專利名稱：用于治療視網(wǎng)膜外層疾病的具有5－h(huán)t的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療因急性或慢性眼部變性情況或疾病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜外層疾病的具有5-HT1A興奮劑活性的化合物。
背景技術(shù)：
與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)是中年以上失明的主要原因，其中發(fā)生率從65歲成年人中的約20％增加到75歲或75歲以上個(gè)體的37％。非滲出性AMD的特征在于視網(wǎng)膜外層、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)、布魯赫膜和脈絡(luò)膜血管層中脈絡(luò)膜小疣累積和視桿和視錐光感受器萎縮；而滲出性AMD導(dǎo)致脈絡(luò)膜新血管形成(Green和Enger，《眼科學(xué)》(Ophthalmol)，1001519-35，1993；Green等，《眼科學(xué)》(Ophthalmol)，92615-27，1985；Green和Key，《美國眼科學(xué)協(xié)會學(xué)報(bào)》(Trans Am Ophthal Soc)，75180-254，1977；Bressler等，《視網(wǎng)膜》(Retina)，14130-42，1994；Schneider等，《視網(wǎng)膜》(Retina)，18242-50，1998；Green和Kuchle(1997)Yannuzzi，L.A.，F(xiàn)lower，R.W.，Slakter，J.S.(編輯)《靛青綠血管成形術(shù)》(Indocyanine green angiography.)St.LouisMosby，151-6頁)。色素性視網(wǎng)膜炎(RP)代表一組遺傳性營養(yǎng)不良，其特征在于視桿變性導(dǎo)致繼發(fā)性視錐光感受器萎縮和位于色素上皮的下面(Pruett，《美國眼科學(xué)協(xié)會學(xué)報(bào)》(Trans Am Ophthalmol Soc)，81693-735，1983；Heckenlively，《美國眼科學(xué)協(xié)會學(xué)報(bào)》(Trans Am Ophthalmol Soc)，85438-470，1987；Pagon，《眼科手術(shù)》(Sur Ophthal)，33137-177，1988；Berson，《眼科視覺科學(xué)研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)，341659-1676，1993；Nickells和Zack，《眼科遺傳學(xué)》(OphthalmicGenet)，17145-65，1996)。諸如AMD和RP這樣的視網(wǎng)膜變性疾病的發(fā)病機(jī)制是多方面的且可以由正常個(gè)體或那些有遺傳傾向的個(gè)體中的環(huán)境因素所引起。迄今為止已經(jīng)對100種以上可能與各種視網(wǎng)膜外層變性有關(guān)的基因進(jìn)行了作圖或克隆。
接觸光是鑒定為諸如AMD這樣的視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)展的構(gòu)成因素的環(huán)境因素(Young，《眼科手術(shù)》(Sur Ophthal)，32252-269，1988；Taylor等，《眼科構(gòu)造》(Arch Ophthal)，11099-104，1992；Cruickshank等，《眼科構(gòu)造》(Arch Ophthal)，111514-518，1993)。已經(jīng)證實(shí)導(dǎo)致對視網(wǎng)膜細(xì)胞光損害的光氧化性應(yīng)激反應(yīng)是用于研究因下列原因?qū)е碌囊暰W(wǎng)膜變性疾病的有用的模型主要對視網(wǎng)膜外層的光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)導(dǎo)致?lián)p害，這與遺傳性變性疾病所影響的細(xì)胞相同(Noell等，《眼科視覺科學(xué)研究》(Invest OphthalVisSci)，5，450-472，1966；Bressler等，《眼科手術(shù)》(SurOphthal)，32，375-413，1988；Curcio等，《眼科視覺科學(xué)研究》(InvestOphthal Vis Sci)，37，1236-1249，1996)；編程性細(xì)胞死亡是細(xì)胞死亡機(jī)制，通過該機(jī)制以及在光氧化性誘發(fā)的細(xì)胞損傷之后光感受器和RPE細(xì)胞在AMD和RP中損耗(Ge-Zhi等，《美國眼科學(xué)協(xié)會學(xué)報(bào)》(TransAm Ophthal Soc)，94，411-430，1996；Abler等，《分子病理藥理學(xué)研究通訊》(Res Commun Mol Pathol Pharmacol)，92，177-189，1996；Nickells和Zack，《眼科遺傳學(xué)》(OphthalmicGenet)，17145-65，1996)；已經(jīng)將光推斷為AMD和RP發(fā)展的環(huán)境危害因素(Taylor等，《眼科構(gòu)造》(ArchOphthalmol)，110，99-104，1992；Naash等，《眼科視覺科學(xué)研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)，37，775-782，1996)；且還證實(shí)抑制光氧化性損傷的治療干預(yù)在遺傳性變性視網(wǎng)膜疾病動(dòng)物模型中是有效的(LaVail等，《美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc Nat Acad Sci)，89，11249-11253，1992；Fakforovich等，《自然》(Nature)，347，83-86，1990；Frasson等，《天然藥物》(Nat.Med.)5，1183-1187，1990)。
已經(jīng)在各種動(dòng)物模型中鑒定了將視網(wǎng)膜的光氧化性損傷減小到最低限度的許多不同化合物類型。它們包括抗氧化劑，諸如抗壞血酸鹽(Organisciak等，《眼科視覺科學(xué)研究》(Invest Ophthal Vis Sci)，261589-1598，1985)、二甲基硫脲(Organisciak等，《眼科視覺科學(xué)研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)，331599-1609，1992；Lam等，《眼科構(gòu)造》(Arch Ophthalmol)，1081751-1752，1990)、α-生育酚(Kozaki等，Nippon Ganka Gakkai Zasshi，98948-954，1994)和β-胡蘿卜素(Rapp等，《最新眼科研究》(Cur Eye Res)，15219-232，1995)；鈣拮抗劑，諸如氟桂嗪(Li等，《眼科實(shí)驗(yàn)研究》《Exp Eye Res》，5671-78，1993；Edward等，《眼科構(gòu)造》(Arch Opht halmol)，109，554-622，1992；Collier等，《眼科視覺科學(xué)研究》(Invest OphthalmolVisSci)，36S516)；生長因子，諸如堿性成纖維細(xì)胞生長因子、腦衍生神經(jīng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和白細(xì)胞介素-1-β(LaVail等，《國家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc Nat Acad Sci)，89，11249-11253，1992)；糖皮質(zhì)激素，諸如甲潑尼龍(Lam等，Graefes Arch Clin ExpOphthal，231，729-736，1993)和地塞米松(Fu等，《眼科實(shí)驗(yàn)研究》《ExpEye Res》，54，583-594，1992)；鐵螯合劑，諸如去鐵胺(Li等，《最新眼科研究》(CurEyeRes)，2，133-144，1991)；NMDA-拮抗劑，諸如依利羅地和MK-801(Collier等，《眼科視覺科學(xué)研究》(InvestOphthalmol Vis Sci)，40S159，1999)。
已經(jīng)注冊了5-羥色胺能5-HT1A興奮劑(即丁螺環(huán)酮、齊培瑞西酮(ziprasidone)、烏拉地爾)或開始將其用于治療焦慮、高血壓、精神分裂癥、精神病或兩極抑郁癥。此外，已經(jīng)證實(shí)5-HT1A興奮劑在各種動(dòng)物模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用且在臨床上正在評估將它用于治療大腦局部缺血、頭部創(chuàng)傷、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化和肌萎縮性側(cè)索硬化。經(jīng)證實(shí)5-HT1A興奮劑8-OH-DPAT(8-羥基-2-(二正丙氨基)四氫化萘)和依沙匹隆可預(yù)防大鼠顱底前庭細(xì)胞外側(cè)核中NMDA誘發(fā)的興奮性毒性神經(jīng)元損害(Oosterink等，《歐洲藥理學(xué)雜志》(Eur JPharmacol)，358147-52，1998)，使用Bay-x3702給藥顯著減少了大鼠急性真皮下血腫模型中的局部缺血損害(Alessandri等，《大腦研究》(Brain Res)，845232-5，1999)，而8-OH-DPAT、Bay-x3702烏拉地爾、吉哌隆和CM57493顯著減小了大腦中動(dòng)脈閉合后大鼠(Bielenberg和Burkhardt，《中風(fēng)》(Stroke)，21(Suppl)IV161-3；Semkova等，《歐洲藥理學(xué)雜志》(Eur J Pharmacol)，359251-60，1998；Peruche等，J Neural Transm-Park Dis DementSect，873-83，1994)和小鼠(Prehn等，《歐洲藥理學(xué)雜志》(Eur JPharmacol)，203213-22，1991；Prehn等，《大腦研究》(BrainRes)，63010-20，1993)皮層梗塞的體積。此外，已經(jīng)證實(shí)使用有效的5-HT1A興奮劑SR57746A治療大鼠對4-血管短暫普遍局部缺血、硫酸長春新堿誘發(fā)的隔海馬損害、丙烯酰胺誘發(fā)的外周神經(jīng)病變和坐骨神經(jīng)粉碎后具有神經(jīng)保護(hù)作用(Fournier等，《神經(jīng)科學(xué)》(Neurosci)，55629-41，1993)且已經(jīng)證實(shí)該方法可延緩pmn小鼠體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的發(fā)展(Fournier等，《英國藥理學(xué)雜志》(Br JPharmacol)，124811-7，1998)。
已經(jīng)公開了這種類型的化合物可用于治療青光眼(減輕和控制眼內(nèi)壓(IOP))，例如，參見WO98/18458(DeSantis等)和EP0771563A2(Mano等)。Osborne等(《眼科學(xué)》(Ophthalmologica)，第210卷308-314，1996)教導(dǎo)了8-羥基二丙氨基四氫化萘(8-OH-DPAT)(一種5-HT1A興奮劑)可降低家兔的IOP。Wang等(《最新眼科研究》(Current Eye Research)，第16卷(8)769-775，1997年8月和IVOS，第39卷(4)，S488，1998年3月)公開了一種α1A拮抗劑和5-HT1A興奮劑5-甲基烏拉地爾可降低猴子的IOP，不過，這是由于其α1A受體活性所導(dǎo)致的。此外，將5-HT1A拮抗劑公開為用于治療青光眼(升高的IOP)(例如WO92/0338，McLees)。此外，DeSai等(WO97/35579)和Macor等(US5,578,612)公開了5-HT1和5-HT1樣興奮劑在治療青光眼(升高的IOP)中的用途。這些抗偏頭痛的化合物是例如舒馬普坦和那拉曲坦這樣的5-HT1B、D、E、、F興奮劑和相關(guān)化合物。
附圖簡述附

圖1A和1B表示對使用8-OH-DPAT全身給藥并接觸嚴(yán)重光氧化性損害的大鼠ERGa-和b-波功能的保護(hù)作用。
附圖2表示對使用8-OH-DPAT全身給藥并接觸嚴(yán)重光氧化性損害的大鼠的視網(wǎng)膜形態(tài)(光感受器和RPE)的保護(hù)作用。
附圖3表示對使用丁螺環(huán)酮全身給藥并接觸嚴(yán)重光氧化性損害的大鼠的視網(wǎng)膜DNA、視網(wǎng)膜細(xì)胞數(shù)測定值(A)的保護(hù)作用和對視網(wǎng)膜形態(tài)(光感受器)的完全保護(hù)作用。
附圖4A和4B表示對使用SR-57746A全身給藥并接觸嚴(yán)重光氧化性損害的大鼠ERGa-和b-波功能的保護(hù)作用。
發(fā)明概括本發(fā)明涉及已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于治療視網(wǎng)膜外層疾病的5-HT1A興奮劑，所述的視網(wǎng)膜外層病特別是AMD、RP和其它形式的遺傳性變性視網(wǎng)膜疾病；視網(wǎng)膜脫離和撕裂；黃斑起皺(macular pucker)；影響視網(wǎng)膜外層的局部缺血；糖尿病性視網(wǎng)膜?。慌c包括光動(dòng)療法(PDT)在內(nèi)的激光療法(濾線柵(grid)、焦點(diǎn)(focal)和全視網(wǎng)膜)相關(guān)的損害；創(chuàng)傷；手術(shù)(視網(wǎng)膜易位、視網(wǎng)膜下手術(shù)或玻璃體切割術(shù))或光誘發(fā)的醫(yī)源性視網(wǎng)膜??；和視網(wǎng)膜移植物的保護(hù)。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述已經(jīng)證實(shí)5-羥色胺能5-HT1A興奮劑是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同損害后的有效神經(jīng)保護(hù)劑。我們已經(jīng)令人意外地證實(shí)8-OH-DPAT(8-羥基-2-(二正丙氨基)四氫化萘)、丁螺環(huán)酮和SR-57746A在視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出有效的神經(jīng)保護(hù)活性并預(yù)防對光感受器和RPE細(xì)胞的光誘發(fā)的編程性細(xì)胞死亡。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用丁螺環(huán)酮治療可以完全預(yù)防光氧化性誘發(fā)的視網(wǎng)膜病并顯著減少了視網(wǎng)膜DNA的損耗和ONL變薄。這些化合物中某些的安全優(yōu)點(diǎn)使得它們特別適合于急性和慢性療法。這類活性劑具有治療各種視網(wǎng)膜外層變性疾病的用途。
在我們的光損害的實(shí)例中，抗氧化劑是無效的(α-生育酚)或在高劑量下在-定程度上有效(抗壞血酸鹽、維生素E類似物)。類似地，某些鈣拮抗劑(氟桂利嗪、尼卡地平)基因適當(dāng)程度的療效，而其它鈣拮抗劑(硝苯地平、尼莫地平、維拉帕米)在預(yù)防光誘發(fā)的功能或形態(tài)改變方面無效。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5-HT1A興奮劑在這些光損害實(shí)例中的功效在100倍以上且由此用于治療視網(wǎng)膜外層疾病。
本發(fā)明關(guān)注任意藥物上可接受的5-HT1A興奮劑、包括藥物上可接受的鹽在治療視網(wǎng)膜外層疾病中的用途(化合物)。藥物上可接受的指的是可以安全地用于治療視網(wǎng)膜外層疾病的化合物。本文所用的視網(wǎng)膜外層包括RPE、光感受器、苗勒細(xì)胞(在其隆起部分延伸入視網(wǎng)膜外層的范圍內(nèi))和外叢狀層。配制這些化合物以用于全身或局部眼部給藥。視網(wǎng)膜外層疾病包括急性和慢性環(huán)境誘發(fā)的(創(chuàng)傷、局部缺血、光氧化性應(yīng)激反應(yīng))正?；蜻z傳傾向個(gè)體中光感受器和RPE細(xì)胞變性情況。這種情況包括、但不限于AMD、RP和其它形式的遺傳性變性視網(wǎng)膜疾病；視網(wǎng)膜脫離和撕裂；黃斑起皺(macular pucker)；影響視網(wǎng)膜外層的局部缺血；糖尿病性視網(wǎng)膜??；與包括光動(dòng)療法(PDT)在內(nèi)的激光療法(濾線柵(grid)、焦點(diǎn)(focal)和全視網(wǎng)膜)相關(guān)的損害；熱或冷凍療法，創(chuàng)傷；手術(shù)(視網(wǎng)膜易位、視網(wǎng)膜下手術(shù)或玻璃體切割術(shù))或光誘發(fā)的醫(yī)源性視網(wǎng)膜??；和視網(wǎng)膜移植物的保護(hù)。
本發(fā)明的化合物對具有范圍約達(dá)500nM(優(yōu)選低于100nM)的IC50值的5-HT1A受體具有有效的親合性。這些化合物也是具有范圍約達(dá)1μM(優(yōu)選低于500nM)的IC50值的完全或部分興奮劑。用于本發(fā)明的有代表性的5-HT1A興奮劑包括、但不限于坦度螺酮、烏拉地爾、齊培瑞西酮、鹽酸瑞吡諾坦(repinotan hydrochloride)、鹽酸扎利普羅登(xaliproden hydrochloride)(SR-57746A)、丁螺環(huán)酮、氟辛克生、EMD-68843、DU127090、吉哌隆、阿奈螺酮、PNU-9566、AP-521、氟利苯噻侖(flibanserin)、MKC-242、來索吡瓊、鹽酸沙立唑坦(sarizotan hydrochloride)、Org-13011、Org-12966、E-5842、SUN-N4057和8-OH-DPAT。
可以使用下列方法測定本發(fā)明的受體結(jié)合和興奮劑活性。
方法15-HT1A受體結(jié)合試驗(yàn)使用在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)的人克隆受體、將(3H)8-OHDPAT用作配體來進(jìn)行5-HT1A結(jié)合研究。在約40個(gè)體積的50mMTris pH7.4中將來自表達(dá)克隆的5-HT1A受體(由Biosignal，Inc.，Montreal，Canada為NEN生產(chǎn)的)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)的膜勻化5秒。使用Beckman Biomek 2000自動(dòng)機(jī)(BeckmanInstruments，F(xiàn)ullerton，CA)制備藥物稀釋液。在27℃下將膜制備物、測試化合物和[3H]8-OH-DPAT(NEN，Boston，MA)在相同緩沖液中溫育1小時(shí)。通過在預(yù)浸入0.3％聚乙烯亞胺的Whatman GF/B玻璃纖維濾膜上的快速真空過濾來終止試驗(yàn)。使用液體閃爍光譜法測定結(jié)合的放射性。使用非線性曲線固定程序分析數(shù)據(jù)(Sharif等，《藥物藥理學(xué)雜志》(J Pharmac Pharmacol)，51685-694，1999)。
還使用來自牛和大鼠腦(局部來源)和人皮層膜的膜制備物進(jìn)行了配體結(jié)合研究。切割出特定的大腦區(qū)域、在10個(gè)體積的0.32M蔗糖中勻化并以700xg離心10分鐘。以43,500xg將所得上清液離心10分鐘并使用10秒polytron處理將沉淀重新懸浮于50mMTris-HCl(pH7.7，25℃)中。將等分部分保存在-140℃下。為了除去內(nèi)源性5-羥色胺，在37℃下將所述制備物溫育10分鐘，此后進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。通過在WhatmanGF/C濾膜上快速過濾、使用Brandel細(xì)胞收集器來終止試驗(yàn)保溫過程。使用Cheng-Prusoff等式計(jì)算Ki值(DeVry等，《藥物實(shí)驗(yàn)療法雜志》(J Pharm Exper Ther)，2841082-1094，1998。)方法25-HT1A功能試驗(yàn)可以使用各種方法測定本發(fā)明化合物的功能以便評價(jià)5-HT1A興奮劑的功能活性。一種這類的試驗(yàn)使用來自雄性Sprague-Dawley大鼠的海馬切片來進(jìn)行，從而測定了對毛喉素刺激的(-stimated)腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用(《藥化雜志》(J Med Chem)，4236，1999；《神經(jīng)化學(xué)雜志》(J Neurochem)，561114，1991；《藥物實(shí)驗(yàn)療法雜志》(J PharmExper Ther)，2841082，1998)。在25℃下將大鼠海馬膜在25個(gè)體積的含有1mM EGTA、5mM EDTA、5mM二硫蘇糖醇和20mM Tris-HCI、pH7.4的0.3M蔗糖中勻化。以1,000xg將該勻化物離心10分鐘。隨后以39,000xg將上清液離心10分鐘。以約1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度將所得沉淀重新懸浮于勻化緩沖液中并將等分部分保存在-140℃下。在應(yīng)用前，將該膜在Potter-Elvehjem勻化器上再次勻化。將50μl的膜混懸液(50μg蛋白質(zhì))加入到含有100mM NaCl、2mM乙酸鎂、0.2mM ATP、1mMcAMP、0.01mM GTP、0.01mM毛喉素、80mM Tris-HCl、5mM磷酸肌酸、0.8U/μl肌酸磷酸激酶、0.1mM IBMX、1-2μCiα-[32P]ATP的保溫緩沖液中。通過向該保溫混合物(30℃下預(yù)溫?zé)?分鐘)中添加膜溶液來啟動(dòng)與測試化合物的保溫過程(30℃下10分鐘)。按照Salomon的方法測定[32P]cAMP(《環(huán)核苷酸研究進(jìn)展》(Adv Cyclic Nucleotide Res)，1035-55，1979)。使用Bradford(《生化分析》(Anal Biochem)，72248-254，1976)試驗(yàn)測定蛋白質(zhì)。
另外可以按照Schoeffter等的方法測定重組人受體中的功能活性(《神經(jīng)藥物學(xué)》(Neuropharm)，36429-437，1997)。使用重組人5-HT1A受體轉(zhuǎn)染的海拉細(xì)胞在24孔平板上生長至融合。將該細(xì)胞用1mlHepes-緩沖鹽水(按mM計(jì))(NaCl 130，KCl 5.4，CaCl21.8，MgSO40.8，NaH2PO40.9，葡萄糖25，Hepes 20，pH7.4)和酚紅5mg/l沖洗。在37℃下將細(xì)胞在0.5ml鹽水中用6μCi/ml的[3H]腺嘌呤(23Ci/mmol，Amersham，Rahn AG，Zurich，Switzerland)標(biāo)記2小時(shí)。隨后用1ml含有1mM異丁基甲基黃嘌呤的緩沖鹽水將平板沖洗2次。在有或沒有10μM毛喉素和測試化合物存在的情況下將細(xì)胞在1ml的該溶液中保溫15分鐘(37℃)。然后除去緩沖液并加入含有0.1mM cAMP和0.1mM ATP的1ml 5％三氟乙酸(TCA)以便提取樣品。在4℃下30分鐘后，使TCA提取物在Dowex AG50W-X4和氧化鋁柱上進(jìn)行層析分離(Salomon，《酶學(xué)方法》(Meth Enzymol)，19522-28，1991)。將產(chǎn)生的環(huán)AMP計(jì)算為[3H]cAMP/([3H]cAMP+[3H]ATP)之比。將方法1和2中所述的上述步驟用于生成下列數(shù)據(jù)。
表1.5-HT1受體結(jié)合和功能試驗(yàn)數(shù)據(jù)
一般對變性疾病而言，通過口服方式給予本發(fā)明的5-HT1A興奮劑，其中這些化合物的每日劑量范圍約為0.001-約500毫克。優(yōu)選的總每日劑量范圍約為1-約100毫克。諸如玻璃體內(nèi)、外用眼部、經(jīng)皮貼劑、真皮下、非腸道、眼內(nèi)、結(jié)膜下或眼球后或腱下(subtenon’s)注射、經(jīng)鞏膜(包括離子電滲透法)或緩釋可生物降解聚合物或脂質(zhì)體這樣的非口服給藥可能還要求調(diào)節(jié)提供治療有效量的所述化合物所必不可少的總每日劑量。還可以以眼部灌洗溶液的形式給予5-HT1A興奮劑。濃度應(yīng)在約0.001μM-約100μM、優(yōu)選約0.01μM-約5μM的范圍。
可以將5-HT1A興奮劑混入各種類型的用于輸送至眼部的眼用制劑(例如通過局部、隔室內(nèi)(intracamerally)或通過植入物的方式)。可以將它們與眼科可接受的防腐劑、表面活性劑、粘度增強(qiáng)劑、膠凝劑、滲透促進(jìn)劑、緩沖劑、氯化鈉和水混合而制成無菌的眼用含水混懸劑或溶液或特性凝膠或在原位形成凝膠?？梢酝ㄟ^將所述化合物溶于生理上可接受的等滲含水緩沖液來制備眼用溶液制劑。此外，所述的眼用溶液可以包括眼科可接受的表面活性劑以便有助于溶解所述的化合物。該眼用溶液可以含有諸如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等這樣的粘度增強(qiáng)劑以便改善所述制劑在結(jié)膜囊中的保留程度。為了制備無菌眼用軟膏制劑，將活性組分與諸如礦物油、液體羊毛脂或白凡士林這樣的適宜載體中的防腐劑混合。可以按照用于類似眼用制劑的公開配制方法通過將所述的活性組分懸浮于由例如卡波姆-940等這樣組合制備的親水性基質(zhì)來制備無菌眼用凝膠制劑；可以混入防腐劑和張度劑。
如果經(jīng)局部給藥，那么優(yōu)選將5-HT1A興奮劑配制成pH約為4-8的局部用眼用混懸劑或溶液。5-HT1A興奮劑在這些制劑中的含有量通常在.001％-5％(重量)、而優(yōu)選.01％-2％(重量)的范圍。因此，就局部給藥而言，根據(jù)有技能的臨床醫(yī)師的考慮，可以給眼部表面滴1-2滴這些制劑，每天1-4次。
根據(jù)有技能的臨床醫(yī)師的考慮，按照本發(fā)明每天給予1-4次下列局部用眼用制劑是有用的。
實(shí)施例1
實(shí)施例2
實(shí)施例3
實(shí)施例4
實(shí)施例5
實(shí)施例6
方法3大鼠光氧化性誘發(fā)的視網(wǎng)膜病模型中的神經(jīng)保護(hù)作用在我們的光氧化性誘發(fā)視網(wǎng)膜病實(shí)例中評價(jià)這些5-HT1A興奮劑的保護(hù)作用。
光化學(xué)損害的誘導(dǎo).通過對在黑暗中適應(yīng)的大鼠(24小時(shí))暴露于(220fc)藍(lán)光(半振幅帶通＝435-475nm)6小時(shí)而誘發(fā)光化學(xué)損害。使動(dòng)物在黑暗中恢復(fù)5天，此后以電診斷方式評價(jià)視網(wǎng)膜功能。在這種光暴露過程中使大鼠單獨(dú)寄居在潔凈的聚碳酸酯籠中。
電診斷評價(jià).在24小時(shí)黑暗適應(yīng)期后記錄來自麻醉大鼠的視網(wǎng)膜電圖(ERG)。通過腹膜內(nèi)注射鹽酸氯胺酮(75mg/Kg)和賽拉嗪(6mg/Kg)使大鼠麻醉。通過觀測ganzfeld而導(dǎo)出從位于角膜上的鉑-銥電線圈電極中記錄的閃爍ERGs。將對一系列強(qiáng)度增加的光閃爍的電反應(yīng)數(shù)字化以便分析暫時(shí)波形特征和反應(yīng)電壓-log強(qiáng)度(VlogI)的關(guān)系。ERGa-波的改變與光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮損害有關(guān)，而對視網(wǎng)膜內(nèi)層的損害反映在ERG b-波的改變中。
視網(wǎng)膜形態(tài)的評價(jià).眼組織獲自對照和藥物或載體給藥的大鼠且通過將它們浸入2％低聚甲醛和2％戊二醛的混合物而固定。使固定的眼球在濃度遞增的乙醇系列中脫水、將它們包埋在JB-4塑料樹脂內(nèi)并使用與顯微鏡連接的定量計(jì)算機(jī)影象分析系統(tǒng)分析1-1.5-微米厚的切片。測定視網(wǎng)膜層厚度(視網(wǎng)膜色素上皮，RPE；外核層厚度，ONL；內(nèi)核層厚度，INL；和光感受器內(nèi)層和外層片段的長度，IS+OS)。
DNA改變的評價(jià).通過CO2吸入對白化體大鼠實(shí)施安樂死并將各視網(wǎng)膜冷凍在單獨(dú)的管中。已經(jīng)將各視網(wǎng)膜在0.8ml(2.0M NaCl，50mMNaPO4，pH7.4，2mM EDTA)中進(jìn)行了超聲處理而產(chǎn)生了均勻的勻化物并將其冷凍保存。用含有1.1μg/ml二苯并咪唑(Hoechst33258)的2.0MNaCl、50mM NaPO4、pH7.4、2mM EDTA將各樣品的等分部分(0.1ml)稀釋10倍。使用溶于相同緩沖液的0-25μg/ml牛胸腺DNA構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將一式三份的0.2ml各視網(wǎng)膜樣品的等分部分和標(biāo)準(zhǔn)品吸移入96孔平板以用于在Cytofluor II中進(jìn)行熒光測定。激發(fā)波長為360nm，而發(fā)射波長為460nm。
受試者和給藥.將雄性Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分成藥物和載體實(shí)驗(yàn)組。使對照大鼠在正常循環(huán)的光接觸條件下寄居在其籠中。在6小時(shí)藍(lán)光接觸前48、24和0小時(shí)對全部大鼠給藥。給藥方案如下1.)8-OH-DPAT(8-羥基-2-(二正丙氨基)四氫化萘)在光接觸前給大鼠皮下(SC)注射三次載體(N＝10)或8-OH-DPAT(0.5mg/kg[N＝5]或1.0mg/kg[N＝10])。將5只大鼠用作對照。通過分析ERG反應(yīng)并測量視網(wǎng)膜形態(tài)的改變來評價(jià)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。
2.)丁螺環(huán)酮為了進(jìn)行DNA定量，在光接觸前給6只大鼠/治療組腹膜內(nèi)給予載體或丁螺環(huán)酮(0.5和1mg/kg)。將來自7只正常大鼠的視網(wǎng)膜用作對照。為了評價(jià)視網(wǎng)膜形態(tài)的改變，對大鼠腹膜內(nèi)給予載體(N＝8)或丁螺環(huán)酮(1.0mg/kg[N＝9])。將6只大鼠用作對照。通過對視網(wǎng)膜DNA改變進(jìn)行定量并測量視網(wǎng)膜形態(tài)的改變來評價(jià)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。
3.)SR-57746A對大鼠腹膜內(nèi)給予載體(N＝15)或SR-57746A(0.5mg/kg[N＝5]或1mg/kg[N＝15])。將11只大鼠用作對照。在5天恢復(fù)期后分析ERG以便評價(jià)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。
8-OH-DPAT評價(jià)結(jié)果.5天恢復(fù)期后測定的藍(lán)光接觸6小時(shí)使得ERG反應(yīng)振幅比在正常時(shí)顯著減小(ANOVA，p＜0.001；Bonferroni t-檢驗(yàn)，p＜0.05)(附圖1A和B)。藍(lán)光接觸使得載體給藥的大鼠比對照組在最大a-和b-波振幅上減小了75％。此外，閾值反應(yīng)較低且在較亮的閃爍強(qiáng)度下產(chǎn)生。
給予8-OH-DPAT的大鼠表現(xiàn)出對這種光氧化性誘發(fā)的視網(wǎng)膜病的視網(wǎng)膜內(nèi)外層功能的劑量依賴性保護(hù)作用(附圖1A和B)。給予8-OH-DPAT(0.5mg/kg)的大鼠在最大a-和b-波反應(yīng)振幅方面與載體給藥的大鼠沒有差異且約為對照振幅的27％。然而，來自8-OH-DPAT(1.0mg/kg)給藥大鼠的最大a-和b-波反應(yīng)振幅分別約為正常值的53％和61％且顯著高于在載體給藥大鼠中測定的反應(yīng)(附圖1A和1B)。
與這些ERG改變一致，3周恢復(fù)期后對這些視網(wǎng)膜的形態(tài)分析證實(shí)光感受器細(xì)胞顯著(ANOVA，p＜0.01)消耗，從而縮短了光感受器內(nèi)層+外層片段長度并使載體給藥的動(dòng)物RPE平整。沒有檢測到INL厚度的顯著改變。與對照組相比，ONL厚度減少了73％，內(nèi)層+外層片段長度減少了82％，且RPE厚度減少了59％(附圖2)。在給予了8-OH-DPAT(0.5mg/kg)的大鼠中觀察到的光損害與載體給藥的大鼠中測定的損害沒有顯著差別。盡管ERGs約減少了63％，但是ONL厚度減少到53％，光感受器片段長度減少了60％，且RPE厚度減少了34％。然而，在給予了8-OH-DPAT(1.0mg/kg)的大鼠中觀察到的光損害顯著不同于在載體給藥大鼠中的觀察結(jié)果。盡管ERG反應(yīng)振幅大于正常值的50％，但是與載體給藥的大鼠相比，ONL厚度為2.4倍厚度、光感受器片段長度為2.9倍且RPE厚度為1.9倍。
丁螺環(huán)酮評價(jià)結(jié)果.正如在附圖3A中所觀察到的，載體給藥的視網(wǎng)膜DNA水平顯著低于對照水平約30％(ANOVA，p＝0.017)。在給予載體或0.1mg/kg丁螺環(huán)酮的組之間沒有測定出顯著差異。在給予丁螺環(huán)酮(1mg/kg)的大鼠中測定了視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。視網(wǎng)膜DNA水平顯著高于載體給藥大鼠中測定的視網(wǎng)膜DNA水平，但與對照組相比沒有顯著性差異。
藍(lán)光接觸6小時(shí)使得光感受器數(shù)量顯著減少(ANOVA，p＜0.05)。在4周恢復(fù)期后對這些視網(wǎng)膜的形態(tài)分析證實(shí)載體給藥的大鼠中外核層比對照組薄54％(附圖3B)。然而，在正常與丁螺環(huán)酮治療的大鼠之間測定的ONL厚度方面沒有顯著性差異。在給予丁螺環(huán)酮(1mg/kg)的大鼠中，與正常大鼠的30.4μ相比，ONL厚度為28.3μ。
SR-57746A評價(jià)結(jié)果.在光接觸的給予了SR-57746A(0.5和1.0mg/kg)的大鼠中測定了對視網(wǎng)膜功能的顯著保護(hù)作用。載體給藥大鼠與對照組相比，最大a-和b-波反應(yīng)振幅減少到50％(附圖4A和B)。在給予了SR-57746A(0.5mg/kg)的大鼠中的最大反應(yīng)為對照組的82％而在給予了1mg/kg的大鼠中為正常值的70％。
結(jié)論.這些5-HT1A興奮劑(8-OH-DPAT、丁螺環(huán)酮和SR-57746A)在這種視網(wǎng)膜變性疾病的氧化性模型中表現(xiàn)出良好的功效和效能。在連續(xù)3天給予低至1mg/kg劑量的大鼠中獲得了功能和結(jié)構(gòu)保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種用于治療視網(wǎng)膜外層疾病的方法，該方法包括給予藥物有效量的具有5-HT1A興奮劑活性的化合物的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的化合物選自坦度螺酮、烏拉地爾、齊培瑞西酮、鹽酸瑞吡諾坦、鹽酸扎利普羅登(SR-57746A)、丁螺環(huán)酮、氟辛克生、EMD-68843、DU127090、吉哌隆、阿奈螺酮、PNU-95666、AP-521、氟利苯噻侖、MKC-242、來索吡瓊、鹽酸沙立唑坦、E-5842、SUN-N4057、Org-13011、Org-12966和8-OH-DPAT組成的組。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的疾病選自下列疾病組成的組AMD、RP和其它形式的遺傳性變性視網(wǎng)膜疾病；視網(wǎng)膜脫離和撕裂；黃斑起皺；影響視網(wǎng)膜外層的局部缺血；糖尿病性視網(wǎng)膜?。慌c包括光動(dòng)療法(PDT)在內(nèi)的激光療法(濾線柵、焦點(diǎn)和全視網(wǎng)膜)相關(guān)的損害；創(chuàng)傷；手術(shù)(視網(wǎng)膜易位、視網(wǎng)膜下手術(shù)或玻璃體切割術(shù))或光誘發(fā)的醫(yī)原性視網(wǎng)膜??；和視網(wǎng)膜移植物的保護(hù)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的疾病是AMD。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的化合物選自坦度螺酮、烏拉地爾、齊培瑞西酮、鹽酸瑞吡諾坦、鹽酸扎利普羅登(SR-57746A)、丁螺環(huán)酮、氟辛克生、EMD-68843、DU127090、吉哌隆、阿奈螺酮、PNU-95666、AP-521、氟利苯噻侖、MKC-242、來索吡瓊、鹽酸沙立唑坦、E-5842、SUN-N4057、Org-13011、Org-12966和8-OH-DPAT組成的組。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的疾病選自AMD、RP和糖尿病性視網(wǎng)膜病組成的組。
全文摘要
本發(fā)明公開了用具有5－HT
文檔編號A61P25/02GK1418121SQ01806764
公開日2003年5月14日 申請日期2001年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月17日
發(fā)明者R·J·小考里爾, M·A·卡賓, M·R·海爾伯格, T·R·迪安 申請人:愛爾康公司