專利名稱：：未熟兒視網(wǎng)膜病和相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療一見網(wǎng)膜疾病的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過向患有或存在發(fā)展所述疾病的風(fēng)險的哺乳動物的眼睛施用譜系(lineage)陰性造血干細(xì)胞來治療未熟兒視網(wǎng)膜病和相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病的方法。
背景技術(shù)：
：視網(wǎng)膜的血管疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、滲出性年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)、未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)和血管閉塞，是視覺缺陷和失明的主要原因。這組疾病是密集的研究的焦點(diǎn)，目的是鑒定幫助防止或改變病理性眼新血管形成的新的治療方式。例如，ARMD影響了65歲以上的1200-1500萬美國人，作為脈絡(luò)膜(視網(wǎng)膜下)新血管形成的之間影響，引起他們中10-15%的視覺損失。65歲以下的美國人的視覺損失的主要原因是糖尿?。辉诿绹?，160萬個體患有糖尿病，每年有40,000患有疾病的眼科并發(fā)癥，通常是視網(wǎng)膜新血管形成的結(jié)果。雖然激光凝結(jié)術(shù)已經(jīng)在高風(fēng)險糖尿病患者的亞群中防止嚴(yán)重的視覺損失方面起到效果，總體上視網(wǎng)膜病的10年發(fā)病率基本上維持不變。對于由于ARMD或炎癥性眼病，例如眼組織胞漿菌病而患有脈絡(luò)膜新血管形成的患者，除了少數(shù)例外的，光凝結(jié)術(shù)在防止視覺損失方面是無效的。雖然近年來發(fā)展的無損的光動力學(xué)治療有希望暫時降低患有先前不可治療的脈絡(luò)膜新血管形成的患者中的個體損失，與45.9%的安慰劑治療的組相比，每3-4個月治療的患者僅61.4%具有改善的或穩(wěn)定的視力。年齡相關(guān)的黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病是工業(yè)化國家中視覺損失的主要原因，這也是異常的視網(wǎng)膜新血管形成的結(jié)果。由于視網(wǎng)膜由界線分明的神經(jīng)元層、神經(jīng)膠質(zhì)層和血管元件層組成，相對小的紊亂，例如在血管增殖或水胂中可見的那些，可以引起視覺功能的重大損失。遺傳性的視網(wǎng)膜退化，例如色素性視網(wǎng)膜炎(RP)也與血管異常，例如小動脈狹窄和血管萎縮有關(guān)。雖然在鑒定促進(jìn)和促進(jìn)血管生成的因子方面取得了顯著的進(jìn)展，當(dāng)前沒有可用的治療來特異性地治療眼血管疾病。視網(wǎng)膜的遺傳性退化影響了多達(dá)3500分之一的個體，其特征是漸進(jìn)性的夜盲、視野損失、視神經(jīng)萎縮、小動脈衰減、改變的血管通透性和常常發(fā)展到完全失明的中央視力損失(Heckenlivdy，J.R.，editor,1988;/e〃'wz7w尸zgwew/YM'(2，Philadelphia:JBLippincottCo.)。這些疾病的分子成因分析已經(jīng)鑒定了超過110個不同基因中的突變，僅解釋了已知的受影響個體中相對小的百分比(Humphries等人，1992，Scw"c'e256:804-808;Farrar等人.2002,EMBOJ.21:857-864.)。這些突變中的許多與光傳導(dǎo)機(jī)制的酶和結(jié)構(gòu)成分相關(guān)，包括視紫紅質(zhì)、cGMP磷酸二酯酶、rA外周蛋白和RPE65。盡管有這些觀察結(jié)果，仍然沒有有效的治療來減緩或逆轉(zhuǎn)這些視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)展。當(dāng)將野生型基因遞送給具有特定突變的動物中的光受體或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)時，基因治療中的新近的發(fā)展已經(jīng)在小鼠的(Ali等人.2000,淑G匿L25:306-310)和rd表型中(Takahashi等人.1999，J.F,ra/.73:7812-7816)和在狗的RPE65表型中(Acland等人.2001，AW.28:92-95)產(chǎn)生了成功逆轉(zhuǎn)。血管生成是新的血管形成的過程。響應(yīng)于特定的化學(xué)信號，毛細(xì)管從現(xiàn)有的血管發(fā)芽，最終生長到有機(jī)體所需的大小。起初，排列成血管的內(nèi)皮細(xì)胞在與現(xiàn)有相關(guān)垂直的方向上分裂，形成實(shí)心的芽。鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞然后形成大的空泡，細(xì)胞重排，從而液泡自身端對端地定向，最終合并形成新毛細(xì)管的管腔(管形成)。血管生成由許多條件刺激，例如響應(yīng)于傷口，在脊推動物有機(jī)體例如哺乳動物中實(shí)際上伴隨這所有的組織生長。血管生成也在某些疾病狀態(tài)，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和某些癌癥中起到作用。例如，腫瘤的生長需要血管生長來向生長的腫瘤組織提供氧氣和營養(yǎng)物。通過用刺激血管生成過程的化學(xué)信號來干擾，可以延滯或抑制血管生成。例如，血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶來消化圍繞血管的基底膜，因而為新毛細(xì)管清除了路徑。這些蛋白酶、或它們的形成的抑制可以防止新血管形成。同樣地，內(nèi)皮細(xì)胞增殖響應(yīng)于化學(xué)信號。特別重要的增殖信號包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)蛋白質(zhì)家族。VEGF已經(jīng)被證明涉及某些腫瘤的血管新生。對這些增殖信號傳導(dǎo)過程的干擾也可以抑制血管生成。一些因子涉及血管生成。酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子分子都是內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的促分裂素。對于血管內(nèi)皮細(xì)胞高度選擇性的促分裂素是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。在正常的成年人中，血管生成受到緊密調(diào)節(jié)，限于傷口愈合、妊娠和子宮周期。血管生成通過特定的血管生成分子，例如堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、VEGF、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、腫瘤壞死因子-cc(TNF-a)和血小板衍生的生長因子(PDGF)來打開。血管生成可以通過抑制性分子例如干擾素-a、凝血栓蛋白-1、制管張素和內(nèi)皮抑制素來抑制。這是控制通常靜息的毛細(xì)血管系統(tǒng)的這些天然發(fā)生的刺激物和抑制物的平衡。當(dāng)這種平衡被擾亂時，如在某些疾病狀態(tài)中，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞被誘導(dǎo)增殖、遷移并最終分化。血管生成在各種疾病包括癌癥和眼新血管形成中起著重要作用。各種肺瘤的持續(xù)的生長和轉(zhuǎn)移也已經(jīng)顯示取決于響應(yīng)于胂瘤衍生的血管生成因子的新的宿主血管向肺瘤中的生長。如在大多數(shù)眼病中發(fā)現(xiàn)為顯性的，發(fā)生了響應(yīng)于各種刺激的新血管增殖，所述失明包括增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、ARMD、rubeoticglaucoma、間質(zhì)性角膜炎和未熟兒視網(wǎng)膜病。在這些疾病中，組織損傷可能刺激引起毛細(xì)管增殖的血管生成因子的釋放。VEGF在虹膜新血管形成和新血管性視網(wǎng)膜病中起到重要作用。雖然報(bào)道清楚地顯示了眼內(nèi)VEGF水平和缺血性視網(wǎng)膜眼新血管形成之間的相關(guān)性，F(xiàn)GF可能起到了作用。已知堿性和酸性FGF存在于正常的成年人視網(wǎng)膜中，即使可檢測的水平與新血管形成沒有一致性地相關(guān)。這可能是主要由于FGF與細(xì)胞外基質(zhì)的帶點(diǎn)成分非常緊密地結(jié)合，可能是不容易在可以通過標(biāo)準(zhǔn)的眼內(nèi)液體分析檢測的游離可擴(kuò)散形式下獲得的。在血管生成響應(yīng)中的最后的通用途徑包括介導(dǎo)增殖性血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的信息交換的整聯(lián)蛋白。這種類型的粘附受體，稱為整聯(lián)蛋白，在所有細(xì)胞上被表達(dá)為具有oc和(3亞基的雜二聚物。一種這樣的整聯(lián)蛋白，ocvp3,是這個家族的最混雜的成員，容許內(nèi)皮細(xì)胞與各種細(xì)胞外基質(zhì)成分相互作用。這個整聯(lián)蛋白的肽和抗體拮抗劑通過選擇性地誘導(dǎo)增殖性血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡來抑制血管生成。存在著血管生成的兩種細(xì)胞因子依賴性途徑，可以根據(jù)它們對不同的血管細(xì)胞整聯(lián)蛋白ccv|33和av(35的依賴性來定義。具體地，堿性FGF和VEGF誘導(dǎo)的血管生成分別取決于整聯(lián)蛋白cxv|33和cxJ35,因?yàn)樵谕媒悄ず碗u胚絨毛尿嚢膜(CAM)模型中每種整聯(lián)蛋白的抗體拮抗劑選擇性地阻斷這些血管生成途徑之一。阻斷所有av整聯(lián)蛋白的肽拮抗劑抑制FGF-和VEGF-刺激的血管生成。雖然正常人眼睛血管不展示任何一種整聯(lián)蛋白，avp3和av|35整聯(lián)蛋白選擇性在來自患有活動性新血管性眼病的患者的組織中的血管上展示。雖然在來自患有ARMD的患者的組織中僅一致地觀察到ccv|33,av(33和cxv(35都存在于來自患有增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的患者的組織中。全身性施用的整聯(lián)蛋白的肽拮抗劑在視網(wǎng)膜血管發(fā)生的小鼠模型中阻斷了新血管形成。通過在各種動物物種，例如小貓、獵兔犬小狗、大鼠和小鼠中氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病(OIR)模型的開發(fā)，測試用于視網(wǎng)膜新血管疾病的潛在治療以及被大大地便利化了。在這些模型的每一種中，將新生的動物暴露于高氧(或暴露于交替的高氧和氧不足)例促使視網(wǎng)膜血管發(fā)育的退化或延遲，在它們回到正常的含氧水平之后產(chǎn)生異常的血管生成。這些模型反映了在未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)期間發(fā)生的事件，未熟兒—見網(wǎng)膜病是一種可以影響早產(chǎn)兒的涉及病理性新血管形成的狀況。在過去的十年間，OIR的小鼠模型成為研究與氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病相關(guān)的異常血管生成的最常用的模型。在這個模型中血管異常的模式稍微不同于在ROP中觀察的；在小鼠中，在暴露于高氧之后中央的、后部的視網(wǎng)膜變?yōu)闊o血管的，而在人類嬰兒中外周部是無血管的。盡管如此，這是用于研究氧不足誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病的疾病機(jī)制和可能的治療的公認(rèn)的模型，血管改變是非常一致的、可重現(xiàn)的和可計(jì)量的。近年來，這個模型的使用已經(jīng)擴(kuò)展到缺血性視網(wǎng)膜并和相關(guān)的抗血管生成介入的一般研究中，現(xiàn)在它在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究環(huán)境中廣泛地使用。用于在小鼠OIR模型中定量增殖性新血管響應(yīng)的歷史上常見的方法是基于對從視網(wǎng)膜伸出到玻璃體("前內(nèi)界膜(ILM)核，，)的新血管相關(guān)的細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)。這通常在靠近視盤的區(qū)域(但不是包括)中在徑向橫截面上進(jìn)行。該方法是極度耗費(fèi)勞力的、費(fèi)時的，并且充滿困難，包括需要從玻璃體的玻璃體血管的細(xì)胞中區(qū)分出異常血管的細(xì)胞。因?yàn)?，一般地，僅評估每到第30個連續(xù)剖面，大部分的組織沒有被定量，潛在地引入了大的采樣誤差。此外，由于整個眼睛被立即切片，它阻礙了這個模型的另一個重要參數(shù)的同一眼的評估，即，血管閉塞的程度和視網(wǎng)膜血管的再形成的速率，其在異常新血管簇形成之后發(fā)生。這個參數(shù)最好在視網(wǎng)膜的完整視網(wǎng)膜固定制品中評定。多年來，已知的是在正常的成年人循環(huán)和骨髓中存在干細(xì)胞的群體。這些細(xì)胞的不同亞群可以沿著造血譜系陽性(Lin+)或譜系陰性(Lin—)系統(tǒng)分化。此外，i普系陰性造血干細(xì)胞(HSC)群體近來顯示了含有能夠在體外和體內(nèi)形成血管的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)(參見Asahara等人.1997,Sc',e"ce275:964-7)。這些細(xì)胞可以參與正常的和病理的出生后血管生成(參見Lyden等人.2001tVw.Met/.7，1194-201;Kalka等人.2000，尸亂淑/.爿cat/.Scz.U.S.A.97:3422-7;和Kocher等人.2001，M/t7:430-6)以及分化成各種非內(nèi)皮細(xì)胞類型，包括肝細(xì)胞(參見Lagasse等人.2000，iVa,.6:1229-34)、小膠質(zhì)細(xì)胞(參見Priller等人.2002M^/.7:1356-61)、cardiomyocytes(參見Orlic等人.2001,尸廠oc.iVa,/.」cadSc/.U.S.A.98:10344-9)和上皮細(xì)胞(參見Lyden等人.2001,M/,.M^/.7:1194-1201)。雖然這些細(xì)胞已經(jīng)在幾個血管生成的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭惺褂?，EPC靶向新血管的機(jī)制是未知的，沒有鑒定出能有效提高促進(jìn)特定血管系統(tǒng)的細(xì)胞的策略。來自骨髓的造血干細(xì)胞是當(dāng)前僅有的通常用于治療應(yīng)用的干細(xì)胞類型。骨髓HSC已經(jīng)在移植中使用超過40年。當(dāng)前，收獲純化的干細(xì)胞的改進(jìn)的方法正在被研究，來開發(fā)用于白血病、淋巴瘤和遺傳性血液失調(diào)的治療的療法。干細(xì)胞在人類中的臨床應(yīng)用已經(jīng)被研究，用于在有限數(shù)量的人類患者中治療糖尿病和進(jìn)展的腎臟癌癥。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)和相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病的方法。所述方法包括向患有或存在風(fēng)險發(fā)展出未熟兒視網(wǎng)膜病或相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的哺乳動物的視網(wǎng)膜施用一定量的來自血管營養(yǎng)譜系陰性造血千細(xì)胞群體的細(xì)胞，有效促進(jìn)視網(wǎng)膜的損傷區(qū)域的有益的生理學(xué)血管再形成和改善由所述疾病引起的對視網(wǎng)膜的損害。優(yōu)選的，所述哺乳動物是人類患者。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體是包含造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性造血干細(xì)胞群體(即，Lm-HSC)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體是分離的骨髓樣骨髓(MLBM)細(xì)胞群體，其中大部分細(xì)胞是譜系陰性的，并且表達(dá)CD44抗原以及CDllb抗原。作為選擇，用于新生兒的治療，適合的語系陰性造血干細(xì)胞群體可以從臍帶靜脈血分離。優(yōu)選的，施用給所述哺乳動物的細(xì)胞對于要治療的個體哺乳動物是自體的。所述細(xì)胞優(yōu)選的通過眼球內(nèi)注射來施用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在疾病的早期將所述細(xì)胞施用給患有未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)的哺乳動物，例如人類嬰兒。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在所述疾病的癥狀發(fā)作之前或嬰兒暴露于高氧之前，作為預(yù)防性試劑，將所述細(xì)胞施用給存在發(fā)展ROP或相關(guān)視網(wǎng)膜狀況的風(fēng)險的哺乳動物。ROP的氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病(OIR)模型的結(jié)果表明，在患有視網(wǎng)膜疾病的哺乳動物的視網(wǎng)膜中，當(dāng)前的治療方法促進(jìn)了治愈和血管再生。此外，由于所述細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)性效果，所述方法促進(jìn)了碎見覺神經(jīng)元的再生。有益地，本發(fā)明的來自i普系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞被4參入到視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)中并分化成內(nèi)皮細(xì)胞，而同時摻入到神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中并改善神經(jīng)元細(xì)胞，例如視網(wǎng)膜中的視錐細(xì)胞的退化。分離的譜系陰性造血干細(xì)胞細(xì)胞群體包括當(dāng)眼內(nèi)注射到眼中時選擇性地耙向活化的視網(wǎng)膜星形細(xì)胞，并且穩(wěn)定地?fù)饺氲窖鄣男卵芟到y(tǒng)和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用治療有用的基因轉(zhuǎn)染來自譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可以使用可操作地編碼神經(jīng)營養(yǎng)試劑等的多核苷酸轉(zhuǎn)染，所述神經(jīng)營養(yǎng)試劑等通過基于細(xì)胞的基因治療形式選擇性地靶向新血管系統(tǒng)并進(jìn)一步促進(jìn)有益的血管再形成和神經(jīng)元發(fā)育。使用本發(fā)明的方法的眼治療的特別的益處是在用來自譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞眼內(nèi)治療的眼中觀察到的血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)援救效果。在用來自本發(fā)明的細(xì)胞群體的細(xì)胞治療的眼中，^L網(wǎng)膜神經(jīng)元和光受體，特別是錐體被保存了，可以維持一些視覺功能的測量。優(yōu)選的，要通過本發(fā)明的方法治療的患病視網(wǎng)膜包括活化的星形干細(xì)胞群體的眼早期治療，或者使用激光來刺激活化的星形細(xì)胞的局部增殖。附圖的簡要說明在附圖中附圖1描繪了發(fā)展小鼠視網(wǎng)膜的示意圖，(a)原發(fā)叢的發(fā)育，(b)視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。GCL,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL,內(nèi)部叢層；INL，內(nèi)核層；OPL,外部叢層；ONL,外核層；RPE，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；ON,視神經(jīng)；P，外周部。畫面(c)描繪了骨髓衍生的Lin+HSC和LirfHSC分離的細(xì)胞的流動細(xì)胞計(jì)特征。頂部^f亍非抗體標(biāo)記的細(xì)胞的點(diǎn)繪圖分布，其中Rl是指陽性PE染色的可計(jì)量的門面積；R2代表GFP陽性；中間行Lin-HSC(C57B/6),和底端行Lin+HSC(C57B/6)細(xì)胞，每種細(xì)胞使用PE結(jié)合的、針對Sca漏l、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的抗體標(biāo)記。Tie-2數(shù)據(jù)獲自Tie-2-GFP小鼠。百分比表示總Lin—HSC或Lm+HSC群體中陽性標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。附圖2描繪了Lin-HSC向發(fā)育的小鼠視網(wǎng)膜中的嫁接，(a)四天后(P6)眼內(nèi)注射的eGFP+Lm—HSC細(xì)胞在視網(wǎng)膜上粘附并分化，(b)Lin-HSC(B6.129S7-G加sa26小鼠，用p-gal抗體染色)自己建立，優(yōu)于用膠原IV抗體染色的血管系統(tǒng)(星號代表血管系統(tǒng)的尖端)，(c)大多數(shù)Lm+HSC細(xì)胞(eGFP+)在注射(P6)后四天不能分化，(d)注射(P6)后四天的腸系膜的eGFP+鼠EC(e)注射到成年小鼠眼中的Lin-HSC(eGFP+)，(f)在GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中歸巢到并沿著先存的星形細(xì)胞模板分化的eGFP+Lin—HSC(箭頭)的低放大圖，(g)在Lin-細(xì)胞(eGFP)和底下的星形細(xì)胞(箭頭)之間的聯(lián)系的更高放大圖，(h)未注射的GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?i)注射(P6)后四天，左圖捕獲了整個固Z的視;膜中的Lin—HSC活性;、右圖指明了視網(wǎng)膜中Lirr細(xì)胞的位置(箭頭)(頂部是玻璃體側(cè)面，底部是鞏膜側(cè)面)，(J)使用oc-CD31-PE和cc-GFP-alexa488抗體的雙標(biāo)記。注射后七天，注射的Lin-HSCs(eGFP,紅色)摻入到血管系統(tǒng)(CD31)中。箭頭指出了摻入?yún)^(qū)域，(k)eGFP+Lin-HSC細(xì)胞在注射后十四天(P17)形成血管。(1和m)羅丹明-葡聚糖的心臟內(nèi)注射表明血管在原發(fā)的(1)和深部叢(m)中都是完整的和功能性的。附圖3顯示了eGFP+Lin—HSC細(xì)胞靶向通過在成年人視網(wǎng)膜中激光(a)和機(jī)械(b)誘導(dǎo)的損傷(星號指示損害位點(diǎn))誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)增生(由表達(dá)GFAP的星形細(xì)胞標(biāo)明，遠(yuǎn)端左側(cè)圖像)。遠(yuǎn)端右側(cè)圖像是更高的放大率，表明了Lin-HSC和星形細(xì)胞的緊密相關(guān)。測徑規(guī)=20nM附圖4顯示了Lin—HSC細(xì)胞援救視網(wǎng)膜退化小鼠的血管系統(tǒng)。(a-d)在注射后27天(P33)用膠原IV染色的視網(wǎng)膜；(a)和(b),用Lin+HSC細(xì)胞(BALB/c)注射的視網(wǎng)膜顯示了在血管系統(tǒng)中與正常的FVB小鼠沒有差異；(c)和(d)用Lm-HSC(BALB/c)注射的視網(wǎng)膜展現(xiàn)了類似于野生型小鼠的豐富血管網(wǎng)絡(luò)；(a)和(c)，用DAPI染色的完整視網(wǎng)膜的冷凍切片(頂部是玻璃體側(cè)面，底部是鞏膜側(cè)面)；(b)和(d),完整數(shù)量的視網(wǎng)膜的深部叢；(e)說明在注射Lin-HSC細(xì)胞的視網(wǎng)膜中形成的深部血管叢的血管分布提高的柱形圖(n=6)。深部視網(wǎng)膜血管新生的程度通過計(jì)算每個圖像內(nèi)血管的總長度來確定。比較Lin-HSC、Lin+HSC或?qū)φ瘴?、視網(wǎng)膜的血管/高倍視野的平均總長度(微米數(shù))，(f)比較用來自小鼠的LmHSC(R，右眼)或Lin+HSC(L,左眼)細(xì)胞注射后深部血管叢的長度。顯示了六只獨(dú)立小鼠的結(jié)果(每種顏色代表獨(dú)立的小鼠)，(g)和(h)當(dāng)注射到P15眼中時Lm-HSC細(xì)胞也(BALB/c)援救了ra^t/血管系統(tǒng)。顯示了Lin-HSC(G)或Lin+HSC(H)細(xì)胞注射的視網(wǎng)膜的中間和深部血管叢(注射液后一個月)。附圖5描繪了小鼠視網(wǎng)膜組織的顯微照片(a)視網(wǎng)膜完整固定物的深層(W/W小鼠)，用eGFP+Lin—HSC注射后五天(Pll)可見(灰色)，(b)和(c)在P6接受了BALB/cLin—細(xì)胞(b)或Lin+HSC細(xì)胞(c)注射的Tie-2-GFP(n//rJ)小鼠的P60視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。在(b)和(c)的左側(cè)畫面僅內(nèi)源的內(nèi)皮細(xì)胞(GFP染色的)是可見的。(b)和(c)的中間畫面用CD31抗體染色；箭頭指明用CD31而不是GFP染色的血管，(b)和(c)的右側(cè)畫面顯示了同時用GFP和CD31染色。(d)LiifHSC注射的(左側(cè)畫面)和對照視網(wǎng)膜(右側(cè)畫面)的oc-SMA染色。附圖6顯示了T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的LirTHSC抑制小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的發(fā)育，(a)人類TrpRS、T^TrpRS和在氨基末端具有Igk信號序列的T2-TrpRS的示意圖，(b)T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lm—HSC注射的視網(wǎng)膜體內(nèi)表達(dá)T2-TrpRS蛋白質(zhì)。(1)在E.coli中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS;(2)在E.coli中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS;(3)在E.coli中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS;(4)對照一見網(wǎng)膜；(5)Lin—HSC+pSecTag2A(^又載體)注射的視網(wǎng)膜；(6)Lin-HSC+PKLel35(pSecTag中的Igk-T2-TrpRS)注射的^L網(wǎng)膜，(a)內(nèi)源的TrpRS。(b)重組T2-TrpRS。(c)LiiTHSC注射的視網(wǎng)膜的T2-TrpRS,(c-f)注射后七天，注射的視網(wǎng)膜的代表性的原發(fā)(表面的)和繼發(fā)(深部的)叢；(c)和(d)用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Lin-HSC注射的眼正常發(fā)育；(e)和(f)大部分T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lin-HSC注射的眼展現(xiàn)了深部叢的抑制作用；(c)和(e)原發(fā)(表面的)叢；(d)和(f)繼發(fā)(深部的)叢)。在(f)中觀察的血管的模糊輪廓是在(e)中顯示的原發(fā)網(wǎng)絡(luò)血管的"透背"圖像。附圖7顯示了編碼His6-標(biāo)記的T2-TrpRS的DNA序列，SEQIDNO:1。附圖8顯示了編碼His6-標(biāo)記的T2-TrpRS的氨基酸序列，SEQIDNO:2。附圖9說明了來自小鼠的視網(wǎng)膜的顯微照片和視網(wǎng)膜電圖(ERG)，所述小鼠的眼用LinHSC和Lm+HSC(對照)注射。附圖10描繪了統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)繪圖，其顯示用Lin—HSC處理的n/々t/小鼠眼的中間(Int.)和深部血管層的神經(jīng)元援救(y軸)和血管援救(x軸)之間的相關(guān)性。附圖11描述了統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)繪圖，其顯示了在用Lin+HSC處理的W/raf小鼠眼的神經(jīng)元援救(y軸)和血管援救(x軸)之間沒有相關(guān)性。附圖12是血管長度(y軸)的柱形圖，在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的時點(diǎn)用Lin-HSC處理的raf/W小鼠眼(黑色柱)和未處理的W/W小鼠眼(亮色柱)的任意相關(guān)單位中。附圖13包括在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的小鼠的外部神經(jīng)層(ONR)中核數(shù)目的三個柱形圖，表明了相對于用Lin+HSC處理的對照眼(亮色柱)的用Lin—HSC處理的眼(黑色柱)的核數(shù)目的顯著提高。附圖14描繪了在單個的W/k/小鼠中外部神經(jīng)層中核數(shù)目的標(biāo)繪圖，在1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的時點(diǎn)(注射后)相對于左眼(L，用Lm+HSC處理的對照眼)比較右眼(R，用Lin—HSC處理)。附圖15描繪了在W//^//(C3H/HeJ，左側(cè)畫面)或野生型小鼠(C57BL/6,右側(cè)畫面)中視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)和神經(jīng)細(xì)胞改變。顯示了同一個視網(wǎng)膜的完整固定的視網(wǎng)膜(紅色膠原IV,綠色CD31)和切片(紅色DAPI,綠色CD31)中的中間(上畫面)或深部(中間畫面)血管叢的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。(GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，INL:內(nèi)核層，ONL:外核層)。附圖16顯示了LmHSC注射援救了n/〃/Y//小鼠中的神經(jīng)細(xì)胞退化。(A、B和C)在P30(A)、P60(B)和P180(C)的LinliSC注射的眼(右側(cè)畫面)和對側(cè)的對照細(xì)胞(CD31—)注射的眼(左側(cè)畫面)的中間(Int.)或深部叢的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和切片。(D)，在P30(左側(cè)，n=10)、P60(中間，n=10)和P180(右側(cè)、n=6)在Lm—HSC注射的或?qū)φ占?xì)胞(CD31-)注射的視網(wǎng)膜中的血管系統(tǒng)的平均總長度(+或-標(biāo)準(zhǔn)平均誤差)。中間(Int.)和深部血管叢的數(shù)據(jù)單獨(dú)地顯示(Y軸血管系統(tǒng)的相對長度)。(E)，在P30(左側(cè)，n=10)、P60(中間，n=10)或P180(右側(cè)，n=6)的對照細(xì)胞(CD3r)或Lin-HSC注射的視網(wǎng)膜中ONL中細(xì)胞核的平均數(shù)量(Y軸ONL中細(xì)胞核的相對數(shù)量)。(F)，在Lm-HSC或?qū)φ占?xì)胞注射的視網(wǎng)膜的P30(左側(cè))、P60(中間)和P180(右側(cè))在ONL(Y軸)中血管系統(tǒng)長度(X軸)和細(xì)胞核數(shù)量之間的線性相關(guān)。附圖17顯示了通過Lin—HSC注射援救的視網(wǎng)膜功能。使用電視網(wǎng)膜圖(ERG)記錄來測量Lin-HSC或?qū)φ占?xì)胞(CD31-)注射的視網(wǎng)膜的功能。(A和B)，在注射后2個月援救的和非援救的視網(wǎng)膜的代表性實(shí)例。顯示了同一動物的Lm-HSC注射的右眼(a)和CD31-對照細(xì)胞注射的左眼(B)的視網(wǎng)膜切片(綠色CD31染色的血管系統(tǒng)，紅色DAPI染色的核)。(C)，在(A)和(B)中顯示的同一動物的ERG結(jié)果。附圖18顯示了人類骨髓細(xì)胞的群體可以援救小鼠中的退化性視網(wǎng)膜(A-C)。這種援救也可以在另一個視網(wǎng)膜退化模型，W/0(D-K)中觀察到。A,用綠色染料標(biāo)記的人類Lm-HSC(hLm—HSC)可以在眼內(nèi)注射到C3SnSmn.CB17-/V/WcSCID小鼠中之后分化成視網(wǎng)膜血管細(xì)胞。(B和C),在注射后].5個月在hLin-HSC注射的眼(B)或?qū)?cè)的對照眼(C)中的^L網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(左側(cè)畫面上部中間叢，下部深部叢)和神經(jīng)細(xì)胞(右側(cè)畫面)。(D-K),通過Lin—HSC的/y//0小鼠援救(在P6注射)。顯示了在P21(D:Lm—HSC，H:對照細(xì)胞)、P30(E:Lin—HSC,I:對照細(xì)胞)、P60(F:Lin—HSC，J:對照細(xì)胞)和P105(G:Lm-HSC,K:對照細(xì)胞)的代表性性視網(wǎng)膜(在每個時點(diǎn)處理的和對照眼來自同一動物)。用CD31(綠色)和月交原IV(紅色)對視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)染色(每個畫面中的上部圖像是中間叢；每個畫面中的中間圖像是深部叢)。每個畫面中的下部圖像顯示了從同一視網(wǎng)膜制成的橫切片(紅色DAPI,綠色CD31)。附圖19表明了在用LiifHSC處理之后在援救的外核層細(xì)胞中晶狀體蛋白aA被增量調(diào)節(jié)，而在用對照細(xì)胞的對側(cè)眼中沒有。左側(cè)畫面在援救的視網(wǎng)膜中的IgG對照，中間畫面援救的視網(wǎng)膜中的晶狀體蛋白o(hù)cA，右側(cè)畫面在非援救的視網(wǎng)膜中的晶狀體蛋白o(hù)cA。附圖20包括在用本發(fā)明的Lm-HSC處理的鼠視網(wǎng)膜中增量調(diào)節(jié)的基因的表格。(A)在用鼠Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)被增加3倍的基因。(B)在用鼠LirfHSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中增量調(diào)節(jié)的晶狀體蛋白基因。(C)在用人類Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)被增加2倍的基因。(D)在用人類Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)被增量調(diào)節(jié)的神經(jīng)營養(yǎng)因子或生長因子的基因。附圖21說明了在CD133陽性(CD133+)和CD133陰性(CD133—)人類Lin-HSC群體上CD31和整聯(lián)蛋白o(hù)c6表面抗原的分布。左側(cè)畫面顯示了流式細(xì)胞計(jì)散布圖。中央的和右側(cè)畫面是顯示在所述細(xì)胞群體上的特異性抗體表達(dá)水平的直方圖。Y軸代表事件的數(shù)目，X軸顯示了信號的強(qiáng)度。在所列的(對照)直方圖的右側(cè)的填充的直方圖代表提高的熒光信號和在背景水平上的抗體表達(dá)。附圖22說明了在出生后P0到P30在正常氧水平(氧正常)中產(chǎn)生的野生型C57/B16小鼠中的出生后視網(wǎng)膜發(fā)育。附圖23說明了在P7和P12之間的高氧水平(氧過多；75%氧)，隨后P12-P17的氧正常中產(chǎn)生的C57/B16小鼠中的氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病模型。附圖24說明了在氧-的視網(wǎng)膜病(OIR)模型中通過用Lin-HSC群體治療的血管援救。附圖25顯示了在Lm-HSC眼內(nèi)注射之后在小鼠外核層(ONL)中援救的光受體主要是錐體。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中小百分比的光受體是錐體(上部畫面)，這通過紅色/綠色錐體視蛋白的表達(dá)證明了(A)，而ONL的大多數(shù)細(xì)胞對于rod特異性視紫紅質(zhì)是陽性的(B)。視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)使用預(yù)免疫血清自體發(fā)熒光(C)，但是核層對于用rod或錐體特異性視蛋白染色是完全陰性的。^//W小鼠視網(wǎng)膜(下部畫面)具有減少的內(nèi)核層和幾乎完全萎縮的ONL，兩者對于錐體(D)或rod(畫面G)視蛋白都是陰性的。對照，CD31—HSC處理的眼與未注射的W/W視網(wǎng)膜一致，對于錐體(E)或rod(H)一見蛋白沒有任何染色。Lin-HSC處理的對側(cè)眼展現(xiàn)了顯著降低的，但清楚呈現(xiàn)的主要由錐體組成的ONL，由對于錐體紅色/綠色視蛋白的陽性免疫反應(yīng)性證明(F)。還觀察到少量的rod(1)。附圖26顯示了譜系陰性和譜系陽性干細(xì)胞群體的流式細(xì)胞計(jì)特征的散布圖(分布為上左和下左圖)，顯示了表達(dá)CD44抗原的細(xì)胞的百分比(紅色的數(shù)據(jù)點(diǎn))；以及CD31陰性和CD31陽性細(xì)胞群體(分別為上右和下右圖)，顯示了表達(dá)CD44抗原的細(xì)胞的百分比(紅色的數(shù)據(jù)點(diǎn))。附圖27顯示了來自表達(dá)顯著性水平的CD44抗原的譜系陰性細(xì)胞群體(圖的左側(cè)組)和不表達(dá)顯著水平CD44抗原的骨髓細(xì)胞亞群(圖的右側(cè)組)的流式細(xì)胞計(jì)特征散布圖，說明了表達(dá)各種其他的細(xì)胞表面抗原的細(xì)力包的相對百分比。附圖28顯示了與用CD441。細(xì)胞眼內(nèi)注射的小鼠的視網(wǎng)膜相比，用來自優(yōu)選分離的MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞眼內(nèi)注射的小鼠(左側(cè)畫面)的視網(wǎng)膜的顯微照相圖像。附圖29顯示了用來自MLBM細(xì)胞群體(CD44hi)的細(xì)胞和用CD441。細(xì)胞注射的眼的視網(wǎng)膜的顯微照相圖像。附圖30顯示了柱形圖，說明了MLBM細(xì)胞群體在未熟兒視網(wǎng)膜病的氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病模型中改善病理性血管發(fā)生并且促進(jìn)小鼠視網(wǎng)膜的有益生理性血管再形成的有益效果。上部圖表比較了對照視網(wǎng)膜(第一柱)、用CD44'。細(xì)胞處理的視網(wǎng)膜(中間柱)和用來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞處理的視網(wǎng)膜(右側(cè)柱)的前—見網(wǎng)膜新血管叢。下部圖表比較了對照視網(wǎng)膜(第一柱)、用CD44'。細(xì)胞處理的視網(wǎng)膜(中間柱)和用來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞處理的視網(wǎng)膜(右側(cè)柱)的血管閉塞區(qū)域。附圖31是顯微照相圖像，表明了一旦來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞摻入到視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)中，細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，如在圖像的下部中細(xì)胞的綠色染色所表明的。附圖32描述了顯微照相圖像，表明來自本發(fā)明的CDllb—MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞選擇性地耙向視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)。附圖33描繪了顯微照相圖像，表明CD44-CDllb+骨髓細(xì)胞不選擇性地耙向視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)。附圖33描繪了顯微照相圖像，表明CD44-CDllb+骨髓細(xì)胞不選擇性地靶向視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)。附圖34顯示了TrpRS的T2片段(SEQIDNO:3)和其T2-TrpRS-GD變體(SEQIDNO:4)的氨基酸殘基序列。附圖35顯示了mmi-TrpRS的氨基酸殘基序列(SEQIDNO:5)。附圖36顯示了Tl-TrpRS的氨基酸殘基序列(SEQIDNO:6)。優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說明骨髓包括能夠發(fā)育成各種血細(xì)胞類型，例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)月包、血小板和紅血球的造血干細(xì)胞。譜系表面抗原是一組細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，其是成熟的血細(xì)胞譜系的標(biāo)志，包括CD2、CD3、CDll、CDlla、Mac-l(CDllb:CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER國119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人類白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)和CD235a(GlycophorinA)。在它們的細(xì)胞表面不表達(dá)顯著性水平的"譜系表面抗原"(Lin)的分離的造血干細(xì)胞在此被稱為"譜系陰性"或"Lin—"造血干細(xì)胞，即，LinliSC。人類造血干細(xì)胞通常表達(dá)其他表面抗原，例如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133。鼠的造血干細(xì)胞通常表達(dá)其他表面抗原例如CD34、CD117(c-kit)、Thy-l和/或Sca-l。骨髓細(xì)胞包括表達(dá)CD44抗原(即，透明質(zhì)酸受體)和CDllb(整聯(lián)蛋白o(hù)cM)的細(xì)胞亞群。在CD44和CDllb表達(dá)細(xì)胞中富集的骨髓細(xì)胞的骨髓樣群體可以通過用針對CD44抗原的抗體(抗-CD44)和/或針對CDllb抗原的抗體(抗-CDllb)處理骨髓細(xì)胞，然后選擇與所述抗體免疫反應(yīng)的細(xì)胞來從骨髓中分離。然后可以通過本領(lǐng)域公知的方法來從細(xì)胞上除去抗體。例如，通過流式細(xì)胞計(jì)，使用結(jié)合于或包被在珠子上的抗體，隨后過濾，或本領(lǐng)域公知的其他分離方法，可以挑選細(xì)胞。大多數(shù)挑選的細(xì)胞是譜系陰性的，并且表達(dá)CD44抗原和CDUb抗原，無論在分離中使用哪種抗體。纟田的i侖述參見StemCells:ScientificProgressandFutureDirections,areportpreparedbytheNationalInstitutesofHealth,OfficeofSciencePolicy,June2001,AppendixE:StemCellMarkers,通過引用合并在此達(dá)到相關(guān)的程度)。從骨髓的大約75%的譜系陰性造血干細(xì)胞也是CD44陽性的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，大多數(shù)來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞是譜系陰性造血干細(xì)胞(即，CD44+Lin—HSC)。如在此和附隨的權(quán)利要求中使用的，用語"成年"是指骨髓和骨髓細(xì)胞，包括出生后分離的，即，來自青少年和成年個體的骨髓，與來自胚胎的相對。因而，術(shù)語"成年哺乳動物"是指青少年(出生后的)和完全成熟的哺乳動物，與胚胎或出生前的個體相對。含有內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的LiiVHSC群體在本發(fā)明的方法中是特別有用的。分離的Lin-HSC群體優(yōu)選的包括哺乳動物細(xì)胞，其中至少約20%的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31,所述CD31通常在內(nèi)皮細(xì)胞上呈現(xiàn)。在其他實(shí)施方式中，至少約50%的所述細(xì)胞表達(dá)CD31，更優(yōu)選的至少約65%,最優(yōu)選的至少約75%。優(yōu)選的至少約50%的本發(fā)明的Lin-HSC群體的細(xì)胞優(yōu)選地表達(dá)整聯(lián)蛋白o(hù)c6抗原。在另一個優(yōu)選的鼠Lin-HSC群體中，至少約50。/。的細(xì)胞表達(dá)CD31抗原，至少約50%的細(xì)胞表達(dá)CD117(c-kit)抗原。優(yōu)選的，至少約75%的Lin-HSC細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31,更優(yōu)選的為約81%的所述細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的鼠的實(shí)施方式，至少約65%的所述細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31，更優(yōu)選的為約70%的所述細(xì)胞。本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式是LirTHSC的群體，其中約50%到約85%的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31并且約70%到約75%的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117.在優(yōu)選的人類Lin-HSC群體中，細(xì)胞是CD133陰性的，至少約50%的細(xì)胞表達(dá)CD31表面抗原，至少約50%的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白a6抗原。又一個優(yōu)選的實(shí)施方式是人類Lin-HSC群體，其中細(xì)胞是CD133陽性的，其中少于約30%的細(xì)胞表達(dá)CD31表面抗原，少于約30%的細(xì)胞表達(dá)整l關(guān)蛋白a6抗原。當(dāng)眼內(nèi)注射到分離出所述細(xì)胞的哺乳動物物種，例如小鼠或人類的眼中時，本發(fā)明的分離的Lin-HSC群體選擇性地靶向星形細(xì)胞并且摻入到視網(wǎng)膜的新血管系統(tǒng)中。當(dāng)眼內(nèi)注射到分離出所述細(xì)胞的哺乳動物物種，例如小鼠或人類的眼中時，分離的MLBM細(xì)胞群體也選擇性地耙向星形細(xì)胞并且摻入到視網(wǎng)膜的新血管系統(tǒng)中。所述分離的MLBM細(xì)胞群體包括分化成內(nèi)皮細(xì)胞并且在視網(wǎng)膜內(nèi)產(chǎn)生血管結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。特別地，MLBM細(xì)胞群體對于治療視網(wǎng)膜新血管和視網(wǎng)膜血管退行性疾病，以及對于視網(wǎng)膜血管損傷的修復(fù)是有用的。MLBM細(xì)胞群體還促進(jìn)視網(wǎng)膜中的神經(jīng)元援救，并促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡基因的增量調(diào)節(jié)。本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群體對于治療新生哺乳動物，例如患有氧誘導(dǎo)的—見網(wǎng)膜病或未熟兒浮見網(wǎng)膜病的哺乳動物的眼中的視網(wǎng)膜缺陷是特別有用的。作為選擇，對于新生兒的治療，分離自臍帶靜脈血的血管營養(yǎng)性i普系陰性造血干細(xì)胞群體可以代替骨髓衍生的干細(xì)胞群體來使用。本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療未熟兒視網(wǎng)膜病和相關(guān)疾病，例如氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病的方法。所述方法包括向患有或存在風(fēng)險發(fā)展出未熟兒視網(wǎng)膜病或相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的哺乳動物的視網(wǎng)膜施用一定量的來自血管營養(yǎng)性譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞，有效促進(jìn)視網(wǎng)膜的損傷部分的有益的生理學(xué)血管再形成。優(yōu)選的，所述哺乳動物是人類患者。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體是包括如上文描述的內(nèi)皮祖細(xì)胞的Lin—HSC群體，例如骨髓衍生的群體。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述譜系陰性造血千細(xì)胞群體是分離的骨髓樣骨髓(MLBM)衍生的細(xì)胞群體，其中大部分細(xì)胞是譜系陰性的，并且表達(dá)CD44抗原以及CDllb抗原。優(yōu)選的，施用給所述哺乳動物的細(xì)胞對于要治療的個體哺乳動物是自體的。所述細(xì)胞優(yōu)選的通過眼球內(nèi)注射來施用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在疾病的早期將所述細(xì)胞施用給患有未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)的哺乳動物，例如人類嬰兒。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在暴露于高氧之前或在疾病的癥狀發(fā)作之前，作為預(yù)防性試劑，將所述細(xì)胞施用給存在發(fā)展ROP或相關(guān)視網(wǎng)膜狀況的風(fēng)險的哺乳動物。注射到眼中的來自語系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞數(shù)量足以延滯眼的疾病狀態(tài)。例如，注射的細(xì)胞的數(shù)量對于修復(fù)眼的視網(wǎng)膜損傷、穩(wěn)定視網(wǎng)膜的新血管系統(tǒng)、成熟視網(wǎng)膜的新血管系統(tǒng)以及防止或修復(fù)血管滲漏和血管出血是有效的。本發(fā)明的來自譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞可以用治療有用的基因轉(zhuǎn)染，例如編碼抗血管生成蛋白的基因用于眼睛的基于細(xì)胞的基因治療和編碼神經(jīng)營養(yǎng)試劑的基因來增強(qiáng)神經(jīng)元援救效果?；?。在一個優(yōu)i的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括一種基因，其可操作地編碼抗血管生成肽，包括蛋白或蛋白片段，例如TrpRS的抗血管生成(即，血管靜止)片段，例如TrpRS的Tl和T2片段，其在自有的共同待決U.S.專利申請系列號NO.10/080,839中詳細(xì)描述，其公開內(nèi)容通過引用合并在此。本發(fā)明的編碼抗血管生成肽的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對于視網(wǎng)膜疾病，包括異常的血管發(fā)育，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和類似疾病的治療是有用的。優(yōu)選的，所述細(xì)胞群體是人類細(xì)胞的群體。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括可操作編碼神經(jīng)營養(yǎng)試劑的基因，所述神經(jīng)營養(yǎng)試劑例如神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)素-3、神經(jīng)營養(yǎng)素-4、神經(jīng)營養(yǎng)素-5、纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，等等。這種神經(jīng)營養(yǎng)細(xì)胞對于促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性疾病例如青光眼和色素性視網(wǎng)膜炎中的神經(jīng)元援救，在對于視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的治療，等等中是有用的。纖毛神經(jīng)營養(yǎng)因子的植入已經(jīng)報(bào)道了對于色素性視網(wǎng)膜炎的治療是有用的(參見Kirby等人.2001，tUo/T7zw3(2):241-8;Farrar等人.2002,EA^(9Jowr憩/21:857-864)。腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子據(jù)報(bào)道調(diào)節(jié)了受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)中的生長相關(guān)的基因(參見Fournier,W1997,147:561-572)。膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子據(jù)報(bào)道延遲了色素性視網(wǎng)膜炎中的光受體退化(參見McGee等人2001,Mo/7Tz^4(6):622-9)。優(yōu)選的，來自譜系陰性造血千細(xì)胞群體的至少約lxl()s個細(xì)胞通過眼內(nèi)注射施用到患有視網(wǎng)膜退行性疾病的哺乳動物眼中。要注射的細(xì)胞數(shù)量可以取決于視網(wǎng)膜退化的嚴(yán)重度，哺乳動物的年齡和對于視網(wǎng)膜疾病治療領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見的其他因素。來自i普系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞可以根據(jù)負(fù)責(zé)治療的臨床醫(yī)師確定的，以單次劑量或在一定時期內(nèi)通過多次劑量來施用。ROP的OIR模型的結(jié)果表明，使用本發(fā)明的方法的治療的特別的益處是在用來自譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞眼內(nèi)治療的眼中觀察到的血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)性援救效果。在用來自本發(fā)明的譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞治療的眼中，視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光受體，特別是錐體被保存了，可以維持一些視覺功能的測量。使用血管生成抑制物的治療不會阻斷譜系陰性造血干細(xì)胞群體的治療效果。巨噬細(xì)胞樣像與援救的血管一同被觀察到，表明在免疫細(xì)胞和譜系陰性骨髓細(xì)胞之間在所述譜系陰性細(xì)胞的血管營養(yǎng)活性方面的可能的聯(lián)系。然而，在P7和P17注射針對CD18的抗體來降低血管的巨噬細(xì)胞外滲不會阻斷錯系陰性造血干細(xì)胞的援救效果。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，在疾病的發(fā)作之前或在其早期注射細(xì)胞來保護(hù)視網(wǎng)膜免于損傷，如果未治療所述眼，所述損傷將接下來發(fā)生。在要治療的哺乳動物已知處于發(fā)展未熟兒視網(wǎng)膜病、氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病或其他網(wǎng)膜疾病的風(fēng)險中時，這種預(yù)防性治療是特別可取的。在當(dāng)前的方法中預(yù)防性治療是特別有效的，因?yàn)樽V系陰性細(xì)胞群體在眼中的存在實(shí)際上降低了對視網(wǎng)膜的血管損害的嚴(yán)重度，可以在損傷發(fā)生前延緩疾病，與僅僅促進(jìn)從損傷的恢復(fù)是相對的。例如，在OIR模型中，在高氧暴露之前在P3和P7用Lin-HSC注射的小鼠，與在高氧暴露之后注射的小鼠相比，具有較少的視網(wǎng)膜損傷和更快的恢復(fù)。此外，在高氧暴露期間處理的小鼠也展現(xiàn)了加速的恢復(fù)。鼠的視網(wǎng)膜血管的發(fā)育眼血管生成的模型。小鼠眼提供了用于哺乳動物視網(wǎng)膜血管的發(fā)育，例如人類視網(wǎng)膜血管發(fā)育的公認(rèn)的模型。在鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)發(fā)育期間，缺血驅(qū)動的視網(wǎng)膜血管發(fā)育與星形細(xì)胞緊密相關(guān)。這種神經(jīng)膠質(zhì)元件在三個月的人類胎兒或新生的嚙齒動物中從視覺芽沿著神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層并且散布放射地遷移到視網(wǎng)膜上。隨著鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的發(fā)育，內(nèi)皮細(xì)胞利用這種已經(jīng)安置的星形細(xì)胞模板來確定視網(wǎng)膜血管圖型(參見附圖1(a和b))。附圖1(a和b)描繪了發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜的示意圖。畫面(a)描繪了在星形細(xì)胞模板(亮線)上疊加的原發(fā)叢(在圖形的左上的暗線)的發(fā)育，而(b)描繪了視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。在附圖1中，GCL代表神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL代表內(nèi)部叢層；INL代表內(nèi)核層；OPL代表外部叢層；ONL代表外核層；RPE代表視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；ON代表視神經(jīng)；P代表外周部。出生時，視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng)實(shí)際上是不存在的。到出生后14天(P14),視網(wǎng)膜發(fā)育了復(fù)雜的原發(fā)(表面的)和繼發(fā)(深部的)的視網(wǎng)膜血管層，與視力的發(fā)展一致。起初，輪輻樣視乳頭周血管在先存的星形細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上朝向外周部放射地生長，通過毛細(xì)管叢形成變得逐漸地互連。這些血管作為單層在神經(jīng)纖維內(nèi)生長直到PIO(附圖l(a))。在P7-P8之間，側(cè)面分支開始從這些原發(fā)叢發(fā)芽并且穿透進(jìn)入視網(wǎng)膜到達(dá)外網(wǎng)織層，在此它們形成繼發(fā)的、或深部的視網(wǎng)膜叢。到P21,整個網(wǎng)絡(luò)經(jīng)歷了擴(kuò)大的改變，第三的、或中間的叢在內(nèi)核層的內(nèi)表面形成(附圖1(b))。由于幾個理由，新生小鼠視網(wǎng)膜血管生成模型對于研究HSC在眼血管生成期間的作用是有用的。在這個生理學(xué)相關(guān)的模型中，在內(nèi)源血管出現(xiàn)之前存在大的星形細(xì)胞模板，允許評估在新血管過程期間細(xì)胞-細(xì)胞靶向的作用。此外，這種一致性和重現(xiàn)性的新生浮見網(wǎng)膜的血管過程已知是缺氧驅(qū)動的，在這點(diǎn)上與其中已知缺血起到作用的許多視網(wǎng)膜疾病具有相似點(diǎn)。從骨髓富集內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)雖然細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)已經(jīng)在HSC的制品中發(fā)現(xiàn)的EPC群體上被廣泛地評估，唯一地鑒定EPC的標(biāo)志仍未充分地確定。為了富集EPC,造血系統(tǒng)標(biāo)志物陽性細(xì)胞(Lin+),即，B淋巴細(xì)胞(CD45)、T淋巴細(xì)胞(CD3)、粒細(xì)胞(Ly-6G)、單核細(xì)胞(CD11)和紅血球(TER-119)從小鼠的骨髓單核細(xì)胞中耗盡。使用Sca-1來進(jìn)一步富集EPC。在相同數(shù)量的LiifSca-l+細(xì)胞或Lin-細(xì)胞的眼內(nèi)注射之后獲得的結(jié)果比較，在兩個組之間沒有檢測到差異。實(shí)際上，當(dāng)僅注射Lin-Sca-r細(xì)胞時，觀察到對發(fā)育中的血管的更大的摻入。根據(jù)功能性分析，用EPC富集Lin-HSC群體。此外，Lin+HSC群體在功能上與LiiVHSC群體表現(xiàn)得完全不同。還評估了通常用于鑒定每個級分的EPC的表位(根據(jù)以前在體外表征研究中報(bào)道的)。雖然這些標(biāo)志物都不專有地與Lin-級分相關(guān)，與Lin+HSC級分相比，它們在Lm-HSC中都提高了約70到約1800%(附圖1(c))。附圖1,畫面(c)說明了骨髓衍生的Lin+HSC和Lm—HSC分離的細(xì)胞的流動細(xì)胞計(jì)特征。畫面(c)的上行顯示了無抗體標(biāo)記的細(xì)胞的造血干細(xì)胞點(diǎn)繪分布。Rl定義了陽性PE染色的可測量的門面積；R2代表GFP陽性。Lm-HSC的點(diǎn)繪圖在中間行顯示，Lm+HSC的點(diǎn)繪圖在底端行顯示。用針對Sca-l、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE結(jié)合的抗體標(biāo)記C57B/6細(xì)胞。Tie-2數(shù)據(jù)獲自Tie-2-GFP小鼠。在點(diǎn)繪圖的邊角的百分比表示總LirT或Lin+HSC群體中陽性標(biāo)記的細(xì)胞的百分比。有趣地，公認(rèn)的EPC標(biāo)志物如Flk-1/KDR、Tie-2和Sca-1貧乏地表達(dá)，因而沒有用于進(jìn)一步的分級。通過(a)從成年哺乳動物提取骨髓；(b)從所述骨髓分離大量的單核細(xì)胞；(c)用生物素結(jié)合的、針對一種或多種譜系表面抗原的譜系組抗體標(biāo)記所述單核細(xì)胞，所述譜系表面抗原優(yōu)選的是選自由CD2、CD3、CD4、CDll、CDlla、Mac-l、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠的)、TER-119(鼠的)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細(xì)月包抗原DR(HLA-DR)和CD235a(GlycophormA)構(gòu)成的組的譜系表面抗原；(d)從所述大量單核細(xì)胞中除去對于所述一種或多種譜系表面抗原是陽性的單核細(xì)胞；以及(e)從中回收譜系陰性造血干細(xì)胞的群體，可以分離LiiTHSC。當(dāng)Lm-HSC是從成年人類骨髓分離時，優(yōu)選的，用生物素結(jié)合的、針對譜系表面抗原CD2、CD3、CD4、CDlla、Mac-l、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的譜系表面抗原的譜系組抗體來標(biāo)記所述單核細(xì)胞。當(dāng)Lin-HSC是從成年鼠骨髓分離時，優(yōu)選的，用生物素結(jié)合的、針對譜系表面抗原CD3、CDll、CD45、Ly-6G和TER-119的譜系組抗體來標(biāo)記所述單才亥纟田月包。眼內(nèi)注射的HSCLin-細(xì)胞含有靶向星形細(xì)胞并摻入到發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)內(nèi)的EPC為了確定眼內(nèi)注射的Lin—HSC是否可以靶向視網(wǎng)膜的特定細(xì)胞類型、利用星形細(xì)胞模板并且參與視網(wǎng)膜血管生成，來自本發(fā)明的Lm-HSC組合物的約105個細(xì)胞或從成年小鼠(GFP或LacZ轉(zhuǎn)基因的)的骨髓分離的Lin+HSC細(xì)胞(對照，約105個細(xì)胞)注射到出生后2天(P2)的小鼠眼中。注射后四天(P6)，來自本發(fā)明的Lin—HSC組合物的許多細(xì)胞，來自GFP或LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的許多細(xì)胞附著到視網(wǎng)膜上，并具有特征性的長形內(nèi)皮細(xì)胞外觀(附圖2(a))。附圖2說明了Lm—細(xì)胞向發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜中的嫁接。如附圖2畫面(a)所示，四天后(P6)眼內(nèi)注射的eGFP+Lin—HSC在視網(wǎng)膜上附著并分化。在視網(wǎng)膜的許多區(qū)域中，表達(dá)GFP的細(xì)胞按照符合底層星形細(xì)胞和類似的血管的圖型分布。這些焚光細(xì)胞在內(nèi)源的、發(fā)育性血管網(wǎng)絡(luò)之前被觀察到(附圖2(b))。相反，僅少量的Lin+HSC(附圖2(c))或成年小鼠腸系膜內(nèi)皮細(xì)胞(附圖2(d))附著于視網(wǎng)膜表面。為了確定來自注射的Lm-HSC群體的細(xì)胞是否也可以附著到具有已經(jīng)建立的血管的視網(wǎng)膜上，將Lin-HSC組合物注射到成年眼中。有趣地，沒有觀察到細(xì)胞附著到視網(wǎng)膜并摻入建立的、正常的視網(wǎng)膜血管(附圖2(e))。這表明，本發(fā)明的Lin-HSC組合物不破壞正常發(fā)育的血管系統(tǒng)，將不會在正常發(fā)育的視網(wǎng)膜中啟動異常的血管新生。為了確定在注射的Lin—HSC組合物和視網(wǎng)膜星形細(xì)胞之間的關(guān)系，使用轉(zhuǎn)基因小鼠，其表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白(GFAP，星形細(xì)胞的標(biāo)志物)和啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白(GFP)。用來自eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的LirTHSC注射的這些GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜的檢查表明了注射的eGFPEPC與現(xiàn)存星形細(xì)胞的共同定位(附圖2(f-h)箭頭)。eGFP+LirTHSC的步驟被觀察到符合底層的星形細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(箭頭，附圖2(g))。這些眼的檢查表明，注射的、標(biāo)記細(xì)胞僅僅附著于星形細(xì)胞；在P6小鼠視網(wǎng)膜中，視網(wǎng)膜外周部還沒有內(nèi)源的血管，注射的細(xì)胞被觀察到在這些尚為血管化的區(qū)域中附著于星形細(xì)胞。令人驚訝地，在視網(wǎng)膜的更深層中在精確的位置觀察到注射的、標(biāo)記的細(xì)胞，在此正常的視網(wǎng)膜的血管將隨后發(fā)展(附圖2(i),箭頭)。為了確定注射Lin-HSC是否穩(wěn)定地?fù)饺氚l(fā)展中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，在以后的幾個時點(diǎn)檢查視網(wǎng)膜的血管。早在P9(注射后七天)，Lin—HSC就摻入到CD31+結(jié)構(gòu)中(附圖2(j))。到P16(注射后14天)，細(xì)胞已經(jīng)廣泛地?fù)饺氲揭暰W(wǎng)膜的血管樣結(jié)構(gòu)中(附圖2(k))。當(dāng)在處死動物之前眼內(nèi)注射羅丹明-葡聚糖時(來鑒定功能性的視網(wǎng)膜血管)，大部分Lm-HSC沿著顯箸的血管排列(附圖2(j))。觀察到兩種圖型的標(biāo)記細(xì)胞分布(l)在一個圖型中，細(xì)胞沿著血管在未標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞中間散布，以及(2)另一個圖型顯示了血管完全由標(biāo)記的細(xì)胞組成。注射的細(xì)胞還摻入到深部血管叢的血管中(附圖2(m))。雖然早先已經(jīng)報(bào)道了LirTHSC衍生的EPC對新血管系統(tǒng)的零星摻入，這是血管網(wǎng)絡(luò)完全由這些細(xì)胞組成的首次報(bào)道。這表明，眼內(nèi)注射的、來自骨髓衍生的LiiTHSC的群體的細(xì)胞可以有效地^參入到成形中的^L網(wǎng)膜血管叢的任何層中。當(dāng)在眼內(nèi)注射達(dá)5或10天之后，非視網(wǎng)膜組織(例如，腦、肝臟、心臟、肺、骨髓)的組織學(xué)檢查沒有顯示任何GFP陽性細(xì)胞的存在。這表明，Lm-HSC級分內(nèi)的細(xì)胞亞群選擇性地乾向視網(wǎng)膜星形細(xì)胞并且穩(wěn)定地?fù)饺氚l(fā)育中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。由于這些細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞的許多特征(與視網(wǎng)膜星形細(xì)胞相關(guān)，長形的形態(tài)，穩(wěn)定地?fù)饺朊黠@的血管并且不在血管外的位置出現(xiàn))，這些細(xì)胞代表了在Lin-HSC群體中存在的EPC。被靶向的星形細(xì)胞是在許多低氧視網(wǎng)膜病中觀察到的相同類型。公知的是，膠質(zhì)細(xì)胞是在DR和其他形式的視網(wǎng)膜損傷中觀察到的叢的新血管蕨葉的主要成分。在活性神經(jīng)膠質(zhì)增生和缺血誘導(dǎo)的新血管形成的狀況下，活化的星形細(xì)胞增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子并且增量調(diào)節(jié)GFAP,類似于在許多哺乳動物物種包括人類中在新生兒牙見網(wǎng)膜血管模板形成期間所觀察到的。Lin-HSC群體在成年小鼠眼中將如同在新生兒眼中一樣靶向活化的星形細(xì)胞，將Lin-HSC細(xì)胞注射到具有被光凝結(jié)(附圖3(a))或針尖(附圖3(b)損傷的視網(wǎng)膜的成年眼中。在兩種模型中，僅在損傷位點(diǎn)周圍觀察到具有顯著GFAP染色的細(xì)胞顯著的(附圖3(a和b))。來自注射的Lin-HSC組合物的細(xì)胞定位到損傷位點(diǎn)并保持了與GFAP陽性星形細(xì)胞的特異性相關(guān)(附圖3(a和b))。在這些位點(diǎn)，還觀察到Lm-HSC細(xì)胞以類似于在深部視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的新生形成期間觀察到的水平遷移到視網(wǎng)膜的更深層。未受損的視網(wǎng)膜部分不含有Lin-HSC細(xì)胞，與當(dāng)Lin-HSC被注射到正常的未受損成年視網(wǎng)膜中觀察到的向(附圖2(e))。這些數(shù)據(jù)表明，Lin-HSC組合物可以在具有神經(jīng)膠質(zhì)增生的受損成年視網(wǎng)膜中以及經(jīng)歷血管新生的新生視網(wǎng)膜中選擇性地耙向膠質(zhì)活化的膠質(zhì)細(xì)胞。眼內(nèi)注射的LinHSC可以援救和穩(wěn)定退化的血管系統(tǒng)由于眼內(nèi)注射的Lin-HSC組合物耙向星形細(xì)胞并摻入到正常的一見網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中，這些細(xì)胞在與神經(jīng)膠質(zhì)增生和血管退化相關(guān)的缺血性或退化性視網(wǎng)膜疾病中也穩(wěn)定了退化的血管系統(tǒng)。W/ra小鼠是視網(wǎng)膜退化的模型，其在出生后一個月展現(xiàn)了光受體和視網(wǎng)膜血管層的深度退化。這些小鼠中的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)通常發(fā)展直到P16,此時更深的血管叢退化；在大多數(shù)小鼠中，深部的和中間叢到P30幾乎完全退化。為了確定HSC是否可以援救退化的血管，Lm+或Lm—HSC(來自Balb/c小鼠)在P6目艮內(nèi)注射到W/廠J小鼠中。到P33,在用Lin+細(xì)胞注射后，深部視網(wǎng)膜層的血管幾乎完全缺失(附圖4(a和b))。相比之下，到P33大多數(shù)Lin-HSC注射的視網(wǎng)膜具有幾乎正常的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，具有三個平行的、良好形成的血管層(附圖4(a和b))。這種效果的定量表明，在Lm—注射的W/k/眼中深部血管叢的血管平均長度是未處理的或Lin+細(xì)胞處理的眼中的幾乎三倍(附圖4(e))。令人驚訝地，來自成年小鼠(FVB/N)骨髓的Lin-HSC組合物的注射也援救了退化的W/W新生小鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)(附圖4(f))。小鼠眼中血管系統(tǒng)的退化早在出生后2-3周被觀察到。遲至P15注射Lin-HSC在W/W小鼠中也引起了退化的血管系統(tǒng)的部分穩(wěn)定達(dá)至少一個月(附圖4(g和h))。注射到較年輕的(例如，P2)W/raM、鼠中的Lin-HSC組合物也摻入到發(fā)育中的表面血管系統(tǒng)內(nèi)。到Pll，觀察到這些細(xì)胞遷移到深部血管叢的水平并形成與在野生型的外視網(wǎng)膜血管層中觀察的相同的圖型(附圖5(a))。為了更清楚地說明細(xì)胞從注射的Lin—HSC組合物摻入到并且穩(wěn)定W/raM、鼠中退化的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的方式，來自Balb/c小鼠的Lin-HSC組合物被注射到Tie-2-GFPFVB小鼠眼中。FVB小鼠具有W/W基因型并且由于它們表達(dá)融合蛋白Tie-2-GFP,所有的內(nèi)源血管是熒光的。當(dāng)來自Lin-HSC組合物的未標(biāo)記的細(xì)胞被注射到新生兒Tie-2-GFPFVB眼中并隨后摻入到發(fā)育的血管系統(tǒng)中時，在內(nèi)源的、Tie-2-GFP標(biāo)記的血管中將有未標(biāo)記的缺口，其相應(yīng)于注射的摻入的、未標(biāo)記的LiifHSC。隨后用另一中血管標(biāo)志物(例如，CD-31)染色則描繪了整個血管，允許確定非內(nèi)源的內(nèi)皮細(xì)胞是否是血管系統(tǒng)的部分。注射后兩個月，在用Lm-HSC組合物注射的眼的視網(wǎng)膜中觀察到CD31陽性的、Tie-2-GFP陰性的血管(附圖5(b))。有趣地，大部分援救的血管含有Tie-2-GFP陽性細(xì)胞(附圖5(c))。通過對平滑肌肌動蛋白的染色確定的，外膜細(xì)胞的分布沒有被Lm-HSC注射改變，無論是否存在血管援救(附圖5(d))。這數(shù)據(jù)清楚地表明，眼內(nèi)注射的Lin—HSC細(xì)胞遷移到視網(wǎng)膜中，參與正常視網(wǎng)膜血管的形成，并且在遺傳缺陷的小鼠中穩(wěn)定內(nèi)源的退化血管系統(tǒng)。來自Lin-HSC的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對視網(wǎng)膜血管生成的抑制作用大部分視網(wǎng)膜血管疾病涉及異常的血管增殖而不是退化。靶向星形細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以用于釋放抗血管生成蛋白質(zhì)并抑制血管生成。來自Lin-HSC組合物的細(xì)胞用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)轉(zhuǎn)染。T2-TrpRS是TrpRS的43kD片段，其強(qiáng)力地抑制視網(wǎng)膜血管生成(附圖6(a)和附圖34)。在P12,在P2用對照質(zhì)粒(無T2-TrpRS基因)轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物注射的眼的視網(wǎng)膜具有正常的原發(fā)(附圖6(c))和繼發(fā)(附圖6(d))的視網(wǎng)膜血管叢。當(dāng)T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的本發(fā)明的Lin-HSC組合物被注射到P2眼中并在10天后評估時，原發(fā)網(wǎng)絡(luò)具有顯著的異常(附圖6(e))，深部視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的形成被幾乎完全地抑制(附圖6(f))。在這些眼中觀察到的少數(shù)血管被顯著地衰減，在血管之間具有大的缺口。分泌T2-TrpRS的LinHSC的抑制作用程度在表1中詳述。T2-TrpRS通過Lin-HSC組合物中的細(xì)胞在體外產(chǎn)生和分泌，在將這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞注射到玻璃體中之后，在視網(wǎng)膜中觀察到T2-TrpRS的30kD片段(附圖6(b))。這種30kD片段僅在用轉(zhuǎn)染的Lin—HSC注射的視網(wǎng)膜中特異性地觀察到，與重組的或體外合成的蛋白質(zhì)相比表觀分子量的降低可能是由于T2-TrpRS的體內(nèi)加工或降解。這些數(shù)據(jù)表明，Lin—HSC組合物可以用于通過靶向活化的星形細(xì)胞將功能上活性的基因，例如表達(dá)血管靜止分子的基因釋放到視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中。雖然有可能觀察到的血管靜止效果是由于細(xì)胞介導(dǎo)的活性，這是很不可能的，因?yàn)橛孟嗤摹⒌从肨2轉(zhuǎn)染的Lm-HSC組合物處理的眼具有正常的—見網(wǎng)膜血管系統(tǒng)。表1.分泌T2-TrpRS的LirVHSC的血管抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>眼內(nèi)注射的Lin-HSC群體定位到視網(wǎng)膜星形細(xì)胞上，摻入到血管中，并且在治療許多視網(wǎng)膜疾病中是有用的。雖然來自注射的HSC組合物的大多數(shù)細(xì)胞附著于星形細(xì)胞模板上，少量的細(xì)胞深部遷移到視網(wǎng)膜內(nèi)，導(dǎo)向到隨后將發(fā)育深部血管網(wǎng)絡(luò)的區(qū)域。盡管在出生后42天之前在這個區(qū)域中沒有觀察到GFAP陽性細(xì)胞，這不能排除已經(jīng)存在GFAP陰性膠質(zhì)細(xì)胞來提供用于Lm-HSC定位的信號的可能性。早先的研究顯示了許多疾病與反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生相關(guān)。特別是，在DR中，膠質(zhì)細(xì)胞和它們的細(xì)胞外基質(zhì)與病理性血管生成相關(guān)。由于來自注射的Lin-HSC組合物的細(xì)胞特異性地附著于表達(dá)GFAP的膠質(zhì)細(xì)胞，無論損傷的類型，本發(fā)明的Lin—HSC組合物可以用于靶向視網(wǎng)膜中的前血管生成病變。例如，在缺血性的視網(wǎng)膜病，例如糖尿病中，新血管形成是對缺氧的響應(yīng)。通過將Lin-HSC組合物靶向到病理性新血管形成的位點(diǎn)，發(fā)育中的新血管系統(tǒng)可以被穩(wěn)定，防止新血管系統(tǒng)的異常，例如出血或水腫(與DR相關(guān)的視力損失的原因)，并且可以潛在地減輕最初刺激新血管形成的缺氧。異常的血管可以恢復(fù)到標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)。此外，通過使用轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物和激光誘導(dǎo)的星形細(xì)胞活化，血管靜止蛋白，例如T2-TrpRS(附圖34中的SEQIDNO:3)、T2-TrpRS-GD(附圖34中的SEQIDNO:4)、mini-TrpRS(附圖35中的SEQIDNO:5)和Tl-TrpRS(附圖36中的SEQIDNO:6)可以被遞送到病理性血管生成的位點(diǎn)。優(yōu)選的TrpRS的血管靜止片段包括T2-TrpRS和T2-TrpRS-GD。由于激光凝結(jié)通常被用于臨床的眼科醫(yī)學(xué)，這種方法對于許多視網(wǎng)膜疾病具有應(yīng)用性。雖然已經(jīng)在癌癥治療中探索了這種基于細(xì)胞的方法，它們對于眼疾病的用途是更有益的，因?yàn)檠矍騼?nèi)注射使得向疾病位點(diǎn)直接遞送大量細(xì)胞成為可臺匕s匕。Lm-HSC的神經(jīng)營養(yǎng)和血管營養(yǎng)援救MACS被用于從如上所述的增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì)(eGFP)、C3H(W/W)、FVB(W//^)小鼠的骨髓分離Lin-HSC。來自這些小鼠的含有EPC的Lin-HSC被眼內(nèi)注射到P6C3H或FVB小鼠眼中。在注射后各個時點(diǎn)(1個月、2個約和6個月)收集視網(wǎng)膜。在用針對CD31的抗體染色和用DAPI的核染色之后的視網(wǎng)膜組織學(xué)之后，通過掃描激光共焦顯微鏡來分析血管系統(tǒng)。還在各個時點(diǎn)對來自視網(wǎng)膜的mRNA使用微陣列基因表達(dá)分析來鑒定潛在地涉及所述效果的基因。到P21,W/>y/小鼠的眼具有感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的深度退化。在P6用LirfHSC處理的W/k/小鼠的眼維持了正常的碎見網(wǎng)膜血管系統(tǒng)長達(dá)6個月；在所有的時點(diǎn)(1M、2M和6M)與對照相比時，深部層和中間層都被顯著地改善了(參見，附圖12)。此外，我們觀察到，相對于作為對照用Lin+HSC處理的眼，用Lm-HSC處理的視網(wǎng)膜也更厚(IM:1.2倍，2M:1.3倍，6M:1.4倍)，并且在外核層中具有更多數(shù)量的細(xì)胞(1M:2.2倍，2M:3.7倍，6M:5.7倍)。與對照(未處理的或非Lin—HSC處理的)W/W視網(wǎng)膜相比，"援救的"(例如，Lin—HSC)視網(wǎng)膜的大規(guī)?；蚪M分析表明，編碼sHSPs(小熱激蛋白)和與血管和神經(jīng)援救相關(guān)的特異性生長因子的基因顯著增量調(diào)節(jié)，包括編碼附圖20，畫面A和B中列出的蛋白質(zhì)的基因。骨髓衍生的Lin—HSC群體顯著地以及可再生地誘導(dǎo)正常血管系統(tǒng)的維持，并顯著地提高小鼠中的光受體和其他神經(jīng)元細(xì)胞層。這種神經(jīng)營養(yǎng)的援救有效果小熱激蛋白和生長因子的顯著增量調(diào)節(jié)相關(guān)，并且提供了對當(dāng)前不可治療的視網(wǎng)膜退化失調(diào)的治療方法的預(yù)見。^///ra7小鼠視網(wǎng)膜展現(xiàn)了深度的血管和神經(jīng)元退化小鼠中正常的出生后視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元發(fā)育已經(jīng)被很好地描述了，類似于在三個月的人類胎兒中觀察到的變化(Dorrell等人.2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43:3500-3510)。W/基因的小鼠純合體享有人類視網(wǎng)膜退化的許多特征(Frasson等人，1999，A^,.A^t/.5:1183-1187),并且作為在編碼PRcGMP磷酸二酯酶的基因中的突變的結(jié)果(Bowes等人.1990,Nature347:677-680)展現(xiàn)了伴有嚴(yán)重血管萎縮的快速光受體(PR)損失。為了檢查視網(wǎng)膜發(fā)育期間的血管系統(tǒng)和其隨后的退化，使用針對膠原IV(CIV)、成熟血管系統(tǒng)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31(PECAM-1)的抗體(附圖15)。W〃W/(C3H/HeJ)的視網(wǎng)膜通常直到大約出生后8天(P)發(fā)育，此時開始了含有光受體的外核層(ONL)的退化。ONL快速地退化，細(xì)胞由于細(xì)胞凋亡死亡，使得到P20僅保留了單層的核。使用針對CIV和CD31的抗體對完整固定的視網(wǎng)膜的雙染色顯示了在W〃/y//小鼠中血管退化的細(xì)節(jié)類似于他人描述的(Blanksetah,1986,J.Comp.Neurol.254:543-553)。原發(fā)和深部視網(wǎng)膜血管層看起來正常發(fā)育到P12,之后存在著內(nèi)皮細(xì)胞的快速損失，由CD31染色的缺少所證明。CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞處于正常分布直到P12，但之后快速地消失。有趣地，CIV陽性染色在整個檢查的時點(diǎn)期間保持存在，表明血管和相關(guān)的ECM正常地形成，但僅僅是基質(zhì)保持到P13之后，此時觀察不到CD31卩日性細(xì)胞。(附圖15,中間畫面)。在P21之后中間媒介也退化，但是進(jìn)展慢于在深部叢中觀察到的(附圖15,上部畫面)。顯示了正常小鼠的視網(wǎng)血管和神經(jīng)細(xì)胞層用于同W〃W/小鼠比較(右側(cè)畫面，附圖15)。在W〃ra7小鼠中骨髓衍生的Lin—HSC的神經(jīng)保護(hù)效果眼內(nèi)注射的Lin-HSC摻入到所有三個血管叢的內(nèi)源碎見網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中，并防止血管退化。有趣地，注射的細(xì)胞實(shí)際上從未在外核層中觀察到。這些細(xì)胞要么摻入到形成中的視網(wǎng)膜血管，或被觀察到非常接近于這些血管。在退化即將發(fā)生之前，在P6將鼠的Lin-HSC(來自C3H/HeJ)眼內(nèi)注射到C3H/HeJ(ra7緒)小鼠眼中。到P30,對照細(xì)胞(CD3r)重注射的眼展現(xiàn)了典型的表型，即，在每個檢查的視網(wǎng)膜中觀察到深部血管叢和ONL的幾乎完全的退化。用Lin—HSC注射的眼維持了正常外觀的中間和深部血管叢。令人驚訝地，與對照細(xì)胞注射的眼相比，在Lin-HSC注射的眼的中間核層(INL)和ONL中觀察到顯著更多的細(xì)胞。Lm-HSC的這種援救效果在注射后2個月觀察到(附圖16(B)),并持續(xù)長達(dá)注射后6個月(附圖16(C))。當(dāng)比較援救和非援救的眼時，在Lin-HSC注射的眼的中間和深部叢的血管系統(tǒng)中，以及含有神經(jīng)元細(xì)胞的INL和ONL的血管系統(tǒng)中的差異，在所有測量的時點(diǎn)是顯著的(附圖16(B和C))。通過測量血管系統(tǒng)的總長度(附圖16(D))和計(jì)數(shù)ONL中觀察到的DAPI陽性細(xì)胞核的數(shù)目(附圖16(E))來定量這種效果。將單元線性回歸分析應(yīng)用于所有時點(diǎn)的數(shù)據(jù)。在LirrHSC注射的眼中在P30(p<0.024)和P60(p<0.034)觀察到血管援救和神經(jīng)元(例如，ONL厚度)援救之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性(附圖16(F))。相關(guān)性保持很好，而當(dāng)比較Lm-HSC注射的視網(wǎng)膜與對照細(xì)胞注射的視網(wǎng)膜時在P180不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p<0.14)(附圖16(F))。相比之下，對照細(xì)胞注射的視網(wǎng)膜顯示了在任何時點(diǎn)血管系統(tǒng)和ONL的保存之間沒有顯著相關(guān)性(附圖16(F))。這些數(shù)據(jù)表明，Lm-HSC的眼內(nèi)注射在WMy//小鼠的視網(wǎng)膜中產(chǎn)生了相伴的視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元援救。在ONL中，或在處理視網(wǎng)膜血管內(nèi)或接近一見網(wǎng)膜血管的任何地方，沒有觀察到注射的細(xì)胞。Lm—HSC注射的W/k/視網(wǎng)膜的功能性援救對注射對照細(xì)胞或鼠Lm-HSC2個月后的小鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖(ERG)(附圖17))。使用ERG記錄之后的每個眼進(jìn)行免疫組織化學(xué)和顯微分析來確認(rèn)出現(xiàn)了血管和神經(jīng)元援救。來自治療的、援救的和對照非援救眼的代表性ERG記錄顯示，在援救的眼中，數(shù)學(xué)減扣的信號(處理的減去未處理的眼)產(chǎn)生了振幅跟…相似的8-10孩i伏的清楚的可檢測信號(附圖17)。清楚地，來自兩只眼的信號都是嚴(yán)重地異常的。然而，從Lin—HSC處理的眼可以記錄一致的和可檢測的ERG。在所有情況下，來自對照眼的ERG是不可檢測的。雖然在援救的眼中信號的振幅顯著地低于正常的眼，每當(dāng)存在組織學(xué)上的援救時信號被一致性地觀察到，并且處于其他的基于基因的援救研究所報(bào)道的數(shù)量級上?？偟恼f來，這些結(jié)果是用Lin—HSC處理的眼中一定程度的功能性援救的證明。援救的/W/W視網(wǎng)膜細(xì)胞類型主要是錐體使用特異于rod或錐體視蛋白的抗體免疫組織化學(xué)地分析援救的和未援救的視網(wǎng)膜。在附圖17中出現(xiàn)的用于ERG記錄的相同的眼用于rod或錐體視蛋白分析。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中，存在的光受體的少于約5%是錐體(Soucy等人.1998,Neuron21:481-493)，用附圖25(A)中所示紅色/綠色錐體視蛋白或附圖25(B)中所示rod視紫紅質(zhì)觀察到的免疫組織化學(xué)染色圖型與推體細(xì)胞的這種百分比一致。當(dāng)用預(yù)免疫IgG染色野生型視網(wǎng)膜時，除了血管的自體熒光之外，在感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜中的任何地方都沒有觀察到染色(附圖25(C))。出生后兩個月，未注射的n/Z^小鼠的視網(wǎng)膜具有實(shí)質(zhì)上萎縮的外核層，其不展現(xiàn)出使用針對紅綠錐體視蛋白(附圖25(D))或視紫紅質(zhì)(附圖25(G))抗體的任何染色。對于錐體(附圖25(E))或rod(附圖25(H))視蛋白，用對照CD31-HSC注射的眼也沒有被陽性地染色。相比之下，用Lin-HSC注射的對側(cè)眼在保留的外核層中具有約3到約8行的核；大多數(shù)這些細(xì)胞對于錐體視蛋白(附圖25(F))是陽性的，具有rod視蛋白的約1-3%的陽性(附圖25(I))。顯著地，這與通常在正常小鼠視網(wǎng)膜中觀察的幾乎相反，其是rod占主導(dǎo)的。這些數(shù)據(jù)表明，Lm-HSC的注射保持了錐體持續(xù)延長的時間，通常在這期間它們將退化。人類骨髓(hBM)衍生的Lin—HSC也援救退化中的視網(wǎng)膜從人類骨髓分離的Lm—HSC與鼠的Lin—HSC表現(xiàn)類似。從人類供體收集骨髓，耗盡Lin+HSC,產(chǎn)生人類Lm-HSC的群體(hLm-HSC)。用熒光染料體外標(biāo)記這些細(xì)胞，注射到C3SnSmn.CB17-尸/^cSCID小鼠眼中。以同注射鼠Lin—HSC時觀察到的相同方式，注射的hLin-HSC遷移到，并且靶向視網(wǎng)膜血管生成的位點(diǎn)(附圖18(A))。除了血管輩巴向之外，人類Lin—HSC還提供了對于W〃W/小鼠的血管和神經(jīng)元細(xì)胞層的健壯的援救效果(附圖18(B和C))。這種觀察確認(rèn)了人類人類中靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)并且可以防止視網(wǎng)膜退化的細(xì)胞的存在。在ra70/ra7(9小鼠中Lin-HSC具有親血管和神經(jīng)營養(yǎng)效果雖然WMr//小鼠是最廣泛使用的和最好地表征的視網(wǎng)膜退化模型(Chang等人.2002,VisionRes.42:517-525),對于與人類疾病中觀察到的普通的、更慢的過程來的不同來說，退化是非?？斓摹Ｔ谶@個品系中，光受體細(xì)胞約P8開始退化，此時視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)仍然快速地?cái)U(kuò)展(附圖15)。深部視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的隨后的退化甚至在中間叢仍在形成時發(fā)生，因而，ra7/W/小鼠的視網(wǎng)膜從不完全地發(fā)育，不同于在患有這種疾病的大多數(shù)人類中觀察到的。具有更慢的退化時間過程并且與人類視網(wǎng)膜退化狀況更為緊密地類似的小鼠模型被用于研究Lin-HSC介導(dǎo)的血管援救。在W/0小鼠中，光受體細(xì)胞退化在約P21開始，血管退化此后不久開始。由于正常的感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜發(fā)育主要在P21完成，觀察到退化在視網(wǎng)膜完全分化之后開始，這樣比/y/M^/小鼠模型更類似于人類視網(wǎng)膜退化。來自ra70小鼠的Lm—HSC或?qū)φ占?xì)胞被注射到P6眼中，在變動的時點(diǎn)評估視網(wǎng)膜。在P21,來自注射Lin-HSC,具有所有血管層的完全發(fā)育以及INL和ONL的正常發(fā)育(附圖18(D和H))。在大約P21,視網(wǎng)膜退化開始并隨年齡進(jìn)展。到P30，對照細(xì)胞注射的視網(wǎng)膜展現(xiàn)嚴(yán)重的血管和神經(jīng)元退化(附圖18(1)),而注射Lin—HSC的細(xì)胞維持了幾乎正常的血管層和光受體細(xì)胞(附圖18(E))。在援救的和非援救的眼之間的差異在以后的時點(diǎn)更為顯著(比較附圖18(F和G)與18(J和K))。在對照處理的眼中，血管退化的進(jìn)展通過對CD31和膠原IV的免疫組織化學(xué)染色非常清楚地觀察到(附圖18(I-K))。對照處理的眼對于CD31是幾乎完全陰性的，而膠原IV陽性血管"蹤跡，，仍然明顯，表明發(fā)生了血管退化而不是完全的血管形成。相比之下，Lin-HSC處理的眼具有CD31和膠原IV陽性血管，看起來非常類似于正常的、野生型眼(比較附圖18(F和I))。在Lin—HSC處理后的^//n/小鼠視網(wǎng)膜的基因表達(dá)分析大規(guī)?；蚪M學(xué)(微陣列分析)被用于分析援救的和非援救的視網(wǎng)膜來鑒定推定的神經(jīng)營養(yǎng)援救介體。在用Lin-HSC處理的小鼠視網(wǎng)膜中的基因表達(dá)與未注射的視網(wǎng)膜以及用對照細(xì)胞(CD3r)注射的視網(wǎng)膜進(jìn)行比較。這些比較各自進(jìn)行三份。當(dāng)前考慮的，基因需要在所有三份中具有比背景水平高至少2倍的表達(dá)水平。與對照細(xì)胞注射的和未注射的W/raf小鼠視網(wǎng)膜相比，在LirTHSC保護(hù)的—見網(wǎng)膜中被增量調(diào)節(jié)3倍的基因在附圖20,畫面A和B中示出。通過用每種cRNA復(fù)制物的平均表達(dá)水平除標(biāo)準(zhǔn)偏差，為表達(dá)的基因計(jì)算變異系數(shù)(GOV)水平。此外，通過將平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)相關(guān)來計(jì)算表達(dá)水平和噪聲離散之間的相關(guān)性。獲得對于每個基因的基因表達(dá)水平和標(biāo)準(zhǔn)偏差之間的相關(guān)性，容許測定背景水平和可靠的表達(dá)水平閾值。總體上，數(shù)據(jù)很好地處于可接受限度內(nèi)(Tu等人.2002，尸rac.Ato/./k'ad5"c,.USA99:1403]-14036)。以下分別討論的基因展現(xiàn)了高于這些臨界表達(dá)水平的表達(dá)水平。還測定了討論的基因的配對的"t-測驗(yàn)"值。在每種情況下，p-值是合理的(接近或低于0.5),其表明在復(fù)制物之間存在相似性以及在不同的測試組之間存在可能的顯著差異。許多顯著地增量調(diào)節(jié)的基因，包括MAD和YmgYang-l(YY-1)(Austen等人.1997，Curr.Top.Microbiol.Immunol.224:123-130.)編碼了具有有關(guān)保護(hù)細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡的功能的蛋白質(zhì)。許多晶狀體蛋白基因，其具有與涉及保護(hù)細(xì)胞免于逆境的已知熱激蛋白的序列同源性和類似功能，也通過Lin—HSC處理被增量調(diào)節(jié)。cc-晶狀體蛋白的表達(dá)通過免疫組織化學(xué)分析被定位在ONL上(附圖19)。附圖19顯示了晶狀體蛋白aA在用Lm-HSC處理后援救的外核層細(xì)胞中，而不是在用對照細(xì)胞處理的對側(cè)眼中被增量調(diào)節(jié)。左側(cè)畫面顯示了在4爰救的#見網(wǎng)膜中的IgG染色(對照)。中間畫面顯示了在援救的視網(wǎng)膜中的ocA。右側(cè)畫面顯示了在非援救的視網(wǎng)膜中的晶狀體蛋白aA。來自用人類Lin-HSC援救的ra7/ra7小鼠視網(wǎng)膜的信使RNA與人類特異性AffymetnxU133A微陣列芯片雜交。在嚴(yán)格的分析之后，在背景之上發(fā)現(xiàn)許多基因，其mRNA表達(dá)是人類特異性的，并且與鼠Lm—HSC援救的視網(wǎng)膜和人類對照細(xì)胞注射的非援救的視網(wǎng)膜相比，在人類Lin-HSC援救的視網(wǎng)膜中顯著更高(附圖20，畫面C)。在原始的和新近分化的CD34+造血干細(xì)胞的表面上表達(dá)的細(xì)胞粘附分子CD6,以及由造血干細(xì)胞的另一個基因表達(dá)的干擾素oc13,都被微陣列生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，驗(yàn)證了評估方案。此外，幾種生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子被人類Lin-HSC援救的小鼠視網(wǎng)膜樣品高于背景地表達(dá)(附圖20，畫面D)。用于譜系確認(rèn)的造血細(xì)胞的標(biāo)志物被用于消極選擇含有EPC的骨髓衍生的Lin-HSC群體。雖然充當(dāng)EPC的骨髓衍生的Lin-HSC的亞群不由通常使用的細(xì)胞表面標(biāo)志物表征，這些細(xì)胞在發(fā)育或受損的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)中的行為完全不同于Lin+或成年內(nèi)皮細(xì)胞群體所觀察到的。這些細(xì)胞選擇性地靶向視網(wǎng)膜血管生成的位點(diǎn)并且參與明顯血管的形成。遺傳的視網(wǎng)膜退行性疾病通常與視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的損失相伴。這種疾病的有效治療需要功能的恢復(fù)以及復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)的維持。雖然一些近來的研究探索了使用營養(yǎng)因子的基于細(xì)胞的遞送或干細(xì)胞本身，這兩者的組合可能是必需的。例如，生長因子療法來治療視網(wǎng)膜退化疾病產(chǎn)生了血管的不受調(diào)節(jié)的過度生長，引起對正常視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞。使用神經(jīng)或視網(wǎng)膜千細(xì)胞來治療視網(wǎng)膜退化性疾病可能恢復(fù)神經(jīng)元功能，。將來自Lm-HSC群體的細(xì)胞摻入到小鼠的視網(wǎng)膜血管中穩(wěn)定了退化的血管系統(tǒng)而不破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞注射到P15W/W小鼠中時，也觀察到這種^爰救效果。由于血管退化在W/rt/小鼠中在P16開始，這種觀察擴(kuò)展了有效的Lm—HSC治療的治療窗口。在用Lm-HSC注射的眼中，視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光受體被保持，視覺功能被維持。當(dāng)眼內(nèi)注射到患有視網(wǎng)膜退化性疾病的小鼠種時，成年骨髓衍生的Lin—HSC細(xì)胞產(chǎn)生深度的親血管和神經(jīng)營養(yǎng)效果。這種援救效果存續(xù)直到處理后的6個月，成年骨髓衍生的Lin-HSC細(xì)胞產(chǎn)生深度的親血管和神經(jīng)營養(yǎng)效果。這種援救效果存續(xù)直到處理后的6個月，當(dāng)在完全的視網(wǎng)膜退化之前注射Lm-HSC時是最有效的(在小鼠中直到出生后16天，小鼠通常在出生后30天展現(xiàn)完全的視網(wǎng)膜退化)。在兩種小鼠視網(wǎng)膜退化模型中觀察到這種援救，顯著地，當(dāng)接受者是患有視網(wǎng)膜退化的免疫缺陷的嚙齒動物(例如，SCID小鼠)或當(dāng)供體是患有視網(wǎng)膜退化的小鼠時，可以使用成年人類骨髓衍生的HSC實(shí)現(xiàn)。雖然幾個新近的報(bào)導(dǎo)已經(jīng)描述了在使用野生型基因的基于病毒的基因援救之后在患有視網(wǎng)膜退化的小鼠或犬中的部分表型援救(Ali,等人.2000,NatGenet25:306-310;Takahashi等人.1999，J.Virol.73:7812-7816;Aclanderal.2001,Nat.Genet28:92-95.),本發(fā)明是首次通過血管援救實(shí)現(xiàn)的一般性基于細(xì)胞的治療效果。因而，在具有超過100個已知的相關(guān)突變的一組疾病(例如，色素性視網(wǎng)膜炎)的治療中這種方法的潛在實(shí)用性將比產(chǎn)生單個基因療法來治療各種已知的突變更為實(shí)用。神經(jīng)營養(yǎng)援救效果的精確的分子基礎(chǔ)仍然是未知的，但僅當(dāng)存在伴隨的血管穩(wěn)定/援救時被觀察到。注射的干細(xì)胞的存在本身不足以產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)援救，在外核層中干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元的明確缺乏排除了注射的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成光受體的可能性。微陣列基因表達(dá)分析獲得的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了已知具有抗細(xì)胞凋亡效果的基因的顯著增量調(diào)節(jié)。由于在視網(wǎng)膜退化中觀察到的大部神經(jīng)元死亡是通過細(xì)胞凋亡的，這種保護(hù)在延長光受體以及對于這些疾病中的視覺功能關(guān)鍵的其他神經(jīng)元的壽命方面是有很大的治療效益的。C-myc是通過各種下游的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子參與細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子。在W//^小鼠中C-myc表達(dá)被提高到野生型中的4.5倍，表明與在W〃W/小鼠中觀察到的光受體退化的潛在聯(lián)系。在LiiTHSC保護(hù)的視網(wǎng)膜中顯著地增量調(diào)節(jié)(附圖20，畫面A)的兩種基因Madl和YY-1,已知抑制c-myc的活性，因而抑制c-myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Madl的過量表達(dá)還顯示了抑制caspase-8的Fas誘導(dǎo)的活化，caspase-8是細(xì)胞凋亡途徑的另一個關(guān)鍵成分。通過防止通常在ra^Y/小鼠中引起退化的細(xì)胞凋亡啟動，這兩種分子的增量調(diào)節(jié)可能在保護(hù)視網(wǎng)膜免于血管和神經(jīng)退化方面起到了作用。在Lin-HSC保護(hù)的視網(wǎng)膜中大大地增量調(diào)節(jié)的另一組基因包括晶狀體蛋白家族的成員(附圖20，畫面B)。類似于熱激蛋白和其他逆境誘導(dǎo)的蛋白，晶狀體蛋白可以通過視網(wǎng)膜逆境活化，并且提供了針對細(xì)胞凋亡的保護(hù)效果。晶狀體蛋白ccA的異常低的表達(dá)與視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的大鼠模型中光受體損失有關(guān)，新近在W/W小鼠的視網(wǎng)膜中的蛋白組分析展現(xiàn)了響應(yīng)于視網(wǎng)膜退化的晶狀體蛋白增量調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)。根據(jù)我們的EPC援救的小鼠視網(wǎng)膜的微陣列數(shù)據(jù)，晶狀體蛋白的增量調(diào)節(jié)看起來在EPC階段的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)中起到關(guān)鍵作用。例如c-myc、Madl、Yx-l和晶狀體-蛋白的基因可能是神經(jīng)元援救的下游介體。神經(jīng)營養(yǎng)試劑可以調(diào)節(jié)抗細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，而我們的用小鼠干細(xì)胞援救的視網(wǎng)膜的微陣列分析沒有展示誘導(dǎo)已知神經(jīng)營養(yǎng)因子的提高的水平。在另一方面，使用人類特異性芯片對人類骨髓衍生的干細(xì)胞介導(dǎo)的援救的分析確實(shí)展現(xiàn)了在多種生長因子基因的表達(dá)方面很低的、但是顯著的提高。增量調(diào)節(jié)的基因包括成纖維細(xì)胞生長因子家族和otoferlin的幾個成員。在otoferlin基因中的突變與由于聽覺神經(jīng)病引起耳聾的遺傳性紊亂相關(guān)?？赡艿氖?，注射的Lin-HSC的otoferlin產(chǎn)生對視網(wǎng)膜神經(jīng)的保護(hù)也起到貢獻(xiàn)。歷史上，長期假定的是，在患有視網(wǎng)膜退化的患者和動物中觀察到的血管變化是繼發(fā)于光受體死亡的降低的代謝需求的。當(dāng)前的數(shù)據(jù)表明，至少對于患有遺傳性視網(wǎng)膜退化的小鼠來說，保持正常的血管系統(tǒng)也可以幫助維持外核層的成分。文獻(xiàn)中新近的報(bào)道證明了組織特異性血管系統(tǒng)具有營養(yǎng)效果的觀念，其超出了根據(jù)僅提供血管"營養(yǎng)，，所預(yù)期的。例如，VEGFR1活化后產(chǎn)生生長因子，所述生長因子對于面對肝損傷時的肝細(xì)胞再生和維持是關(guān)鍵的(LeCouter等人.2003,Science299:890-893)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞和鄰近的肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間類似的指示性相互作用被報(bào)道涉及肝臟器官發(fā)生，遠(yuǎn)在功能性血管的形成之前。在患有視網(wǎng)膜退化的個體中內(nèi)源性視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)可能不能促進(jìn)如此顯著的援救，但是如果這種血管系統(tǒng)被來自骨髓造血干細(xì)胞群體的內(nèi)皮祖代支撐，它們可能產(chǎn)生對于退化更有抗性的血管系統(tǒng)，并且同時促進(jìn)視網(wǎng)的神經(jīng)以及血管的存活。在患有視網(wǎng)膜退化的人類中，延遲完全視網(wǎng)膜退化的發(fā)作可以提供數(shù)年的額外的視力。用Lm-HSC處理的動物具有ERG的顯箸保持，其足以支持視覺。臨床上，廣泛理解的是，可以存在實(shí)質(zhì)上的光受體和其他神經(jīng)元損失而仍然保持功能性的視力。在某個點(diǎn)上，臨界閾值被跨越，視力喪失。由于幾乎所有的人類遺傳性視網(wǎng)膜退化是早期的但是緩慢的發(fā)作，患有視網(wǎng)膜退化的個體可以被鑒定，并用本發(fā)明的自體骨髓干細(xì)胞的移植來眼內(nèi)地治療以延遲視網(wǎng)膜退化和相伴的^L力損失。為了增強(qiáng)本發(fā)明的干細(xì)胞的靶向和摻入，活化的星形細(xì)胞的存在是期望的(Otani等人，2002,Nat.Med.8:1004-1010);這可以伴隨有存在相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)增生時的早期治療，或伴隨有使用激光來刺激活化的星形細(xì)胞的局部增殖。任選的，可以使用在眼球內(nèi)注射之前用一種或多種神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)對干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染來增強(qiáng)援救效果。這種方法可以應(yīng)用于治療其他的視覺神經(jīng)退化失調(diào)，例如青光眼，其中存在著視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化。來自成年骨髓的Lin-HSC群體含有EPC的群體，其可以通過靶向反應(yīng)性星形細(xì)胞并摻入到建立的模板中來促進(jìn)血管生成而不破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。在患有視網(wǎng)膜退化的眼中，Lin-HSC還提供了長期的神經(jīng)營養(yǎng)援救效果。此外，含有EPC的、遺傳修改的自體Lm-HSC組合物可以被移植到缺血性的或異常血管化的眼中，并可以穩(wěn)定地?fù)饺氲叫卵芎蜕窠?jīng)層中，并連續(xù)地局部釋放治療分子持續(xù)很長的時期。這種以生理學(xué)有意義的劑量表達(dá)藥理學(xué)試劑的基因的局部遞送，代表了治療當(dāng)前不可治療的眼睛疾病的新的范例。例如，在正常小鼠視網(wǎng)膜中的光受體主要是rod,但是在用本發(fā)明的Lin-HSC援救之后觀察到的外核層主要含有錐體。大多數(shù)遺傳性人類視網(wǎng)膜退化作為原發(fā)rod特異性缺陷的結(jié)果發(fā)生，錐體的損失被認(rèn)為是繼發(fā)于rod功能障礙的，其可能與通過rod表達(dá)的某些營養(yǎng)因子的損失有關(guān)。實(shí)施例實(shí)施例1.細(xì)胞分離和富集；鼠Lin-HSC群體A和B的制備。一般過程。所有的體內(nèi)評估根據(jù)NIH(NIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)來進(jìn)4亍，所有的i平估過一呈由Scripps研究所(TSRI,LaJolla,CA)動物照料和使用委員會(AnimalCareandUseCommittee)批準(zhǔn)。骨髓細(xì)胞從B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(^//W小鼠)或Balb/cBYJ成年小鼠(TheJacksonLaboratory,ME)提取。然后通過使用HISTOPAQUEpolysucrose梯度(Sigma，St.Louis,MO)的密度梯度分離分離單核細(xì)胞，用結(jié)合生物素的譜系組抗體(CD45、CD3、Ly-6G、CDll、TER-119、Pharmmgen,SanDiego，CA)標(biāo)記用于小鼠中的LiiV選擇使用磁力分離設(shè)備(AUTOMACS分選機(jī)，MiltenyiBiotech,Auburn,CA)從LinHSC中分離和除去譜系陽性(Lin+)細(xì)胞。產(chǎn)生的含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的Lin—HSC群體進(jìn)一步4吏用FACSTMCalibur;泉式細(xì)月包i十(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)使用以下抗體來表征PE結(jié)合的Sca-l、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，SanDiego,CA)。Tie-2-GFP骨髓細(xì)胞被用于Tie-2的表征。為了收獲成年小鼠內(nèi)皮細(xì)胞，從ACTbEGFP小鼠外科地除去系膜組織，并放入膠原酶(Worthington,Lakewood，NJ)中來消化組織，隨后使用45過濾器過濾。收集流通物并用內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(Clonetics，SanDiego,CA)孵育。通過觀察形態(tài)上圓形的外觀、用CD31mAb(Pharmingen)染色并檢查培養(yǎng)物在MATRIGELTM基質(zhì)(BecktonDickinson,FranklinLakes,NJ)中管樣結(jié)構(gòu)的形成，來確認(rèn)內(nèi)皮特征。鼠Lm-HSC群體A。從ACTbEGFP小鼠通過如上所述的一般程序提取骨髓細(xì)胞。通過FACS流式細(xì)胞計(jì)對于CD31、c-kit、Sca-l、Flk-1和Tie-2細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物來標(biāo)準(zhǔn)Lm—HSC細(xì)胞。結(jié)果在附圖1(c)中示出。約81%的Lin—HSC展現(xiàn)CD31標(biāo)志物，約70.5%的Lm-HSC展現(xiàn)c-kit標(biāo)志物，約4%的Lm-HSC展現(xiàn)Sca-l標(biāo)志物，約2.2%的Lin'HSC展現(xiàn)Flk-1標(biāo)志物，約0.91%的Lin—HSC細(xì)胞展現(xiàn)Tie畫2標(biāo)志物。相比之下，從這些骨髓細(xì)胞分離的Lin+HSC具有顯著不同的細(xì)胞標(biāo)志物分布型(即，CD31:37.4%;c-kit:20%;Sca-l:2.8%;Flk-:0.05%)。鼠Lin-HSC群體B。從Balb/C、ACTbEGFP和C3H小鼠通過如上所述的一般程序提取骨髓細(xì)胞。分析Lin—HSC細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物的存在(Sca-l、Flk-1/KDR、c-kit(CD117)、CD34、CD31和各種整聯(lián)蛋白o(hù)tl、a2、oc3、oc4、oc5、oc6、aL、cxM、av、allb、(31、P2、p3、^4、(35和卩7)。結(jié)果在表2中示出。表2.Lin-HSC群體B的表征。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實(shí)施例2.鼠模型中的細(xì)胞眼內(nèi)施用。在小鼠眼瞼中用精細(xì)刀片產(chǎn)生眼瞼裂隙來暴露P2到P6的眼球。然后使用33-規(guī)格(Hamilton,Reno,NV)針頭的注射器眼內(nèi)注射本發(fā)明的譜系陰性HSC群體A(在約0.5pl到約liul細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中約105個細(xì)胞)。實(shí)施例3.EPC轉(zhuǎn)染。使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Indianapolis,IN)才艮據(jù)廠家的方案用編碼TrpRS的片段(SEQIDNO:3)并且包括His6標(biāo)記的DNA(SEQIDNO:1,附圖7)轉(zhuǎn)染鼠Lin-HSC(群體A)。將Lin-HSC細(xì)胞(約106個細(xì)胞每ml)懸浮在含有干細(xì)胞因子(PeproTech,RockyHill,NJ)的opti—MEM⑧介質(zhì)(Invitrogen，Carlsbad,CA)中。然后添加DNA(約1)ig)和FuGENE試劑(約3pi)混合物，混合物在37。C孵育約18小時。孵育之后，洗滌并收集細(xì)胞。這個系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率通過FACS分析確認(rèn)為大約17%。通過western印跡來確認(rèn)T2-TrpRS產(chǎn)生。His6標(biāo)記的T2-TrpRS的氨基酸序列顯示為SEQIDNO:2，附圖8。實(shí)施例4.免疫組織化學(xué)和共焦分析在各個時點(diǎn)收集小鼠視網(wǎng)膜，準(zhǔn)備用于完整的固定或冷凍切片。對于完整固定，用4%多聚曱醛固定視網(wǎng)膜，在50%胎兒牛血清(FBS)和20%正常山羊血清中在室溫環(huán)境下封閉一'J、時。用初級抗體處理一見網(wǎng)膜，用二級抗體檢測。使用的初級物是抗膠原IV(Chemicon,Temecula，CA)、抗-(3-gal(Promega，Madison,WI)、抗GFAP(DakoCytomation，Carpenteria,CA)、抗oc-平滑月幾肌動蛋白(cc-SMA,DakoCytomatkm)。使用的二級抗體結(jié)合到Alexa488或594萸光標(biāo)志物(MolecularProbes，Eugene,OR)。使用MRC1024共焦顯微鏡(BIO-RAD，Hercules,CA)采集圖像。使用LASERSHARP⑧軟件(Bio-Rad)來創(chuàng)造三維圖像檢查完整固定視網(wǎng)膜中三個不同血管層的發(fā)育。由共焦顯微術(shù)辨別出的、在增強(qiáng)的GFP(eGFP)小鼠和GFAP/wtGFP小鼠之間GFP像素強(qiáng)度中的差異，被利用來產(chǎn)生3維圖實(shí)施例5.小鼠中的體內(nèi)視網(wǎng)膜血管生成定量分析。對于T2-TrpRS分析，從小鼠視網(wǎng)膜的三維圖像重建原發(fā)和深部叢。原發(fā)叢被分成兩種類型正常發(fā)育，或停止的血管發(fā)展。深部血管發(fā)育的抑制的種類基于包括以下指標(biāo)的血管抑制作用百分比來分析深部叢形成的完全抑制被標(biāo)記為"完全的"，正常的血管發(fā)育(包括低于25%的抑制作用)被標(biāo)記為"正常的"，其他的標(biāo)記為"部分的"。對于W/W小鼠援救數(shù)據(jù)，每個完整的固定視網(wǎng)膜中四個獨(dú)立區(qū)域的深部叢使用10x透鏡來捕獲。對每個圖像計(jì)算血管系統(tǒng)總長度，匯總并在各組之間比較。為了獲得精確的信息，將Lm-HSC注射到一只眼中，Lm+HSC注射到同一小鼠的另一只眼中。未注射的對照視網(wǎng)膜采自同窩小鼠。實(shí)施例6.成年視網(wǎng)膜損傷鼠模型使用二極管激光器(150mW，1秒，50mm)或通過用27規(guī)格針頭刺穿小鼠視網(wǎng)膜機(jī)械地產(chǎn)生激光和傷疤模型。損傷后五天，使用眼內(nèi)方法注射細(xì)胞。從5天后的小鼠收集眼。實(shí)施例7.視網(wǎng)膜再生的神經(jīng)營養(yǎng)援救成年鼠骨髓衍生的譜系陰性造血干細(xì)胞(Lin-HSC)在視網(wǎng)膜退化的小鼠模型中具有血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)性援救效果。用含有約105個本發(fā)明的LirTHSC的0.5微升眼內(nèi)注射10天齡小鼠的右眼，2個月后評估視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的存在和神經(jīng)層核計(jì)數(shù)。同一,J、鼠的左眼用相同數(shù)量的Lin+HSC注射作為對照，類似地進(jìn)行評估。如附圖9所示，在Lin-HSC處理的眼中，視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)看起來幾乎是正常的，內(nèi)核層幾乎是正常的，外核層(ONL)具有約3到4層的核。相比之下，對側(cè)的Lin+HSC處理的眼具有顯著萎縮的中間視網(wǎng)膜血管層、完全萎縮的外視網(wǎng)膜血管層；內(nèi)核層是顯著萎縮的，外核層完全消失。在小鼠3和小鼠5中顯著地說明了這一點(diǎn)。在小鼠l中，不存在援救效果，這在約15%的注射的小鼠中是事實(shí)。當(dāng)用視網(wǎng)膜電圖(ERG)評定視覺功能時，當(dāng)觀察到血管和神經(jīng)元援救時，觀察到陽性ERG的恢復(fù)(小鼠3和5)。當(dāng)沒有血管或神經(jīng)元援救時，沒有觀察到陽性ERG(小鼠1)。在通過本發(fā)明的LiiTHSC在W/W小鼠眼的血管和神經(jīng)營養(yǎng)援救之間的這種相關(guān)性通過附圖10所示的回歸分析圖說明了。對于中間血管系統(tǒng)類型(產(chǎn)0.45)和對于深部血管系統(tǒng)(r=0.67),觀察到神經(jīng)元(y軸)和血管(x軸)再生之間的相關(guān)性。附圖11顯示了Lin+HSC的血管和神經(jīng)元援救之間沒有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。血管援救進(jìn)行定量，數(shù)據(jù)在附圖12中呈現(xiàn)。在注射后1個月(1M)、2個月(2M)和6個月(6M)的時點(diǎn)的小鼠I史據(jù)在附圖12中顯示，展現(xiàn)了相對于來自相同小鼠的未處理的眼中的血管長度(亮色柱)，特別是在注射后1個月和2個月，用本發(fā)明的Lm-HSC處理的眼中血管長度顯著提高(黑色柱)。通過在Lin-HSC或Lm+HSC注射約2個月后，通過計(jì)數(shù)內(nèi)核層和外核層中的在，來定量神經(jīng)營養(yǎng)援救效果。結(jié)果在附圖13和14中示出。實(shí)施例8.人類Lm-HSC群體。從健康成年人類志愿者通過如上所述的一般程序提取骨髓細(xì)胞。然后使用HISTOPAQUEpolysucrose梯度(Sigma,St.Louis，MO)通過密度梯度分離來分離單核細(xì)胞。為了從人類骨髓單核細(xì)胞分離Lm-HSC群體，以下的生物素結(jié)合的譜系組抗體被用于磁力分離系統(tǒng)(AUTOMACS分選機(jī)，MiltenyiBiotech,Auburn，CA):CD2、CD3、CD4、CDlla、Mac-l、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。人類Lin-HSC群體根據(jù)CD133表達(dá)進(jìn)一步分離成兩個亞群。用生物素結(jié)合的CD133抗體標(biāo)記細(xì)胞并分離成CD133陽性和CD133陰性亞群。實(shí)施例9.在視網(wǎng)膜退化的鼠模型中人類和鼠細(xì)胞的眼內(nèi)施用。C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-7WcSCID和小鼠品系被用作視網(wǎng)膜退化才莫型。C3H/HeJ和C3SnSmn.CB17畫尸,UcSCID小鼠(TheJacksonLaboratory,Maine)對于一見網(wǎng)月莫退化1(ra7)突變是純合的，一種引起早期發(fā)作嚴(yán)重視網(wǎng)膜退化的突變。突變位于編碼rod光受體cGMP磷酸二酯酶(3亞基的Pde6b基因的外顯子7中。這個基因中的突變已經(jīng)在含有常染色體隱性色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的人類患者中發(fā)現(xiàn)。C3SnSmn.CB17-尸nWcSCID小鼠對于嚴(yán)重組合免疫缺陷自體突變(尸nWcSCID)也是純合的，被用于人類細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。ra70小鼠中的視網(wǎng)膜退化是由Pde6b基因的外顯子13中的突變引起的。這也是具有比ra^/VJ/更晚的發(fā)作和更輕的視網(wǎng)膜退化的臨床有關(guān)的RP模型。所有的體內(nèi)評估根據(jù)NIH實(shí)驗(yàn)動物的照料和使用指南(NIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)來進(jìn)行,所有過程由Scripps研究所(TSRI,LaJolla,CA)動物照料和使用委員會(AnimalCareandUseCommittee)水匕),。在小鼠眼瞼中用精細(xì)刀片產(chǎn)生眼瞼裂隙來暴露P2到P6的眼球。然后使用33-規(guī)格(Hamilton,Reno，NV)針頭的注射器眼內(nèi)注射鼠群體A或人類群體C的譜系陰性HSC細(xì)胞(在約0.5iul到約l細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中約105個細(xì)胞)。為了顯現(xiàn)注射的人類細(xì)胞，在注射前用染泮+(CelltrackergreenCMFDA,MolecularProbes)才示i己纟田月包。在各個時點(diǎn)收集視網(wǎng)膜，用4%多聚曱醛(PFA)和曱醇固定，隨后在50%FBS/20%NGS中在室溫下封閉一'h時。為了染色視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，用抗CD31(Pharmingen)和抗膠原I(Chemicon)抗體、隨后是Alexa488或594結(jié)合的二級抗體(MolecularProbes,Eugene,Oregon)孵育視網(wǎng)膜。使用四徑向松弛切口來將視網(wǎng)膜鋪平以獲得完整固定的制品。使用RadianceMP2100共焦顯微鏡和LASERSHARP軟件(Biorad,Hercules,California)獲得中間或深部一見網(wǎng)膜血管叢的血管系統(tǒng)圖像(參見Dorrell等人.2002/"veW<9//2/7w/wo/.F"、.Set43:3500-3510)。對于血管系統(tǒng)的定量，從中間或深部血管層的中間部分隨機(jī)選擇四個獨(dú)立的視野(900|iimx900|Lim)，使用LASERPLX⑧分析軟件(Biorad)測量血管系統(tǒng)的總長。在相同的叢中這四個一見野的總長被用于進(jìn)一步的分析。將扁平固定的視網(wǎng)膜重新包埋用于恒冷切片。將視網(wǎng)膜置于4%PFA中過夜，隨后用20%蔗糖孵育。將視網(wǎng)膜包埋在最佳的切削溫度化合物(OCT:Tissue-Tek;SakuraFineTech,Torrance,CA)中。恒冷切片(10nm)在含有核染料DAPI(Sigma-Aldrich,St.Louis，Missouri)的PBS中重新水化。在含有^L神經(jīng)頭和整個周圍的—見網(wǎng)月莫的單個切片中三個不同區(qū)域的(280寬，無偏取樣)DAPI標(biāo)記的核圖像通過共焦顯微鏡來采集。位于一個切片中三個獨(dú)立視野的ONL中的核數(shù)量被計(jì)數(shù)，加起來用于分析。進(jìn)行單線性回歸分析來檢查深部叢中的血管系統(tǒng)長度和ONL中細(xì)胞核數(shù)目。在黑暗適應(yīng)過夜之后，通過15pg/gm開他敏和7Mg/gm曱苯噻嗪的腹膜內(nèi)注射來麻痹小鼠。使用金回路角膜電極以及口腔參照和尾部地電極，從瞳孔擴(kuò)張(1%硫酸阿托品)之后的每只眼的角膜表面記錄視網(wǎng)膜電圖(ERG)。用附加在高反射性Ganzfeld圓頂外面的GrassPhoticStimulator(PS33Plus,GrassInstruments,Quincy,MA)產(chǎn)生刺激。記錄對在直到光刺激器(0.668cd-s/m2)容許的極限的強(qiáng)度范圍上的短波長(Wratten47A;人max=470nm)光閃的rod反應(yīng)。將響應(yīng)信號擴(kuò)大(CP511AC放大器，GrassInstruments)、數(shù)字化(PCI-1200,NationalInstruments,Austin,TX)并進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。每個小鼠使用/人處理和未處理的眼記錄的ERG充當(dāng)它自己的內(nèi)部對照。多至100次掃描被平均用于最弱的信號。來自未處理的眼的平均反應(yīng)數(shù)字上減去來自處理的眼的反應(yīng)，這種信號上的差異被用于標(biāo)引功能性援救。微陣列分析被用于評估Lm-HSC靶向的視網(wǎng)膜基因表達(dá)。P6M/k/小鼠用Lm-或CD31-HSC注射。注射后40天在無RNase介質(zhì)中分析這些小鼠的視網(wǎng)膜(在注射后的這個時點(diǎn)視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)和光受體層的援救是明顯的)。通過完整固定來分析每個視網(wǎng)膜的四分之一以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了正常的HSC靶向以及血管系統(tǒng)和神經(jīng)保護(hù)。來自成功注射的視網(wǎng)膜的RNA使用TRIzol(LifeTechnologies,Rockville,MD)、苯酚/氯仿RNA分離方案來純化。RNA與AffymetrixMu74Av2芯片雜交，使用GENESPRING(SihconGenetics,RedwoodCity,CA)軟件分析基因表達(dá)。純化人類或小鼠HSC眼內(nèi)注射到P6小鼠中。在P45,分析視網(wǎng)膜并集中到1)人類HSC注射的援救的小鼠視網(wǎng)膜，2)人類HSC注射的非援救的小鼠視網(wǎng)膜，和3)小鼠HSC注射的援救的小鼠視網(wǎng)膜的部分中，用于DNA純化和與人類特異性U133AAffymetrix芯片雜交。使用GENESPRING⑧軟件來鑒定高于背景表達(dá)的并在人類HSC援救的視網(wǎng)膜中更高表達(dá)的基因。然后分別地分析這些基因的每一個的探針對表達(dá)分布型并與正常人U133A微陣列實(shí)驗(yàn)的模型比較，所述實(shí)驗(yàn)使用dChip來確定人類物種特異性雜交并消除由于物種間雜交的々支陽性。附圖21說明了比較本發(fā)明的CD133陽性(CD133+)和CD133陰性(CD133-)人類Lin—HSC群體上CD31和整聯(lián)蛋白a6表面抗原表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)據(jù)。左側(cè)畫面顯示了流式細(xì)胞計(jì)散布圖。中央的圖。Y軸代表事件的數(shù)目:X軸顯示了信號的強(qiáng)度。列出的直方圖是同種型IgG對照抗體，顯示了非特異性背景染色法的水平。實(shí)心的直方圖顯示了在細(xì)胞群體上表達(dá)的特異性抗體的水平。在所列的(對照)直方圖的右側(cè)的填充的直方圖代表提高的熒光信號和在背景水平上的抗體表達(dá)。比較兩種細(xì)胞群體之間實(shí)心直方圖的峰的位置體現(xiàn)了細(xì)胞上的蛋白表達(dá)的差異。例如，在本發(fā)明的CD133+和CD133-細(xì)胞上CD31高于背景表達(dá)；然而，與CD133-群體中存在的相比，在CD133+細(xì)胞群體中存在更多的細(xì)胞表達(dá)更低水平的CD31。根據(jù)這個數(shù)據(jù)，顯然的是CD31表達(dá)在兩個群體之間變動，a6整聯(lián)蛋白表達(dá)主要限于Lin—群體中的細(xì)胞，因而可以充當(dāng)具有親血管和神經(jīng)營養(yǎng)援救功能的細(xì)胞的標(biāo)、志物。當(dāng)CD133陽性和CD133陰性Lin—HSC亞群眼內(nèi)注射到新生SCID小鼠的眼中時，對于CD133陰性亞群觀察到了對發(fā)育的血管系統(tǒng)的最大程度的摻入，所述CD133陰性亞群表達(dá)了CD31和整聯(lián)蛋白cc6表面抗原(參見附圖21,底部)。不表達(dá)CD31或整聯(lián)蛋白o(hù)c6(附圖21,頂部)的CD133陽性亞群看起來耙向外周缺血驅(qū)動的新血管形成的位點(diǎn)，但當(dāng)注射到經(jīng)歷血管生成的中時不會。使用特異于rod或錐體視蛋白的抗體免疫組織化學(xué)地分析援救的和未援救的視網(wǎng)膜。在附圖17中出現(xiàn)的用于ERG記錄的相同的眼用于rod或錐體視蛋白分析。在野生型小鼠視網(wǎng)膜中，存在的光受體的少于約5%是錐體(Soucy等人.1998，iVewro"21:481-493),用附圖25(A)中所示紅色/綠色錐體視蛋白或附圖25(B)中所示rod視紫紅質(zhì)觀察到的免疫組織化學(xué)染色圖型與推體細(xì)胞的這種百分比一致。不列顛哥侖比亞大學(xué)的RobertMolday博士提供了特異于rod視紫紅質(zhì)(rho4D2)的抗體，如先前描述的使用(Hicks等人.1986,￡>e42:55-71)。特異于錐體紅/綠浮見蛋白的兔抗體購自Chemicon(AB5405),根據(jù)廠家的說明書使用。實(shí)施例10.在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜退化的鼠模型中人類和鼠細(xì)胞的眼內(nèi)施用。在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜退化(OIR)模型中，出生后P7到P12天的新生野生型C57B16小鼠暴露于氧過多(75%氧)。附圖22說明了在P0到P30的C"B16小鼠中的正常出生后血管發(fā)育。在PO，僅在視覺芽周圍可以觀察到發(fā)芽的淺表血管。在接下來幾天，原發(fā)的淺表網(wǎng)絡(luò)向外周部蔓延，到P10到達(dá)遠(yuǎn)端外周部。在P7和P12之間，繼發(fā)性(深部)叢發(fā)育。到P17,存在擴(kuò)大的淺表和深部血管網(wǎng)絡(luò)(附圖22，插圖)。在接下來幾天，隨著第三(中間)層的血管的發(fā)育而發(fā)生改型，直到大約在P21達(dá)到成年結(jié)構(gòu)。相比之下，在此處描述的OIR模型中，在P7-P12暴露于75%氧之后，事件的標(biāo)準(zhǔn)順序被嚴(yán)重地破壞(附圖23)。在P3在隨后經(jīng)歷OIR的小鼠眼中眼內(nèi)注射成年鼠的Lin-HSC群體，另一只眼用PBS或CD31陰性細(xì)胞注射作為對照。附圖24說明了Lin—HSC群體可以逆轉(zhuǎn)在發(fā)育的小鼠視網(wǎng)膜中高氧水平的退化效果。在處理的眼中觀察到充分發(fā)育的淺表和深部的視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)，而對照眼顯示了基本上沒有深部血管的大的無血管區(qū)域(附圖24)。觀察了OIR模型中的大約100只小鼠眼。相比CD31—處理的對照眼的12%以及PBS處理的對照眼的3%,在用Lin-HSC群體處理的58%的眼中觀察到正常的血管新生。實(shí)施例11.通過CD44選擇從鼠骨髓分離骨髓樣骨髓細(xì)胞。從成年小鼠(TheJacksonLaboratory,ME)提取骨髓細(xì)胞。用鼠CD44抗體處理完整的骨髓，使用流式細(xì)胞計(jì)來從骨髓中分離表達(dá)CD44的細(xì)胞。從抗體上分離細(xì)胞并保存在緩沖溶液中備用。還分離了不顯著表達(dá)CD44的細(xì)胞群體(CD44'。BM)。實(shí)施例12.通過CD44選擇從鼠骨髓分離骨髓樣骨髓細(xì)胞。如實(shí)施例11描述的，還使用了針對CDllb的抗體代替CD44來正選擇骨髓細(xì)胞。分離了CD44hi和CDllb+的骨髓樣骨髓細(xì)胞群體，其具有與實(shí)施例11中使用CD44分離的CD44hi群體相似的活性特征。還分離了CD44i。CDllb群體，其發(fā)現(xiàn)是無效的。實(shí)施例13.MLBM細(xì)胞群體的表征。雖然在這方面CD44的作用還不清楚，可能的是，在細(xì)胞注射到眼中后，這種受體在富含透明質(zhì)酸的玻璃體中介導(dǎo)了細(xì)胞存活、細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞分化。CD44hi(W，MLBM)和CD44'。的明顯群體存在于未分級的小鼠骨髓中。MLBM細(xì)胞群體代表了早先的實(shí)施例中使用的Lin—群體的76%,而來自骨髓的Lin+和CD31/CD34/CD1lb細(xì)胞群體的分別僅約37%和4%表達(dá)CD44(附圖26)。因而，在這三種群體中觀察到的CD44表達(dá)與血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)活性之間存在極好的相關(guān)性，即，Lm+細(xì)胞水最有效的，而CD327CD347CDllb-細(xì)胞一致地是最低效力的。使用譜系特異性抗體的板塊，大多數(shù)CD44"細(xì)胞被測定具有強(qiáng)烈的骨髓特征(附圖27)。類似地，幾乎所有的CD44hi骨髓細(xì)胞也是00111)+(附圖27)。在實(shí)施例12中使用CDllb抗體正選擇的MLBM(CD44111CDllb+)得到活性結(jié)果，類似于在血管耙向?qū)嶒?yàn)中使用CD44抗體選擇分離的MLBM所獲得的那些。實(shí)施例12的MLBM細(xì)胞群體以及實(shí)施例12中分離的CD441。CDllb—細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原特征在以下的表3中示出。在表3中，更多的加號(+)數(shù)量表示相對更高的抗原表達(dá)。減號(-)表示沒有檢測到表達(dá)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例14.MLBM細(xì)胞群體的血管營養(yǎng)和神經(jīng)營養(yǎng)效果。就血管耙向和親血管和神經(jīng)營養(yǎng)效果而言，實(shí)施例11的MLBM細(xì)胞群體保持了Liif細(xì)胞的性質(zhì)，而CD44'。BM細(xì)胞顯示了很少的活性或沒有活性。通過眼內(nèi)注射來自GFP+MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞到出生后7天(P7)的小鼠中并在P14分析視網(wǎng)膜，證明了血管靶向活性。在用GSisolectm標(biāo)記血管之后，觀察到GFP+細(xì)胞把向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)并呈現(xiàn)血管周圍定位，沒有摻入的證據(jù)。當(dāng)使用MLBM時這些事件是常見的，但在用CD44'。BM處理的眼中是罕見的或缺乏的(附圖28)。實(shí)施例11的MLBM細(xì)胞群體的親血管和神經(jīng)營養(yǎng)活性使用如上所述用于Lin—HSC的視網(wǎng)膜退化的小鼠模型來評估。W//ra7小鼠顯示了一見網(wǎng)膜退化性疾病的特征，包括光受體死亡和深部視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)的萎縮。如上所述。Lin-HSC骨髓細(xì)胞保持了深部視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)并部分地援救了光受體。MLBM細(xì)胞群體表現(xiàn)了相同的功能(附圖28)。氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病模型享有未熟兒視網(wǎng)膜病的特征。當(dāng)用來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞處理眼時，與這個模型相關(guān)的病變被顯著地降低，在這個模型中來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞的效果類似于如上所述使用Lin-HSC所觀察到的。用來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞處理的眼顯示了在用于定量這個模型中病變程度的兩個參數(shù)上的明顯降低血管閉塞面積和新血管叢面積。相比之下，用CD44'。BM細(xì)胞處理的眼顯示了相對用載體對照處理的眼沒有改善(附圖30)。除了靶向視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)之外，來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞樣(F4/80+)細(xì)胞，滲透視網(wǎng)膜，并占據(jù)與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)緊密相對的位置。這種定位促進(jìn)了來自MLBM纟田月包群體的細(xì)胞的觀察的血管和光受體援救效果。此外，一但處于靠近RPE的位置，來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞生產(chǎn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),由來自VEGF-GFP小鼠的MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞的注射來證明，其中綠色熒光蛋白(GFP)在VEGF基因活化時表達(dá)(附圖31)。因此，來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞似乎處于VEGF"活化"狀態(tài)。導(dǎo)入的來自MLBM細(xì)胞群體的細(xì)胞似乎征募了相同類型的內(nèi)源細(xì)胞，因?yàn)樵赗PE區(qū)域中觀察到GFP+(導(dǎo)入的)和GFP-(內(nèi)源的)細(xì)胞。這種定位已經(jīng)在野生型小鼠中在正常的視網(wǎng)膜血管發(fā)育期間觀察到，在W〃/^/小鼠和在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病模型中的援救的視網(wǎng)膜中觀察到。對于實(shí)施例12的MLBM細(xì)胞群體發(fā)現(xiàn)了類似的血管靶向結(jié)果。附圖32顯示了到P20，當(dāng)在P2注射時，實(shí)施例12的CD44hiCDllb+細(xì)胞(綠色)以類似于實(shí)施例1]的CD44-高群體的方式特異性靶向血管系統(tǒng)(紅色)。附圖33顯示了實(shí)施例12的CD441。CDllb—不特異性耙向血管系統(tǒng)。本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群體提供了對缺血性視網(wǎng)膜疾病等眼睛疾病的有效的和通用的治療。細(xì)胞容易地從自體的骨髓分離，因而最小化了常常在基于細(xì)胞的療法中觀察到的可能的免疫原性。長期(長達(dá)六個月)跟蹤揭示了在用譜系陰性細(xì)胞注射的眼中僅有神經(jīng)視網(wǎng)膜的偶然的瓣?duì)铙w和組織學(xué)保存。此外，本發(fā)明的MLBM細(xì)胞群體可以用有用的基因轉(zhuǎn)染用于將功能基因遞送到視網(wǎng)膜中。可以進(jìn)行以上描述的實(shí)施方式的各種變體和修改而不背離本發(fā)明的新穎特征的精神和范圍。不意圖、或不應(yīng)被推斷為對于在此描述的具體實(shí)施方式有限制。權(quán)利要求1.一種治療患有或存在風(fēng)險發(fā)展出未熟兒視網(wǎng)膜病或相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的哺乳動物的方法，所述方法包括向所述哺乳動物的視網(wǎng)膜施用一定量的來自血管營養(yǎng)譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞，有效促進(jìn)視網(wǎng)膜的損傷區(qū)域的有益的生理學(xué)血管再形成和改善由所述疾病引起的對視網(wǎng)膜的損害。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體包含來自骨髓的造血干細(xì)胞和內(nèi)皮-且細(xì)胞。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體通過一種方法產(chǎn)生，所述方法包括從哺乳動物分離骨髓、從所述骨髓除去i普系陽性細(xì)胞以及從所述骨髓中回收譜系陰性造血干細(xì)胞群體。4.權(quán)利要求3的方法，其中通過用至少一種譜系組抗體處理來自所述骨髓的單核細(xì)胞，并從所述單核細(xì)胞分離與至少一種譜系組抗體免疫反應(yīng)的細(xì)胞，來除去語系陽性細(xì)胞。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體是分離的骨髓樣骨髓細(xì)胞群體，其中大部分細(xì)胞是譜系陰性的，并且表達(dá)CD44抗原以及CDllb抗原。6.權(quán)利要求5的方法，其中分離的骨髓樣骨髓細(xì)胞群體通過一種方法產(chǎn)生，所述方法包括從哺乳動物分離骨髓并從所述骨髓陽性地選擇與抗體免疫反應(yīng)的細(xì)胞，所述抗體選自抗-CD44、抗-CDllb和其組合。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體從臍帶靜脈血分離。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述哺乳動物是人類。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述哺乳動物是嬰兒哺乳動物。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述嬰兒哺乳動物已經(jīng)暴露于高氧條件。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述細(xì)胞通過眼球內(nèi)注射施用。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞對于要治療的哺乳動物是自體的。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞在疾病癥狀發(fā)作之前施用。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞在所述哺乳動物暴露于高氧條件之前施用。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞在施用細(xì)胞之前用治療上有用的基因轉(zhuǎn)染。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述治療上有用的基因編碼Trp-RS的血管靜止片段。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述TrpRS的血管靜止片段是T2-TrpRS(SEQIDNO:3)或T2-TrpRS-GD(SEQIDNO:4)。全文摘要本發(fā)明提供了用于治療未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)和相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病的方法。所述方法包括向患有或存在風(fēng)險發(fā)展出未熟兒視網(wǎng)膜病或相關(guān)視網(wǎng)膜疾病的哺乳動物的視網(wǎng)膜施用一定量的來自血管營養(yǎng)譜系陰性造血干細(xì)胞群體的細(xì)胞，有效促進(jìn)視網(wǎng)膜的損傷區(qū)域的有益的生理學(xué)血管再形成和改善由所述疾病引起的對視網(wǎng)膜的損害。優(yōu)選的，所述哺乳動物是人類患者。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體是包含造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性造血干細(xì)胞群體(即，Lin^-HSC)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述譜系陰性造血干細(xì)胞群體是分離的骨髓樣骨髓(MLBM)細(xì)胞群體，其中大部分細(xì)胞是譜系陰性的，并且表達(dá)CD44抗原和CD11b抗原。作為選擇，用于新生兒的治療，譜系陰性造血干細(xì)胞群體可以從臍帶靜脈血分離。文檔編號C12N5/0789GK101356268SQ200680013823公開日2009年1月28日申請日期2006年2月24日優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日發(fā)明者E·巴寧,E·阿吉拉,M·弗里蘭德申請人:斯克里普斯研究學(xué)院