專利名稱：堿性β－甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為微生物發(fā)酵生產(chǎn)新型β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法，涉及一種新的酶制劑。
β-甘露聚糖酶(1.4-β-D-mannan mannohydrolase，β-mannanaseEC 3.2.1.78)是一種半纖維素酶，可將葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等一些植物多糖降解為甘露寡糖，與纖維素酶及木聚糖酶一起成為生物轉(zhuǎn)化中最重要的酶系。β-甘露聚糖酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，自六十年代初，已有許多關(guān)于微生物產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的報(bào)道，已知產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的微生物包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophile)、野油菜黃單孢桿菌(Xanthomonas campestris)、乳酸細(xì)菌(Enterococcus sp.)、陸生梭孢菌(Thielavia terrestris)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、木霉(Trichoderma sp.)和鏈霉菌(Streptomyces sp.)等，近年來國內(nèi)外競相研究開發(fā)這類酶制劑，并已有一些專利報(bào)道及許多研究報(bào)告。其中，涉及到不同性質(zhì)酶的生產(chǎn)方法、純化與特性、基因分析等，包括低溫酶、高溫酶等，(JP-；JP05176767，03.06.1993，SU-；SU1514776，26.10.1987；AU-；WO9324622，18.05.1993；EP529712，1991；Ratto，M，et al.Biotechnol.lett.，10661-664，1988；Araujo，A.et al.J.Ind.Microbiol.6269-274，1990；World-J.Microbiol.Biotechnol.；11310-374，1995；J.Biotechnol.45165-172，1996；Appl.Environ.Microbiol.63169-177，1997；Appl.Biochem.Biotechnol.70-72939-953，1998；J.Biotechnol.644428-4432，1998；J.Biotechnol.，63199-210，1998；FEBS Lett.443149-153，1999；J.Bacteriol.1811643-1651，1999)。
在堿性條件下，植物多糖大分子易于溶漲，而且許多生物處理過程需要堿性條件，因此，堿性β-甘露聚糖酶具有特殊的應(yīng)用價(jià)值，而涉及堿性甘露聚糖酶的專利僅有三個(gè)專利，并且都是小試條件。第一個(gè)堿性β-甘露聚糖酶的報(bào)道是日本Horikoshi等1986年的專利，產(chǎn)酶菌種是一株嗜堿芽胞桿菌AM-001，產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成是蛋白胨、槐豆膠、K2HPO4，MgSO4，Na2CO3等，最大產(chǎn)酶量為36u/ml，(JP-；J03047076，12.07.1986)。第二個(gè)專利是上述酶的純化及特性(JP-；J63036775，10.11.1986)，第三個(gè)專利是熱穩(wěn)定性的堿性酶，其產(chǎn)酶菌株也是一株嗜堿細(xì)菌，PH8-10為最適PH，其新穎性在于具有較好的熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為65℃(JP-；JP08051975；27.02.1996)。但所有這些菌都來自土壤，不是專性嗜堿菌，所產(chǎn)的酶量也不大，未見發(fā)酵工藝的報(bào)道。本發(fā)明所涉及的菌種是專性嗜堿芽胞桿菌，PH8以下不生長，具有更好的熱穩(wěn)定性，最適70℃，酶活力高達(dá)500單位/毫升發(fā)酵液以上，該水平迄今未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)菌株及堿性β-甘露聚糖酶大量生產(chǎn)的新方法。
本發(fā)明所采用的菌株為分離自中國內(nèi)蒙堿湖的嗜堿芽孢桿菌N16-15(alkaliphilic Bacillus sp.N16-15)，該菌株在中國科學(xué)院微生物所內(nèi)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏(保藏號為CGMCC No.)。菌株N16-15在以甘露聚糖為碳源的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生芽胞，生長的PH范圍為PH8-11.5，在5-8％的NaCl中生長良好。
本發(fā)明所采用的液體種子培養(yǎng)基含有(克/升)淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O 0.15，NaCl 80，Na2CO310。固體斜面種子培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基中添加2％的瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基(克/升)魔芋粉10-18，旦白胨5-9，酵母粉5-7，K2HPO41-3，MgSO47H2O 0.1-0.3，NaCl70-120，Na2CO38-15，豆油2-5ml。
取固體斜面培養(yǎng)基上生長良好的培養(yǎng)物少許，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置37℃，220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)24小時(shí)作為一級種子液。以4％的接種量將一級種子轉(zhuǎn)接于裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000ml三角瓶中，上述條件培養(yǎng)24小時(shí)，作為二級種子液，再以3-5％的接種量，將二級種子液轉(zhuǎn)接于種子罐或發(fā)酵罐中。種子罐為50升罐，裝料體積20-30升，發(fā)酵溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉(zhuǎn)速400-450轉(zhuǎn)/分，時(shí)間20-28小時(shí)。發(fā)酵罐為250升-1噸罐，裝料量120-600升。發(fā)酵溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉(zhuǎn)速200-450轉(zhuǎn)/分。發(fā)酵時(shí)間36-48小時(shí)。
按上述方法得到的發(fā)酵液，β-甘露聚糖酶的酶活力在500u/ml以上，酶活力測定方法參照AKino，T.et al.Appl.Miarobiol.Biotechnol.26323-327，1987的方法測定以0.9ml，0.5％(W/V)槐豆膠(Locust beangam)作底粉，用pH10，0.05MOL/L甘氨酸-NaOH緩沖液加入0.1ml稀釋酶液，70℃保溫10分鐘，用二硝基水楊酸試劑測產(chǎn)生的還原糖，1個(gè)酶活力單位定義為上述反應(yīng)條件下，一分鐘釋放1mMOL相當(dāng)于D-甘露糖的還原糖的酶量。發(fā)酵液經(jīng)板框過濾、中空纖維柱超濾濃縮即可獲得純凈的濃縮酶液，濃縮倍數(shù)10倍，酶收率85％以上。
本發(fā)明提供了專性嗜堿的β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌，為實(shí)現(xiàn)堿性β-甘露聚糖酶大量生產(chǎn)提供了可行的工藝，其酶活力屬世界先進(jìn)水平，酶的熱穩(wěn)定性較好。該酶可有效地降解植物甘露聚糖生成甘露寡糖，為有效植物自然資源在堿性條件下的轉(zhuǎn)化利用創(chuàng)造了條件。
實(shí)施例1.
將嗜堿芽孢桿菌菌株N16-15從斜面上接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，220轉(zhuǎn)/分搖床上振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接于4個(gè)裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，上述條件培養(yǎng)24小時(shí)，再接種于裝有120升發(fā)酵培養(yǎng)基的250升發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(克/升)魔芋粉12，大豆粉4.5，味精4.5，酵母粉7，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.3，NaCl 80，Na2CO310，豆油4ml，發(fā)酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度400轉(zhuǎn)/分。發(fā)酵過程中，菌體生長延遲期約為8小時(shí)，進(jìn)入對數(shù)期后，菌體迅速生長，酶量隨之增長，穩(wěn)定期時(shí)(32-48小時(shí))酶活力最高。發(fā)酵40小時(shí)可放罐，發(fā)酵液酶活力500u/ml以上。
發(fā)酵液以加濾紙板的板框進(jìn)行過濾，過濾壓力0-2Kg/cm2，濾液由中空纖維超濾柱進(jìn)行濃縮，(柱的截留分子量為6000)，基本無需壓力，濃縮10倍左右后，以10nM Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH10)洗滌濃縮酶液，并洗滌超濾柱。最終酶的總收率85％。實(shí)施例2.
將菌株N16-15從斜面上接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)作為一級種子液。以3％的接種量將一級種子液接入一個(gè)裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000ml三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)作為二級種子液。將二級種子液接入裝有25升種子培養(yǎng)基的50升種子發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶1.0，攪拌速度450轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵24小時(shí)后，將其轉(zhuǎn)接入裝有600升發(fā)酵培養(yǎng)基的1噸罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(克/升)魔芋粉12，酵母粉7，大豆粉4.5，味精4.5，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.1，NaCl 120，Na2CO312，豆油4ml/升，發(fā)酵溫度35℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度240轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵40小時(shí)，終止發(fā)酵，發(fā)酵液酶活力500u/ml以上。發(fā)酵液以加濾紙板的板框進(jìn)行過濾，并加適當(dāng)硅藻土作為助濾劑。濾液如例1所述進(jìn)行超濾濃縮，濃縮10倍左右，總收率85％以上。實(shí)施例3.
將嗜堿芽孢桿菌菌株N16-15從斜面上接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃，220轉(zhuǎn)/分搖床上振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接于4個(gè)裝有1000ml種子培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，上述條件培養(yǎng)24小時(shí)，再接種于裝有120升發(fā)酵培養(yǎng)基的250升發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(克/升)槐豆膠12，蛋白胨9，酵母粉6，K2HPO41.5，MgSO47H2O 0.3，NaCl 80，Na2CO310，豆油4ml，發(fā)酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度400轉(zhuǎn)/分。發(fā)酵40小時(shí)放罐，發(fā)酵液酶活力500u/ml以上。
發(fā)酵液以加濾紙板的板框進(jìn)行過濾，過濾壓力0-2Kg/cm2，濾液由中空纖維超濾柱進(jìn)行濃縮，(柱的截留分子量為6000)，基本無需壓力，濃縮10倍左右后，以10mM Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH10)洗滌濃縮酶液，并洗滌超濾柱。最終酶的總收率85％。
權(quán)利要求
1，一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的新方法，其特征在于生產(chǎn)堿性β-甘露聚糖酶所采用的微生物是專性嗜堿芽胞桿菌，通過種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液通過板框過濾和中空纖維超濾進(jìn)行過濾濃縮，制備堿性β-甘露聚糖酶。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于生產(chǎn)堿性β-甘露聚糖酶的微生物是專性嗜堿芽胞桿菌N16-15(alkaliphilic Bacillussp.)，在以甘露聚糖為碳源的培養(yǎng)基條件下，可產(chǎn)生芽胞。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基是指每升培養(yǎng)基中含有淀粉5克，蛋白胨10克，酵母粉5克，K2HPO41克，MgSO4-7H2O 0.15克，NaCl 80克，Na2CO310克。發(fā)酵培養(yǎng)基是每升培養(yǎng)液中含有魔芋粉10-18克，旦白胨5-9克，酵母粉5-7克，K2HPO41-3克，MgSO47H2O 0.1-0.3克，NaCl 70-120克，Na2CO38-15克，豆油2-5ml。
4，根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于專性嗜堿芽胞桿菌N16-15置于種子培養(yǎng)基的溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，置于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度為35℃±1℃，通氣量為1∶0.75，罐發(fā)酵攪拌速度為400轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間為32-48小時(shí)。
5，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵液的過濾采用通用的板框過濾，濾液可加適量的硅藻土作為助濾劑，過濾壓力可以在0-2Kg/cm2之間。
6，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于板框過濾液可以采用中空纖維過濾裝置濃縮，中空纖維過濾截留分子量為6000最宜。超濾緩沖液為pH10的10mM Na2CO3-NaHCO3。
7，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于本方法所制備的β-甘露聚糖酶可應(yīng)用于甘露聚糖的水解。
全文摘要
一種新堿性β－甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法。嗜堿芽孢桿菌N16—5以魔芋粉、大豆粉等為原料,發(fā)酵生產(chǎn)β－甘露聚糖酶,生產(chǎn)條件簡單,發(fā)酵液的酶活力500u/ml以上,后提取收率80%以上。該酶的最適反應(yīng)pH為10.0,最適反應(yīng)溫度為70℃,在甘露寡糖生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該發(fā)明提供了一種新型β－甘露聚糖酶的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。
文檔編號C12N9/42GK1266096SQ9910283
公開日2000年9月13日 申請日期1999年3月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月5日
發(fā)明者馬延和, 周培瑾, 劉洪燦 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所