SEQIDNO8和ACGACCTTTCTGAGCCCTGGGACTC，SEQIDNO9)。類似地，依次擴(kuò)增BsiWI-DraIII片段(8666-13015號核苷酸；引物AGAGGAGACCAGTTCACTGTACTCC，SEQIDNO10和TGATTCCCTCCCCTGAGGCATGAGC，SEQIDNO11)、NdeI/DraIII片段(5845-8665號核苷酸；引物GCAATCCAATCTCTTAGAACCAGCC，SEQIDNO12和TCGAATCTGTAAAATTGGTGACACC，SEQIDNO13)和SalI和NdeI片段(2962-5844號核苷酸；引物GCCATTACTAAACTAACTG，SEQIDNO14和CTCTTATGAATTTCTCCTCC，SEQIDNO15)，并添加到生長的cDNA克隆中。最后擴(kuò)增含有T7啟動子和CDV1-296號核苷酸的NtoI/SalI(引物ATGGGTTTCAGCTGGAGGTCTCTC，SEQIDNO16和cggcgccgcgtaatacgactcactataACCAGACAAAGTTGGCT，SEQIDNO17，其中，CDV核苷酸用大寫字母表示，并且添加到基因組cDNA克隆中。對完整的基因組cDNA質(zhì)粒進(jìn)行測序，并且與CDV基因組保守序列進(jìn)行比較。由此發(fā)現(xiàn)了多個核苷酸改變，這些改變很有可能是通過RT/PCR擴(kuò)增導(dǎo)入的。由于氨基酸密碼子的專一性，蛋白編碼區(qū)上的某些堿基變化是沉默的。不修復(fù)這些堿基取代；將其用作有用的“標(biāo)記”，以便鑒定重組病毒。另外，還在位于M和F基因之間的基因間區(qū)(M/F基因間區(qū))的6837號核苷酸上發(fā)現(xiàn)了一個非編碼區(qū)堿基的改變，該堿基取代沒有被修復(fù)。影響密碼子專一性的堿基取代，可以通過寡核苷酸誘變或通過用獨立RT-PCR擴(kuò)增的DNA片段取代突變區(qū)而修復(fù)。寡核苷酸誘變是這樣進(jìn)行的首先亞克隆需要堿基校正的片段，然后使用QuickChange(Stratagene)或Morph(5prime-3prime，Inc)誘變試劑盒進(jìn)行校正。然后將校正的片段送回所述完整長度的克隆中。對修復(fù)的完整長度克隆進(jìn)行測序，以便證實誘變的校正。1B-CDV微型復(fù)制子同樣用用于完整長度cDNA克隆的質(zhì)粒載體制備含有CDV微型復(fù)制子(CDV-CAT)序列的pCDV-CAT。構(gòu)成CDV微型復(fù)制子的序列包括CAT基因，在報導(dǎo)基因的5’末端是以CDV前導(dǎo)序列為旁側(cè)序列，而在其3’末端是CDV尾隨序列(圖1B)。將CDV微型復(fù)制子以與完整長度克隆相反的方向插入T7聚合酶啟動子和核酶之間。因此，T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了負(fù)鏈微型基因組RNA的等同物。將所述CDV微型復(fù)制子克隆到上述載體主鏈上。用于克隆的微型復(fù)制子DNA是通過PCR制備的。CAT基因的5’末端以CDV前導(dǎo)序列和核酶序列為旁側(cè)序列(包括NarI位點)，而CDV尾隨序列和T7啟動子位于3’末端(圖1B)。它是通過4個嵌套PCR反應(yīng)產(chǎn)生的。簡單地講，用4套不同的引物CAT基因進(jìn)行4次不同的擴(kuò)增。第一套引物定向擴(kuò)增CAT基因，同時通過整合在CAT基因?qū)Ｒ恍砸?’末端的序列在PCR產(chǎn)物上添加前導(dǎo)和尾隨序列部分。下一輪PCR使用的引物與第一套引物重疊，同時添加來自CDV前導(dǎo)和尾隨序列的其他序列。將這種使用重疊引物進(jìn)行5’延伸的方案重復(fù)4次，使用選自下面列舉的引物質(zhì)粒微型復(fù)制子5’末端引物A65CDV107CDVCAT基因5’末端||GATCCTACCTTAAAGAACAAGGCTAGGGTTCAGACCTACCAATATGGAGAAAAAAATCACSEQIDNO.18B26CDVCDV85||TTAAATTATTGAATATTTTATTAAAAACTTAGGGTCAATGATCCTACCTTAAAGAACAAGSEQIDNO.19C1CDVCDV57||ACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATAGTTAAATTATTGAATATTTTATTAAAAACTTAGSEQIDNO.20D核酶序列CDV1CDV24NarI||GGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATASEQIDNO.21E核酶序列CDV1CDV24NarI||ATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCCATGCCGGCCACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATASEQIDNO.22質(zhì)粒微型復(fù)制子3′末端引物F15624CDVCDV15584CAT基因3’末端||TAGCAATGAATGGAAGGGGGCTAGGAGCCAGACTAACCTGTCATTACGCCCCGCCCTGC來自CDVL基團(tuán)的終止密碼子******來自CAT的終止密碼子SEQIDNO.23G15666CDVCDV15608||ACTTATTAATAACCGTTGTTTTTTTTCGTATAACTAAGTTCAATAGCAATGAATGGAAGGSEQIDNO.24H15690CDVCDV15640||CTCACTATAACCAGACAAAGCTGGGTATGATAACTTATTAATAACCGTTGTTTTTTTTCGSEQIDNO.25I15690CDVCDV15662HindIIIT7啟動子||ATTGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAGACAAAGCTGGGTATGATAACTTATSEQIDNO.26J15690CDVCDV15661NotIT7啟動子||ATTGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAGACAAAGCTGGGTATGATAACTTATSEQIDNO.274輪嵌套PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的微型復(fù)制子片段包括5’-NarI位點-33bp的核酶序列-CDV前導(dǎo)序列-CAT基因-CDV尾隨序列-T7啟動子-HindIII位點。以上4輪嵌套PCR擴(kuò)增是用以下引物對進(jìn)行的第一輪引物A+F；第二輪引物B+G；第三輪引物C+H；第四輪引物D+I。人們可以發(fā)現(xiàn)，引物F在CT基因的3’末端決定兩種終止密碼子。一種是CAT基因終止密碼子，而另一種則來自CDV基因組的L基因。這兩種終止密碼子進(jìn)行簡單地整合，以便引入3個額外的核苷酸(第二種終止密碼子)，使得該微型基因組遵循rule-of-six(6，23)。此時，最初的計劃是使用在圖1B中的NtoI位點上含有HindIII位點的載體。因此，上面所列舉的引物I含有HindIII位點。在所述載體上使用NtoI位點的決定，導(dǎo)致了進(jìn)行第五輪PCR，以便制備含有NtoI位點的微型復(fù)制子片段。為了引入NtoI位點，用引物E和J(J包括NtoI位點)擴(kuò)增所述微型復(fù)制子DNA。最后，上面使用的引物在CDV微型復(fù)制子上整合了一個野生型T7啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQIDNO28，參見引物H、I和J)。由于在轉(zhuǎn)染實驗中具有較差的微型復(fù)制子活性，因而導(dǎo)致了對微型復(fù)制子進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，以便消除T7啟動子3’末端的3個G殘基(斜體)。T7啟動子上的這些殘基由所述聚合酶精確拷貝，并且整合到微型復(fù)制子轉(zhuǎn)錄物上。由此產(chǎn)生了不遵循rule-of-six的微型復(fù)制子RNA(6，23)。T7啟動子的截短，降低了啟動子活性，不過產(chǎn)生了一種遵循rule-of-six的微型復(fù)制子轉(zhuǎn)錄物。使用類似于E和J的引物，通過PCR擴(kuò)增制備修飾過的微型復(fù)制子，修飾過的引物J缺少以上3個G殘基。1C-用于表達(dá)異源核酸或基因序列的CDV結(jié)構(gòu)。對基因組cDNA克隆的P和M基因之間的部分進(jìn)行修飾，以便能夠插入外源基因。對修飾進(jìn)行選擇，以便能夠?qū)肴舾瑟毺氐南拗莆稽c，同時又能對CDV序列產(chǎn)生最小的改變。引入8種核苷酸取代，產(chǎn)生3種獨特的限制位點(3330G→A，3331G→A，3335T→C，3348A→G，3349A→G，3355G→C，3373T→A和3377T→G)。這些修飾在CDV的3329-3377號核苷酸位置之間產(chǎn)生了三種獨特的限制位點(AatII，F(xiàn)seI和MluI，圖5A)。在緊靠AatII位點的3’末端增加第九種堿基改變(3337A→T)，以便剔除為了產(chǎn)生AatII位點而進(jìn)行的核苷酸改變時所產(chǎn)生的SalI位點。首先在包括P和M基因間區(qū)的質(zhì)粒亞克隆上進(jìn)行核苷酸取代(2961號位置上的SalI改變成5843號位置上的NdeI)。將來自所述亞克隆的修飾過的片段交換送回到完整長度的基因組克隆上，將所述新的限制酶位點定位在P基因開放讀框的3’末端和P/M基因-末端/基因-啟動信號的5’末端。該片段(pBS-rCDV+)的成功挽救，表明了所述堿基取代沒有對所述病毒產(chǎn)生顯著的破壞作用。然后將克隆pBS-rCDV+用作載體，用于插入外源基因。用引物(5’末端，TACTGGCCGGCCATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACAT，SEQIDNO29；3’末端，ACGCGTTTTACAATTTGGACTTTACGC，SEQIDNO30)擴(kuò)增來自pGL2-luc(Promega)的熒光素酶基因，在熒光素酶基因上整合了一個5’FseI位點和3’MluI位點。對熒光素酶編碼區(qū)的氨基末端專一的5’末端引物還包括一個5’延伸部分，該部分除了FseI位點之外，還包括一個拷貝的來自P/M基因間區(qū)的GE/GS信號(圖5A)。對用于擴(kuò)增熒光素基因的引物進(jìn)行設(shè)計，以便在最終將它插入pBS-rCDV+內(nèi)產(chǎn)生pBS-rCDV-P/luc/M時產(chǎn)生一種遵循rule-of-six的片段(23)(圖5A)。1D-表達(dá)載體pCDV-N、pCDV-P和pCDV-L如圖1C所示，通過將N(108-1679號核苷酸)、P(801-3324)或L(9029-15584)編碼序列插入基于pTM-1(29，41)的載體，制備表達(dá)載體pCDV-N、pCDV-P和pCDV-L。該載體含有腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)上游的T7RNA聚合酶啟動子。將位于IRES3’末端的NcoI位點用于克隆，并且還包括ATG起始密碼子。一個合成的聚腺苷酸片段位于所述克隆片段的3’末端，隨后是一個T7RNA聚合酶終止子。所述N、P和L基因插入片段是通過PCR擴(kuò)增制備的。所述N和P基因是通過RT/PCR由感染的細(xì)胞RNA擴(kuò)增的。所述L基因是由完整長度的CDVcDNA克隆通過PCR擴(kuò)增的。在PCR期間引入的錯誤，通過用由獨立的PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的片段取代突變的序列或者通過寡核苷酸定向誘變而修復(fù)。在由感染的細(xì)胞RNA進(jìn)行RT/PCR擴(kuò)增之后，將來自實驗室改良的Edmonston菌株的MVN、P和L基因(55)克隆到T7載體上。1E-DNA測序和序列驗證使用染料終止子/TaqDNA聚合酶試劑盒(ABI)通過循環(huán)測序(16，24)測定克隆在表達(dá)載體上的基因的序列、pCDV-CAT的序列、和完整長度基因組克隆的序列。在microspinG50柱(Amersham-PharmaciaBiotech)純化測序反應(yīng)物，并且在ABI377自動測序儀(ABI)上分析。用MacVector(牛津分子)通過計算機(jī)分析分析序列數(shù)據(jù)。通過直接由擴(kuò)增的RT/PCR產(chǎn)物制備共有序列，驗證CDVOnderstepoort菌株的基因組序列(36)。簡單地講，使用Trizol試劑(LifeTechnologies)通過胍-苯酚-氯仿提取方法(9)，從感染的細(xì)胞中提取RNA。使用基因?qū)Ｒ恍砸锖蚐uperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)對純化的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后用基因?qū)Ｒ恍砸锖蚑aqDNA聚合酶(ABI)擴(kuò)增基因組片段，然后進(jìn)行凝膠純化。按上述方法對純化的PCR片段進(jìn)行循環(huán)測序和分析。驗證挽救的CDV通過DNA測序分析重組CDV(rCDV)分離物基因組上的序列標(biāo)記或分析限制酶位點標(biāo)記的存在。利用14個核苷酸位點區(qū)分在實驗室中使用的rCDV和CDV菌株。通過上述胍-苯酚-氯仿提取分離感染細(xì)胞的RNA。使用TitanonetubePCR試劑盒(Roche分子生物學(xué))通過RT-PCR擴(kuò)增含有合適的序列標(biāo)記的基因組區(qū)。用于驗證污染質(zhì)粒DNA存在的負(fù)對照(-RT)是通過在RT步驟之后添加RNA進(jìn)行的，它是在單一試管反應(yīng)系統(tǒng)中完成的。按上述方法對PCR片段進(jìn)行測序，或者用合適的限制酶消化擴(kuò)增的片段(圖4B)。通過序列分析分析含有熒光素酶基因的rCDV基因組(rCDV-P/luc/M)，以便驗證熒光素酶基因是正確插入的。還要分析用rCDV-P/luc/M分離物感染的細(xì)胞對熒光素酶的表達(dá)。用Reporter裂解緩沖液(PromegaMadison，Wisc.)制備感染細(xì)胞提取物，并用購自Pharmingen的試劑和分析熒光素實驗室發(fā)光計(Pharmingen，SanDiego，CA)分析熒光素酶活性。例2通過CAT測定進(jìn)行的瞬時表達(dá)分析和病毒挽救的一般方法通過若干種方法進(jìn)行微型復(fù)制子轉(zhuǎn)染。對于用CDV微型復(fù)制子作為RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染的實驗來說，用Lipofectace(LifeTechnologies)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。微型復(fù)制子RNA是用pCDV-CATDNA(圖1B)作轉(zhuǎn)錄模板，通過T7RNA聚合酶在體外制備的(2)。使用Megascript試劑盒(Ambion)中的試劑和方法合成并純化RNA。在由CDV感染提供的補(bǔ)償?shù)奈⑿蛷?fù)制子實驗中(圖2A)，RNA轉(zhuǎn)染混合物的成分是用兩只試管制備的。一只試管裝有20微克純化的微型復(fù)制子RNA和100微升無血清OptiMEM(LifeTechnologies)。第二只試管是用100微升無血清OptiMEM和9-12微升Lipofectace(LifeTechnologies)制備的。然后混合兩只試管中的內(nèi)含物，并且在室溫下培養(yǎng)30-40分鐘。在轉(zhuǎn)染之前，從293細(xì)胞單層中除去培養(yǎng)基(在60毫米的培養(yǎng)皿上達(dá)到大約80％的鋪滿度)，并且用無血清OptiMEM洗滌細(xì)胞1次。然后將RNA轉(zhuǎn)染混合物與含有足夠CDV(Onderstepoort)的0.8毫升無血清OptiMEM混合，以便以每個細(xì)胞大約2個噬斑形成單位(pfu)的感染復(fù)數(shù)(moi)感染所述單層。然后將1毫升該轉(zhuǎn)染混合物添加到細(xì)胞單層上，并且在37℃下培養(yǎng)5小時。在經(jīng)過5小時培養(yǎng)之后，將1毫升補(bǔ)充了20％SBS的TMEM添加到所述細(xì)胞中，并且繼續(xù)培養(yǎng)過夜。在轉(zhuǎn)染之后大約24小時制備細(xì)胞提取物，此時有超過70％的細(xì)胞單層表現(xiàn)出細(xì)胞融合。基本上按以前披露的方法進(jìn)行CAT測定(35)。在某些實驗中(圖3)，用熒光底物取代C14-標(biāo)記氯霉素底物(20，62)，并且按照底物生產(chǎn)商的方法對測定方法進(jìn)行改進(jìn)(FastCATYellow或FastCATGreen；MolecularProbes)。在FlourImager(MolecularDynamics)上分析熒光CAT測定的產(chǎn)物，并且用ImageQunt軟件(MolecularDynamics)進(jìn)行定量。另外用N、P和L表達(dá)質(zhì)粒對RNA微型基因組進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。該轉(zhuǎn)染基本是按上述方法進(jìn)行的，所不同的是，將RNA與合適的質(zhì)粒DNA(1微克pCDV-N和pCDV-P，2納克pCDV-L)、100微升無血清OptiMEM和20微升Lipofectace(LifeTechnologies)混合。在轉(zhuǎn)染之前1小時，用MVA/T7以每個細(xì)胞5個pfu的感染復(fù)數(shù)感染293細(xì)胞單層，以便提供用于轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)粒的T7RNA聚合酶。對上述轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行改進(jìn)，以便用于DNA微型復(fù)制子轉(zhuǎn)染，并且按照類似于Whitehead等所披露的方法(59)。在這些實驗中，我們將293細(xì)胞換成HEp2或A594細(xì)胞，因為我們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞明顯更能抗MVA/T7感染。用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通常為大約70-90％的鋪滿度。在添加15微升Lipofectace(LifeTechnologies)之前，通過在200微升無血清OptiMEM中混合微型復(fù)制子DNA(10納克pCDV-CAT)和表達(dá)質(zhì)粒(400納克pCDV-N、300納克pCDV-P、50-100納克pCDV-L)制備轉(zhuǎn)染混合物。在室溫下將該混合物培養(yǎng)20-30分鐘。制備足夠量的獨立的MVA/T7混合物，以便提供0.8微升含有足夠MVA/T7無血清OptiMEM，以每個細(xì)胞大約2-5pfu的感染復(fù)數(shù)感染6孔平板的每一個孔。在開始轉(zhuǎn)染之前，除去單層中的培養(yǎng)基，并將轉(zhuǎn)染混合物添加到800微升MVA/T7混合物中，將合并后的1微升混合物添加到細(xì)胞中。在培養(yǎng)一夜之后，用補(bǔ)充了10％FBS的DMEM取代所述轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并且再培養(yǎng)一天。在開始轉(zhuǎn)染之后大約48小時，按上述方法收獲細(xì)胞，并制備提取物用于CAT活性分析。正如在圖例中所標(biāo)明的，大體上按下文所述的磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行某些微型復(fù)制子實驗(圖3B)，進(jìn)行病毒挽救。用于病毒挽救的細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要是通過磷酸鈣方法進(jìn)行的。我們還采用了上述Lipofectace方法，但是發(fā)現(xiàn)，與一個熱激步驟組合的磷酸鈣方法(35)更為有效。在轉(zhuǎn)染之前，在6孔平板中的A549細(xì)胞或HEp2單層的鋪滿度為75-90％。在轉(zhuǎn)染之前1-2小時，用4.5毫升含有10％FBS的DMEM飼養(yǎng)所述細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移到設(shè)定為3％二氧化碳的培養(yǎng)箱中。正常情況下，該培養(yǎng)箱的溫度也被設(shè)定為32℃而不是37℃，因為微型復(fù)制子實驗表明，這種較低的溫度有可能獲得較高水平的挽救(圖3A)。通過首先在5毫升的聚丙烯試管中混合完整長度的CDV質(zhì)粒(5微克)和400納克pCDV-N、300納克pCDV-P和100納克pCDV-L，并用水將最終體積調(diào)整到225微升制備磷酸鈣-DNA沉淀物。然后將25微升的2.5M氯化鈣添加到所述DNA溶液中。最后，將250微升的2×BES緩沖的鹽溶液(50mMBES[pH6.95-6.98]，1.5mM磷酸氫二鈉，280mM氯化鈉)滴加到所述試管中，同時輕輕渦攪拌該混合物。在室溫下讓沉淀物形成20-30分鐘。然后將所述沉淀物滴加到培養(yǎng)基中，接著添加足夠量的MVA/T7，以便提供1-3的MOI。在將所述細(xì)胞送回到設(shè)定為3％二氧化碳的培養(yǎng)箱中之前，輕輕搖晃所述平板，以便確保培養(yǎng)基、磷酸鈣-DNA沉淀物和MVA/T7均勻混合。在開始轉(zhuǎn)染3小時之后，將所述6孔平板密封在拉鏈封口的塑料袋中，并且在設(shè)定為43-44℃的水浴中浸泡2小時。在熱激之后，將細(xì)胞送回到設(shè)定為3％二氧化碳的32℃的培養(yǎng)箱中。次日，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并且用hepes-緩沖的鹽溶液(10mMhepes[pH7.0]，150mM氯化鈉，1mM氯化鎂)洗滌細(xì)胞，并且用2-3毫升補(bǔ)充了10％FBS的DMEM飼養(yǎng)。在32℃下將所述細(xì)胞再培養(yǎng)24-48小時。在轉(zhuǎn)染開始之后48-72小時，將所述細(xì)胞刮入所述培養(yǎng)基中，并且轉(zhuǎn)移到裝有Vero細(xì)胞的70-80％鋪滿單層和10毫升培養(yǎng)基的10厘米的平板上，以便開始培養(yǎng)(35)。在開始培養(yǎng)之后3-5小時，用10毫升含有10％FBS的DMEM取代所述培養(yǎng)基。在4-6天之后，出現(xiàn)了噬斑。通過將細(xì)胞刮入所述培養(yǎng)基并且在-80℃下冷凍回收挽救的病毒用于隨后的分析。例3CDV微型復(fù)制子表達(dá)。對于開發(fā)病毒挽救系統(tǒng)來說，用微型復(fù)制子報導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行瞬時表達(dá)研究是重要的，通過微型復(fù)制子報導(dǎo)基因分析瞬時表達(dá)，可以比較迅速地評估轉(zhuǎn)染參數(shù)，以便確定最佳條件，并且它還是用于確定N、P和L表達(dá)載體是否能指導(dǎo)合成有功能的蛋白的有價值的工具。3.1通過病毒挽救CDV微型復(fù)制子3.1.1該微型復(fù)制子實驗檢驗了CDV-CAT微型復(fù)制子是否能發(fā)揮其通過病毒補(bǔ)償挽救的能力。將體外合成的CDV-CAT微型復(fù)制子RNA(20微克)轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞的60毫米的培養(yǎng)皿中，在轉(zhuǎn)染開始時，同樣用相近的CDV以大約2的感染復(fù)數(shù)感染所述細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之后大約24小時，當(dāng)大約70％的細(xì)胞已經(jīng)整合成合胞體時，制備細(xì)胞提取物，并且分析CAT活性(圖2A)。在圖2A中示出了表示CAT測定結(jié)果的放射性自顯影圖。在用微型復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染的CDV感染的細(xì)胞中很容易檢測到CAT活性，這表明該微型復(fù)制子是有功能的(圖2A，泳道2)。用RNA轉(zhuǎn)染但沒有用CDV感染的對照細(xì)胞不能產(chǎn)生可檢測的CAT活性(圖2A，泳道1)，這表明CAT活性明顯是由于所述微型復(fù)制子的復(fù)制和表達(dá)所導(dǎo)致的。3.1.2在確定了當(dāng)提供由互補(bǔ)的病毒表達(dá)的反式作用蛋白時CDV微型復(fù)制子RNA是有功能的之后，我們隨后檢驗了N、P和L蛋白表達(dá)載體提供補(bǔ)償作用的能力(圖1A)，用微型復(fù)制子RNA(20微克)和pCDV-N(1微克)、pCDV-P(1微克)和pCDV-L(用量如圖2B所示)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染之前1小時，用MVA-T7以5的感染復(fù)數(shù)感染用于本實驗中的293細(xì)胞，以便提供由所述質(zhì)粒載體表達(dá)N、P和L蛋白所必需的T7RNA聚合酶。分析來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取物的CAT活性表明，所述表達(dá)質(zhì)粒能有效提供補(bǔ)充作用(圖2B)。在使用50和100納克的pCDV-L表達(dá)質(zhì)粒時就能檢測到指示微型復(fù)制子復(fù)制和表達(dá)的CAT活性(圖2B)，并且在100納克的用量下活性最大。超過100納克的L表達(dá)質(zhì)粒具有抑制作用(圖2B，泳道5)。正如所預(yù)料的，在僅接受微型復(fù)制子RNA(圖2B，泳道1)或不接受L蛋白表達(dá)載體(圖2B，泳道2)的負(fù)對照轉(zhuǎn)染中，檢測到很少CAT活性或沒有該活性。3.1.3CDV微型復(fù)制子DNA的挽救用于最終的微型復(fù)制子實驗中的條件更接近于用于挽救完整長度病毒的條件，因為是將微型復(fù)制子質(zhì)粒DNA而不是RNA與N、P和L的表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。因此，復(fù)制子RNA的合成取決于T7RNA聚合酶的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。圖3A中的結(jié)果表明，在微型復(fù)制子DNA轉(zhuǎn)染之后可以獲得微型復(fù)制子活性。另外，為了驗證微型復(fù)制子的活性可能具有某種溫度敏感性的可能性，我們在不同溫度下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖3A)。在6孔平板中轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，并且在32℃或37℃下培養(yǎng)。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒微型復(fù)制子pCDV-CAT(50納克)與表達(dá)質(zhì)粒(400納克pCDV-N、300納克pCDV-P，50-100納克pCDV-L)共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。類似地，用麻疹病毒微型復(fù)制子(100納克pMV107-CAT)和麻疹病毒蛋白表達(dá)載體(400納克pMV-N、300納克pMV-P，100納克pMV-L)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染的同時，用MVA/T7以大約2的感染復(fù)數(shù)感染所述細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之后大約48小時制備細(xì)胞提取物，并且分析CAT活性。在該附圖所示實驗中，CAT測定是用熒光氯霉素底物進(jìn)行的，并通過熒光圖象儀對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量。圖3A中所示的相對CAT活性是相對在泳道8中給出的值表達(dá)的。圖3所示結(jié)果清楚地表明CDV-CAT微型復(fù)制子活性水平(參見圖3A，泳道2和3)顯著高于省略了pCDV-LDNA的負(fù)對照轉(zhuǎn)染的水平(參見圖3A，泳道1)。在缺少pCDV-L載體的情況下出現(xiàn)了弱的但是可檢測的背景信號，這可能是由于CDV前導(dǎo)序列中隱蔽的痘苗病毒啟動子或細(xì)胞RNA聚合酶II啟動子所造成的。除了存在MV前導(dǎo)序列和尾隨序列之外的相同的微型復(fù)制子載體在使用明顯更大量的MV微型復(fù)制子時產(chǎn)生幾乎無法檢測的背景(參見圖3A，泳道5)(35，41)。上述結(jié)果還表明，在32℃下而不是在37℃下培養(yǎng)，通常能產(chǎn)生高出2-3倍水平的CDV-CAT活性。因此，將32℃的溫度用于病毒挽救。另外，上述實驗(圖3)是用A549或HEp2細(xì)胞進(jìn)行的(在圖3中是A549；HEp2，資料未發(fā)表)，因為我們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞似乎比293細(xì)胞更能耐受MVA/T7感染(圖2B)。對上述某些實驗來說，還用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法(圖3A)取代了磷酸鈣方法(圖3B)。還檢驗了其他變數(shù)，并且在下文中披露。對CDV微型復(fù)制子進(jìn)行的熱激使用在方法部分所披露的磷酸鈣方法，用pCDV-CAT微型復(fù)制子(10納克)和N(400納克)、P(300納克)和L(50-100納克)的表達(dá)載體對6孔平板上的A549細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在開始轉(zhuǎn)染之后3小時，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到43℃下培養(yǎng)2小時，然后再送回到32℃下培養(yǎng)一夜。在圖3B中示出了熱激對CDV微型復(fù)制子表達(dá)的影響。熱激處理能將CDV-CAT活性提高大約4-16倍，這表明該處理可能對挽救CDV有利。例44.1rCDV的挽救將上述產(chǎn)生了最高微型復(fù)制子活性水平的轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)條件應(yīng)用于挽救CDV，即通過磷酸鈣方法(方法部分)用完整長度的cDNA質(zhì)粒和pCDV-N、pCDV-P和pCDV-L表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549或Hep2細(xì)胞。在開始轉(zhuǎn)染之后3小時，在43-44℃下對所述細(xì)胞進(jìn)行2小時的熱激，然后送回到32℃的培養(yǎng)箱中。次日，更換培養(yǎng)基，并將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再培養(yǎng)1天。為了鑒定能產(chǎn)生病毒并擴(kuò)增少量rCDV的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物，用新的Vero細(xì)胞單層培養(yǎng)轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞(方法部分；參考文獻(xiàn)35)。在32℃下培養(yǎng)4-6天之后出現(xiàn)了合胞體(參見圖4A)。在大多數(shù)實驗中，我們的挽救條件在轉(zhuǎn)染的6孔平板中產(chǎn)生了4-6個rCDV陽性孔，這些陽性孔在用Vero細(xì)胞培養(yǎng)后可以檢測到。我們還使用磷酸鈣或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對挽救效率進(jìn)行了有限的比較。在方法部分所披露的磷酸鈣方法所導(dǎo)致的CDV陽性感染通常比脂質(zhì)體試劑導(dǎo)致的陽性感染高大約2倍(資料未發(fā)表)。4.2挽救病毒的特征分析將來自用兩種rCDV分離物(rCDV1和rCDV2)或從MartinBilleter獲得的Onderstepoort菌株(Ond)感染過的細(xì)胞中獲得的RNA用于擴(kuò)增來自P基因的DNA片段。來自重組菌株的RT/PCR擴(kuò)增的片段含有一個BstBI的限制酶消化位點“標(biāo)記”。非重組(Ond)菌株缺乏該位點。對來自若干種實驗的CDV分離物進(jìn)行特征分析，以便證實挽救了重組的病毒。重組CDV應(yīng)當(dāng)包括在cDNA克隆期間引入的核苷酸改變(序列“標(biāo)記”)，該改變沒有修復(fù)。例如，在P基因具有兩個位置很近的堿基改變(2295和2298號核苷酸)，它在氨基酸密碼子專一性方面是沉默的，但產(chǎn)生了BstBI限制酶消化位點。在實驗室中使用的兩種CDV菌株上缺乏重組cDNA上的這種BstBI標(biāo)記(我們的實驗室改良的Onderstepoort菌株和由蘇黎士大學(xué)的MartinBilleter提供的實驗室改良的Onderstepoort菌株)，這兩種菌株有可能成為污染病毒源。例如，通過RT/PCR由感染的細(xì)胞擴(kuò)增了P基因的一部分(從1978-2804號位置)，然后用BstBI進(jìn)行消化。結(jié)果清楚地表明，重組病毒含有BstBI標(biāo)記，而非重組菌株沒有(參見圖4B，比較泳道2，3，6和泳道8，9，10)。通過BstBI裂解來自重組病毒的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生了比抗消化的DNA移動更快的雙鏈體(參見圖4B)。還通過對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行直接測序驗證了上述結(jié)果。對11種其他序列標(biāo)記進(jìn)行類似分析，并且結(jié)果明確表明，CDV的重組菌株是通過挽救產(chǎn)生的。通過兩個負(fù)對照可以排除序列標(biāo)記的分析是由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞細(xì)胞攜帶的污染的基因組cDNA引起的可能性。用源于接受了除了pCDV-L表達(dá)載體之外的所有質(zhì)粒DNA的負(fù)對照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備的RNA不能產(chǎn)生可檢測數(shù)量的PCR產(chǎn)物(參見圖4B，泳道1)。另外，如果省略逆轉(zhuǎn)錄步驟的話，就不會出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物(參見圖4B，泳道3，5，7)。例5用上述挽救方法由挽救的CDV表達(dá)異源基因a)熒光素酶基因的表達(dá)為了進(jìn)一步評估CDV作為潛在載體的可能性，對CDV基因組cDNA進(jìn)行修飾，以便接收外源基因。首先，向3330和3373號位置之間的部分引入9個核苷酸取代(圖5A、5B)。由此在P和M基因之間的基因間區(qū)(P/M基因間區(qū))引入了3個限制酶位點(AatII、FseI和MluI)。這些位點在基因組cDNA克隆在pBS-rCDV+中是獨特的(圖5B)。挽救了含有這些堿基取代的病毒(rCDV+)，這表明所述修飾對病毒的生活力沒有明顯影響(資料未發(fā)表)。然后利用FseI和MluI位點插入熒光素酶報導(dǎo)基因。諸如B對原始rCDV質(zhì)粒載體(pBS-rCDV)進(jìn)行的核苷酸取代，以便制備質(zhì)粒pBS-rCDV+。對熒光素酶基因進(jìn)行修飾，并插入質(zhì)粒prCDV-mcs(圖5B)。制備用于克隆的熒光素酶基因，首先進(jìn)行PCR，以便擴(kuò)增編碼序列，在擴(kuò)增時使用質(zhì)粒pGL2-對照(PromegaofMadison，WS)作模板。PCR引物(參見下面的PCR引物表，引物1和2)包括末端限制酶裂解位點，以便能將擴(kuò)增的報導(dǎo)基因插在prCDV-mcs的FseI和MluI位點之間(圖5B)。5’PCR引物(引物1)還包括等同于CDV/P/M基因間轉(zhuǎn)錄控制序列的合成拷貝的額外序列。用所述引物對熒光素酶編碼序列進(jìn)行的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生了一種包括P/M基因間轉(zhuǎn)錄控制序列和與5’末端融合的FseI位點和與3’末端融合的MluI位點的熒光素酶基因。將擴(kuò)增的序列克隆到pBS-rCDV-mcs上，隨后進(jìn)行的DNA序列分析證實熒光素酶基因精確地克隆了熒光素酶基因，從而產(chǎn)生了pBS-rCDV-P/Luc/M(圖5C)。在將含有熒光素酶基因的cDNA用于挽救實驗之后，檢測病毒噬斑(參見圖4A，rCDV-P/Luc/M)。通過對跨越連接CDV序列和熒光素酶基因之間的結(jié)合部分的RT/PCR擴(kuò)增的片段進(jìn)行測序，鑒定回收病毒(rCDV-P/Luc/M)的分離物，由此發(fā)現(xiàn)所述基因正如所預(yù)料的被插入重組病毒中(資料未發(fā)表)。用由5種不同的rCDV-P/Luc/M病毒的分離物(編號1-5)感染的細(xì)胞制備的提取物進(jìn)行熒光素酶測定。用不同的rCDV菌株感染裝有Vero細(xì)胞的6孔平板的每一個孔，并且在感染之后大約48小時當(dāng)75％或更多的單層表現(xiàn)出細(xì)胞融合時制備細(xì)胞提取物。將提取物稀釋104倍，并對其中的50微升進(jìn)行分析，以便產(chǎn)生在下面的熒光素酶表中所示出的結(jié)果。在不進(jìn)行稀釋的情況下對負(fù)對照樣品進(jìn)行分析。所述對照樣品包括一種模擬感染和用rCDV和rCDV-mcs病毒進(jìn)行的感染。在挽救rCDV-P/Luc/M病毒時，同時用缺乏L表達(dá)質(zhì)粒(無pCDV-L)進(jìn)行負(fù)對照轉(zhuǎn)染。將來自該平行模擬挽救的細(xì)胞裂解物用于進(jìn)行模擬感染，這種感染同樣只能產(chǎn)生背景水平的熒光素酶活性。正如在下面的熒光素酶表中所示出的，在從獨立感染中回收的用rCDV-P/Luc/M的不同分離物感染的細(xì)胞中觀察到了較高水平的熒光素酶活性(參見表，編號1-5)。負(fù)對照產(chǎn)生非常低的背景水平熒光素酶(rCDV，rCDV+，無L質(zhì)粒)。熒光素酶表b)犬細(xì)小病毒(CPV)VP2基因的表達(dá)制備含有CPVVP2基因的CPV基因組質(zhì)粒(參見圖5D和下面的流程圖)。用于克隆VP2基因的CPV基因組DNA是通過用蛋白酶K消化和有機(jī)提取方法用CPV疫苗菌株FD99制備的(該菌株是從FortDodge實驗室的犬疫苗DURAMUNEMAX中分離的CPV菌株，F(xiàn)t.Dodge，Iowa)。用5’引物(引物4)通過PCR擴(kuò)增VP2編碼序列，該引物含有與VP2編碼序列的5’末端同源的序列，此外還含有與CDVP/V基因間轉(zhuǎn)錄控制序列(引物3)等同的序列。5’和3’引物(引物3和4)還含有如上文所述的用于將擴(kuò)增的VP2編碼序列插入質(zhì)粒prCDV-mcs的末端限制位點。在克隆擴(kuò)增的VP2DNA之前，將該DNA的一部分直接用于DNA序列分析。由此提供了有關(guān)VP2基因的DNA序列，該序列不含在隨后的克隆步驟中引入的任何潛在的核苷酸改變。然后，將VP2PCR產(chǎn)物的其余部分用于將所述基因克隆到標(biāo)準(zhǔn)克隆載體(pBSK(+))上。然后使用染料終止子循環(huán)測序(購自應(yīng)用生物系統(tǒng)的循環(huán)測序試劑，F(xiàn)osterCity，CA)和自動測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)377，F(xiàn)osterCity，CA)，通過DNA測序測定克隆的VP2基因和連接的CDVP/M基因間轉(zhuǎn)錄控制序列的核苷酸序列(有關(guān)核苷酸序列參見圖9，SEQIDNO39，有關(guān)氨基酸序列參見圖10，SEQIDNO40)，然后將其轉(zhuǎn)入CDV基因組DNA克隆(prCDV-mcs)上的P和M基因之間，以便制備質(zhì)粒pBS-rCDV-VP2(圖8E)。用質(zhì)粒pBS-rCDV-VP2從獨立轉(zhuǎn)染中挽救若干種病毒分離物。用引物7和8(見下文)通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增(RT/PCR)分析病毒基因組RNA，發(fā)現(xiàn)上述菌株不含有VP2基因。為了證實rCDV-VP2病毒能表達(dá)VP2蛋白，人們可以使用一種能夠通過傳統(tǒng)方法制備的多克隆抗體。通過Western印跡(2)根據(jù)對VP2的反應(yīng)性測定VP2表達(dá)。簡單地講，通過在Laemmli緩沖液(Bio-Rad實驗室，Hercules，CA)中煮沸，裂解被用作正對照的用CPV感染的狗腎細(xì)胞。在12％的聚丙烯酰胺凝膠上對粗制細(xì)胞提取物中的蛋白進(jìn)行電泳，然后將蛋白電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用封閉緩沖液(磷酸緩沖的鹽溶液+5％干奶粉(Bio-Rad實驗室，Hercules，CA))處理所述膜，然后與用封閉緩沖液稀釋的含有抗CPV抗體的狗血清起反應(yīng)。用過氧化物酶標(biāo)記過的抗狗二級抗體(Sigma，St.Louis，MO)和化學(xué)發(fā)光底物(SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate，Pierce，Rockford，IL)檢測抗原-抗體結(jié)合。Western印跡分析發(fā)現(xiàn)所述狗抗血清能與來自用CPV感染的細(xì)胞的65kDa的蛋白專一性反應(yīng)；這種65kDa多肽的相對遷移率與預(yù)期的VP2大小吻合?？梢杂迷摲椒ㄗC實同一種多肽在用rCDV-VP2菌株感染的細(xì)胞中的存在。c)乙型肝炎病毒表面抗原基因HBsAg的表達(dá)用質(zhì)粒prcDV-HBsAg挽救含有來自乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原基因的rCDV分離物(圖8E)。通過將HBsAg編碼序列插在prCDV-mcs的FseI和MluI位點之間制備質(zhì)粒pBS-rCDV-HBsAg，如在上面的例子(a)和(b)中所述。使用引物5和6(見下文)，通過PCR由克隆的HBV基因組(菌株ayw；GenBank保藏號V01460；(75))擴(kuò)增HBsAg基因。使用質(zhì)粒pBS-rCDV-HBsAg分離若干種獨立挽救的含有HBsAg基因的CDV的重組菌株。通過用基因?qū)Ｒ恍砸?引物7和8)進(jìn)行引物RT-PCR分析來自rCDV-HBsAg分離物的病毒基因組RNA(rCDV-HBsAg1，2和3)，以便證實該重組分離物含有HBsAg基因。在證實所述重組病毒含有HBsAg基因之后，進(jìn)行Western印跡分析，以確保HBsAg基因被表達(dá)。如圖8所示，Western印跡分析發(fā)現(xiàn)了24和27kDa的蛋白。27kDa形式的HBsAg菌株是該蛋白的糖基化形式(76)。用缺乏HBV基因的重組CDV感染的細(xì)胞提取物不能與所述抗體起反應(yīng)(FitgeraldIndustriesInternationalInc.，Concord，MA)。作為對照，剝離所述印跡，并且用抗CDVN蛋白抗體(VMRD，Inc.，Pullman，WA)檢測，證實所有提取物都是由用CDV感染的細(xì)胞制備的。PCR引物表1.熒光素酶5’末端5’-TACTGGCCGGCCATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACAT-3’(SEQIDNO.31)在CDV基因-末端/基因起始信號下面劃線，F(xiàn)seI位點用斜體表示。在熒光素酶ATG起始密碼子(粗體)之前添加Kozak(77)翻譯控制共有序列(GCCACC)。2.熒光素酶3’末端5’-TTTTACGCGTTTACAATTTGGACTTTCCGC-3’(SEQIDNO32)MluI位點用斜體表示。3.CPVVP25’末端TACTGGCCGGCCATTATAAAAAACTTAGGACACAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC(SEQIDNO.33)參見引物1的說明。4.CPVVP23’末端TTTTACGCGTTTAATATAATTTTCTAGGTGC(SEQIDNO.34)MluI位點用斜體表示。5.HbsAg5’末端TACTGGCCGGCCATTATAAAAAACTTAGGACAAAGAGCCTAAGTCCGCTGCCACCATGGAGAACATCACATCAGGAT(SEQIDNO35)參見引物1的說明。6.HbsAg3’末端TTTTACGCGTTTATCAGCTGGCATAGTCAGGCACGTCATAAGGATAGCTAATGTATACCCAAAGACA(SEQIDNO.36)MluI位點用斜體表示。7.FseI位點5’ATAACATGCTGGCTCTGCTC(SEQIDNO.37)用于PCR分析插入重組CDV菌株基因組中的基因的5’引物。對所述外源基因5’末端旁側(cè)的CDV序列有專一性。8.MluI位點的3’末端GCTAGTCAGGAGAACCATGT(SEQIDNO.38)用于PCR分析插入重組CDV菌株基因組中的基因的3’引物。對所述外源基因3’末端旁側(cè)的CDV序列有專一性。開發(fā)含有CPVVP2基因的CDV表達(dá)載體的流程圖·通過蛋白酶K消化和苯酚氯仿提取從疫苗病毒制劑中純化CPV基因組DNA↓·PCR擴(kuò)增VP2編碼序列。(5’PCR引物含有對CDVP/M基因間轉(zhuǎn)錄控制序列專一的結(jié)合序列，5’和3’引物都含有用于克隆的末端限制位點)↓·用擴(kuò)增的DNA作模板測定確切的CPVVP2序列(圖9)↓將VP2基因克隆到質(zhì)粒載體pBSK(+)上↓·對克隆的VP2基因進(jìn)行測序，以便確定該序列是否與以前確定的序列吻合↓·將克隆的VP2基因轉(zhuǎn)入CDV基因組克隆(將VP2基因插在CDVP和M基因之間↓·挽救重組病毒并分析基因組結(jié)構(gòu)。對出現(xiàn)在重組病毒菌株中的所述基因進(jìn)行測序↓·通過用狗多克隆抗血清進(jìn)行免疫吸印檢查感染細(xì)胞的提取物，驗證VP2表達(dá)。下面提供了被收作本文的參考文獻(xiàn)清單。參考文獻(xiàn)1.Appel，M.J.G.1999.Fortyyearsofcaninevaccination.Adv.Vet.Med.41309324.2.Ausubel，F(xiàn).M.，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Siedman，J.A.Smith，andK.Struhl(ed.).1987.CurrentProtocolsinMolecularBiology.GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NewYork.3.Ball，L.A.，C.R.Pringle，B.Flanagan，V.P.Perepelitsa，andG.W.Wertz.1999.Phenotypicconsequencesofrearrangingthep，MandGgenesofvesicularstomatitisvirus.J.Virol.734705-4712.4.Barrett，T.1999.Morbillivirusinfection，withspecialemphasisonmorbillivirusesofcarnovores.Vet.Micro.693-13.5.Been，M.D.，andG.S.Wickham.1997.Self-cleavingribozymesofhepatitisdeltavirusRNA.Eur.J.Biochem.247741-753.6.Calain，P.，andL.Roux.1993.Theruleofsix，abasicfeatureforefficientreplicationofSendaivirusdefectiveinterferingRNA.J.Virol.674822-4830.7.Carmichael，L.E.1999.Canineviralvaccinesataturningpoint-apersonalperspective.Adv.Vet.Med41289-304.8.Chen，C.，andH.Okayama.1987.High-efficiencytransformationofmammaliancellsbyplasmidDNA.Mol.CellBiol.72745-2752.9.Chomczynski，P.，andN.Sacchi.1987.Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction.AnalyticalBiochem.162156-159.10.Conzelmann，K.K.1998.Nonsegmentednegative-strandRNAvirusesgeneticsandmanipulationofviralgenomes.AnnualReviewofGenetics32123-162.11.deSwart，R.L.，T.C.Harder，P.S.Ross，H.W.Vos，andA.D.M.E.Osterhaus.1995.Morbillivirusesandmorbillivirusdiseaseofmarinemammals.InfectiousAgentsDisease4125-130.12.Durbin，A.P.，J.M.McAuliffe，P.L.Collins，andB.R.Murphy.1999.MutationsintheC，D，andVopenreadingframesofhumanparainfluenzavirustype3attenuatereplicationinrodentsandprimates.Virology261319-330.13.Escoffier，C.，S.Mainie，S.Vincent，Muller，C.P.，M.A.Billeter，andD.Gerlier.1999.NonstructuralCproteinisrequiredforefficientmeaslesvirusreplicationinhumanperipheralbloodcells.J.Virol.731695-1698.14.Fraser，D.W.1997.Paget′sdiseaseofbone.Curr.OpinionRheumatology9347-354.15.Garcin，D.，M.Itoh，andD.Kolakofsky.1997.ApointmutationintheSendaivirusaccessoryCproteinsattenuatesvirulenceformicebutnotvirusgrowthincellculture.Virology238424-431.16.Griffin，H.G.，andA.M.Griffin.1993.DNAsequencing.Recentinnovationsandfuturetrends.Appl.Biochem.Biotech.38147-159.17.Haig，D.A.1956.Caninedistemper-immunizationwithavianisedvirus.OnderstepoortJ.Vet.Res.2719-53.18.Harder，T.C.，andA.D.M.E.Osterhaus.1997.Caninedistempervirus-amorbillivirusinsearchofanewhost.TrendsMicro.5120-124.19.Hodge，M.J.，andC.Wolfson.1997.Caninedistempervirusandmultiplesclerosis.Neurology49(Suppl.)S62-S69.20.Hruby，D.E.，andE.M.U.Wilson.1992.Useoffluorescentchloramphenicolderivativeasasubstrateforchloramphenicolacetyltransferaseassays.MethodsEnzymol.216369-376.21.Juhasz，K.，B.R.Murphy，andP.L.Collins.1999.Themajorattenuatingmutationsoftherespiratorysyncytialvirusvaccinecandidatecpts530/1009specifytemperature-sensitivedefectsintranscriptionandreplicationandanon-temperature-senssitivealterationinmRNAtermination.J.Virol.735176-5180.22.Kato，A.，K.Kiyotani，Y.Sakai，T.Yoshida，andY.Nagai.1997.Theparamyxovirus，Sendaivirus，VProteinencodesaluxuryfunctionrequiredforviralpathogenesis.EMBOJ.16578-587.23.Kolakofsky，D.，T.Pelet，D.Garcin，S.Hausmann，J.Curran，andL.Roux.1998.ParamyxovirusRNAsynthesisandtherequirementforhexamergenomelengththeruleofsixrevisited.J.Virol.72891-899.24.Kretz，K.，W.Callen，andV.Hedden.1994.Cyclesequencing.GenomeRes.3S101-S112.25.Lamb，R.A.，andD.Kolakofsdy.1996.Paramyxoviridaethevirusesandtheirreplication.InB.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，T.O.Monath，J.L.Melnick，B.Roizman，andS.E.Straus(ed.)，F(xiàn)ieldsVirology，Thirded.Lippncott-RavenPublishers，Philadelphia.26.Maniatis，T.，E.F.Fritsch，andJ.Sambrook.1982.MolecularCloningalaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY.27.Mcllhatton，M.A.，M.D.Curran，andB.K.Rima.1997.Nucleotidesequenceanalysisofthelarge(L)genesofphocinedistempervirusandcaninedistemperviris(corrected).J.Gen.Virol.78571-576.28.Mee，A.P.，andP.T.Sharpe.1993.Dogs，distemperandPaget′sdisease.BioEsaays15783-789.29.Moss，B.，O.Elroy-Stein，T.Mizukami，W.A.Alexander，andT.R.Fuerst.1990.Newmammalianexpressionvectors.Nature34891-92.30.Murphy，F(xiàn).A.1996.VirusTaxonomy.InB.N.Fields，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，T.O.Monath，J.L.Melnick，B.Roizman，andS.E.Straus(ed.)，F(xiàn)ieldsVirology，Thirded.Lippncott-RavenPublishers，Philadelphia.31.Nagai，Y.1999.Paramyxovirusreplicationandpathogenesis.Reversegeneticstransformsunderstanding.Rev.Med.Virol.983-99.32.Nagai，Y.，andA.Kato.1999.Paramyxovirusreversegeneticsiscomingofage.Microbiol.Immunol.43613-624.33.Oglesbee，M.J.，H.Kenney，T.Kenney，andS.Krakowka.1993.EnhancedproductionofMorbillivirusgene-specificRNAsfollowinginductionofthecellularstressresponseinstablepersistentinfection.Virology192556-567.34.Pardo，M.C.，J.E.Bauman，andM.Mackowiak.1997.Protectionofdogsagainstcaninedistemperbyvaccinat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ThrAsnTyrIleThrGluAlaThrIleMetArgProAlaGluVal325330335GlyTyrSerAlaProTyrTyrSerPheGluAlaSerThrGlnGlyPro340345350PheLysThrProIleAlaAlaGlyArgGlyGlyAlaGlnThrAspGlu355360365AsnGlnAlaAlaAspGlyAspProArgTyrAlaPheGlyArgGlnHis370375380GlyGlnLysThrThrThrThrGlyGluThrProGluArgPheThrTyr385390395400IleAlaHisGlnAspThrGlyArgTyrProGluGlyAspTrpIleGln405410415AsnIleAsnPheAsnLeuProValThrAspAspAsnValLeuLeuPro420425430ThrAspProIleGlyGlyLysThrGlyIleAsnTyrThrAsnIlePhe435440445AsnThrTyrGlyProLeuThrAlaLeuAsnAsnValProProValTyr450455460ProAsnGlyGlnIleTrpAspLysGluPheAspThrAspLeuLysPro465470475480ArgLeuHisValAsnAlaProPheValCysGlnAsnAsnCysProGly485490495GlnLeuPheValLysValAlaProAsnLeuThrAsnGluTyrAspPro500505510AspAlaSerAlaAsnMetSerArgIleValThrTyrSerAspPheTrp515520525TrpLysGlyLysLeuValPheLysAlaLysLeuArgAlaSerHisThr530535540TrpAsnProIleGlnGlnMetSerIleAsnValAspAsnGlnPheAsn545550555560TyrValProSerAsnIleGlyGlyMetGluIleValTyrGluArgSer565570575GlnLeuAlaProArgLysLeuTyr580<210>6<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>6cagccggcgccagcgaggaggctgggaccatgccggccaccagacaaagctgggt55<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7tactcaagtcaaatactcagggac24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>8caggggtgcttttctgagtcactgc25<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>9acgacctttctgagccctgggactc25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>10agaggagaccagttcactgtactcc25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>11tgattccctcccctgaggcatgagc25<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>12gcaatccaatctcttagaaccagcc25<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>13tcgaatctgtaaaattggtgacacc25<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>14gccattactaaactaactg19<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15atcttatgaatttctcctcc20<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>16atgggtttcagctggaggtctctc24<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>17cggcggccgcgtaatacgactcactataaccagacaaagttggct45<210>18<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>18gatcctaccttaaagaacaaggctagggttcagacctaccaatatggagaaaaaaatcac60<210>19<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>19ttaaattattgaatattttattaaaaacttagggtcaatgatcctaccttaaagaacaag60<210>20<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>20accagacaaagttggctaaggatagttaaattattgaatattttattaaaaacttag57<210>21<211>57<212>DNA<213>人工序列<400>21ggcgccagcgaggaggctgggaccatgccggccaccagacaaagttggctaaggata57<210>22<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>22attggcgccagcgaggaggctgggaccatgccggccaccagacaaagttggctaaggata60<210>23<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>23tagcaatgaatggaagggggctaggagccagactaacctgtcattacgccccgccctgc59<210>24<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>24acttattaataaccgttgttttttttcgtataactaagttcaatagcaatgaatggaagg60<210>25<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>25ctcactataaccagacaaaagctgggtatgataacttattaataaccgttgttttttttcg60<210>26<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>26attgcggccgctaatacgactcactatagggaccagacaaagctgggtatgataacttat60<210>27<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>27attgcggccgctaatacgactcactatagggaccagacaaagctgggtatgataacttat60<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28taatacgactcactataggg20<210>29<211>76<212>DNA<213>人工序列<400>29tactggccggccattataaaaaacttaggacacaagagcctaagtccgctgccaccatgg60aagacgccaaaaacat76<210>30<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>30ttttacgcgtttacaatttggactttccgc30<210>31<211>76<212>DNA<213>人工序列<400>31tactggccggccattataaaaaacttaggacacaagagcctaagtccgctgccaccatgg60aagacgccaaaaacat76<210>32<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>32ttttacgcgtttacaatttggactttccgc30<210>33<211>78<212>DNA<213>人工序列<400>33tactggccggccattataaaaaacttaggacacaagagcctaagtccgctgccaccatga60gtgatggagcagttcaac78<210>34<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>34ttttacgcgtttaatataattttctaggtgc31<210>35<211>78<212>DNA<213>人工序列<400>35tactggccggccattataaaaaacttaggacacaagagcctaagtccgctgccaccatgg60agaacatcacatcaggat78<210>36<211>67<212>DNA<213>人工序列<400>36ttttacgcgtttatcagctggcatagtcaggcacgtcataaggatagctaatgtataccc60aaagaca67<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>37ataacatgctggctctgctc20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>38gctagtcaggagaaccatgt20權(quán)利要求1.一種用于生產(chǎn)重組犬熱病病毒的方法，包括在培養(yǎng)基中，在至少一個宿主細(xì)胞中實施挽救組合物的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，該組合物包括(i)一種轉(zhuǎn)錄載體，該載體包括一種分離的核酸分子，該核酸分子包括編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列，和(ii)至少一種表達(dá)載體，它包括編碼衣殼化、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的反式作用蛋白(N、P和L)的多核苷酸序列的一種或多種分離的核酸分子，所述轉(zhuǎn)染是在足以實現(xiàn)所述載體共表達(dá)和產(chǎn)生重組病毒的條件下進(jìn)行的。2.如權(quán)利要求1的方法，還包括回收所述重組病毒。3.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子是一個以上基因組或反基因組源的嵌合體。4.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子包括SEQIDNO1、2或3的多核苷酸序列。5.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子編碼減毒的病毒或傳染形式的病毒。6.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子編碼傳染形式的病毒。7.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子編碼減毒的病毒。8.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的分離核酸分子編碼傳染形式的減毒病毒。9.如權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。10.如權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞是脊椎動物細(xì)胞。11.如權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞是禽細(xì)胞。12.如權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞源于人細(xì)胞。13.如權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主細(xì)胞源于人胚胎細(xì)胞。14.如權(quán)利要求12的方法，其中所述宿主細(xì)胞源于人胚胎腎細(xì)胞、人肺癌、和人宮頸癌或動物腎細(xì)胞。15.用權(quán)利要求1的方法制備的重組犬熱病病毒。16.一種組合物，包括(i)用權(quán)利要求1的方法制備的重組犬熱病病毒和(ii)可以藥用的載體。17.如權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄載體還包括T7RNA聚合酶基因。18.一種免疫原性組合物，包括一種分離的重組生產(chǎn)的犬熱病病毒和可以藥用的載體。19.一種對動物或人進(jìn)行免疫，以便誘導(dǎo)對犬熱病病毒的保護(hù)作用的方法，包括給所述動物或人服用權(quán)利要求18的免疫原性組合物。20.一種核酸分子，包括編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列。21.如權(quán)利要求20的核酸分子，包括SEQIDNO1的正鏈反基因組信使犬熱病病毒序列。22.一種核酸分子，包括編碼犬熱病病毒的一種或多種蛋白的多核苷酸序列。23.如權(quán)利要求20、21或22的核酸分子，其中多核苷酸序列還包括一種或多種異源核苷酸序列或一種或多種異源基因。24.一種質(zhì)粒，包括編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列。25.一種質(zhì)粒，包括編碼犬熱病病毒的一種或多種蛋白的多核苷酸序列。26.如權(quán)利要求24的質(zhì)粒，其中所述多核苷酸序列還包括一種或多種異源核苷酸序列或一種或多種異源基因。27.如權(quán)利要求25的質(zhì)粒，其中所述多核苷酸序列還包括一種或多種異源核苷酸序列或一種或多種異源基因。28.一種用權(quán)利要求24-27的至少一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞。29.一種組合物，包括分離的重組生產(chǎn)的犬熱病病毒和可以藥用的載體；其中所述犬熱病病毒能表達(dá)至少一種異源多核苷酸。30.如權(quán)利要求18的免疫原性組合物，其中所述犬熱病病毒能表達(dá)至少一種編碼一種抗原的異源多核苷酸。31.如權(quán)利要求18的免疫原性組合物，還包括針對除了犬熱病病毒之外的病原體的至少一種抗原。32.如權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中至少一種抗原是減毒的RNA病毒。33.如權(quán)利要求18的免疫原性組合物，還包括針對能感染犬的病原體的至少一種抗原。34.如權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中至少一種抗原是針對選自下列一組的一種或多種病毒的抗原狂犬病病毒、犬細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒2、犬冠狀病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、和犬副流感病毒。35.如權(quán)利要求18的免疫原性組合物，還包括針對能感染人的病原體的至少一種抗原。36.如權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中除了犬病毒之外的病原體的至少一種抗原是由重組生產(chǎn)的犬熱病病毒表達(dá)的。37.如權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中至少一種抗原是一種或多種犬細(xì)小病毒的抗原。38.一種核苷酸序列，包括重組犬熱病病毒的cDNA克隆的序列。39.如權(quán)利要求26的質(zhì)粒，其中所述異源核苷酸序列是作為單一的轉(zhuǎn)錄單位插入犬熱病病毒基因組序列內(nèi)。40.如權(quán)利要求26的質(zhì)粒，其中所述異源核苷酸序列是作為一個或多個單順反子轉(zhuǎn)錄單位插入犬熱病病毒基因組序列內(nèi)。41.如權(quán)利要求26的質(zhì)粒，其中所述異源核苷酸序列是作為至少一個可能包括一個或多個核糖體進(jìn)入位點的多順反子轉(zhuǎn)錄單位插入犬熱病病毒基因組內(nèi)。42.一種組合物，包括用權(quán)利要求28的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的分離的重組生產(chǎn)的犬熱病病毒，和可以藥用的載體。43.一種核苷酸序列，包括圖6(SEQIDNO2)或圖7(SEQIDNO3)的重組犬熱病病毒cDNA克隆的多核苷酸序列。44.如權(quán)利要求19的方法，其中所述動物選自犬、貓、牛、豬和馬。45.一種對動物或人進(jìn)行免疫，以便誘導(dǎo)對犬熱病病毒的保護(hù)作用的方法，包括給所述動物或人服用權(quán)利要求18，30-37的免疫原性組合物。46.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列或其變體多核苷酸序列，包括犬熱病病毒野生型核苷酸的至少一個突變，以便該突變相當(dāng)于單負(fù)病毒綱(OrderMononegavirales)的其他非節(jié)段化的、負(fù)的單鏈RNA病毒的編碼或非編碼區(qū)上的已知減毒突變。47.如權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼犬熱病病毒的基因組或反基因組的多核苷酸序列或其變體多核苷酸序列，包括使重組生產(chǎn)的病毒復(fù)制失效的至少一個突變。48.如權(quán)利要求46的方法，其中所述RNA病毒選自PIV、RSV、腮腺炎和麻疹。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過犬熱病病毒重組生產(chǎn)非節(jié)段化的負(fù)的單鏈RNA病毒的方法，以及通過該方法所生產(chǎn)的免疫原性組合物。其他實施方案涉及生產(chǎn)作為減毒和/或傳染性病毒的犬熱病病毒的方法。所述重組病毒可以用cDNA克隆制備，并且可以相應(yīng)獲得具有特定變化的病毒，這些變化包括核苷酸/多核苷酸缺失、插入、取代和重組。文檔編號A61P31/14GK1455816SQ01811601公開日2003年11月12日申請日期2001年6月22日優(yōu)先權(quán)日2000年6月23日發(fā)明者C·L·帕克斯,M·S·西胡,P·瓦爾皮塔,G·R·科瓦克斯,S·A·烏德姆申請人:美國氰胺公司