專利名稱：具有雙重結(jié)合活性的抗MRSA-PBP 2a的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬單克隆抗體技術(shù)領(lǐng)域(生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域)，特別是，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了一種能夠特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌(MRSA)抗原表位，并可區(qū)分MRSA和MSSA的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus),即耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，是全球性導(dǎo)致病人感染的最重要的耐藥致病菌之一 此菌對(duì)常用的多種抗生素廣泛耐藥，其中包括甲氧西林，其主要耐藥機(jī)制是由于MRSA菌體產(chǎn)生的青霉素結(jié)合蛋白2a(Penicillin Binding Protein 2a, PBP 2a),蛋白分子量為 75kDa ;此蛋白由菌體染色體，即mecA基因編碼，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PBP2a對(duì)β -內(nèi)酰胺類抗生素呈現(xiàn)低親和力的結(jié)合，從而導(dǎo)致耐藥性。依據(jù)本菌對(duì)抗生素的耐藥性和敏感性，在臨床上分為MRSA和MSSA(對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌)兩類。

發(fā)明內(nèi)容
制備和鑒定出能特異性且高親和力結(jié)合MRSA的PBP 2a蛋白的兩種單克隆抗體，該抗體也能進(jìn)一步區(qū)別MRSA和MSSA。確定了兩種單克隆抗體結(jié)合MRSA的PBP2a蛋白抗原表位，10A10. F2細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合表位是，DKEINNTIDAIEDKNFKQVY，即位于氨基酸27 46 ；4B10. B6細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合表位是，SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS,即位于氨基酸375 400。另一方面,本發(fā)明還包括一種來源于MRSA的PBP2a抗原表位,該抗原表位能與單克隆抗體特異性結(jié)合，從而用于區(qū)分MRSA和MSSA。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，所述的抗原表位為S. aureus (MRSA)的PBP2a蛋白的27 46 位的 DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 和 375 400 位的 SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，所述的兩種抗原表位包括核心氨基酸EDK。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，所述的抗原表位能被4B10. B6細(xì)胞株產(chǎn)生單克隆抗體特異性識(shí)別。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，所述的抗原表位能被10A10. F2細(xì)胞株產(chǎn)生單克隆抗體特異性識(shí)別。在本發(fā)明的另一具體實(shí)例中，還包括一種區(qū)別MSSA和MRSA的方法，步驟包括(i)分離制備耐藥性及非耐藥性葡萄球菌，并獲取菌體培養(yǎng)上清及裂解液為鑒定樣品；(ii)將能夠與MRSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位結(jié)合而不能與MSSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位結(jié)合的單克隆抗體與生物樣本作用，所述的單克隆抗體還具有能夠區(qū)分MRSA和MSSA菌的特性；(iii)檢測(cè)單克隆抗體與生物樣本的結(jié)合物，由此，鑒定生物樣本中的MRSA菌。在本發(fā)明的具體實(shí)例中，所述的單克隆抗體為鑒定的4B10. B6細(xì)胞株產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一具體實(shí)施例中，所述的單克隆抗體為鑒定的10A10.F2細(xì)胞株產(chǎn)生。


為使更加容易理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。圖I.鼠抗MRSA單克隆抗體與培養(yǎng)的MRSA細(xì)胞蛋白特異結(jié)合的免疫印跡分析。樣品經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳分析，I. MRl (15 μ L/泳道);2· MSl (15 μ L/泳道)；
3.Ε. coli (15 μ I/ 泳道)；4. MR2 (15 μ I/ 泳道)；5. MS2 (15 μ I/ 泳道)；6. Protein Marker,MRl和MR2來源于MRSA菌，MSl和MS2來源于MSSA菌。圖2A和2B.鼠抗MRSA單克隆抗體與體外表達(dá)的PBP2a蛋白結(jié)合免疫印跡分析。2A 1. Marker ；2. PBP2a(2 μ g/ 泳道);3· MRl (15 μ L/ 泳道)。 2Β 1. PBP2a(2 μ g/lane) ；2. PBP2a(0. 2 μ g/Lane)，3. MRl (15 μ L/ 泳道)。圖3.顯示單克隆抗體4bl0. b6與合成肽抗原1733和1734的結(jié)合。包被抗原(IOOng/孔)，非相關(guān)肽作為對(duì)照，常規(guī)包被96孔板，4°C包被過夜，封閉液封閉I小時(shí)，加入抗體的系列稀釋液，然后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗(I 20，000)檢測(cè)。圖4A和4B顯示單克隆抗體與肽1733和1734的結(jié)合作用能被競(jìng)爭(zhēng)ELISA所抑制。兩圖均顯示抗體與肽1733和1734的結(jié)合作用被競(jìng)爭(zhēng)性抑制。IOOng每孔包被抗原，將非相關(guān)性肽作為對(duì)照肽加入96孔板，4°C過夜，封閉液封閉I小時(shí)，加入抗體的系列稀釋液，然后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗(I 20，000)檢測(cè)。圖5.闡明選擇抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合斑點(diǎn)雜交分析。兩種純化后的抗體與抗原1733和1734結(jié)合。MRSA實(shí)驗(yàn)對(duì)照抗體特異的單克隆抗體抗MRSA單抗僅能與1733結(jié)合，抗PBP2a單克隆抗體既能與1734結(jié)合，也能與整個(gè)表達(dá)蛋白相結(jié)合。圖6A-6D.抗體結(jié)合樣品中抗原的免疫印跡分析。6A 4B10. B6克隆(亞型IgGl) ；6B : 10A10克隆(亞型IgM) ；6C :供應(yīng)商提供的抗MRSA單克隆抗體；6D :商業(yè)購買的抗PBP2a單克隆抗體。l.Marker ；2. MRSA ；
3.MSSA ；4. SEPl ；5. E. coli。圖7A和7B.單克隆抗體能特異性沉淀MRSA裂解液中的蛋白。7A :染色SDS-PAGE ；7B:特異性測(cè)定。檢測(cè)先將MRSA菌與4B10.B6抗體共同孵育，然后再與抗鼠磁珠孵育；洗脫的混合物加入SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)印膜經(jīng)生物素標(biāo)記的10A10. F2抗體和Streptavidin-HRP 系統(tǒng)檢測(cè)，I. Marker ;2. MRSA 樣本 + 沉淀抗體(15 μ I/ 泳道)；3.MSSA 樣本+沉淀抗體(15 μ I/泳道)。圖8. PBP2a蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別的抗原表位區(qū)域用下劃線標(biāo)出。圖9.兩種抗體與MRSA的結(jié)合位點(diǎn)。以下的描述和實(shí)例將對(duì)以上附圖進(jìn)行更詳細(xì)的說明。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，即通過下面的說明、附圖、具體實(shí)例和權(quán)力要求來闡明發(fā)明的功能、對(duì)象和優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明的范圍。
除非特別提出，每一居中值，應(yīng)為最小界限的十個(gè)單位的每一組均值，即介于最高和最低界限范圍，而且，其它數(shù)值和均值也同樣列入此描述范圍。除非另有說明，本發(fā)明所涉及的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語是公眾所理解的普通技術(shù)，任何類似或等同于此處描述的方法和材料也適宜于本公開發(fā)明，但現(xiàn)對(duì)優(yōu)選方案做一描述。該說明書中引用的所有出版物和專利都包括在參考文獻(xiàn)中，就如出版物和專利指明均要一一列出，同時(shí)，這些文獻(xiàn)用于揭示和描述引用部分相關(guān)的方法和材料。引用的任何出版物都是在申請(qǐng)日期前公開的，但不要誤解為承認(rèn)是提前公布，現(xiàn)在的公開是晚于該出版物。此外，提供的出版日期可以不同于實(shí)際的出版日期，這需要另外專門來證實(shí)。本發(fā)明中的技術(shù)是顯而易見的，此處描述說明的每一個(gè)都有獨(dú)特的部分和特征，這可能比較容易地與其它幾個(gè)的特征有區(qū)分或結(jié)合，而不偏離本發(fā)明的范圍。所有引用的方法均會(huì)以有序、合理的步驟加以實(shí)施。
除非另有說明，本發(fā)明涉及的實(shí)施例將應(yīng)用于醫(yī)學(xué)技術(shù)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域。文獻(xiàn)中對(duì)這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了充分的說明。除非另外說明，優(yōu)先使用以下定義。定義本發(fā)明所涉及的描述和要求依照以下所述來定義。本發(fā)明所述的“特異性結(jié)合”是指兩種不同分子能特異地識(shí)別，而與其它分子的識(shí)別結(jié)合能力很弱。一般情況下，兩個(gè)分子在其表面或孔穴具有特異性識(shí)別的區(qū)域。如抗原抗體的相互作用、酶與底物的相互作用、核苷酸的相互作用等。本發(fā)明所述的抗體是一種免疫球蛋白，此蛋白因特定的空間互補(bǔ)結(jié)構(gòu)或極性作用能夠與另一分子特異性結(jié)合。這些抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或重組抗體，可以通過常規(guī)技術(shù)方法制備，免疫動(dòng)物并收集血清制備(多克隆抗體)，培養(yǎng)連續(xù)混合細(xì)胞系并收集分泌蛋白(單克隆抗體)，核苷酸序列的克隆與表達(dá)或者具有天然抗體的特異性結(jié)合所需的氨基酸序列編碼的誘導(dǎo)片段。抗體包括完整的免疫球蛋白或者其片段，免疫球蛋白包括各類亞型，如 IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgY 等。這些片段可能包括 Fab、Fv、F(ab' )2、Fab'和scFv等。此外，也可以用免疫球蛋白或其片段的聚合物、集合體、率禹合物維持對(duì)特定分子結(jié)合的親和力。說明4B10. B6和10A10. F2兩種鼠單克隆抗體分別特異性識(shí)別并結(jié)合MRSA表達(dá)的PBP2a蛋白，這兩種單克隆抗體依常規(guī)技術(shù)制備。MRSA菌表達(dá)PBP2a重組蛋白，用該蛋白作為免疫原免疫小鼠，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。用該蛋白免疫小鼠后，取B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合,形成雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體，單克隆抗體經(jīng)親和層析進(jìn)行純化。ELISA、Western Blotting和免疫沉淀法用來分析單克隆抗體與MRSA分泌的天然PBP2a的結(jié)合特性。如圖I所示，4B10. B6和10A10. F2單克隆抗體均不能與分離自MSSA菌的蛋白相結(jié)合。資料顯示，本發(fā)明的兩種單克隆抗體都能區(qū)分MRSA和MSSA菌。兩種抗體識(shí)別PBP2a蛋白不同序列(圖8和圖9所示)。單克隆抗體10A10. F2特異性識(shí)別PBP2a蛋白的27-46位的氨基酸片段，而單克隆抗體4B10. B6特異性識(shí)別375-400位的氨基酸片段(圖8所示)。兩個(gè)表位，都有一個(gè)包含EDK氨基酸核心序列。
與商業(yè)化的MRSA抗體相比，4B10. B6單克隆抗體有獨(dú)特的結(jié)合特性，此結(jié)合特性在于所述抗體能夠特異性識(shí)別來自不同區(qū)域的合成肽。因此，可以認(rèn)為PBP2a蛋白有兩個(gè)區(qū)域作為結(jié)構(gòu)相似的抗原表位被一種單克隆抗體所識(shí)別。本發(fā)明所述兩種單克隆抗體能夠?qū)RSA和MSSA區(qū)別開的特性是臨床診斷檢測(cè)的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明包括如下實(shí)施方案雜交瘤細(xì)胞和該雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體、能夠特異性識(shí)別PBP2a蛋白的單個(gè)或多個(gè)區(qū)域的單克隆抗體。而且，本發(fā)明所述單克隆抗體能夠區(qū)別MRSA菌和MSSA菌。本發(fā)明還涉及一種鑒別MRSA菌和MSSA菌的方法。本發(fā)明所述單克隆抗體能夠高親和的結(jié)合MRSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位，而對(duì)MSSA菌蛋白抗原沒有任何結(jié)合活性。因而，所述單克隆抗體具有區(qū)別MRSA菌和MSSA菌的特性。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的兩種單克隆抗體具有特異性結(jié)合S. aureus 菌表達(dá)的PBP2a蛋白的抗原表位，即定位于27-46位、375-400位氨基酸，序列分別為DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 和 SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的單克隆抗體能夠特異性結(jié)合S. aureus菌表達(dá)的PBP2a蛋白的27-46位，即氨基酸片段DKEINNTIDAIEDKNFKQVY，將此單克隆抗體克隆命名為 10A10. F2。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的單克隆抗體能夠特異性結(jié)合S. aureus菌表達(dá)的PBP2a 蛋白的376-400位，即氨基酸片段SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS，將此單克隆抗體克隆命名為4B 10. B6。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，闡述了分離自MRSA菌PBP2a蛋白的抗原表位，及所述單克隆抗體特異性結(jié)合，而且，能區(qū)分MRSA和MSSA菌。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的抗原表位位于S. aureus菌PBP2a蛋白的27_46位的 DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 和 375-400 位的 SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的抗原表位包括核心氨基酸EDK。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的抗原表位能夠被單克隆抗體4B10. B6特異性識(shí)別。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的抗原表位能夠被單克隆抗體10A10. F2特異性識(shí)別。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，還包括一種區(qū)別MRSA和MSSA的方法，步驟包括⑴獲得包括葡萄球菌的生物樣本；( )將能結(jié)合MRSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位而不能結(jié)合MSSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位的單克隆抗體與生物樣本反應(yīng)；(iii)檢測(cè)單克隆抗體與生物樣本的結(jié)合產(chǎn)物，由此，檢定生物樣本中的MRSA，因此，所述單克隆抗體還具有能夠區(qū)分MRSA和MSSA菌的特性。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的單克隆抗體細(xì)胞株為4B10. B6。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的單克隆抗體細(xì)胞株為10A10. F2。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明的范圍。上述實(shí)施例中也許會(huì)有一些變化和修改，但不偏離于實(shí)施例的精神和原則。這些變化和修改包括在此發(fā)明范圍內(nèi)，此發(fā)明權(quán)利要求如下。下列實(shí)施例用以說明本發(fā)明所用的一般技術(shù)和方法，如何用所述組分和成分實(shí)施方案，力求數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性(如數(shù)量、溫度等)，但是，一些差錯(cuò)和誤差也在所難免。除非另有說明，組成用質(zhì)量分?jǐn)?shù)，溫度單位為。C，壓強(qiáng)為大氣壓。標(biāo)準(zhǔn)溫度和大氣壓定義為20°C和一個(gè)大氣壓。應(yīng)該指出，本發(fā)明所述比例、濃度、數(shù)量和其他的數(shù)值數(shù)據(jù)用一定的格式表示。應(yīng)理解，固定格式是為方便和簡(jiǎn)潔，因此，應(yīng)靈活理解，數(shù)值不但明確地限定范圍，而且，如果每個(gè)數(shù)值和子范圍應(yīng)用是，還包括所有的個(gè)別數(shù)值或數(shù)值的子范圍。舉例說明，濃度范圍為，O. 1% -5%應(yīng)理解為不僅包括O. Iwt. %，而且包括5wt. %的確切范圍，還包括制定范圍內(nèi)的個(gè)別濃度(如，1%、2%、3%和4% )和子濃度范圍(如，0.5%、I. 1%、2· 2%、3· 3%和 4.4% )。所述術(shù)語“約”包括 ±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9%或±10%，或者更多變更后的數(shù)值。實(shí)施例I圖I.免疫印跡中使用一抗為純化的鼠抗MRSA抗體(2 μ g/ml)，二抗為HRP標(biāo)記的抗鼠二抗(I 5000)，再用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)抗體結(jié)合的特異蛋白。圖中箭頭示抗體特異性識(shí)別結(jié)合細(xì)菌樣品中的目標(biāo)蛋白。
權(quán)利要求
1.一種具有雙重結(jié)合活性的抗MRSA-PBP 2a的單克隆抗體，其生物特征型是，該單克隆抗體對(duì)MRSA菌表達(dá)的PBP2a蛋白抗原表位具有特異的高親和結(jié)合力，而不能結(jié)合MSSA菌表達(dá)的蛋白，從而能特異性地鑒定出MRSA和MSSA兩種菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合S. aureus 表達(dá)的 PBP2a 蛋白的 27_46 位的 DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 氨基酸片段和 375-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS氨基酸片段以及兩者的結(jié)合的抗原表位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體能夠特異性結(jié)合S. aureus菌表達(dá)的PBP2a蛋白的27_46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY氨基酸片段，分泌此抗體的細(xì)胞株命名為10A10.F2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體能夠特異性結(jié)合 S. aureus 表達(dá)的 PBP2a 蛋白的 376-400 位的 SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS 氨基酸片段，分泌此抗體的細(xì)胞株命名為4B10. B6。
5.所鑒定出的抗體結(jié)合MRSA菌的PBP2a蛋白抗原表位，其特征在于，所述抗體僅特異性地結(jié)合此表位，用以鑒定MRSA和MSSA兩種菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗原表位,其特征在于,該抗原表位分別位于S.aureus (金黃色葡萄球菌)PBP2a蛋白的氨基酸序列的27-46位，DKEINNTIDAIEDKNFKQVY和375-400位SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位包括核心氨基酸EDK。
8.根據(jù)權(quán)利要求5和4所述的抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位能被4B10.B6細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體特異性的識(shí)別。
9.根據(jù)權(quán)利要求5和4所述的抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位能被10A10.F2細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體特異性的識(shí)別。
10.一種鑒定MRSA和MSSA兩種金黃色葡萄球菌的方法，其主要步驟包括 (i)分離制備耐藥性及非耐藥性葡萄球菌，并獲取菌體培養(yǎng)上清及裂解液為鑒定樣品; (ii)將能結(jié)合MRSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位而不能結(jié)合MSSA菌來源的PBP2a蛋白抗原表位的單克隆抗體與生物樣本作用，所述的單克隆抗體還具有能夠區(qū)分MRSA和MSSA菌的特性； (iii)檢測(cè)單克隆抗體與生物樣本的結(jié)合物，由此，鑒定生物樣本中的MRSA菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述為4B10.B6細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述為10A10.F2細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有雙重結(jié)合活性的抗MRSA-PBP 2a的單克隆抗體。該單克隆抗體對(duì)MRSA菌表達(dá)的PBP 2a蛋白抗原表位具有特異的高親和力，而對(duì)MSSA表達(dá)的PBP 2a蛋白不能特異性結(jié)合，從而能區(qū)分MRSA菌和MSSA菌。所述的單克隆抗體能夠特異性結(jié)合S.aureus表達(dá)的PBP 2a蛋白的27-46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY氨基酸片段和375-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS氨基酸片段以及兩者的結(jié)合的抗原表位。本發(fā)明將應(yīng)用于醫(yī)學(xué)技術(shù)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K14/31GK102887952SQ201210034300
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者黃若磐, 張英 申請(qǐng)人:廣州瑞博奧生物科技有限公司