專利名稱：干擾VEGF/VEGF和血管生成素/Tie受體功能的組合和組合物以及它們的用途(II)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供干擾血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/VEGF受體系統(tǒng)生物活性的物質(zhì)(化合物I)和干擾血管生成素(Angiopoietin)/Tie受體系統(tǒng)生物功能的物質(zhì)(化合物II)的組合，所述組合用于抑制血管形成和治療癌癥。
特異性調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)配體和受體酪氨酸激酶實(shí)質(zhì)上與生理血管發(fā)生以及與疾病相關(guān)的血管發(fā)生有關(guān)。這些配體/受體系統(tǒng)包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素(Ang)家族，以及它們的受體，VEGF受體家族和具有免疫球蛋白樣及表皮生長因子同源域(Tie)的酪氨酸激酶家族。受體酪氨酸激酶兩個(gè)家族的成員主要在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。VEGF受體家族包括Flt1(VEGF-R1)、Flk1/KDR(VEGF-R2)和Flot4(VEGF-R3)。這些受體被VEGF相關(guān)生長因子的成員所識(shí)別，因?yàn)镕lt1的配體是VEGF和胎盤生長因子(PIGF)，而Flk1/KDR與VEGF、VEGF-C和VEGF-D結(jié)合，并且Flt4的配體是VEGF-C和VEGF-D(Nicosia，Am.J.Pathol.153，11-16，1998)。內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶的第二個(gè)家族由Tie1和Tie2代表(也稱作Tek)。雖然Tie1仍是孤兒受體，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Tie2的三個(gè)分泌的糖蛋白配體Ang1、Ang2和Ang3/Ang4(Davis等，Cell87，1161-1169，1996；Maisonpierre等，Science 277，55-60，1997；Valenzuela等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1904-1909，1999；專利US5,521,073、US 5,650,490、US 5,814,464)。
VEGF及其受體在血管發(fā)育期間的關(guān)鍵作用在對(duì)靶向基因失活的研究方面得以例證。甚至VEGF基因的雜合破裂都導(dǎo)致血管形成的致命缺陷(Carmeliet等，Nature 380，435-439，1996；Ferrara等，Nature 380，439-442，1996)。在FIt1或Flk1/KDR基因中攜帶純合破裂的小鼠在妊娠中期死于急性血管缺損。但是，表型的獨(dú)特之處在于Flk1/KDR剔除的小鼠缺乏內(nèi)皮細(xì)胞和發(fā)育的造血系統(tǒng)(Shalaby等，Nature 376，62-66，1995)，然而Flt1缺乏的小鼠具有正常的造血祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，卻不能組裝成功能性血管(Fong等，376，66-70，1995)。Flt4基因廣泛的胚胎表達(dá)僅限于成體中的淋巴管，其破裂表明在心血管系統(tǒng)早期發(fā)育期間，F(xiàn)lt4對(duì)初始血管網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)并成熟為大血管的重要作用(Dumont等，Science 282，946-949，1998)。與成體中Flt4的淋巴表達(dá)一致，VEGF-C在轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中的過度表達(dá)導(dǎo)致淋巴，而不是血管的內(nèi)皮增生和血管擴(kuò)大(Jeltsch等，Science 276，1423-1425，1997)。此外，據(jù)報(bào)道VEGF-C在小鼠角膜和小雞胚胎絨膜尿囊膜血管發(fā)生模型中誘導(dǎo)新血管形成(Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14389-14394，1998)。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)第二類內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶在脈管系統(tǒng)的形成和完整性方面是非常有關(guān)的。Tie1缺乏的小鼠死于水腫和出血，其原因是微血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞的差結(jié)構(gòu)完整性(Sato等，Nature376，7074，1995；Rodewald & Sato，Oncogene 12，397-404，1996)。Tie2剔除的表型的特征在于缺乏分支網(wǎng)絡(luò)并且缺乏外周內(nèi)皮支持細(xì)胞的未成熟血管(Sato等，Nature 376，70-74，1995；Dumont等，GenesDev.8，1897-1909，1994)。Tie2配體Ang1的靶向失活，以及抑制配體Ang2的過度表達(dá)導(dǎo)致與Tie2剔除相似的表型(Maisonpierre等，Science 277，55-60，1997；Suri等，cell 87，1171-1180)。相反，在Ang1的轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)之后立即觀察到增加的血管形成(Suri等，Science 282，468-471，1998；Thurstonen等，Science 286，2511-2514，1999)。
對(duì)黃體發(fā)育中血管源性生長因子表達(dá)的研究的結(jié)果(Maisonpierre等，Science 277，55-60，1997；Goede等.Lab.Invest.78，1385-1394，1998)，對(duì)視網(wǎng)膜中血管成熟的研究的結(jié)果(Alon等，NatureMed.1，1024-1028，1995；Benjamin等，Development 125，1591-1598，1998)，以及對(duì)Tie2、Ang1和Ang2的基因靶向和轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的結(jié)果提示血管生成素/Tie受體系統(tǒng)在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和周圍周細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞之間相互作用中的重要作用。由外周內(nèi)皮細(xì)胞(periendothelialcell)表達(dá)并且似乎基本上在成體內(nèi)表達(dá)的Ang1被認(rèn)為使存在的成熟血管穩(wěn)定化。Ang2，在血管發(fā)育位置由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的Ang1的天然拮抗劑，似乎介導(dǎo)內(nèi)皮-外周內(nèi)皮細(xì)胞接觸的松動(dòng)，從而允許血管重構(gòu)并在諸如VEGF的血管發(fā)生引發(fā)劑的協(xié)作下發(fā)育，或者在缺乏VEGF時(shí)血管退化(Hanahan，Science 277，48-50，1997)。
在與異常的新血管形成相關(guān)的病態(tài)集(pathological setting)中已經(jīng)觀察到血管源性生長因子及其受體的升高的表達(dá)。大多數(shù)實(shí)體瘤表達(dá)高水平的VEGF，且VEGF受體主要出現(xiàn)在惡性組織周圍的血管或貫穿惡性組織的血管的內(nèi)皮細(xì)胞中(Plate等，Cancer Res.53，5822-5827，1993)。通過VEGF-中和抗體干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)(Kim等，Nature 362，841-844，1993)，顯性陰性VEGF受體變體的反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)(Millauer等，Nature 367，576-579，1994)，重組VEGF-中和受體變體(Goldman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，8795-8800，1998)，或者VEGF受體酪氨酸激酶的小分子抑制劑(Fong等，Cancer Res.59，99-106，1999；Wedge等，Cancer Res.60，970-975，2000；Wood等，Cancer Res.60，2178-2189，2000)，或者通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向細(xì)胞毒試劑(Arora等，Cancer Res.59，183-188，1999；EP 0696456A2)導(dǎo)致降低腫瘤生長和腫瘤血管形成的減少。然而，盡管通過干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)使許多腫瘤得以抑制，但其他一些腫瘤不受影響(Millauer等，Cancer Res.56，1615-1620，1996)。人腫瘤和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤異種移植物含有大量尚未補(bǔ)充外周內(nèi)皮細(xì)胞的未成熟血管。未成熟血管在緩慢生長的前列腺癌外周內(nèi)皮細(xì)胞的未成熟血管。未成熟血管在緩慢生長的前列腺癌中所占比例在40％的范圍內(nèi)，在快速生長的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中所占比例在90％的范圍內(nèi)。在C6成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物模型中，通過減量調(diào)節(jié)VEGF轉(zhuǎn)基因表達(dá)而退縮VEGF之后立即觀察到未成熟腫瘤血管的選擇性閉塞。這一結(jié)果與VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞存活因子的功能一致。類似地，作為雄激素消融療法結(jié)果的人前列腺癌關(guān)閉VEGF表達(dá)導(dǎo)致缺乏外周內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋的血管中內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性凋亡。相反，抵抗VEGF退縮的血管部分顯示外周內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋(Benjamin等，J.Clin.Invest.103，159-165，1999)。
Tie受體在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤內(nèi)皮(Kaipainen等，Cancer Res.54，6571-6577，1994)、乳腺癌(salve等，Br.J.Cancer 74，69-72，1996)和顯性陰性VEGF受體存在下生長的腫瘤異種移植物(Millauer等，Cancer Res.56，1615-1620，1996)中的升高的表達(dá)，以及Flt4受體在淋巴和乳腺癌周圍的淋巴管內(nèi)皮中(Jussila等，Cancer Res.58，1599-1604，1998)、VEGF-C在各種人腫瘤樣品中(salve等，Am.J.Pathol.153，103-108，1998)的升高的表達(dá)的觀察結(jié)果提示這些內(nèi)皮特異性生長因子和受體作為驅(qū)動(dòng)腫瘤新血管形成的候選可選途徑。在早期腫瘤中Ang2表達(dá)的高增量調(diào)節(jié)已經(jīng)被解釋為針對(duì)發(fā)育中的腫瘤對(duì)現(xiàn)有血管的初始補(bǔ)選(initial cooption)的宿主防御機(jī)理。在缺乏VEGF的情況下，補(bǔ)選的血管經(jīng)歷消退，導(dǎo)致腫瘤中心內(nèi)的壞死。相反，升高的Ang2表達(dá)協(xié)同VEGF表達(dá)的缺氧增量調(diào)節(jié)拯救并支持腫瘤邊緣的血管形成和腫瘤生長(Holash等，Science 284，1994-1998，1999；Holash等，Oncogene 18，5356-5362，1999)。
已證明通過由胞外配體結(jié)合域組成的血管生成素-中和Tie2變體干擾Tie2受體功能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的生長和血管形生的抑制(Lin等，J.Clin.Invest.103，159-165，1999；Lin等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，8829-8834，1998；Siemeister等，Cancer Res.59，3185-3191，1999)。比較通過相應(yīng)的胞外受體域的旁分泌表達(dá)干擾內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶對(duì)相同細(xì)胞背景的影響，證明VEGF受體系統(tǒng)和Tie2受體系統(tǒng)封閉后各自的腫瘤生長的抑制(Siemeister等，Cancer Res.59，3185-3191，1999)。
已知用各種方法抑制VEGF/VEGF受體系統(tǒng)僅導(dǎo)致大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長的減慢(Millauer等，Nature 367，576-579，1994；Kim等，Nature 362，841-844，1993；Millauer等，Cancer Res.56，1615-1620，1996；Goldman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，8795-8800，1998；Fong等，Cancer Res.59，99-106，1999；Wedge等，Cancer Res.60，970-975，2000；Wood等，Cancer Res.60，2178-2189，2000；Siemeister等，Cancer Res.59，3185-3191，1999)。甚至通過治療劑量增加也實(shí)現(xiàn)治療效果的高峰水平(Kim等，Nature 362，841-844，1993；Wood等Cancer Res.60，2178-2189，2000)。類似的結(jié)果可以在干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)時(shí)觀察到(Lin等，J.Clin.Invest.103，159-165，1999；Lin等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 95，8829-8834，1998；Siemeister等，Cancer Res.59，3185-3191，1999)。
然而，仍非常需要增強(qiáng)抗血管發(fā)生化合物治療功效的方法。
在尋找增強(qiáng)抗血管發(fā)生化合物治療功效的方法時(shí)，在組合抑制VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和干擾血管生成素/Tie受體系統(tǒng)生物功能后，意外地觀察到優(yōu)越的抗腫瘤作用。所觀察到的優(yōu)越作用的作用模式可能是干擾血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能破壞現(xiàn)有成熟腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞-外周內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用的穩(wěn)定性，從而使內(nèi)皮對(duì)針對(duì)VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的化合物變得敏感。
基于這一意外的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供功能性干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和功能性干擾血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的組合，其用于抑制血管形成和腫瘤生長。
本發(fā)明的藥物組合物由以下兩種成分組成化合物I抑制一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物活性，或者化合物I由通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的識(shí)別而靶向于內(nèi)皮的細(xì)胞毒試劑組成。化合物II干擾一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能，或者化合物II由通過血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的識(shí)別而靶向于內(nèi)皮的細(xì)胞毒試劑組成。或者，化合物I抑制一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物活性，而化合物II由通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的識(shí)別或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的識(shí)別而靶向于內(nèi)皮的細(xì)胞毒試劑組成?？梢酝ㄟ^以下途徑進(jìn)行VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物活性的靶向或調(diào)節(jié)a)抑制受體酪氨酸激酶活性的化合物；b)抑制配體結(jié)合于受體的化合物；c)抑制受體的胞內(nèi)信號(hào)途徑激活的化合物；d)抑制或刺激VEGF或Tie受體系統(tǒng)的配體或受體表達(dá)的化合物；e)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的識(shí)別使細(xì)胞毒試劑或凝固作用誘導(dǎo)試劑靶向于內(nèi)皮；f)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們靶向于內(nèi)皮并誘導(dǎo)壞死或凋亡。
本發(fā)明的組合物包含的化合物可以是小分子量的物質(zhì)、寡核苷酸、寡肽、重組蛋白、抗體，或者它們的綴合物或融合蛋白。抑制劑的實(shí)例是通過與催化位點(diǎn)結(jié)合并占據(jù)催化位點(diǎn)使受體酪氨酸激酶失活從而降低受體生物活性的小分子量分子。激酶抑制劑在本領(lǐng)域是公知的(SugenSU5416，SU6668；Fong等，(1999)，Cancer Res.59，99-106；Vajkoczy等，Proc.Am.Associ.Cancer Res.San Francisco(2000)，Abstract ID 3612；ZenecaZD4190，ZD6474；Wedge等，(2000)，Cancer Res.60，970-975；Parke-Davis PD0173073，PD0173074；Johnson等，Proc.Am.Associ.Cancer Res.，San Franzisco(2000)，Abstract ID 3614；Dimitroff等，(1999)，Invest.New Drugs 17，121-135)。拮抗劑的實(shí)例是與配體結(jié)合從而阻止配體激活受體的重組蛋白或抗體。拮抗劑的另一個(gè)實(shí)例是與受體結(jié)合從而阻止受體激活的抗體。表達(dá)調(diào)節(jié)劑的實(shí)例是控制配體或受體表達(dá)的反義RNA或核酶。靶向細(xì)胞毒試劑的實(shí)例是配體和細(xì)菌或植物毒素如假單胞菌外毒素A、白喉毒素或蓖麻毒蛋白毒素的融合蛋白。靶向凝固作用誘導(dǎo)試劑的實(shí)例是單鏈抗體和組織因子的綴合物。Genentech(rhuMAbVEGF)和Presta等，(1997)，Cancer Res.57，4593-4599描述了配體結(jié)合抑制劑，如本領(lǐng)域公知的中和抗體。配體結(jié)合受體域在下列文獻(xiàn)中描述Kendall & Thomas(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.90，10705-10709；Goldman等，(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.95，8795-8800；以及Lin等，(1997)，J.Clin.Invest.100，2072-2078。另外，顯性陰性受體在Millauer等，(1994)，Nature 367，567-579中描述。
Imclone(c-p1C11，US 5,874,542)已經(jīng)描述了受體封閉性抗體。另外，拮抗配體突變體也是公知的(Siemeister等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.95，4625-4629)。高親和性配體或受體結(jié)合寡核苷酸已經(jīng)在NeXstar(NX-244)和Drolet等，(1996)，Nat.Biotech 14，1021-1025中描述。另外，小分子和肽也已經(jīng)得到描述。
表達(dá)調(diào)節(jié)劑已被描述為反義寡核苷酸和核酶(RPI，AngiozymeTM)，參見RPI主頁)。
輸運(yùn)/靶向系統(tǒng)的實(shí)例已被描述為配體/抗體-毒素-融合-蛋白或綴合物(Arora等，(1999)，Cancer Res.59，183-188和Olson等，(1997)，Int.J.Cancer 73，865-870)；被描述為脂質(zhì)體的內(nèi)皮細(xì)胞靶向(Spragg等，(1997)，Prog.Natl.Acad.Sci，U.S.A94，8795-8800；以及被描述為內(nèi)皮細(xì)胞靶向加凝固作用誘導(dǎo)(Ran等，(1998)，Cancer Res.58，4646-4653)。
舉例來說，抑制受體酪氨酸激酶活性的小分子是通式I的分子 式中r為0至2，n為0至2；R3和R4a)彼此獨(dú)立地代表低級(jí)烷基；b)一起形成通式II的橋， 其中通過兩個(gè)末端C原子連接，且m為0至4；或者c)一起形成通式III的橋， 其中環(huán)成員T1、T2、T3、T4中的一個(gè)或兩個(gè)代表氮，其它代表CH，并且通過原子T1和T4連接；G代表C1-C6烷基、C2-C6亞烷基或C2-C6亞烯基；或者被酰氧基或羥基取代的C2-C6亞烷基或C3-C6亞烯基；-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2、氧(-O-)、硫(-S-)或亞氨基(-NH-)；A、B、D、E和T彼此獨(dú)立地代表N或CH，條件是這些取代基中不超過三個(gè)代表N；Q代表低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或鹵素；R1和R2彼此獨(dú)立地代表H或低級(jí)烷基；X代表亞氨基、氧或硫；Y代表氫、未取代或取代的芳基、雜芳基，或者未取代或取代的環(huán)烷基；且Z代表氨基、單或二取代的氨基、鹵素、烷基、取代的烷基、羥基、醚化或酯化的羥基、硝基、氰基、羧基、酯化的羧基、烷?；?、氨基甲酰基、N-單取代或N，N-二取代的氨基甲酰基、脒基、胍基、巰基、硫代、苯硫基、苯基-低級(jí)烷基-硫、烷基-苯基-硫、苯基亞磺酰基、苯基-低級(jí)烷基-亞磺酰基、烷基苯基亞磺?；?、苯基磺?；⒈交?低級(jí)烷-磺?；?，或者烷基苯基磺?；?，但是，如果存在多于一個(gè)其余的Z(m≥2)，取代基Z彼此相同或不同，而且其中箭頭表示的鍵是單鍵或雙鍵；或者所述化合物的N氧化物，其中一個(gè)或多個(gè)N原子攜帶氧原子；或者是它們的鹽。
優(yōu)選的鹽是有機(jī)酸鹽，尤其是琥珀酸鹽。
這些化合物可以優(yōu)選地在本發(fā)明的藥物組合物中用作化合物I或化合物II。
舉例來說，分別阻止酪氨酸磷酸化，或阻止持續(xù)血管發(fā)生從而導(dǎo)致阻止腫瘤生長和腫瘤擴(kuò)散的化合物是通式IV的蒽酸(anthranylacid)衍生物 式中A代表＝NR2基團(tuán)；W代表氧、硫、兩個(gè)氫原子或＝NR8基團(tuán)，Z代表＝NR10基團(tuán)，或＝N-、-N(R10)-、(CH2)q-、支鏈或非支鏈C1-6烷基，或者是以下基團(tuán) 或者A、Z和R1一起形成以下基團(tuán) 或 m、n和o為0至3，q為1至6，Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf彼此獨(dú)立地代表氫、C1-4烷基或＝NR10基團(tuán)，和/或Ra和/或Rb與Rc和/或Rd一起，或者Rc與Re和/或Rf一起形成鍵，或者Ra-Rf基團(tuán)中多達(dá)兩個(gè)與R1或R2形成每個(gè)多達(dá)三個(gè)碳原子的橋，X代表＝NR9或＝N-基團(tuán)；Y代表-(CH2)p基團(tuán)，p為整數(shù)1至4；R1代表未取代或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代的C1-6烷基，或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基，或者是未取代或取代的芳基或雜芳基；R2代表氫或C1-6烷基，或與Ra-Rf和Z或R1一起形成多達(dá)3個(gè)環(huán)原子的橋；R3代表單環(huán)或雙環(huán)芳基或雜芳基，它們未被取代或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或羥基取代；R4、R5、R6和R7彼此獨(dú)立地代表氫、鹵素或C1-6烷氧基、C1-6烷基或C1-6羧基烷基，它們未被取代或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代，或者R5和R6一起形成以下基團(tuán) R8、R9和R10彼此獨(dú)立地代表氫或C1-6烷基，以及它們的異構(gòu)體和鹽。
這些化合物也可以優(yōu)選地在本發(fā)明的藥物組合物中用作化合物I或II。
更優(yōu)選的通式V的化合物 式中R1代表以下基團(tuán) 式中R5是氯、溴或-OCH3基團(tuán)， 式中R7是-CH3或氯， 式中R8是-CH3、氟、氯或 式中R4是 式中R6是-CH3-CF3， 氟、氯、溴、 或氯-CF3、-N＝C、-CH3、-OCF3或-CH2OH，R2代表吡啶基或以下基團(tuán) 或 且R3代表氫或氟，以及它們的異構(gòu)體和鹽也可以用作本發(fā)明的藥物組合物中的化合物I或II。
這些化合物具有與上述化合物IV中提到的相同的性質(zhì)，并且可以用于治療血管發(fā)生疾病。
組合物包含單獨(dú)的通式I、IV和V的化合物，或者它們的組合。
上述化合物也是在本發(fā)明的組合內(nèi)要求保護(hù)的主題。
配體結(jié)合抑制劑的其他實(shí)例是肽和編碼這些肽的DNA序列，它們用于治療血管發(fā)生疾病。這些肽和DNA序列在序列表的Seq.IDNo.1至59中公開。已證明Seq.ID No.34和34a是所主要關(guān)心的。
因此，本發(fā)明要求保護(hù)的主題是以下藥物組合物a)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能。
b)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮，所述化合物II調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能。
c)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，或者調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II靶向于內(nèi)皮。
d)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II通過一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
e)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮，所述化合物II通過一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
f)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
g)包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II通過一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮，以及h)包含一種或幾種試劑的藥物組合物，所述試劑既干擾一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的功能，也干擾一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的功能。
對(duì)于順序治療施用，本發(fā)明的藥物組合物可以同時(shí)或單獨(dú)施用。
本發(fā)明的組合物包含至少下列化合物之一作為化合物I或作為化合物IIa)抑制受體酪氨酸激酶活性的化合物；b)抑制配體結(jié)合于受體的化合物；c)抑制受體的胞內(nèi)信號(hào)途徑激活的化合物；d)抑制或刺激VEGF或Tie受體系統(tǒng)的配體或受體表達(dá)的化合物；e)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的識(shí)別使細(xì)胞毒試劑或凝固作用誘導(dǎo)試劑靶向于內(nèi)皮；f)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們靶向于內(nèi)皮并誘導(dǎo)壞死或凋亡。
這些組合物也是本發(fā)明要求保護(hù)的主題。
本發(fā)明要求保護(hù)的主題還有包含Seq.ID No.1-59中至少之一作為化合物I和/或II的藥物組合物。最有價(jià)值的是根據(jù)權(quán)利要求，包含Seq.ID No.34a作為化合物I和/或II的藥物組合物，以及包含sTie2、mAB 4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物至少之一作為化合物I和/或II的藥物組合物。
本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的主題是包含至少一種通式I、通式IV和/或通式V的小分子作為化合物I和/或II的藥物組合物。
可以在本發(fā)明的組合物中用作化合物I或II的最優(yōu)選的化合物是琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨。
因此，本發(fā)明要求保護(hù)的主題還有包含琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨、sTie2、mAB 4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物作為化合物I，以及琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨、sTie2、mAB 4301-42-35、scFv-tTF和/或L19scFv-tTF綴合物作為化合物II的藥物組合物，條件是化合物I與化合物II不同，以及最優(yōu)選的包含琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨作為化合物I，以及sTie2、mAB 4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物作為化合物II的藥物組合物；包含mAB4301-42-35作為化合物I，以及sTie2和/或scFv-tTF綴合物作為化合物II的藥物組合物；包含scFv-tTF綴合物作為化合物I，以及sTie2和/或mAB 4301-42-35作為化合物II的藥物組合物；包含L19 scFv-tTF綴合物作為化合物I，以及sTie2作為化合物II的藥物組合物。
上述小分子化合物、蛋白質(zhì)和DNA表達(dá)蛋白可以單獨(dú)或以配方形式作為治療腫瘤、癌癥、銀屑病、關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤、血管纖維瘤、眼病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼、腎病如腎小球腎炎、糖尿病腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管病綜合征、移植排斥反應(yīng)和腎小球病、纖維化疾病如硬變肝、腎小球膜細(xì)胞增生疾病、關(guān)節(jié)硬化(artheriosclerosis)和神經(jīng)組織損傷的藥物。
用本發(fā)明的組合治療損傷的神經(jīng)組織阻礙損傷位置瘢痕的快速形成。這樣，在軸突彼此聯(lián)系之前沒有瘢痕形成。因此，神經(jīng)連接的重建更容易。
此外，本發(fā)明的組合可以用于抑制患者中腹水形成。還可能抑制VEGF水腫。為了將本發(fā)明的組合用作藥物，將化合物配方成藥物組合物。所述配方除包含一種或幾種活性化合物之外，還包含藥學(xué)可接受的有機(jī)或無機(jī)惰性載體，如水、明膠、阿拉伯膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物油、聚亞烷基二醇等。所述藥物制劑可以以固體形式施用，如片劑、丸劑、栓劑、膠囊劑，或者可以以液體形式施用，如溶液、混懸劑或乳劑。
如果需要，該組合物另外含有添加劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、洗滌劑或乳化劑，用于改變滲透壓的鹽和/或緩沖劑。
這些用途以及活性化合物的配方也是本發(fā)明要求保護(hù)的主題。
對(duì)于腸胃外施用，注射溶液或混懸劑尤其適合，尤其是多羥基乙氧基化蓖麻油中的活性化合物水溶液。
還可以使用添加劑作為載體，如棓酸鹽或者動(dòng)物或植物磷脂，以及它們的混合物，和脂質(zhì)體或其成份。
對(duì)于口服施用，具有滑石粉和/或烴載體或粘合劑如乳糖、玉米或馬鈴薯淀粉的片劑、丸劑或膠囊劑尤其適合。口服施用還可以是任選地含有甜味劑的液體形式，如果汁。
活性物質(zhì)的劑量依據(jù)化合物的施用、患者的年齡和體重，以及疾病的形式和病程而不同。
活性化合物的每日劑量是0.5-1000mg，特別是50-200mg。劑量可以每日一劑，或者每日兩劑或多劑。
這些配方和施用形式也是本發(fā)明的一部分。
對(duì)VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的組合功能性干擾可以同時(shí)進(jìn)行，或者順序進(jìn)行以使對(duì)干擾一種配體/受體系統(tǒng)的生物響應(yīng)與對(duì)第二種配體/受體系統(tǒng)的生物響應(yīng)重疊?；蛘?，對(duì)VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的組合功能性干擾，以及通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或通過血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向細(xì)胞毒試劑可以同時(shí)進(jìn)行，或者順序進(jìn)行以使對(duì)功能性干擾配體/受體系統(tǒng)的生物響應(yīng)及時(shí)與細(xì)胞毒試劑的靶向重疊。
本發(fā)明還涉及功能性干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的物質(zhì)，或者通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和血管生成素/Tie受體系統(tǒng)而靶向的物質(zhì)。
VEGF/VEGF受體系統(tǒng)包括配體VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF，和受體酪氨酸激酶VEGF-R1(Flt1)、VEGF-R2(KDR/Flk1)、VEGF-R3(Flt4)，以及它們的共同受體(即神經(jīng)菌毛蛋白-1(neuropilin-1))。血管生成素/Tie受體系統(tǒng)包括Ang1、Ang2、Ang3/Ang4，和與Tie1或Tie2結(jié)合的與血管生成素相關(guān)的多肽，以及受體酪氨酸激酶Tie1和Tie2。
本發(fā)明的藥物組合物可以用于醫(yī)療目的。舉例來說，這些疾病是癌癥、癌轉(zhuǎn)移、包括視網(wǎng)膜病變和銀屑病在內(nèi)的血管發(fā)生。本發(fā)明的藥物組合物可以口服施用、腸胃外施用，或者通過基因療法而施用。
因此，本發(fā)明還涉及藥物組合物用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療腫瘤、癌癥、銀屑病、關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤、血管纖維瘤、眼病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼、腎病如腎小球腎炎、糖尿病腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管病綜合征、移植排斥反應(yīng)和腎小球病、纖維化疾病如硬變肝、腎小球膜細(xì)胞增生疾病、關(guān)節(jié)硬化、神經(jīng)組織損傷、抑制患者中腹水形成和抑制VEGF水腫。
以下實(shí)施例證明所公開的本發(fā)明的可行性，但并不將本發(fā)明限制于所公開的實(shí)施例。
使人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375v被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，從而過度表達(dá)人Tie2受體酪氨酸激酶的胞外配體-中和域(sTie2；化合物II)(Siemeister等，Cancer Res.59，3185-3191，1999)。為了對(duì)照，用空表達(dá)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染A375v細(xì)胞(A375v/pCEP)。分別用1×106個(gè)轉(zhuǎn)染的A375v/sTie2或A375v/pCEP腫瘤細(xì)胞皮下注射瑞士nulnu小鼠。用每日劑量為50mg/Kg的VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨治療接受化合物I的動(dòng)物達(dá)38天(Wood等，Cancer Res.60，2178-2189，2000)。各種治療方式如表1所述。通過卡尺測(cè)量最大直徑及其垂線來確定腫瘤生長。
表1
源于A375v/pCEP對(duì)照細(xì)胞的腫瘤在沒有治療的情況下(組1)在24天內(nèi)達(dá)到約250mm2的大小(平均面積)(

圖1)。單獨(dú)用VEGF受體抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨(化合物I，治療組2)治療，或者單獨(dú)通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie受體系統(tǒng)(化合物II，治療組3)延遲腫瘤生長，在31天時(shí)才達(dá)到約250mm2的大小。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie2系統(tǒng)和通過激酶抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的組合(化合物I+化合物II，治療組4)延遲腫瘤生長，到38天時(shí)才達(dá)到約250mm2的大小。
這一結(jié)果清楚地證明相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)模式而言，干擾VEGF-A/VEGF受體系統(tǒng)和干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合具有優(yōu)越的作用。實(shí)施例2功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)和中和VEGF-A的組合在抑制腫瘤生長方面優(yōu)于單獨(dú)干預(yù)模式。
按照實(shí)施例1描述的方法在裸鼠內(nèi)誘導(dǎo)源于A375v/sTie2細(xì)胞和A375v/pCEP細(xì)胞的腫瘤。每周兩次用200μg腹膜內(nèi)劑量的VEGF-A-中和單克隆抗體(mAb)4301-42-35治療接受化合物I的動(dòng)物，持續(xù)4周(Schlaeppi等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.125，336-342，1999)。各種治療方式如表2所述。當(dāng)組1的腫瘤超過約1000mm3的體積時(shí)，出于倫理原因而處死動(dòng)物。通過卡尺測(cè)量最大直徑及其垂線來確定腫瘤生長。
表2
源于A375v/pCEP對(duì)照細(xì)胞的腫瘤在沒有治療的情況下(組1)在28天內(nèi)達(dá)到約1000mm3的大小(圖2)。用VEGF-A-中和mAb 4301-42-35(化合物I，治療組2)治療的腫瘤在28天內(nèi)長到約450mm3的體積。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)(化合物II，治療組3)減慢腫瘤生長，在28天內(nèi)長到約600mm3的體積。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie系統(tǒng)和通過mAb 4301-42-35中和VEGF-A的組合(化合物I+化合物II，治療組4)抑制腫瘤生長，在28天內(nèi)才達(dá)到約250mm3的體積。
這清楚地證明相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，中和VEGF-A和功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合具有優(yōu)越的作用。
按照實(shí)施例1描述的方法在裸鼠內(nèi)誘導(dǎo)源于A375v/sTie2細(xì)胞和A375v/pCEP細(xì)胞的腫瘤。使特異性識(shí)別人VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物的單鏈抗體(scFv)(WO 99/19361)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，并且通過Ran等(Cancer Res.58，4646-4653，1998)描述的方法綴合到凝固作用誘導(dǎo)重組人截短的組織因子(tTF)上。當(dāng)腫瘤達(dá)到約200mm3的大小時(shí)，用20μg靜脈內(nèi)劑量的scFv-tTF綴合物在第0天和第4天治療接受化合物I的動(dòng)物。各種治療方式如表3所述。當(dāng)組1的腫瘤超過約1000mm3的體積時(shí)，出于倫理的原因處死動(dòng)物。通過卡尺測(cè)量最大直徑及其垂線來確定腫瘤生長。
表3
源于A375v/pCEP對(duì)照細(xì)胞的腫瘤在沒有治療的情況下(組1)在28天內(nèi)達(dá)到約1000mm3的大小(圖3)。用通過scFv-tTF綴合物而靶向于VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物的凝固作用誘導(dǎo)tTF(化合物I，治療組2)治療的腫瘤在28天內(nèi)長到約500mm3的體積。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie2系統(tǒng)(化合物II，治療組3)減慢腫瘤生長，在28天內(nèi)達(dá)到約600mm3的體積。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie系統(tǒng)和靶向VEGF受體復(fù)合物的組合(化合物I+化合物II，治療組4)抑制腫瘤生長，在28天內(nèi)才達(dá)到約300mm3的體積。
這清楚地證明相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，凝固作用誘導(dǎo)tTF靶向于VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物和功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合具有優(yōu)越的作用。預(yù)期將細(xì)胞毒試劑靶向于VEGF/VEGF受體系統(tǒng)會(huì)有相似的作用。
按照實(shí)施例1描述的方法在裸鼠內(nèi)誘導(dǎo)源于A375v/pCEP細(xì)胞的腫瘤。用每日50mg/Kg口服劑量的VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨治療接受化合物I的動(dòng)物，直到28天(Wood等，Cancer Res.60，2178-2189，2000)?；衔颕I由特異性識(shí)別人VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物的單鏈抗體(scFv)(WO 99/19361)組成，使該抗體在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，并且通過Ran等(Cancer Res.58，4646-4653，1998)描述的方法綴合到凝固作用誘導(dǎo)重組人截短的組織因子(tTF)上。當(dāng)腫瘤長到約200mm3的大小時(shí)，用20μg靜脈內(nèi)劑量的scFv-tTF綴合物在第0天和第4天治療接受化合物II的動(dòng)物。各種治療方式如表4所述。當(dāng)組1的腫瘤超過約1000mm3的體積時(shí)，出于倫理的原因處死動(dòng)物。通過卡尺測(cè)量最大直徑及其垂線來確定腫瘤生長。
表4
源于A375v/pCEP對(duì)照細(xì)胞的腫瘤在沒有治療的情況下(組1)在28天內(nèi)達(dá)到約1000mm3的大小(圖4)。單獨(dú)用VEGF受體抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨治療(化合物I，治療組2)導(dǎo)致腫瘤體積降低到約550mm3。用通過scFv-tTF綴合物靶向于VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物的凝固作用誘導(dǎo)tTF(化合物II，治療組3)治療的腫瘤在28天內(nèi)生長到約500mm3的體積。通過琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨抑制VEGF受體酪氨酸激酶和靶向VEGF受體復(fù)合物的組合(化合物I+化合物II，治療組4)抑制腫瘤生長，在28天內(nèi)達(dá)到約400mm3的體積。
這清楚地證明相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，凝固作用誘導(dǎo)tTF靶向于VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物和功能性干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的組合具有優(yōu)越的作用。預(yù)期將細(xì)胞毒試劑靶向于血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)會(huì)有相似的作用。
按照實(shí)施例1描述的方法在裸鼠內(nèi)誘導(dǎo)源于A375v/sTie2細(xì)胞和A375v/pCEP細(xì)胞的腫瘤。按照Nilsson等描述的方法(Nat.Med.，in press)使由特異性識(shí)別纖連蛋白癌胚(oncofoetal)ED-B域的L19單鏈抗體和組織因子的胞外域組成的融合蛋白(L19 scFv-tTF)在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。此外，D.Neri和F.Nilsson已經(jīng)提供了L19 scFv-tTF的數(shù)據(jù)(會(huì)議“Advances in the application of monoclonal antibodies inclinical oncology(單克隆抗體在臨床腫瘤學(xué)中的進(jìn)展)”，Samos，Greece，31.May-2.June 2000)。當(dāng)腫瘤達(dá)到約200mm3的大小時(shí)，用200μl鹽水中20μg L19 scFv-tTF的單一靜脈內(nèi)劑量治療接受化合物I的動(dòng)物。各種治療方式如表5所述。當(dāng)組1的腫瘤超過約1000mm3的體積時(shí)，出于倫理的原因處死動(dòng)物。通過卡尺測(cè)量最大直徑及其垂線來確定腫瘤生長。
表5
源于A375v/pCEP對(duì)照細(xì)胞的腫瘤在沒有治療的情況下(組1)在28天內(nèi)達(dá)到約1000mm3的大小(圖5)。用凝固作用誘導(dǎo)L19 scFv-tTF治療(化合物I，治療組2)的腫瘤在28天內(nèi)生長到約450mm3的體積。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)(化合物II，治療組3)減慢腫瘤生長，在28天內(nèi)達(dá)到約600mm3的體積。通過sTie2表達(dá)干擾血管生成素/Tie2系統(tǒng)和用L19 scFv-tTF靶向內(nèi)皮的組合(化合物I+化合物II，治療組4)抑制腫瘤生長，在28天內(nèi)達(dá)到約250mm3的體積。
這清楚地證明相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，L19 scFv-tTF靶向于內(nèi)皮和功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合具有優(yōu)越的作用。
按照實(shí)施例1描述的方法在裸鼠內(nèi)誘導(dǎo)源于A375v/pCEP細(xì)胞的腫瘤。用每日50mg/Kg口服劑量的VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨治療接受化合物I的動(dòng)物，直到28天(Wood等，Cancer Res.60，2178-2189，2000)?；衔颕I由實(shí)施例5中描述的L19 scFv-tTF融合蛋白組成。當(dāng)腫瘤達(dá)到約200mm3的大小時(shí)，用200μl鹽水中20μg L19 scFv-tTF的靜脈內(nèi)劑量治療接受化合物II的動(dòng)物。各種治療方式如表6所述。當(dāng)組1的腫瘤超過約1000mm3的體積時(shí)，出于倫理的原因處死動(dòng)物。通過卡尺測(cè)量最大直徑及其垂線來確定腫瘤生長。
表6
源于A375v/pCEP對(duì)照細(xì)胞的腫瘤在沒有治療的情況下(組1)在28天內(nèi)達(dá)到約1000mm3的大小(圖6)。單獨(dú)用VEGF受體抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨(化合物I，治療組2)治療的腫瘤的腫瘤體積降低到約550mm3。用靶向于內(nèi)皮的凝固作用誘導(dǎo)L19 scFv-tTF治療(化合物II，治療組3)的腫瘤在28天內(nèi)長到約450mm3的體積。通過琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨抑制VEGF受體酪氨酸激酶和靶向VEGF受體復(fù)合物的組合(化合物I+化合物II，治療組4)抑制腫瘤生長，在28天內(nèi)長到約200mm3的體積。
這清楚地證明L19 scFv-tTF靶向于內(nèi)皮和功能性干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的組合相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，具有優(yōu)越的作用。
簡寫代表下述意義mock，con. ＝治療組1mock+VEGF-A ＝治療組2sTIE2-c113 ＝治療組3sTIE2-c113+VEGF-A ＝治療組4圖2顯示VEGF中和與功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，在腫瘤生長抑制方面的優(yōu)越作用(表2中給出了組1-4的治療方式)。
圖3顯示通過scFv-tTF綴合物使凝固作用誘導(dǎo)tTF靶向于VEGF/VEGF受體I復(fù)合物和功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，在腫瘤生長抑制方面的優(yōu)越作用(表3中給出了組1-4的治療方式)。
圖4顯示通過scFv-tTF綴合物使凝固作用誘導(dǎo)tTF靶向于VEGF/VEGF受體I復(fù)合物和通過VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨功能性干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的組合相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，在腫瘤生長抑制方面的優(yōu)越作用(表4中給出了組1-4的治療方式)。
圖5顯示使凝固作用誘導(dǎo)L19 scFv-tTF融合蛋白靶向于內(nèi)皮和功能性干擾血管生成素/Tie2受體系統(tǒng)的組合相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，在腫瘤生長抑制方面的優(yōu)越作用(表5中給出了組1-4的治療方式)。
圖6顯示使凝固作用誘導(dǎo)L19 scFv-tTF融合蛋白靶向于內(nèi)皮和通過VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨功能性干擾VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的組合相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)方式而言，在腫瘤生長抑制方面的優(yōu)越作用(表6中給出了組1-4的治療方式)。
序列表<110>舍林股份公司<120>干擾VEGF/VEGF和血管生成素/Tie受體功能的組合和組合物以及它們的用途II<130>51867AEPM1XX00-P<140><141><160>59<210>1<211>1835<212>DNA<213>人<400>1ttttacagtt ttccttttct tcagagttta ttttgaattt tcatttttgg ataaccaagc 60agctctttaa gaagaatgca cagaagagtc attctggcac ttttggatag tacataagat 120tttctttttt ttttttaaat tttttttaat agtcacattc agctcgcttg ctcaaaccag 180actcccacat tgggtgagca agatgagccc ataggattcc agagttaata cgtaaccgta 240tatacaaaca gccaaaaaac cataatggtg ccacagggat ggagcaggga agggcatctc 300taacgtgtcc tctagtctat cttcgctaaa cagaacccac gttacacatg ataactagag 360agcacactgt gttgaaacga ggatgctgac cccaaatggc acttggcagc atgcagttta 420aagcaaaaga gacatccttt aataactgta taaaatccag gcagttccat taaaggggtt 480aagaaaacca acaacaacaa aaagcgaggg actgtctgtt gtcactgtca aaaaggcact 540tggagttaat gggaccagga ttggaggact cttagctgat acagatttca gtacgatttc 600attaaaaggc ttggatgtta agagaggaca ctcagcggtt cctgaaggga gacgctgaga 660tggaccgctg agaagcggaa cagatgaaca caaaggaatc aaatctttac aaccaaattg 720catttaagcg acaacaaaaa aaggcaaacc 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300tgaagatggt cttctccgtg gggcgagaga caaagcagtc cacgaggtag gggcagggtg 360ctcgctggca cacaaacacg ggctccatgg tccagccgta caggcgccac tggccataga 420ggaagcctgc ctctagcaca ctcttgcaga gcacactggc gacataggtg cccatcagtg 480ctccgcggat gcgcaggcga ccatcttctg ccaccgagat cttggccatc tgacgctcta 540cggccgccag cgcccgctcc acctgtgggt ccttggccgg cagtgcccgc agctccccct 600ccttctgccg cagccgctct tctcgccgag acaggtaaat gacatggccc aggtagacca 660gggtgggtgt gctgacgaag aggaactgca gcacccagta gcggatgtgg gagatgggga 720aggcctggtc atagcagacg ttggtgcagc ctggctgggc cgtgttacac tcgaaatctg 780actgctcgtc accccacact gactcgccgg ccaggcccag gatgaggatg cggaagatga 840agagcaccgt cagccagatc ttacccacca cggtcgagtg ctcctggacc tggtccagca 900acttctccac gaagccccag tcacccatgg ctcccgggcc tccgtcggca aggagacaga 960gcacgtcagt gtgtcagcat ggcatccttc tcgttcgccc agcaacaagc ctgcagggag 1020gtctgccacg cccgttctac cgcctgcctg ccgggcggcc caggtggagg tggggacgat 1080ggccggagtg acgcccgcg<210>5<211>1015<212>DNA<213>人<400>5gaggataggg agcctggggt caggagtgtg ggagacacag 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cgcggagatg acgtcacgca agcaacggcg 1620ctgacgtcac atatcaccgt ggtgatggcg tcacgtggcc atgtagacgt cacgaagaga 1680tatagcgatg gcgtcgtgca gatgcagcac gtcgcacaca gacatgggga acttggcatg 1740acgtcacacc gagatgcagc aacgacgtca cgggccatgt cgacgtcaca catattaatg 1800tcacacagac gcggcgatgg catcacacag acggtgatga tgtcacacac agacacagtg 1860acaacacaca ccatgacaac gacacctata gatatggcac caacatcaca tgcacgcatg 1920ccctttcaca cacactttct acccaattct cacctagtgt cacgttcccc cgaccctggc 1980acacgggcca aggtacccac aggatcccat cccctcccgc acagccctgg gccccagcac 2040ctcccctcct ccagcttcct ggcctcccag ccacttcctc acccccagtg cctggacccg 2100gaggtgagaa caggaagcca ttcacctccg ctccttgagc gtgagtgttt ccaggacccc 2160ctcggggccc tgagccgggg gtgagggtca cctgttgtcg ggaggggagc cactccttct 2220cccccaactc ccagccctgc ctgtggcccg ttgaaatgtt ggtggcactt aataaatatt 2280agtaaatcct taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa<210>7<211>389<212>DNA<213>人<400>7gccaaaaaga tggcttcaaa agtaagaatg aaacatttga tccattcagc tttaggctat 60gccactggat tcatgtctag aaaagatagg ataatttctg taaagaaatg 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ctgtttcctg<210>58<211>1049<212>DNA<213>人<400>58atctgatcaa gaatacctgc cctggtcact ctgcggatgt ttctgtccac ttgttcacat 60tgaggaccaa gatatccttt tttacagagg cacttgttcg gtctaacaca gacacctcca 120tgacgacatg ctggctcaca ttttgcagtt ctgcagaagt ccccctccca gcctggacta 180cagcagcact ttcccgtggg ggtgcagtag ccgtttcgac agagcctgga gcactctgaa 240gtcagtgtct gtgcaggttg taccgtggct ctgcattcct caggcattaa aggtcttttg 300ggatctacaa ttttgtagag ttttccattg tgagtctggg tcatactttt actgcttgat 360aaaatgtaaa cttcacctag ttcatcttct ccaaatccca agatgtgacc ggaaaagtag 420cctctacagg acccactagt gccgacacag agtggttttt cttgccactg ctttgtcaca 480ggactttgct ggagagttag gaaattccca ttacgatctc caaacacgta gcttccatac 540aatctttctg actggcagcc ccggtataca aatccaccaa ccaaaggacc attactgaat 600ggcttgaatt ctaaaagtga tggctcactt tcataatctt tcccctttat tatctgtaga 660attctggctg atgatctgtt ttttccattg gagtctgaac acagtatcgt taaattgatg 720tttatatcag tgggatgtct atccacagca catctgcctg gatcgtggag cccatgagca 780aacacttcgg ggggctggtt ggtgctgttg aagtgtgggt tgctccttgg 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gatcagagat acacccgtgt ttgtctcgaa gggctccaca 660gcccagtacg acatgcttgc agaagtagta tctctggact tctgcctcca gtcgaccggc 720cgcgaattta gtagtaatag cggccgc
權(quán)利要求
1.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能。
2.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮，所述化合物II調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能。
3.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，或者調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II靶向于內(nèi)皮。
4.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II通過一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
5.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮，所述化合物II通過一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
6.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II通過一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
7.包含一種或幾種試劑作為化合物I，以及一種或幾種試劑作為化合物II的藥物組合物，所述化合物I調(diào)節(jié)一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的生物功能，所述化合物II通過一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)靶向于內(nèi)皮。
8.包含一種或幾種試劑的藥物組合物，所述試劑既干擾一種或幾種VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的功能，也干擾一種或幾種血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的功能。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的藥物組合物，所述藥物組合物打算供同時(shí)或單獨(dú)順序治療施用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少下列化合物之一作為化合物Ia)抑制受體酪氨酸激酶活性的化合物；b)抑制配體結(jié)合于受體的化合物；c)抑制受體的胞內(nèi)信號(hào)途徑激活的化合物；d)抑制或刺激VEGF或Tie受體系統(tǒng)的配體或受體表達(dá)的化合物；e)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的識(shí)別使細(xì)胞毒試劑或凝固作用誘導(dǎo)試劑靶向于內(nèi)皮；f)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們靶向于內(nèi)皮并誘導(dǎo)壞死或凋亡。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-8的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少下列化合物之一作為化合物IIg)抑制受體酪氨酸激酶活性的化合物；h)抑制配體結(jié)合于受體的化合物；i)抑制受體的胞內(nèi)信號(hào)途徑激活的化合物；j)抑制或刺激VEGF或Tie受體系統(tǒng)的配體或受體表達(dá)的化合物；k)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們通過VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的識(shí)別使細(xì)胞毒試劑或凝固作用誘導(dǎo)試劑靶向于內(nèi)皮；l)輸運(yùn)系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和性結(jié)合寡核苷酸或寡肽，或脂質(zhì)體，它們靶向于內(nèi)皮并誘導(dǎo)壞死或凋亡。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的藥物組合物，所述藥物組合物包含Seq.ID No.1-59中至少之一作為化合物I和/或II。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11的藥物組合物，所述藥物組合物包含Seq.ID No.34a作為化合物I和/或II。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11的藥物組合物，所述藥物組合物包含sTie2、mAB 4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物中至少之一作為化合物I和/或II。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11的藥物組合物，所述藥物組合物包含以下至少一種小分子作為化合物I和/或II通式I的化合物，或者所述化合物的N氧化物，其中一個(gè)或多個(gè)N原子攜帶氧原子；或者是它們的鹽， 式中r為0至2，n為0至2；R3和R4a)彼此獨(dú)立地代表低級(jí)烷基；b)一起形成通式II的橋， 其中通過兩個(gè)末端C原子連接，且m為0至4；或者c)一起形成通式III的橋， 其中環(huán)成員T1、T2、T3、T4中的一個(gè)或兩個(gè)代表氮，其它代表CH，并且通過原子T1和T4連接；G代表C1-C6烷基、C2-C6亞烷基或C2-C6亞烯基；或者被酰氧基或羥基取代的C2-C6亞烷基或C3-C6亞烯基；-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-、-CH2-NH-CH2、氧(-O-)、硫(-S-)或亞氨基(-NH-)；A、B、D、E和T彼此獨(dú)立地代表N或CH，條件是這些取代基中不超過三個(gè)代表N；Q代表低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或鹵素；R1和R2彼此獨(dú)立地代表H或低級(jí)烷基；X代表亞氨基、氧或硫；Y代表氫、未取代或取代的芳基、雜芳基，或者未取代或取代的環(huán)烷基；且Z代表氨基、單或二取代的氨基、鹵素、烷基、取代的烷基、羥基、醚化或酯化的羥基、硝基、氰基、羧基、酯化的羧基、烷酰基、氨基甲?；?、N-單取代或N，N-二取代的氨基甲?；㈦呋?、胍基、巰基、硫代、苯硫基、苯基-低級(jí)烷基-硫、烷基-苯基-硫、苯基亞磺?；?、苯基-低級(jí)烷基-亞磺?；?、烷基苯基亞磺?；?、苯基磺?；?、苯基-低級(jí)烷-磺?；蛘咄榛交酋；?，如果存在多于一個(gè)其余的Z(m≥2)，取代基Z彼此相同或不同，而且其中箭頭表示的鍵是單鍵或雙鍵；和/或通式IV的化合物，以及它們的異構(gòu)體和鹽， 式中A代表＝NR2基團(tuán)；W代表氧、硫、兩個(gè)氫原子或＝NR8基團(tuán)，Z代表＝NR10基團(tuán)，或＝N-、-N(R10)-、(CH2)q-、支鏈或非支鏈C1-6烷基，或者是以下基團(tuán) 或者A、Z和R1一起形成以下基團(tuán) 或 m、n和o為0至3，q為1至6，Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf彼此獨(dú)立地代表氫、C1-4烷基或＝NR10基團(tuán)，和/或Ra和/或Rb與Rc和/或Rd一起，或者Rc與Re和/或Rf一起形成鍵，或者Ra-Rf基團(tuán)中多達(dá)兩個(gè)與R1或R2形成每個(gè)多達(dá)三個(gè)碳原子的橋，X代表＝NR9或＝N-基團(tuán)；Y代表-(CH2)p基團(tuán)，p為整數(shù)1至4；R1代表未取代或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代的C1-6烷基，或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基，或者是未取代或取代的芳基或雜芳基；R2代表氫或C1-6烷基，或與Ra-Rf和Z或R1一起形成多達(dá)3個(gè)環(huán)原子的橋；R3代表單環(huán)或雙環(huán)芳基或雜芳基，它們未被取代或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或羥基取代；R4、R5、R6和R7彼此獨(dú)立地代表氫、鹵素或C1-6烷氧基、C1-6烷基或C1-6羧基烷基，它們未被取代或任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素取代，或者R5和R6一起形成以下基團(tuán) R8、R9和R10彼此獨(dú)立地代表氫或C1-6烷基，和/或通式V的化合物，以及它們的異構(gòu)體和鹽， 式中R1代表以下基團(tuán) 式中R5是氯、溴或-OCH3基團(tuán)， 式中R7是-CH3或氯， 式中R8是-CH3、氟、氯或 式中R4是 式中R6是-CH3-CF3， 氟、氯、溴、 或氯-CF3、-N＝C、-CH3、-OCF3或-CH2OH，R2代表吡啶基或以下基團(tuán) 或 且R3代表氫或氟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，所述藥物組合物包含琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨作為化合物I和/或II。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16的藥物組合物，所述藥物組合物包含琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨、sTie2、mAB4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物作為化合物I，以及琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨、sTie2、mAB4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物作為化合物II，條件是化合物I與化合物II不同。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17的藥物組合物，所述藥物組合物包含琥珀酸(4-氯苯基)[4-(4-吡啶甲基)-酞嗪-1-基]氫銨作為化合物I，以及sTie2、mAB 4301-42-35、scFv-tTF和/或L19 scFv-tTF綴合物作為化合物II。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17的藥物組合物，所述藥物組合物包含mAB 4301-42-35作為化合物I，以及sTie2和/或scFv-tTF綴合物作為化合物II。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-17的藥物組合物，所述組合物包含scFv-tTF綴合物作為化合物I，以及sTie2和/或mAB 4301-42-35作為化合物II。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-17的藥物組合物，所述藥物組合物包含L19 scFv-tTF綴合物作為化合物I，以及sTie2作為化合物II。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21的藥物組合物用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療腫瘤、癌癥、銀屑病、關(guān)節(jié)炎如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤、血管纖維瘤、眼病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼、腎病如腎小球腎炎、糖尿病腎病、惡性腎硬化、血栓性微血管病綜合征、移植排斥反應(yīng)和腎小球病、纖維化疾病如硬變肝、腎小球膜細(xì)胞增生疾病、關(guān)節(jié)硬化、神經(jīng)組織損傷、抑制患者中腹水形成和抑制VEGF水腫。
全文摘要
本發(fā)明描述了干擾血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/VEGF受體系統(tǒng)生物活性的物質(zhì)(化合物I)和干擾血管生成素(Angiopoietin)/Tie受體系統(tǒng)生物功能的物質(zhì)(化合物II)的組合，所述組合用于抑制血管形成和治療癌癥。
文檔編號(hào)A61P27/06GK1479629SQ01811583
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2001年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月23日
發(fā)明者格哈德·西梅斯特, 馬丁·哈貝賴, 卡爾－海因茨·蒂爾奧赫, Ｒ虼摹さ俁 潞, 哈貝賴, 格哈德 西梅斯特 申請(qǐng)人:舍林股份公司, 格哈德·西梅斯特, 馬丁·哈貝賴, 卡爾－海因茨·蒂爾奧赫