專利名稱：病毒株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及例如皰疹病毒(諸如HSV)的非實(shí)驗(yàn)室病毒株，與實(shí)驗(yàn)室病毒株相比，所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株具有改進(jìn)的溶瘤能力和/或基因傳遞能力。
已經(jīng)提出單純皰疹病毒(HSV)既可用作神經(jīng)系統(tǒng)和其它系統(tǒng)中的基因傳遞載體，又可用于溶瘤法治療癌癥。然而，在這兩種應(yīng)用中，必須使病毒成為缺陷型的，使它不再具有致病性，但是使它仍能進(jìn)入細(xì)胞并執(zhí)行所需功能。因而，對(duì)于利用HSV使無毒基因傳遞至靶細(xì)胞，顯然在大多數(shù)情況下，必須阻止病毒的立即早期基因表達(dá)或?qū)⑵浔磉_(dá)減至最小。對(duì)于溶瘤法治療癌癥(該療法也可以包括傳遞增強(qiáng)所述治療效應(yīng)的基因)，已經(jīng)鑒定出HSV的許多突變，HSV的這些突變?nèi)栽试S病毒在培養(yǎng)物或在體內(nèi)活躍分裂的細(xì)胞內(nèi)(例如腫瘤內(nèi))復(fù)制，但是阻止其在正常組織內(nèi)的有效復(fù)制。這樣的突變包括破壞ICP34.5、ICP6和胸苷激酶的編碼基因。迄今為止，在這些突變病毒中，具有ICP34.5突變或者ICP34.5突變以及例如ICP6突變的病毒已經(jīng)顯示最為有利的安全分布圖。已經(jīng)顯示僅缺失ICP34.5的病毒在體外在許多腫瘤細(xì)胞類型中復(fù)制并且在人工誘導(dǎo)的小鼠腦腫瘤內(nèi)選擇性復(fù)制，而不傷害周圍組織。早期臨床試驗(yàn)也表明它們?cè)谌祟愔惺前踩摹?br> 然而，雖然有希望將各種病毒(包括HSV)用于基因傳遞/治療或者用于溶瘤法治療癌癥，但該項(xiàng)工作中的絕大多數(shù)工作一直使用已經(jīng)在組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)保持許多年的病毒株。在僅需要病毒進(jìn)入細(xì)胞以傳遞基因的應(yīng)用中，這可以證明是不成問題的，因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)中保持也需要病毒進(jìn)入細(xì)胞，雖然通常與載體的可能靶細(xì)胞相比是不同類型或物種的細(xì)胞。然而，在需要其它特性的應(yīng)用中，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室病毒株不可能使病毒在需利用的具體應(yīng)用中具有全部潛能。
在目前正作為載體開發(fā)的病毒中HSV具有獨(dú)特的能力，這是由于HSV天然進(jìn)化成感染神經(jīng)元并在此中潛伏。HSV也進(jìn)化成從感染部位(通常在外周)沿神經(jīng)以高效率運(yùn)輸至通常位于脊神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元胞體。在細(xì)胞培養(yǎng)物中不需要這種能力，由于這種能力需要HSV的特殊進(jìn)化的特性，進(jìn)一步適應(yīng)在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)可能導(dǎo)致喪失最有效的軸突運(yùn)輸能力。如果以最大效率一直保留軸突運(yùn)輸特性，則用于將基因傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的HSV載體可能顯示最大效率。在此，在外周部位接種則可以允許最有效地將基因傳遞至外周神經(jīng)元胞體，而在腦內(nèi)接種則可能允許最有效地將基因傳遞至多個(gè)連接的部位。目前基于實(shí)驗(yàn)室HSV毒株的載體可能不容許以可能的最大效率發(fā)生這一事件。事實(shí)上，因?yàn)镠SV沿神經(jīng)運(yùn)輸?shù)哪芰?qiáng)，因此在需要保守的特性和可能在培養(yǎng)物中保留的特性之間可能存在特別大的差異。
HSV和其它病毒(例如腺病毒或rheovirus)也在溶瘤法治療癌癥方面具有潛在的效用。然而，在正在開發(fā)用于這些目的病毒先前一直廣泛地在培養(yǎng)物中保持。由于溶瘤法治療癌癥需要在通常相對(duì)緩慢生長(zhǎng)的人腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制，因此預(yù)期使實(shí)驗(yàn)室病毒株適應(yīng)在特定培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，可能降低了在可能最適發(fā)生人腫瘤細(xì)胞內(nèi)裂解性復(fù)制的效率或感染人腫瘤細(xì)胞的效率。
發(fā)明概述本發(fā)明提供開發(fā)基因傳遞和/或裂解性破壞腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)能力改進(jìn)的病毒的機(jī)會(huì)。在此，基于合適病毒的最新臨床分離株而不是先前一直使用的連續(xù)傳代的實(shí)驗(yàn)室毒株，構(gòu)建適用于這些目的的病毒株。因此，本發(fā)明的潛力是提供具有以下特性的病毒體內(nèi)感染人細(xì)胞的能力改進(jìn)、在這類細(xì)胞內(nèi)復(fù)制/裂解的能力改進(jìn)以及(就HSV而論)從接種部位沿神經(jīng)運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體的能力改進(jìn)。本發(fā)明利用HSV舉例說明，但同樣適用于目前正開發(fā)作為載體和/或用于溶瘤法破壞癌癥細(xì)胞的其它病毒。
我們已經(jīng)證明，與HSV1毒株17+(標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株)相比，兩種HSV1臨床分離株(毒株JS1和BL1)增強(qiáng)了在某些人腫瘤細(xì)胞系內(nèi)的復(fù)制。
我們使臨床分離株JS1缺失ICP34.5，然后再與其中也缺失ICP34.5的HSV1毒株17+(標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株)相比，比較在人腫瘤細(xì)胞類型中的復(fù)制潛能。該毒株(JS1/ICP34.5-)是一種來源于臨床分離株的經(jīng)修飾的毒株，并因此是一種本發(fā)明的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室毒株。
與具有相同修飾的HSV1 ICP34.5缺失毒株17+(即標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室病毒株)相比，具有ICP34.5缺失的JS1顯示出在某些被測(cè)人腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)增強(qiáng)。然而，與來源于毒株17+的實(shí)驗(yàn)室毒株相比，JS1/ICP34.5-病毒在所有被測(cè)腫瘤細(xì)胞系中增強(qiáng)細(xì)胞殺傷能力。
因此，可以觀察到應(yīng)用非實(shí)驗(yàn)室病毒株增強(qiáng)這類病毒的抗腫瘤能力，并且已在所有至今被測(cè)的腫瘤細(xì)胞系中得到證實(shí)。這將適用于人類患者的癌癥治療。
如果這些病毒隨后用來傳遞具有抗腫瘤活性的基因，則也可以預(yù)期進(jìn)一步增強(qiáng)活性。這樣的基因包括編碼前體藥物激活蛋白、腫瘤抑制蛋白或促細(xì)胞凋亡因子(pro-apoptotic factors)或免疫刺激蛋白的基因。
對(duì)于該目的，我們產(chǎn)生了表達(dá)人GMCSF的HSV1的ICP34.5缺失型臨床分離株。該病毒用來在腫瘤內(nèi)注射后增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也提供攜帶一種或多種異源基因的本發(fā)明病毒。術(shù)語(yǔ)異源基因包括在所述病毒基因組中不存在的任何基因。所述異源基因可以是野生型基因的任何等位基因變異體，或者它可以是突變基因。最好將異源基因與允許所述異源基因體內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的控制序列有效連接。因此，本發(fā)明的病毒可用來將一種或多種異源基因體內(nèi)傳遞至將讓其表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)。對(duì)于溶瘤病毒療法，這樣的基因通常編碼能夠增強(qiáng)病毒的腫瘤破壞特性的蛋白。這些基因可以編碼其自身具有細(xì)胞毒性的蛋白、可以編碼前體藥物激活蛋白或者可以編碼能夠刺激/增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的蛋白。對(duì)于利用HSV將基因傳遞至周圍神經(jīng)系統(tǒng)，所述一種或多種異源基因可以編碼能夠改變對(duì)疼痛刺激應(yīng)答或緩解慢性疼痛的多肽，例如能夠隔絕例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、其它疼痛調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣分子的蛋白或物質(zhì)P或其它神經(jīng)肽。所述一種或多種異源基因也可以編碼能夠刺激變性性疾病中損傷神經(jīng)再生長(zhǎng)或防止神經(jīng)進(jìn)一步變性的多肽。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，異源基因可以包括那些在神經(jīng)變性性疾病(例如帕金森氏病或早老性癡呆)中具有潛在益處的基因，并且在這類疾病中通常可以包括編碼能夠增強(qiáng)其余細(xì)胞活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和/或酶的基因。在所有情況下，一種病毒可以攜帶一種或多種異源基因。
因此，本發(fā)明提供應(yīng)用經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒株生產(chǎn)溶瘤法治療癌癥的藥物；應(yīng)用經(jīng)修飾的、無復(fù)制能力的、包含一種異源基因的非實(shí)驗(yàn)室病毒株生產(chǎn)用于將所述基因傳遞至受治療者的藥物；一種確定一種基因是否對(duì)與周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響的方法，所述方法包括(i)將包含一種異源基因、無復(fù)制能力的本發(fā)明皰疹病毒接種到外周神經(jīng)中；和(ii)監(jiān)測(cè)所述疾病的表型或所述基因的表達(dá)對(duì)所述細(xì)胞的影響，由此確定所述基因是否具有與所述疾病有關(guān)的效應(yīng)；一種確定一種基因是否對(duì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響的方法，所述方法包括(i)將無復(fù)制能力的本發(fā)明皰疹病毒接種到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)；和(ii)監(jiān)測(cè)所述疾病的表型或所述基因的表達(dá)對(duì)所述細(xì)胞的影響，由此確定所述基因是否對(duì)所述細(xì)胞或所述表型有影響；一種確定一種基因是否編碼與致病感染或癌癥相關(guān)的抗原的方法，所述方法包括用包含一種編碼抗原的異源基因、無復(fù)制能力的本發(fā)明病毒感染樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，并且監(jiān)測(cè)所述基因的多肽產(chǎn)物的抗原呈遞、或所述基因的表達(dá)效應(yīng)、或所述致病感染或癌癥的表型，由此確定所述基因是否編碼與所述感染或癌癥相關(guān)的抗原及其自身是否具有治療潛能或者是治療性干涉的靶；一種測(cè)定非實(shí)驗(yàn)室病毒株對(duì)于修飾成如本文所限定的經(jīng)修飾的毒株的適應(yīng)性的方法，所述方法包括(i)任選地從宿主中分離非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)提供所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(iii)評(píng)價(jià)所述病毒在一種或多種理想特征方面的特性；并且任選地，(iv)選擇供修飾用的具有理想特性的病毒株；一種測(cè)定非實(shí)驗(yàn)室病毒株對(duì)于修飾成本發(fā)明經(jīng)修飾的溶瘤毒株的適應(yīng)性的方法，所述方法包括(i)任選地從宿主中分離非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)評(píng)價(jià)所述病毒在一種或多種類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)；并且任選地(iii)選擇供修飾用的具有高生長(zhǎng)速率或細(xì)胞殺傷能力的病毒株；一種測(cè)定非實(shí)驗(yàn)室病毒株對(duì)于修飾成經(jīng)修飾的溶瘤毒株的適應(yīng)性的方法，所述方法包括(i)提供一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株，任選地用剛才限定的方法對(duì)其進(jìn)行選擇；(ii)修飾所述毒株，使其變成溶瘤毒株；和(iii)評(píng)價(jià)所述經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；并且任選地(iv)選擇表現(xiàn)出高腫瘤細(xì)胞殺傷能力的毒株，用于進(jìn)一步修飾；并且任選地(v)進(jìn)行進(jìn)一步修飾；一種確定一種基因是否增強(qiáng)病毒的抗腫瘤效應(yīng)的方法，所述方法包括(i)提供一種本發(fā)明經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株；(ii)將所述基因作為異源基因插入到所述病毒中；和(iii)與步驟(i)中提供的前體毒株的能力相比，評(píng)價(jià)所述經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；一種產(chǎn)生經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒株的方法，所述方法包括(i)從宿主中分離一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)任選確定對(duì)其進(jìn)行如上所限定的修飾的適應(yīng)性；和(iii)對(duì)其進(jìn)行修飾，使其成為溶瘤病毒；并且任選地(iv)進(jìn)行進(jìn)一步修飾；一種產(chǎn)生經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株的方法，所述方法包括(i)提供一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)對(duì)其進(jìn)行修飾，使其成為無復(fù)制能力的病毒和(iii)插入一種異源基因；
一種如本文定義的、經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒株；一種如本文定義的、包含一種異源基因的、經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株；應(yīng)用通過如上限定的方法鑒定為對(duì)與周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響的基因或者由所述基因編碼的基因產(chǎn)物，生產(chǎn)治療周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物；應(yīng)用通過如上限定的方法鑒定為對(duì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響的基因或者由所述基因編碼的基因產(chǎn)物，生產(chǎn)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物；應(yīng)用通過如上限定的方法鑒定為編碼與致病感染或癌癥相關(guān)的抗原的基因或者由所述基因編碼的抗原，生產(chǎn)治療或預(yù)防所述感染或癌癥的藥物；一種通過本發(fā)明方法鑒定或者在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的非實(shí)驗(yàn)室病毒株；應(yīng)用通過如上限定的方法鑒定為增強(qiáng)病毒的抗腫瘤效應(yīng)的基因或者由所述基因編碼的基因產(chǎn)物，生產(chǎn)治療或預(yù)防癌癥的藥物；一種通過本發(fā)明方法獲得或者可通過本發(fā)明方法獲得的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株；HSV1毒株JS1，保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，臨時(shí)保藏號(hào)為01010209；或由其衍生的HSV1毒株；包含這種病毒的藥用組合物；用于治療人或動(dòng)物的這種病毒；一種治療需要所述治療的個(gè)體體內(nèi)腫瘤的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體有效量的本發(fā)明溶瘤病毒；一種將一種基因傳遞至需要所述基因的個(gè)體的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體有效量的本發(fā)明非溶瘤病毒；和一種治療或預(yù)防中樞周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括將有效量的本發(fā)明親神經(jīng)病毒給予需要所述治療或預(yù)防的個(gè)體的外周神經(jīng)。
(2)ICP34.5-17+和JS1在腫瘤細(xì)胞上的生長(zhǎng)。左圖LNCaP細(xì)胞。右圖MDA-MB-231細(xì)胞。
(3)JS1/34.5-在HSV ICP34.5突變株的非許可細(xì)胞上不生長(zhǎng)。左圖3T6細(xì)胞-17+，JS1。右圖3T6細(xì)胞-17+，JS1ICP34.5-。圖3.ICP34.5缺失型HSV臨床分離株顯示在所有被測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)裂解增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞系以指定的MOI進(jìn)行模擬感染、用HSV1毒株17+/34.5-感染或者用HSV1毒株JS1/34.5-感染，然后在感染后于不同時(shí)間點(diǎn)用結(jié)晶紫染色，使細(xì)胞顯現(xiàn)。照片中的每個(gè)方框代表一種細(xì)胞類型。從上到下，分別為HT29結(jié)腸直腸腺癌、LNCaP.FGC前列腺癌、MDA-MB-231乳腺癌、SK-MEL-28惡性黑素瘤和U-87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤星形細(xì)胞瘤。左方框代表HSV1毒株17+/34.5-的結(jié)果。右方框代表HSV1毒株JS1/34.5-的結(jié)果。中間方框代表模擬受感染的細(xì)胞。在每個(gè)方框中，最上一行代表24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，第二行代表48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，第三行代表72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)方框中，左邊一欄代表MOI＝0.2，中間一欄代表MOI＝0.1，右邊一欄代表MOI＝5。
發(fā)明詳述A.病毒本發(fā)明的病毒株本發(fā)明總的來講適用于病毒。優(yōu)選本發(fā)明的病毒株為皰疹病毒毒株、腺病毒毒株、微小RNA病毒毒株、反轉(zhuǎn)錄病毒毒株或甲病毒毒株。更優(yōu)選本發(fā)明的病毒株為皰疹病毒毒株。再更優(yōu)選本發(fā)明的病毒株為單純皰疹病毒(HSV)毒株、通常為HSV1毒株或HSV2毒株。
當(dāng)本發(fā)明的病毒為單純皰疹病毒時(shí)，所述病毒可以來源于例如HSV1毒株或HSV2毒株或者它們的衍生毒株，最好是HSV1。衍生毒株包括含有來自HSV1毒株和HSV2毒株的DNA的型間(inter-type)重組體。這種型間重組體在本領(lǐng)域有描述，例如Thompson等(1998)和Meignier等(1988)描述了這類型間重組體。衍生毒株與HSV1基因組或HSV2基因組的序列同源性優(yōu)選為至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％或95％。更優(yōu)選的是，衍生毒株與HSV1基因組或HSV2基因組的序列同一性為至少70％，更優(yōu)選至少80％同一性，甚至更優(yōu)選至少90％、95％或98％同一性。
例如UWGCG程序包提供可以用來計(jì)算同源性的BESTFIT程序(例如用其缺省設(shè)置)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395頁(yè))。PILEUP和BLAST算法可以用來計(jì)算同源性或?qū)⑿蛄信帕?通常用其缺省設(shè)置)，例如如在Altschul(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Alschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所述。
用于進(jìn)行BLAST分析的軟件公眾可通過National Centre forBiotechnology Information(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字串比對(duì)時(shí)或者匹配或者滿足某些正數(shù)值最低分值T的長(zhǎng)度W的短字串，來鑒定高分序列配對(duì)(HSP)。T被稱為相鄰字串分值閾值(Altschul等，1990)。這些原始相鄰字串命中作為起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的HSP的種子。字串命中以兩個(gè)方向沿每個(gè)序列延伸，只要累積序列比對(duì)分值可以增加。在每個(gè)方向的字串命中延伸當(dāng)遇到以下情況之一時(shí)終止累積序列比對(duì)分值比其獲得的最大值低數(shù)量X；累積分值為零或以下，這是由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)打分殘基比對(duì)的累積所致；或到達(dá)每個(gè)序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定所述比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用的缺省字長(zhǎng)(W)為11，使用BLOSUM62打分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)比對(duì)(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，并且比較兩條鏈。
BLAST算法對(duì)兩個(gè)序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；參見例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA905873-5787。BLAST算法提供的一種相似性測(cè)定是最小和概率(P(N))，它提供了在兩個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率的指標(biāo)。例如，如果在將一個(gè)序列與另一序列進(jìn)行比較時(shí)最小和概率小于約1、優(yōu)選小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01、最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為所述第一序列與第二序列相似。
衍生毒株可以具有通過核苷酸取代例如1、2或3至10、25、50或100個(gè)而取代修飾的HSV1基因組序列或HSV2基因組序列。HSV1基因組或HSV2基因組可以或者或另外通過一個(gè)或多個(gè)插入和/或缺失和/或通過在任一末端或兩個(gè)末端進(jìn)行延伸來修飾。本發(fā)明病毒株的特性本發(fā)明病毒株是“非實(shí)驗(yàn)室”毒株。它們也可以被稱為“臨床”毒株。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地將實(shí)驗(yàn)室毒株和非實(shí)驗(yàn)室毒株或臨床毒株區(qū)分開來。此外，下文給出了病毒株可能表現(xiàn)出的特性指南。
實(shí)驗(yàn)室毒株和非實(shí)驗(yàn)室毒株之間的關(guān)鍵區(qū)別在于目前常用的實(shí)驗(yàn)室毒株已經(jīng)在培養(yǎng)物中保持了相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，在有些情況下為許多年。病毒(例如HSV)的培養(yǎng)涉及被稱為連續(xù)傳代的技術(shù)。為了使病毒生長(zhǎng)和保持，用病毒感染合適的細(xì)胞，病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，然后收獲病毒；然后重新感染新鮮細(xì)胞。該過程構(gòu)成連續(xù)傳代的一個(gè)周期。就HSV而論，每個(gè)這樣的周期可能需要例如幾天。如上所討論的，這種連續(xù)傳代可能導(dǎo)致病毒株特性的改變，因?yàn)榘l(fā)生對(duì)有利于在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的特性(例如快速?gòu)?fù)制)的選擇，而不是選擇與可用于實(shí)際應(yīng)用的特性，例如就HSV而論為保持沿軸突運(yùn)輸?shù)哪芰Α?br> 本發(fā)明病毒株是非實(shí)驗(yàn)室毒株，因?yàn)樗鼈儊碓从趶氖芨腥緜€(gè)體中最新分離的毒株。與原始臨床分離株相比，本發(fā)明毒株是經(jīng)修飾的，可能需要培養(yǎng)一段時(shí)間，但是培養(yǎng)所用時(shí)間比較短。用這樣的方法制備本發(fā)明毒株，使其基本上保留它們所來源的原始臨床分離株的理想特性。
本發(fā)明的病毒能夠有效感染人類靶細(xì)胞。這樣的病毒剛從受感染個(gè)體中分離，然后根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株相比增強(qiáng)在體外和/或體內(nèi)在腫瘤細(xì)胞和/或其它細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的所需能力進(jìn)行篩選，或者(就親神經(jīng)病毒例如HSV而論)采用體內(nèi)模型根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株相比增強(qiáng)沿神經(jīng)運(yùn)輸?shù)哪芰M(jìn)行篩選。與實(shí)驗(yàn)室病毒株相比，具有改進(jìn)特性的這類病毒是本發(fā)明的病毒。然后可以對(duì)具有這種所需改進(jìn)特性、經(jīng)鑒定的病毒通過合適基因的突變進(jìn)行工程改造，使它們可以選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞，或者將其突變，使它們可以在非溶瘤性應(yīng)用中將基因傳遞至靶組織而沒有毒性效應(yīng)。這些經(jīng)修飾的病毒也是本發(fā)明的病毒。或者，病毒株也可以從受感染個(gè)體中分離，并且對(duì)其進(jìn)行預(yù)期適用于溶瘤法治療和/或基因傳遞的突變。然后對(duì)這些經(jīng)修飾的病毒根據(jù)與實(shí)驗(yàn)室毒株相比的所需改進(jìn)特性進(jìn)行篩選，具有這種改進(jìn)特性的病毒提供其它的本發(fā)明病毒。
如下提供本發(fā)明病毒株的可能特性的進(jìn)一步指南。
優(yōu)選本發(fā)明病毒株從其宿主中分離其未經(jīng)修飾的臨床前體毒株算起已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷三年或三年以下。更優(yōu)選本發(fā)明毒株已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷一年或一年以下，例如九個(gè)月或九個(gè)月以下、六個(gè)月或六個(gè)月以下、三個(gè)月或三個(gè)月以下、或二個(gè)月或二個(gè)月以下、一個(gè)月或一個(gè)月以下、二周或二周以下、或一周或一周以下。在培養(yǎng)物中時(shí)間的這些定義，是指在培養(yǎng)物中實(shí)際所用的時(shí)間。因此，例如，通常的做法是將病毒株冷凍，以便保存它們。顯然，通過冷凍保存或以等同方式保存并不看作是在培養(yǎng)物中保持毒株。因而，冷凍保存所用時(shí)間或用其它方法保存所用時(shí)間不包括在培養(yǎng)物所用時(shí)間的上述定義的范圍內(nèi)。在培養(yǎng)物中所用時(shí)間通常是實(shí)際經(jīng)歷連續(xù)傳代所用的時(shí)間，即在可以發(fā)生選擇不想要的特征期間的時(shí)間。
優(yōu)選本發(fā)明的病毒株從其宿主中分離其未經(jīng)修飾的臨床前體毒株算起經(jīng)歷了1,000個(gè)或更少的連續(xù)傳代周期。更優(yōu)選它已經(jīng)歷了500個(gè)或更少、100個(gè)或更少、90個(gè)或更少、80個(gè)或更少、70個(gè)或更少、60個(gè)或更少、50個(gè)或更少、40個(gè)或更少、30個(gè)或更少、20個(gè)或更少、或者10個(gè)或更少這樣的周期。
最好是，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定，本發(fā)明病毒比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株執(zhí)行某些可用于目前應(yīng)用的功能的能力強(qiáng)。例如，就用于腫瘤治療的溶瘤病毒而論，優(yōu)選本發(fā)明的病毒株比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染任何腫瘤細(xì)胞或在其中復(fù)制、殺傷腫瘤細(xì)胞或在組織中的細(xì)胞間傳播的能力強(qiáng)。更優(yōu)選這種更強(qiáng)的能力是具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的更強(qiáng)的能力。例如，按照本發(fā)明，就待測(cè)特性而論，本發(fā)明的病毒株的能力可以是所述參比毒株的能力的至多1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
最好是，就一種或多種特征為可用于目前應(yīng)用的特性而論，本發(fā)明的病毒基本上具有(即保留)其未經(jīng)修飾的臨床前體毒株的能力。例如，就計(jì)劃用來治療腫瘤的溶瘤病毒而論，本發(fā)明的病毒株優(yōu)選基本上具有其未經(jīng)修飾的臨床前體毒株感染任何腫瘤細(xì)胞或在其中復(fù)制、殺傷腫瘤細(xì)胞或在組織中的細(xì)胞間傳播的能力。
最好是，按照本發(fā)明，病毒基本上保留其未經(jīng)修飾的臨床前體毒株的特性，如果在定量試驗(yàn)中，就待測(cè)特性而論，它保留未經(jīng)修飾的臨床前體毒株能力的75％、更優(yōu)選80％、90％、95％、98％、99％或100％。更優(yōu)選就待測(cè)特性而論，所述未經(jīng)修飾的臨床前體毒株和本發(fā)明經(jīng)修飾的毒株之間的任何差異都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
可以用標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，例如t-檢驗(yàn)、ANOVA或x2檢驗(yàn)，對(duì)本文所述特性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通常，測(cè)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平為p＝0.05(5％)、更優(yōu)選p＝0.01、p＝0.001、p＝0.0001、p＝0.000001。修飾本發(fā)明的病毒與其前臨床毒株相比通常是經(jīng)修飾的。具體地說，通常使得某些基因無功能，并且所述病毒也包含異源基因。通常，使本發(fā)明的病毒減毒。
根據(jù)本文所述目的改變的病毒區(qū)域或者可以被消除(完全或部分)或者成為無功能的、或者被其它序列取代、尤其是被異源基因序列取代?？梢允挂环N或多種基因成為無功能基因，并且可以插入一種或多種異源基因。本發(fā)明的溶瘤病毒在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的病毒是經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒。這些病毒可用于溶瘤法治療癌癥。這類病毒感染腫瘤細(xì)胞并在所述腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，隨后殺傷所述腫瘤細(xì)胞。因此，這類病毒是具有復(fù)制能力的病毒。最好是它們選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有復(fù)制能力。這意味著它們?cè)谀[瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)不復(fù)制，或者它們?cè)谀[瘤細(xì)胞內(nèi)比在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)更為有效地復(fù)制。選擇性復(fù)制能力的測(cè)定可以通過本文所述用以測(cè)定復(fù)制能力和腫瘤細(xì)胞殺傷能力的試驗(yàn)來進(jìn)行，如有需要，也可以通過本文列舉的統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。
優(yōu)選本發(fā)明的溶瘤病毒比具有相同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染腫瘤細(xì)胞或在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、殺傷腫瘤細(xì)胞或在組織中的細(xì)胞間傳播的能力強(qiáng)。更優(yōu)選這種能力為如本文所述的具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的更強(qiáng)能力。所述病毒株關(guān)于腫瘤細(xì)胞的特性可以用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行測(cè)定。
例如，病毒感染腫瘤細(xì)胞的能力可以通過測(cè)量為測(cè)量出給定的細(xì)胞百分率(例如50％或80％細(xì)胞)所需的病毒劑量進(jìn)行定量。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力可以通過生長(zhǎng)測(cè)量進(jìn)行測(cè)定，例如在實(shí)施例中所進(jìn)行的測(cè)定(參見圖2)，例如通過測(cè)量在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間的時(shí)間周期內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)的病毒生長(zhǎng)。
病毒殺傷腫瘤細(xì)胞的能力可以通過肉眼大致定量(參見圖3)，或者通過對(duì)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)對(duì)于給定細(xì)胞類型在給定時(shí)間點(diǎn)和MOI下保留的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而更準(zhǔn)確地定量。例如，可以在24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)內(nèi)并且使用任何已知腫瘤細(xì)胞類型進(jìn)行比較。具體地說，可以使用HT29結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞、LNCaP.FGC前列腺癌細(xì)胞、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞、SK-MEL-28惡性黑素瘤細(xì)胞或U-87 MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤星形細(xì)胞瘤細(xì)胞?？梢允褂眠@些細(xì)胞類型中的任一種或這些細(xì)胞類型的任何組合，也可以使用其它腫瘤細(xì)胞類型。可能最好構(gòu)建用于該目的的一組標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞類型。為了對(duì)在給定時(shí)間點(diǎn)保留的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以對(duì)排除錐蟲藍(lán)的細(xì)胞(即活細(xì)胞)的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。也可用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)或MTT分析進(jìn)行定量測(cè)定。也可以體內(nèi)測(cè)定腫瘤細(xì)胞殺傷能力，例如通過測(cè)量由于特定病毒引起的腫瘤體積的減小。
病毒在組織、尤其在實(shí)體組織內(nèi)傳播的能力也可以通過測(cè)定與原始感染部位相連部位的細(xì)胞數(shù)來進(jìn)行測(cè)定。
為了測(cè)定本發(fā)明病毒的特性，一般而言，最好使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室參比毒株進(jìn)行比較。可以使用任何合適的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室參比毒株。就HSV而論，最好使用HSV1毒株17+、HSV1毒株F或HSV1毒株KOS中的一種或多種。所述參比毒株通常具有與本發(fā)明待測(cè)毒株等同的修飾。因此，所述參比毒株通常具有等同修飾，例如基因缺失和/或異源基因插入。例如，就HSV毒株而論，如果在本發(fā)明的病毒中已經(jīng)使ICP34.5和ICP47編碼基因變成無功能的，則在參比毒株中也使它們變成無功能的。對(duì)參比毒株進(jìn)行的修飾可以與對(duì)本發(fā)明的毒株進(jìn)行的修飾相同。為此，意味著在參比毒株中的基因破壞位于與本發(fā)明毒株中的基因破壞完全等同的位置，例如缺失為相同大小并位于相同位置。同樣，在這些實(shí)施方案中，異源基因會(huì)在相同位置插入、由相同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)等等。然而，不一定需要進(jìn)行相同的修飾。重要的是參比基因具有功能上等同的修飾，例如使相同的基因變成無功能的和/或插入相同的一種或多種異源基因。
在本發(fā)明的溶瘤病毒中，可以對(duì)所述病毒進(jìn)行合適的修飾，使其具有溶瘤活性，如果它是非天然存在的，最好使其具有選擇性溶瘤活性。
就HSV而論，提供選擇性溶瘤活性的這類突變包括ICP34.5、ICP6和/或胸苷激酶(TK)、最好是ICP34.5編碼基因的突變。盡管可以使用其中ICP34.5為無功能的任何突變，但是有關(guān)HSV的實(shí)驗(yàn)室毒株的ICP34.5編碼基因的這類突變?cè)贑hou等1990、Maclean等1991中有描述。
因此，在HSV毒株中，最好對(duì)所述病毒進(jìn)行修飾，使其缺乏功能性ICP34.5編碼基因、功能性ICP6編碼基因、功能性糖蛋白H編碼基因、功能性胸苷激酶編碼基因中的一個(gè)或多個(gè)；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏與所述HSV基因之一等同的功能性基因。
更優(yōu)選所述病毒缺乏功能性ICP34.5編碼基因。
也可以進(jìn)行其它修飾。具體地說，就HSV而論，可以對(duì)所述病毒進(jìn)行修飾，使其缺乏功能性ICP47基因。這是因?yàn)镮CP47通常的功能是阻斷受HSV感染的細(xì)胞內(nèi)的抗原呈遞，所以其破壞產(chǎn)生這樣的病毒該病毒并不賦予受感染的腫瘤細(xì)胞特定特性，即可以保護(hù)受這種HSV感染的細(xì)胞抵抗宿主免疫系統(tǒng)的特性。
提供溶瘤特性(即與周圍組織相比在腫瘤內(nèi)選擇性復(fù)制)的任何其它基因缺失/突變的病毒也是本發(fā)明的病毒，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到的，上述列表為非窮盡性的，對(duì)上述任一病毒的其它基因功能的鑒定可能提示構(gòu)建也是本發(fā)明病毒的新病毒。
也可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)和/或本文描述的技術(shù)，將異源基因插入到本發(fā)明的這類病毒中。在溶瘤病毒中，所述異源基因通常是增強(qiáng)所述病毒對(duì)抗腫瘤的能力的基因。因此可以插入賦予病毒抗腫瘤特性的任何基因。具體地說，所述異源基因可以是能夠以有益方式改進(jìn)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的基因，尤其是免疫刺激多肽例如CD40L、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、其它細(xì)胞因子或趨化因子(例如RANTES)、B7.1或B7.2或IL12。或者，所述異源基因可以編碼前體藥物激活蛋白，例如硝基還原酶或細(xì)胞色素P450。在本發(fā)明的正文中，設(shè)想用被所述前體藥物激活蛋白激活的前體藥物和本發(fā)明病毒來聯(lián)合治療腫瘤。或者，所述異源基因可以編碼腫瘤抑制蛋白，例如p53。本發(fā)明的其它病毒株在其它實(shí)施方案中，非溶瘤病毒是合乎要求的。這些病毒可以是無復(fù)制能力的病毒。其功能通常是將異源基因傳遞至個(gè)體。
具體地說，對(duì)于在非溶瘤性應(yīng)用中用作載體，可以進(jìn)行突變，使得病毒調(diào)節(jié)性立即早期基因的表達(dá)減至最小。因而，可以單獨(dú)或聯(lián)合使ICP4、ICP27、ICP22和/或ICP0編碼基因失活或缺失，或者在病毒體反式激活蛋白vmw65中的突變包括阻止/降低其反式激活能力。在用于非溶瘤性應(yīng)用的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使ICP27、ICP0和ICP4編碼基因缺失(具有或不具有額外的ICP22和/或ICP47缺失/失活)，或者將ICP27和ICP4缺失加上vmw65中的失活，或者ICP4缺失加上vmw65中的失活。這類病毒的實(shí)例包括Samaniego等1998、Krisky等1998或Thomas等1999報(bào)道的病毒。親神經(jīng)病毒在將異源基因傳遞至神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，按照本發(fā)明可以使用親神經(jīng)病毒、尤其是單純皰疹病毒例如HSV1和HSV2。
按照本發(fā)明這一實(shí)施方案的病毒通常比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染神經(jīng)元的能力、在神經(jīng)組織中的細(xì)胞間傳播的能力或在軸突內(nèi)運(yùn)輸?shù)哪芰?qiáng)。感染神經(jīng)元的能力總的來講可以按照上述關(guān)于細(xì)胞的所述方法來測(cè)定。在軸突內(nèi)運(yùn)輸?shù)哪芰蛟谏窠?jīng)組織中的細(xì)胞間傳播的能力可以通過測(cè)定與原始感染部位相連部位的神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞的感染來測(cè)定。可以如上所述對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
在這些實(shí)施方案中，最好在HSV毒株中，對(duì)所述病毒進(jìn)行修飾，使其缺乏功能性ICP27編碼基因、功能性ICP4編碼基因、功能性ICP0編碼基因或功能性ICP22編碼基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏一種與所述HSV基因之一等同的功能性基因；和/或在HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性vmw65基因，這是由于在所述基因中消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的一個(gè)突變所致；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏與vmw65基因等同的功能性基因，這是由于在所述基因中消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的一個(gè)突變所致。
優(yōu)選使ICP27、ICP4、ICP0和ICP22編碼基因中的兩個(gè)或兩個(gè)以上變成無功能的，更優(yōu)選使三個(gè)、再更優(yōu)選使全部四個(gè)編碼基因變成無功能的。最好是，按照這些實(shí)施方案，本發(fā)明的病毒既缺乏功能性ICP4編碼基因，又缺乏功能性ICP27編碼基因，并且本發(fā)明的病毒在vmw65編碼基因中具有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的失活突變。
這類病毒可以用來治療周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的情況下，特別優(yōu)選使選自ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的至少兩個(gè)立即早期基因變成無功能的。免疫治療性病毒在免疫治療應(yīng)用領(lǐng)域，用本發(fā)明的皰疹病毒感染樹突細(xì)胞或免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞。通常，皰疹病毒感染樹突細(xì)胞，降低所述樹突細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答的能力。因此，對(duì)本發(fā)明的病毒進(jìn)行修飾，使它們能夠有效感染樹突細(xì)胞，但不阻止所述樹突細(xì)胞刺激免疫系統(tǒng)(WO00/08191)。在這種應(yīng)用中，本發(fā)明的病毒通常包含編碼抗原基因產(chǎn)物的異源基因。這可能是與致病感染或癌癥相關(guān)的抗原。所述基因在樹突細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且所述基因產(chǎn)物在所述樹突細(xì)胞表面作為抗原呈遞。這通過激活T細(xì)胞刺激針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答，所述T細(xì)胞尋找在其表面顯現(xiàn)該抗原的細(xì)胞，即腫瘤或病原體細(xì)胞或受病原體感染的細(xì)胞，然后將其破壞。
最好是，在HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性UL43基因和/或功能性vhs基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性UL43和/或vhs的等同基因；并且任選在HSV毒株中，所述病毒由于在與vmw65等同的基因中有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的突變，因而缺乏所述與vmw65等同的功能性基因；或者在非HSV毒株中，所述病毒由于在與vmw65等同的基因中有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的突變，因而缺乏所述與vmw65等同的功能性基因；并且任選缺乏選自ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的至少一個(gè)功能性立即早期基因。
在本發(fā)明的正文中，最好是本發(fā)明的病毒比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染樹突細(xì)胞或刺激免疫應(yīng)答的能力強(qiáng)，一般而言，可以按照上述關(guān)于細(xì)胞的所述方法，評(píng)價(jià)對(duì)樹突細(xì)胞的感染。具體地說，本發(fā)明的非實(shí)驗(yàn)室病毒株與參比實(shí)驗(yàn)室毒株相比，當(dāng)所述兩種毒株用量相同時(shí)感染樹突細(xì)胞的百分率通常更高?？梢杂靡陨纤龇椒ㄟM(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B.互補(bǔ)細(xì)胞系當(dāng)本發(fā)明的病毒是一種缺乏特定功能性必需基因(例如ICP4或ICP27編碼基因)的單純皰疹病毒時(shí)，讓本發(fā)明的病毒在表達(dá)該必需基因的細(xì)胞系上繁殖。例如，當(dāng)病毒缺乏功能性ICP27基因時(shí)，所述病毒可以在V27細(xì)胞(Rice和Knipe，1990)、2-2細(xì)胞(Smith等，1992)或B130/2細(xì)胞(Howard等，1998)上繁殖。當(dāng)病毒缺乏功能性ICP4基因時(shí)，所述病毒可以在表達(dá)ICP4的細(xì)胞系例如E5細(xì)胞(DeLuca等，1985)上繁殖。當(dāng)病毒缺乏功能性ICP4基因和功能性ICP27基因時(shí)，所述病毒在表達(dá)ICP4和ICP27兩者的細(xì)胞系(例如E26細(xì)胞；Samaniego等，1995)上繁殖；而當(dāng)病毒還缺乏功能性vmw65基因時(shí)，所述病毒可以在也含有vmw65的非HSV同源物的細(xì)胞系(例如得自馬皰疹病毒，Thomas等，1999)上繁殖。在病毒生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基中包括六亞甲基雙乙酰胺(HMBA)，也可以部分代償vmw65的突變(MacFarlane等，1992)。
表達(dá)ICP27的細(xì)胞系可以通過用包含能夠在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的功能性HSV ICP27基因的載體最好是質(zhì)粒載體編碼一種選擇標(biāo)記(例如新霉素抗性)的載體最好是質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如Vero細(xì)胞或BHK細(xì)胞)來產(chǎn)生。然后采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如，Rice和Knipe中所述的方法，1990)，篩選具有所述選擇標(biāo)記的克隆，進(jìn)一步確定哪些克隆還表達(dá)功能性ICP27，例如基于其支持ICP27-HSV毒株生長(zhǎng)的能力來確定。
如上所述產(chǎn)生不能讓ICP27-突變型HSV毒株回復(fù)為具有功能性ICP27毒株的細(xì)胞系，確保包含功能性ICP27基因的載體不含與ICP27突變型病毒中其余序列重疊的序列(即與所述序列同源的序列)。
在本發(fā)明的HSV毒株在其它必需基因(例如ICP4)中包含失活修飾的情況下，互補(bǔ)細(xì)胞系將以有關(guān)ICP27所述的相同方式包含互補(bǔ)經(jīng)修飾的必需基因的功能性HSV基因。例如，在ICP27和ICP4兩者中均包含突變的HSV毒株的情況下，使用表達(dá)ICP27和ICP4兩者的細(xì)胞系(例如Samaniego等，1995或Thomas等，1999所述)?？梢砸耘c有關(guān)ICP27所述方式的相似方式，構(gòu)建表達(dá)其它必需基因的HSV毒株。再者，如果確保沒有所述其余病毒DNA和插入到供病毒生長(zhǎng)的細(xì)胞系之間重疊的序列，則可將所述病毒在生長(zhǎng)期間回復(fù)為缺陷程度降低形式的可能性減至最小。C.突變方法可以通過本領(lǐng)域眾所周知的多種技術(shù)使所述各種病毒基因無功能活性的基因。例如，可以通過缺失、取代或插入、最好是通過缺失使它們無功能活性。缺失可以去除基因的一部分或完整的基因。例如，可以進(jìn)行僅一個(gè)核苷酸的缺失，導(dǎo)致移碼。然而，優(yōu)選進(jìn)行較大的缺失，例如整個(gè)編碼和非編碼序列的至少25％、更優(yōu)選至少50％(或者，用絕對(duì)的術(shù)語(yǔ)，至少10個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少1000個(gè)核苷酸)。特別優(yōu)選去除所述完整的基因和某些側(cè)翼序列。插入序列可以包括下文所述的一種或多種異源基因。就vmw65基因而論，不缺失整個(gè)基因，由于它編碼必需的結(jié)構(gòu)蛋白，但進(jìn)行小的失活突變，以消除vmw65轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)E基因的能力(例如，Ace等，1989或Smiley等，1997)。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的同源重組方法，對(duì)所述皰疹病毒進(jìn)行突變。例如，將HSV基因組DNA與包含鄰接HSV同源序列的突變序列的載體、最好是質(zhì)粒載體一起轉(zhuǎn)染。所述突變序列可以包含缺失、插入或取代，所有這些突變序列都可以通過常規(guī)技術(shù)來構(gòu)建。插入可以包括選擇標(biāo)記基因，例如lacZ或GFP，用于通過例如β-半乳糖苷酶活性或熒光篩選重組病毒。D.異源基因和啟動(dòng)子可以對(duì)本發(fā)明的病毒進(jìn)行修飾，以攜帶一種或多種異源基因。術(shù)語(yǔ)“異源基因”包括任何基因。雖然異源基因通常是在皰疹病毒基因組中不存在的基因，但是可以使用一種或多種皰疹基因，前提是所述編碼序列不是與其天然相關(guān)的所述病毒控制序列有效連接。所述異源基因可以是野生型基因的任何等位基因變異體，或者它可以是突變基因。術(shù)語(yǔ)“基因”包括能夠至少被轉(zhuǎn)錄的核酸序列。因而，該定義包括mRNA、tRNA和rRNA編碼序列。然而，本發(fā)明涉及多肽的表達(dá)，而不是tRNA和rRNA的表達(dá)。mRNA編碼序列任選包括部分或全部與被翻譯的編碼序列天然相連或者與其相關(guān)的5’和/或3’轉(zhuǎn)錄但非翻譯的側(cè)翼序列?？梢匀芜x還包括通常與轉(zhuǎn)錄序列相關(guān)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄控制序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和下游增強(qiáng)子元件。
通過HSV毒株與例如攜帶鄰接HSV序列的一種或多種異源基因的質(zhì)粒載體進(jìn)行同源重組，可以將所述一種或多種異源基因插入到病毒基因組中。采用本領(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)，可以將一種或多種異源基因?qū)氚捳畈《拘蛄械倪m宜質(zhì)粒載體中?？梢詫⒁环N或多種異源基因插入到病毒基因組的任何位置上，前提是所述病毒仍可以繁殖。最好是將一種或多種異源基因插入到必需基因中?？梢栽谒霾《净蚪M內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)上插入異源基因。
最好將一種或多種異源基因的轉(zhuǎn)錄序列與允許所述一種或多種異源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、最好是腫瘤細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的控制序列有效連接。術(shù)語(yǔ)“有效連接的”是指一種并列，其中所述組分之間的關(guān)系允許它們以其計(jì)劃的方式起作用。與編碼序列“有效連接的”控制序列的連接方式，使得在與所述控制序列匹配的條件下所述編碼序列的表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。
所述控制序列包含允許所述一種或多種異源基因表達(dá)的啟動(dòng)子和用于終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。所述啟動(dòng)子選自在哺乳動(dòng)物、最好是人神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞或腫瘤或免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)有功能的啟動(dòng)子。所述一種或多種啟動(dòng)子可以來源于真核基因的啟動(dòng)子序列。例如，啟動(dòng)子可以來源于其中要發(fā)生所述異源基因表達(dá)的細(xì)胞、最好是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、最好是人細(xì)胞的基因組。就真核啟動(dòng)子而論，它們可以是以普遍存在的方式起作用的啟動(dòng)子(例如β-肌動(dòng)蛋白、微管蛋白的啟動(dòng)子)，或者是以組織特異性方式起作用的啟動(dòng)子(例如神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)啟動(dòng)子)。它們也可以是對(duì)特定刺激應(yīng)答的啟動(dòng)子，例如結(jié)合類固醇激素受體的啟動(dòng)子。也可以使用病毒啟動(dòng)子，例如莫洛尼鼠類白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MMLV LTR)啟動(dòng)子或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子一人或鼠巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子或皰疹病毒基因啟動(dòng)子，包括驅(qū)動(dòng)表達(dá)潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的皰疹病毒基因啟動(dòng)子。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)克隆技術(shù)(參見例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning-A laboratory manual；Cold Spring HarborPress)，可以構(gòu)建包含一種或多種異源基因和控制序列的表達(dá)盒和其它適宜構(gòu)建體。
所述啟動(dòng)子可能最好是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，使得所述異源基因的表達(dá)水平可以在細(xì)胞的生存期受調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)型的是指可以調(diào)節(jié)采用所述啟動(dòng)子所獲得的表達(dá)水平。例如，在其中超過一個(gè)異源基因插入到所述HSV基因組的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)啟動(dòng)子可以包括對(duì)先前報(bào)道的tet阻抑蛋白/VP16轉(zhuǎn)錄激活蛋白融合蛋白應(yīng)答的啟動(dòng)子(Gossen和Bujard，1992，Grossen等，1995)并且驅(qū)動(dòng)待調(diào)節(jié)的異源基因表達(dá)的啟動(dòng)子。第二個(gè)啟動(dòng)子可以包括驅(qū)動(dòng)tet阻抑蛋白/VP16融合蛋白表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如CMV IE啟動(dòng)子)。因此，在該實(shí)施例中，第一個(gè)異源基因的表達(dá)將取決于是否存在四環(huán)素。
異源基因通常編碼具有治療用途的多肽。例如，在神經(jīng)系統(tǒng)中，在非溶瘤性應(yīng)用時(shí)，可以調(diào)節(jié)疼痛的基因刺激神經(jīng)再生長(zhǎng)或防止神經(jīng)變性。在溶瘤性應(yīng)用中，異源基因可以編碼其自身有細(xì)胞毒性的蛋白、編碼前體藥物激活酶或能夠刺激或增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的蛋白。
異源基因也可以包括標(biāo)記基因(例如，編碼β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白或其它熒光蛋白)或其產(chǎn)物調(diào)節(jié)其它基因表達(dá)的基因(例如包括上述tet阻抑蛋白/vmw65轉(zhuǎn)錄激活融合蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)。
基因治療和其它治療應(yīng)用可能非常需要給予多種基因。多種基因的表達(dá)對(duì)于治療各種各樣的病癥可能是有利的。皰疹病毒特別適合，因?yàn)樗鼈儾痪哂衅渌《据d體系統(tǒng)的有限包裝能力。因而，在其基因組中可以容納多種異源基因。例如，可以將2-5種基因插入到所述基因組中。
例如有至少兩種其中可以實(shí)現(xiàn)該結(jié)果的方式。例如，可以在所述病毒基因組的單一位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)上將不止一種異源基因和相關(guān)控制序列導(dǎo)入特定HSV毒株中。也有可能應(yīng)用成對(duì)的啟動(dòng)子(相同或不同的啟動(dòng)子)，所述啟動(dòng)子相互為相反定向，分別驅(qū)動(dòng)一種如上所述的異源基因(相同或不同的異源基因)的表達(dá)。E.治療應(yīng)用本發(fā)明的病毒可以用于治療方法中。具體地說，本發(fā)明的溶瘤病毒可以用于包括溶瘤法治療癌癥的應(yīng)用中，例如通過直接腫瘤內(nèi)注射。在所述病毒包含編碼前體藥物激活蛋白的異源基因的情況下，可以進(jìn)行另外的前體藥物療法。另外，可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式將治療與免疫應(yīng)答的刺激聯(lián)合。本發(fā)明的病毒可以用來治療性治療哺乳動(dòng)物、最好是人體內(nèi)的任何實(shí)體瘤。例如，可以將本發(fā)明的病毒給予患有以下疾病的受治療者前列腺癌、乳癌、肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、結(jié)腸癌或?qū)m頸癌；腺癌；黑素瘤；淋巴瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；或肉瘤，例如軟組織肉瘤和骨肉瘤。
本發(fā)明的無復(fù)制能力病毒可以用來將基因傳遞至需要基因治療的個(gè)體。具體地說，本發(fā)明的親神經(jīng)病毒可以用來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病。用于治療或預(yù)防的優(yōu)選中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)變性性疾病。用于治療或預(yù)防的特別優(yōu)選的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是中風(fēng)、帕金森氏病、早老性癡呆、泰-薩病(Tay Sachs disease)和粘多糖病。用于治療或預(yù)防的優(yōu)選周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、慢性疼痛和外周神經(jīng)損傷。
本發(fā)明的免疫治療性病毒可以用來預(yù)防或治療其抗原與所插入的異源編碼基因有關(guān)的致病感染或癌癥。F.給藥因此，本發(fā)明的病毒可以用于需要治療的患者、最好是人類患者。本發(fā)明的病毒可以用來溶瘤法治療癌癥，而本發(fā)明的皰疹病毒(除溶瘤性應(yīng)用外)可以用來治療例如疼痛、神經(jīng)系統(tǒng)的變性性疾病或用來刺激神經(jīng)再生長(zhǎng)。治療性治療的目的是改善所述患者的病癥。通常，采用本發(fā)明的病毒治療性治療會(huì)緩解所述待治療患者的疾病或病癥的癥狀。因此，按照本發(fā)明的治療方法包括給予患有癌癥、疼痛、神經(jīng)變性性疾病或神經(jīng)損傷的患者治療有效量的本發(fā)明病毒。
將本發(fā)明的溶瘤病毒給予腫瘤患者通常會(huì)殺傷腫瘤細(xì)胞，因而減少腫瘤大小和/或防止惡性腫瘤細(xì)胞的播散。將本發(fā)明的病毒給予患有其它疾病(例如疼痛、變性性疾病或神經(jīng)損傷)的患者通常會(huì)改善所述患者的病癥。例如減輕疼痛的嚴(yán)重程度、減慢神經(jīng)組織的變性或促進(jìn)神經(jīng)再生長(zhǎng)。
一種給藥治療的方法包括將所述病毒和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合，以制備藥用組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸緩沖鹽溶液。
然后，可以采用將所述載體組合物直接注射到所述靶組織，進(jìn)行溶瘤法治療和/或?qū)⒒騻鬟f至細(xì)胞內(nèi)以供治療。就HSV而論，給予的病毒量范圍為104-1010pfu、優(yōu)選105-108pfu、更優(yōu)選約106-108pfu。對(duì)于溶瘤法治療或非溶瘤法治療，當(dāng)注射時(shí)，基本上由所述病毒和一種藥學(xué)上可接受的合適載體或稀釋劑組成的藥用組合物的注射用量通常至多500μl、通常1-200μl、優(yōu)選1-10μl。然而，對(duì)于某些溶瘤法治療應(yīng)用，根據(jù)所述腫瘤和接種部位，也可以使用至多10ml的較大體積。
因?yàn)榧夹g(shù)人員能夠容易地確定最佳給藥途徑和劑量，所以所述給藥途徑和劑量?jī)H作為指南。所述劑量可以根據(jù)各種參數(shù)、尤其根據(jù)待治療患者的年齡、體重和病癥、疾病或病癥的嚴(yán)重程度以及給藥途徑來確定。
對(duì)于癌癥患者優(yōu)選的給藥途徑是直接注射到腫瘤內(nèi)。也可以系統(tǒng)給予所述病毒，或通過注射將所述病毒給予給所述腫瘤供血的血管內(nèi)。最適給藥途徑將取決于所述腫瘤的位置和大小。所述劑量可以根據(jù)各種參數(shù)、尤其是根據(jù)腫瘤的位置、腫瘤的大小、待治療患者的年齡、體重和病癥以及給藥途徑來確定。G.非治療方面也提供可供按照本發(fā)明進(jìn)行修飾的合適臨床毒株的鑒定方法。另外，還提供靶證實(shí)的方法。這些涉及對(duì)適用于如上所述的本發(fā)明治療應(yīng)用的基因進(jìn)行鑒定。
也提供本發(fā)明病毒的制備方法。
以下實(shí)施例說明本發(fā)明。
先前已經(jīng)顯示其中神經(jīng)毒力因子ICP34.5被失活的I型單純皰疹病毒(HSV1)在體外和體內(nèi)兩種腫瘤模型中均指導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞裂解。這類病毒在通過直接注射到晚期神經(jīng)膠質(zhì)癌患者的大腦內(nèi)進(jìn)行的I期臨床試驗(yàn)中，也顯示出是安全的。
早期研究一直使用連接傳代的HSV1的實(shí)驗(yàn)室分離株(來源于HSV1毒株17+或HSV1毒株F的病毒)，與最新的臨床分離株相比，可以預(yù)期所述病毒在人腫瘤細(xì)胞方面的裂解能力被減弱。
在目標(biāo)是產(chǎn)生具有增強(qiáng)的溶瘤潛能和抗腫瘤潛能的ICP34.5缺失型HSV的研究中，我們使HSV1臨床分離株缺失了ICP34.5，并比較與HSV1毒株17+(標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株)相比的在多種人腫瘤細(xì)胞類型中的復(fù)制潛能和裂解潛能。病毒構(gòu)建(參見

圖1)所用的病毒或者基于HSV1毒株17+(標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室毒株)或者基于來源于唇皰疹、得自HSV1的常見復(fù)活物(frequent re-activator)的兩株臨床分離株。這些毒株命名為BL1和JS1。使毒株17+和JS1完全缺失ICP34.5并且插入CMV-GFP盒。通過插入人GM-CSF或小鼠GM-CSF，以便置換ICP34.5基因，對(duì)JS1也進(jìn)行進(jìn)一步工程改造。因此，BL1和JS1為臨床分離株或“非實(shí)驗(yàn)室”毒株。本文所討論的JS1衍生毒株也是非實(shí)驗(yàn)室毒株，即本發(fā)明經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室毒株。病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)(參見圖2)與HSV1 ICP34.5缺失型毒株17+相比，當(dāng)在72小時(shí)內(nèi)測(cè)試時(shí)，JS1和BL1顯示在某些被測(cè)人腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)增強(qiáng)(圖2)。選擇JS1以供進(jìn)行進(jìn)一步研究用，并且對(duì)其進(jìn)行如上所述的修飾(參見圖1和上文)。病毒的裂解能力(參見圖3)在所有被測(cè)腫瘤細(xì)胞系中，用JS1衍生的非實(shí)驗(yàn)室毒株衍生病毒增強(qiáng)裂解(細(xì)胞殺傷)能力。更具體地說，參照?qǐng)D3，JS1/ICP34.5-病毒，即通過缺失去除ICP34.5的JS1，顯示在以下細(xì)胞內(nèi)裂解能力增強(qiáng)HT29結(jié)腸直腸腺癌、LNCaP.FGC前列腺癌、MDA-MB-231乳腺癌、SK-MEL-28惡性黑素瘤和U-87 MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤星形細(xì)胞瘤。
與毒株17+相比，在用BL1、JS1感染后，通過對(duì)受感染細(xì)胞進(jìn)行錐蟲藍(lán)排除測(cè)定，也評(píng)價(jià)在各種劑量和時(shí)間在SK-MEL-28、MDA-MB-231和HT29細(xì)胞內(nèi)的裂解能力?；罴?xì)胞排除錐蟲藍(lán)，因此，通過該方法可以評(píng)價(jià)在培養(yǎng)物中剩余的活細(xì)胞數(shù)。以MOI為0.1或1用或者17+、BL1或者JS1，對(duì)在六孔平皿的復(fù)份孔中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系感染24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)，然后對(duì)活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在等同的未感染對(duì)照孔中的活細(xì)胞數(shù)百分率示于表1中。
因此，當(dāng)在人類患者中用于治療癌癥時(shí)，在所有情況下，用臨床分離株病毒BL1和JS1比實(shí)驗(yàn)室分離株17+殺死更多的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到溶瘤活性增加，因此應(yīng)用最新的臨床病毒株可能增強(qiáng)這類經(jīng)修飾以獲得腫瘤選擇性復(fù)制(例如通過缺失ICP34.5)的病毒的抗腫瘤能力。表1
進(jìn)一步增強(qiáng)的抗腫瘤活性如果這些病毒用來傳遞具有抗腫瘤活性的基因，則也可以預(yù)期進(jìn)一步增強(qiáng)的活性。這樣的基因包括編碼前體藥物激活蛋白或免疫刺激蛋白的基因。
為此，我們由JS1構(gòu)建了一種表達(dá)人GM-CSF或小鼠GM-CSF的HSV1的ICP34.5缺失型臨床分離株，GM-CSF是一種有效的免疫刺激蛋白。該病毒設(shè)計(jì)用以在腫瘤內(nèi)注射后增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
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權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒株的用途，所述病毒株用于生產(chǎn)溶瘤法治療癌癥的藥物。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室毒株(a)從其宿主中分離其未經(jīng)修飾的前體毒株算起，在培養(yǎng)物中經(jīng)歷了1年或1年以下，或(b)從其宿主中分離其未經(jīng)修飾的前體毒株算起，經(jīng)歷了100個(gè)連續(xù)傳代周期或100個(gè)連續(xù)傳代周期以下，或(c)比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染腫瘤細(xì)胞或在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、殺傷腫瘤細(xì)胞或在組織中的細(xì)胞間傳播的能力強(qiáng)，或(d)就(c)中限定的一種或多種特性而論，基本上具有其未經(jīng)修飾的前體毒株的能力。
3.權(quán)利要求2的用途，其中在(c)中所述更強(qiáng)的能力為具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的更強(qiáng)的能力；或者其中在(d)中所述能力基本上是相同的能力或沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的能力。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株是皰疹病毒毒株、腺病毒毒株、微小RNA病毒毒株、反轉(zhuǎn)錄病毒毒株或甲病毒毒株。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株是皰疹病毒毒株。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株是單純皰疹病毒(HSV)毒株。
7.權(quán)利要求6的用途，其中HSV毒株是HSV1毒株或HSV2毒株。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的用途，其中在HSV毒株中，對(duì)所述病毒進(jìn)行修飾，使其缺乏功能性ICP34.5編碼基因、功能性ICP6編碼基因、功能性糖蛋白H編碼基因、功能性胸苷激酶編碼基因中的一個(gè)或多個(gè)；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏與所述HSV基因之一等同的功能性基因。
9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述毒株是HSV毒株，并且所述病毒缺乏功能性ICP34.5編碼基因。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述病毒還缺乏功能性ICP47基因。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株還包含一種異源基因。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述異源基因是能夠改進(jìn)免疫應(yīng)答的基因。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述能夠改進(jìn)免疫應(yīng)答的異源基因編碼免疫刺激多肽或能夠改進(jìn)免疫應(yīng)答的其它基因產(chǎn)物、前體藥物激活蛋白、腫瘤抑制蛋白或促細(xì)胞凋亡的(pro-apoptotic)基因產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述免疫刺激多肽是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、其它細(xì)胞因子或趨化因子、RANTES、B7.1或B7.2或IL12，或者其中所述前體藥物激活蛋白是硝基還原酶或細(xì)胞色素p450，或者其中所述腫瘤抑制蛋白是p53。
15.權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室毒株是HSV毒株，權(quán)利要求2中限定的參比毒株是具有與所述非實(shí)驗(yàn)室毒株等同修飾的HSV1毒株17+、HSV1毒株F或HSV1毒株KOS。
16.一種經(jīng)修飾的、無復(fù)制能力的、包含一種異源基因的非實(shí)驗(yàn)室病毒株的用途，所述病毒株用于生產(chǎn)將所述基因傳遞至受治療者的藥物。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株(a)從其宿主中分離其未經(jīng)修飾的前體毒株算起，在培養(yǎng)物中經(jīng)歷了1年或1年以下，或(b)從其宿主中分離其未經(jīng)修飾的前體毒株算起，經(jīng)歷了100個(gè)連續(xù)傳代周期或100個(gè)連續(xù)傳代周期以下，或(c)比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染靶細(xì)胞的能力強(qiáng)，或(d)比具有等同修飾的參比實(shí)驗(yàn)室毒株感染神經(jīng)元、在神經(jīng)組織中的細(xì)胞間傳播、在軸突內(nèi)運(yùn)輸、感染樹突細(xì)胞或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力強(qiáng)，或(e)就(c)或(d)中限定的一種或多種特性而論，基本上具有其未經(jīng)修飾的前體毒株的能力。
18.權(quán)利要求17的用途，其中在(c)中所述更強(qiáng)的能力為具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的更強(qiáng)的能力；或者在(d)中所述能力基本上是相同的能力或沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異的能力。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所限定。
20.權(quán)利要求19的用途，其中在HSV毒株中，對(duì)所述病毒進(jìn)行修飾，使其缺乏功能性ICP27編碼基因、功能性ICP4編碼基因、功能性ICP0編碼基因或功能性ICP22編碼基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部；或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏與所述HSV基因之一等同的功能性基因；和/或，在HSV毒株中，所述病毒由于在vmw65基因中有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的突變，因而缺乏功能性vmw65基因；或者在非HSV毒株中，所述病毒由于在與vmw65等同的基因中有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的突變，因而缺乏所述與vmw65等同的功能性基因。
21.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用來通過將所述藥物給予外周神經(jīng)而治療或預(yù)防周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并且所述異源基因編碼在治療所述周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有治療用途的多肽或反義RNA。
22.一種確定一種基因是否對(duì)與周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響的方法，所述方法包括(i)將包含一種異源基因、如權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)限定的無復(fù)制能力的皰疹病毒接種到外周神經(jīng)中；和(ii)監(jiān)測(cè)所述疾病的表型或所述基因的表達(dá)對(duì)所述細(xì)胞的影響，由此確定所述基因是否具有與所述疾病有關(guān)的效應(yīng)。
23.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用來治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所述異源基因編碼在治療所述疾病方面具有治療用途的多肽或反義RNA，并且所述無復(fù)制能力的皰疹病毒包含(a)一個(gè)或多個(gè)突變，所述突變阻止或降低至少兩種立即早期基因的表達(dá)；和(b)一種異源基因，所述異源基因與在皰疹病毒的潛伏期有活性的啟動(dòng)子有效連接。
24.權(quán)利要求27的用途，其中所述毒株是HSV毒株，所述一種或多種立即早期基因是ICP0、ICP4、ICP22和ICP27編碼基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。
25.一種確定一種基因是否對(duì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響的方法，所述方法包括(i)將權(quán)利要求23或24中限定的無復(fù)制能力的皰疹病毒接種到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)；和(ii)監(jiān)測(cè)所述疾病的表型或所述基因的表達(dá)對(duì)所述細(xì)胞的影響，由此確定所述基因是否對(duì)所述細(xì)胞或所述表型有影響。
26.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)的用途，其中所述皰疹病毒是能夠有效感染樹突細(xì)胞但不阻止受感染細(xì)胞刺激免疫應(yīng)答的減毒皰疹病毒；所述藥物用于治療或預(yù)防致病感染或癌癥的方法中；所述方法包括用所述病毒感染樹突細(xì)胞；并且所述異源基因編碼與所述感染或癌癥相關(guān)的抗原。
27.權(quán)利要求26的用途，其中，在HSV毒株中，所述病毒缺乏功能性UL43基因和/或功能性vhs基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒缺乏一種UL43和/或vhs的功能性等同基因；并且任選的是，在HSV毒株中，所述病毒還缺乏功能性ICP34.5基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒還缺乏ICP34.5的功能性等同基因；并且任選的是，在HSV毒株中，所述病毒由于在vmw65基因中有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的突變，因而缺乏功能性vmw65基因，或者在非HSV毒株中，所述病毒由于在與vmw65等同的基因中有一個(gè)消除其轉(zhuǎn)錄激活活性的突變，因而缺乏所述與vmw65等同的功能性基因；并且任選缺乏至少一種功能性立即早期基因。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述毒株是HSV毒株，所述一種或多種立即早期基因是ICP0、ICP4、ICP22和ICP27編碼基因中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部。
29.一種確定一種基因是否編碼與致病感染或癌癥相關(guān)的抗原的方法，所述方法包括用權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)限定的病毒感染樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，并且監(jiān)測(cè)所述基因的多肽產(chǎn)物的抗原呈遞、或所述基因表達(dá)的效應(yīng)、或所述致病感染或癌癥的表型，由此確定所述基因是否編碼與所述感染或癌癥相關(guān)的抗原以及其自身是否具有治療潛能或者是治療性干涉的靶。
30.一種測(cè)定非實(shí)驗(yàn)室病毒株對(duì)于修飾成如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)限定的經(jīng)修飾的毒株的適應(yīng)性的方法，所述方法包括(i)任選地從宿主中分離非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)提供所述非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(iii)就權(quán)利要求2中的步驟(c)或(d)或者權(quán)利要求17中的步驟(c)、(d)或(e)限定的一種或多種特征而論，評(píng)價(jià)所述病毒的特性；并且任選地，(iv)選擇供修飾用的具有理想特性的病毒株。
31.一種測(cè)定非實(shí)驗(yàn)室病毒株對(duì)于修飾成權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)限定的經(jīng)修飾的溶瘤毒株的適應(yīng)性的方法，所述方法包括(i)任選地從宿主中分離非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)評(píng)價(jià)所述病毒在一種或多種類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)；并且任選地(iii)選擇供修飾用的具有高生長(zhǎng)速率的病毒株。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述病毒如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所限定。
33.一種測(cè)定非實(shí)驗(yàn)室病毒株對(duì)于修飾成經(jīng)修飾的溶瘤毒株的適應(yīng)性的方法，所述方法包括(i)提供一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株，任選地通過權(quán)利要求31或32中的步驟(ii)的方法對(duì)其進(jìn)行選擇；(ii)修飾所述毒株，使其變成溶瘤毒株；和(iii)評(píng)價(jià)所述經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；并且任選地(iv)選擇表現(xiàn)出高腫瘤細(xì)胞殺傷能力的毒株用于進(jìn)一步修飾；并且任選地(v)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。
34.一種權(quán)利要求33的方法，其中所述病毒如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所限定。
35.一種權(quán)利要求33的方法，其中所述病毒是皰疹病毒，并且在HSV毒株中，通過使得一種或多種選自ICP34.5、ICP6和胸苷激酶編碼基因的基因變成無功能的對(duì)其進(jìn)行修飾；或者在非HSV毒株中，通過使得與所述一種或多種HSV基因等同的一種或多種基因變成無功能的對(duì)其進(jìn)行修飾。
36.一種權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)的方法，其中通過與其相同的基因變成無功能的參比實(shí)驗(yàn)室毒株的腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)行比較，測(cè)定所述經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株的腫瘤細(xì)胞殺傷能力。
37.一種權(quán)利要求36的方法，其中所述非實(shí)驗(yàn)室毒株是HSV毒株，所述參比毒株是HSV1毒株17+、HSV毒株F或HSV毒株KOS。
38.一種確定一種基因是否增強(qiáng)病毒的抗腫瘤效應(yīng)的方法，所述方法包括(i)提供一種權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)限定的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株；(ii)將所述基因作為異源基因插入到所述病毒中；和(iii)與步驟(i)中提供的前體毒株的能力相比，評(píng)價(jià)所述經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤毒株殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
39.一種經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒株的制備方法，所述方法包括(i)從宿主中分離一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)任選測(cè)定其對(duì)如權(quán)利要求33所述的修飾的適應(yīng)性；和(iii)對(duì)其進(jìn)行修飾，使其成為溶瘤病毒；并且任選地(iv)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所產(chǎn)生的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒如權(quán)利要求2-15中任一項(xiàng)所限定。
41.一種經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株的制備方法，所述方法包括(i)提供一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株；(ii)對(duì)其進(jìn)行修飾，使其成為無復(fù)制能力的病毒株，和(iii)插入一種異源基因。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所產(chǎn)生的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株如權(quán)利要求16-29中任一項(xiàng)所限定。
43.一種權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)限定的、經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室溶瘤病毒株。
44.一種權(quán)利要求16-29中任一項(xiàng)限定的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株，所述病毒株包含一種異源基因。
45.一種權(quán)利要求43或44的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株，所述病毒株是皰疹病毒毒株。
46.一種權(quán)利要求45的經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株，所述病毒株是單純皰疹病毒(HSV)毒株。
47.一種基因或由所述基因編碼的基因產(chǎn)物在生產(chǎn)治療周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物方面的用途，其中所述基因通過權(quán)利要求22的方法鑒定為對(duì)與周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響。
48.一種基因或由所述基因編碼的基因產(chǎn)物在生產(chǎn)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物方面的用途，其中所述基因通過權(quán)利要求23的方法鑒定為對(duì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的表型或?qū)εc中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞有影響。
49.一種基因或由所述基因編碼的抗原在生產(chǎn)治療或預(yù)防致病感染或癌癥的藥物方面的用途，其中所述基因通過權(quán)利要求29的方法鑒定為編碼與所述感染或癌癥相關(guān)的抗原。
50.一種非實(shí)驗(yàn)室病毒株，所述病毒株通過權(quán)利要求30-42中任一項(xiàng)的方法鑒定或在所述方法的過程中產(chǎn)生。
51.一種基因或由所述基因編碼的基因產(chǎn)物在生產(chǎn)治療或預(yù)防癌癥的藥物方面的用途，其中所述基因通過權(quán)利要求38的方法鑒定為增強(qiáng)病毒的抗腫瘤效應(yīng)。
52.一種經(jīng)修飾的非實(shí)驗(yàn)室病毒株，所述病毒株通過權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)的方法獲得或者可通過所述方法獲得。
53.HSV1毒株JS1或由其衍生的HSV1毒株，所述HSV1毒株JS1保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，臨時(shí)保藏號(hào)為01010209。
54.一種HSV1毒株，所述HSV1毒株由權(quán)利要求53中限定的JS1衍生并且具有權(quán)利要求2-29中任一項(xiàng)所述的特征。
55.一種HSV1毒株，所述HSV1毒株由權(quán)利要求54中限定的JS1衍生并且經(jīng)過修飾，使其缺乏功能性ICP34.5基因、并且任選地缺乏功能性ICP47基因；并且任選地還包含一種編碼GMCSF的異源基因。
56.一種藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求53-55中任一項(xiàng)限定的病毒。
57.一種用來治療人或動(dòng)物的權(quán)利要求53-55中任一項(xiàng)限定的病毒。
58.一種治療需要所述治療的個(gè)體的腫瘤的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體有效量的權(quán)利要求1中限定的病毒。
59.一種將基因傳遞至需要所述基因的個(gè)體的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體有效量的權(quán)利要求16中限定的病毒。
60.一種治療或預(yù)防周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要求21中限定的病毒給予需要所述治療或預(yù)防的個(gè)體的外周神經(jīng)。
61.一種治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括給予需要所述治療或預(yù)防的個(gè)體權(quán)利要求23中限定的病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及非實(shí)驗(yàn)室病毒株，例如皰疹病毒(諸如HSV)的非實(shí)驗(yàn)室病毒株，與實(shí)驗(yàn)室病毒株相比，所述病毒株具有改良的溶瘤能力和/或基因傳遞能力。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1425073SQ01806750
公開日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
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