專利名稱：酚酸酯酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有酚酸酯酶活性的酶，DNA分子編碼所述酶及制備和使用所述酶的方法。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞壁分為兩部分，即第一和第二細(xì)胞壁。第一細(xì)胞壁是由三種主要類(lèi)型的多糖組成纖維素、半纖維素和果膠。第二細(xì)胞壁也含有多糖及木質(zhì)素。半纖維素是一種常規(guī)類(lèi)型的存在于植物細(xì)胞壁的高支鏈多糖，它與其自身及纖維素和木質(zhì)素相連接，并且這些連接的鍵對(duì)植物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和支撐植物結(jié)構(gòu)起著作用。
基于木糖骨架的半纖維素稱為木聚糖。已顯示廣泛存在于各種不同植物，包括水果、蔬菜、豆類(lèi)、谷類(lèi)、草、軟木和硬木，中的木聚糖是線性β-(1-4)-D-吡喃型木糖聚合物，該聚合物可以被包括α-L-阿拉伯糖、α-D-葡糖醛酸和/或α-D-葡糖醛酸的4-O-甲基醚衍生物的糖基取代。許多木聚糖也與包括香豆酸和阿魏酸的酚酸殘基發(fā)生酯化作用。這些酚酸殘基以酯的形式與α-L-呋喃型阿拉伯糖基木聚糖相連接并用于防止木聚糖水解酶，即木聚糖酶，對(duì)木聚糖的降解，以及通過(guò)與其中的木質(zhì)素形成的共價(jià)鍵而賦予植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。此外，阿魏酸在不同的木聚糖鏈之間存在二阿魏酸橋鍵，這更進(jìn)一步地賦予了對(duì)植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)支撐(Linden J.C.等，美國(guó)化學(xué)會(huì)志專題論文集，566卷(1994)，452～467)。
已知許多微生物能夠通過(guò)植物細(xì)胞壁多糖的酶解而水解酚酸酯和消化植物細(xì)胞壁。其中某些微生物擁有具有酚酸酯酶活性的酶，即香豆酸酯酶活性或阿魏酸酯酶活性或這兩種活性的結(jié)合。
例如，Borneman，W.S.等(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)，58卷(1992)，3762～3766)描述的兩種阿魏酸酯酶(FAE)，分別指定為FAE-I和FAE-II，是從厭氧真菌Neocallimastix strain MC-2中分離出來(lái)的。據(jù)報(bào)道FAE-II對(duì)底物(O-{5-O-[(E)-阿魏?；鵠-α-L-呋喃型阿拉伯糖基}-(1-3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1-4)-D-吡喃型木糖(FAXX)具有特異性，而FAE-I既具有FAXX的降解活性又有(O-{5-O-[(E)-p-香豆?；鵠-α-L-呋喃型阿拉伯糖基}-(1-3)-O-β-D-吡喃型木糖基-(1-4)-D-吡喃型木糖(PAXX)的降解活性，F(xiàn)AXX∶PAXX的最高代謝比為3∶1。當(dāng)使用FAXX作為底物時(shí)，這兩種酶的最適PH值分別為6.2和7.0。
英國(guó)專利2 301 103披露了得自黑曲霉的FAE及基因編碼的所述酶。當(dāng)阿魏酸甲酯用作底物時(shí)，所述酶具有約5的最適PH值和約50～60℃的最適溫度。
其它具有阿魏酸酯酶活性的純化酶是已知的(例如，McCrae，S.I.等，Enzyme Microb.Technol(酶微生物技術(shù))，16卷(1994)，826～834；Faulds，C.B.和Williamson，G.，Microbiology(微生物學(xué))，140卷(1994)，779～784；Castanares，A.等，酶微生物技術(shù)，14卷(1992)，875；和Kroon，P.A.等，Biotechnol.Appl.Biochem(生物技術(shù)應(yīng)用生物化學(xué))，23卷(1996)，255～262)，該純化酶具有約5.0～6.0范圍的最適PH值和30～60℃的最適溫度。
具有酚酸酯酶活性的酶可用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療的應(yīng)用，這些應(yīng)用可以在PH值約或高于6.5和/或溫度高于45℃下進(jìn)行。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有良好酚酸酯酶活性的酶。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠相對(duì)大量獲得的具有酚酸酯酶活性的酶的來(lái)源。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)目的是提供制備具有酚酸酯酶活性的酶的方法。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的一個(gè)目的是提供具有酚酸酯酶活性的酶在例如食物和飼料的生產(chǎn)、紙張和紙漿以及木質(zhì)纖維素廢物的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的應(yīng)用。
本發(fā)明的其它目的將通過(guò)下面的詳細(xì)描述而變得顯而易見(jiàn)。
本發(fā)明的主題是具有酚酸酯酶活性的酶，其特征在于當(dāng)其在含有33μM FAXX作為底物的檸檬酸/正磷酸氫二鈉的緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所述酶具有高于6.5，優(yōu)選約7.0的最適PH值和高于45℃，優(yōu)選約高于50℃，更優(yōu)選約55℃的最適溫度。在優(yōu)選的情況下，所述酶具有阿魏酸酯酶活性和/或香豆酸酯酶活性。
本發(fā)明的主題也是一種具有酚酸酯酶活性的酶，該酶能從Piromyces SP.，例如Piromyces equi得到，優(yōu)選從布達(dá)佩斯條約國(guó)際微生物研究所(IMI)，Bakeham Lane，Egham，Surrey，UK登記號(hào)為375061保藏的Piromyces equi strain得到。
在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的酶含有在SEQ ID NO1中所給出的氨基酸序列或其功能性衍生物。本發(fā)明的酶的功能性衍生物定義為在SEQ ID NO1中所給出的氨基酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)N-末端、C-末端或內(nèi)部取代、插入和/或缺失的酶，當(dāng)該功能性衍生物在含有33μMFAXX作為底物的檸檬酸/正磷酸氫二鈉的緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其保持高于6.5，優(yōu)選約7.0的最適PH值和高于45℃，優(yōu)選高于50℃，更優(yōu)選約55℃的最適溫度。在更優(yōu)選的情況下，本發(fā)明的酶含有在SEQID NO3中所給出的氨基酸序列或其功能性衍生物。
此外，本發(fā)明的酶優(yōu)選用SEQ ID NO1中所給出的DNA序列或其功能性衍生物進(jìn)行編碼。本發(fā)明的酶更優(yōu)選用SEQ ID NO3中所給出的DNA序列或其功能性衍生物進(jìn)行編碼。
本發(fā)明涉及具有一個(gè)和多個(gè)上述性質(zhì)的酚酸酯酶。
本發(fā)明更進(jìn)一步的主題是具有酚酸酯酶活性的用DNA分子編碼的酶，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO1中給出的DNA序列或其功能性衍生物或同系物。在SEQ ID NO1中給出的DNA序列的功能性衍生物定義為具有SEQ ID NO1所給出的DNA序列中具有一種或多種5′-，3′-或內(nèi)部取代、插入和/或缺失的DNA序列，所述功能性衍生物保持其編碼具有酚酸酯酶活性的酶的能力，并當(dāng)其在含有33μM FAXX作為底物的檸檬酸/正磷酸氫二鈉的緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，具有高于6.5，優(yōu)選約7.0的最適PH值和高于45℃，優(yōu)選高于50℃，更優(yōu)選約55℃的最適溫度。本發(fā)明的DNA序列的功能性同系物定義為SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所給出的DNA序列上優(yōu)選有75％的同系物，更優(yōu)選有85％的同系物，最優(yōu)選有95％的同系物的DNA序列。在更優(yōu)選的情況下，按照本發(fā)明的用DNA分子編碼的酶含有SEQ ID NO3所給出的DNA序列或其功能性衍生物或同系物。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA分子含有能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中復(fù)制所述DNA分子和/或表達(dá)所述酶的載體序列。
本發(fā)明更進(jìn)一步的主題是含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的DNA分子的轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選選自由大腸桿菌，球形芽孢桿菌如枯草桿菌、球形乳酸桿菌和球形乳球菌，曲霉屬，木霉屬，青霉菌，白霉屬，克魯維酵母菌屬和酵母屬如啤酒酵母組成的組中。
本發(fā)明的酶可以在基因轉(zhuǎn)移植物如玉米、大豆和canola/油菜籽或植物根儲(chǔ)備器官，如土豆、胡蘿卜、甜菜根中表達(dá)。
在適當(dāng)?shù)碾A段，如在收獲期，引入表達(dá)和/或分泌的本發(fā)明酯酶具有可以在降低生長(zhǎng)階段減少對(duì)基因轉(zhuǎn)移植物或植物根儲(chǔ)備器官結(jié)構(gòu)破壞的危險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的生產(chǎn)方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的?；蜣D(zhuǎn)移真菌如曲霉菌，轉(zhuǎn)化的酵母菌如酵母菌和基因轉(zhuǎn)移植物也是本技術(shù)領(lǐng)域已知的，并能夠通過(guò)專利GB2 301 103、EP479 359和EP449 375中所教導(dǎo)和披露的方法制備。
本發(fā)明的主題也是一種制備具有酚酸酯酶活性的酶或酶制劑的方法，其特征在于所述酶是從自然發(fā)生的生物體或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或能夠表達(dá)按照本發(fā)明的酶的生物體中分離出來(lái)的。包括，例如，部分純化的可作為細(xì)胞或生物體提取物的酶制劑也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明的酶制劑可以含有一種或多種進(jìn)一步的多糖改性和/或降解的酶。所述多糖改性和/或降解的酶優(yōu)選選自包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、內(nèi)葡聚糖酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、果膠酶、乙酰酯酶、甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶和其它糖基水解酶的組中。
此外，本發(fā)明的酶制劑也可以含有一種或多種進(jìn)一步地選自包括淀粉酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、植酸酶和脂酶組成的組中的酶。
按照本發(fā)明的酶和/或酶制劑的應(yīng)用包括在從含有酚酸部分的底物中釋放酚酸的方法中的應(yīng)用。
按照本發(fā)明所述的酶和/或酶制劑可同樣用于改善植物材料的可消化性的動(dòng)物飼料的生產(chǎn)中，尤其是用于飼料中植物細(xì)胞壁具有高含量的酚酸。而且，本發(fā)明的酶和/或酶制劑可用于谷類(lèi)植物包括但不限于玉米、小麥、草和苜蓿，通過(guò)預(yù)改性細(xì)胞壁的含量以改善用于家蓄飼料的可消化性。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的主題是飼料添加劑，該添加劑含有按照本發(fā)明的具有酚酸酯酶活性的酶或酶制劑和含有所述飼料添加劑的飼料。
本發(fā)明的酶和/或酶制劑在生產(chǎn)紙張和紙漿工業(yè)中的應(yīng)用，例如可以幫助從纖維素紙漿中除去木質(zhì)素。另外，本發(fā)明的酶和/或酶制劑與木聚糖水解酶相結(jié)合通過(guò)增加紙漿中木質(zhì)素的可溶解性和可提取性而能夠降低用于漂白所需要的氯的量。
此外，當(dāng)與木聚糖酶和/或纖維素酶結(jié)合時(shí)，本發(fā)明的酶和/或酶制劑可用于將植物材料或木質(zhì)素纖維廢物生物轉(zhuǎn)化成糖，例如，用于化學(xué)或燃料生產(chǎn)，和/或酚酸的制備。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1用FAXX作為底物測(cè)量的本發(fā)明的酚酸酯酶的PH曲線。
圖2用FAXX作為底物測(cè)量的本發(fā)明的酚酸酯酶的溫度曲線。
本發(fā)明的詳細(xì)描述下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明更加詳細(xì)地說(shuō)明而不是對(duì)本發(fā)明主題的限制。實(shí)施例1將分離自馬盲腸的(Orpin C.G.，J.Gen.Microbiol.(基因微生物雜志)，1981年第123卷第287～296頁(yè))和由E.A.Munn描述的(AnaerobicFungi，Biology，Ecology and Function，由D.O.Mountfort和C.G.Orpin編輯，MarcelDekker，Inc.，紐約，1994年第47～105頁(yè))和在布達(dá)佩斯條約國(guó)際微生物研究所(IMI)登記號(hào)為375061保藏的Piromyces equi在厭氧的條件下溫度為39℃在含瘤胃分泌液(kem，P.，Lander，D.J.和Orpin，C.G.，基因微生物雜志1984年130卷第27-37頁(yè))的帶有0.10％可溶木聚糖和0.5％Sigmacell(Sigma化學(xué)公司，Poole，Dorset，英國(guó))為碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)?？俁NA從上述條件下生長(zhǎng)的真菌中提取，通過(guò)小(dT)色譜選擇多(A)+RNA，并從選定的RNA合成雙鏈cDNA，并將其用ZAP-cDNA合成試劑盒克隆到λZAPII中并按照試劑盒制造者(Stratagene，La Jolla，美國(guó)加尼福尼亞)(Xue，G-P等，J.Gen.Microbiol.(基因微生物雜志)，1992年第138卷第1413～1420頁(yè)和Ali，B.R.S.等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.(FEMS微生物通訊)，1995年第125卷第15～22頁(yè))的指導(dǎo)進(jìn)行體外包裝。重組噬菌體通過(guò)在軟瓊脂涂覆層中大腸桿菌XL1-Blue的菌群上的平鋪而生長(zhǎng)并用抗純化的真菌纖維素/半纖維素復(fù)合體而產(chǎn)生的抗體對(duì)重組噬菌體進(jìn)行篩選，純化真菌纖維素/半纖維素復(fù)合體的方法按照Ali，B.R.S等發(fā)表于FEMS微生物通訊1995年第125卷第15～22頁(yè)的方法進(jìn)行。用兔抗復(fù)合抗體作為初級(jí)抗體進(jìn)行噬菌斑的抗體篩選，方法是基本上按照picoBlueTM免疫篩選試劑盒(Stratagene)所提供的操作指南進(jìn)行，并做了下列修改將異丙基-β-D-吡喃型硫代半乳糖苷(IPTG；0.33mM)直接加入到含有重組λZAPII和宿主細(xì)菌(大腸桿菌XL1-Blue)的軟瓊脂涂覆層中；將噬菌斑提到Hybond-C過(guò)濾器上(Amersham)；代替BSA的封閉溶液含有干奶粉(4％重量/體積)；將與辣根過(guò)氧化酶(Sigma化學(xué)品公司)偶合的抗兔IgG(總分子量)用作第二抗體；著色展開(kāi)液在50mM三鹽酸緩沖液中含有3，3`二氨基聯(lián)苯胺(0.5毫克/毫升)，PH值為7.4，和過(guò)氧化氫(0.5微升/毫升)。酯酶的生產(chǎn)根據(jù)Dalrymple，B.P.等發(fā)表于FEMS微生物通訊，1996年，第143卷第115～120頁(yè)上的方法，通過(guò)抗體篩選選擇的克隆合成能水解[4-甲基散形花酰基(肉桂酸-p-三甲基氯化銨)](4-methylumbelliferoyl(p-trimethylammonium cinnamate chloride)的酶。
根據(jù)Sambrook等的Molecular Cloning(分子克隆)試驗(yàn)室手冊(cè)(1989年第二版，Cold Spring Harbor，New York)，完成一般分子生物學(xué)技術(shù)，包括DNA分離、限制酶的消化、絡(luò)合、轉(zhuǎn)化以及酯酶基因的DNA測(cè)序。
完成了本發(fā)明的具有酚酸酯酶活性的基因編碼酶的核苷酸測(cè)序，其結(jié)果列于SEQ ID NO3中?？勺g框架包括1608個(gè)核苷酸，具有預(yù)測(cè)分子量為55,540道爾頓的536個(gè)氨基酸的編碼蛋白質(zhì)。實(shí)施例2最適PH值的測(cè)定在含有50mM三鹽酸，PH＝9.0，50mM NaCl，10mM MgCl2，200μMdNTPs，50微微摩爾的底物的緩沖溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)(30秒94℃，45秒50℃，1分鐘72℃的20次循環(huán))產(chǎn)生由SEQ ID NO.1編碼的截?cái)嗟拿?。所述底物?`-端5`-CGCGGATCCAACAGCGGTCCAACTGTTG-3`，3`-端5`-GCGAATTCTTATCTTATGGGAGAGAG-3`，250納克模板DNA和用載體PET32a(Novagen，Inc.)在大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen，Inc.，Wisconsin，USA)中表達(dá)。
按照美國(guó)Novagen，Inc的指導(dǎo)，將來(lái)自新制備的游離細(xì)胞的提取物通過(guò)鍵和到Talon樹(shù)脂上(Clontech Laoratories Inc.，美國(guó)加尼福尼亞)并用限定級(jí)的Thrombin從金屬親合樹(shù)脂上洗脫而得到純化酶，該酶用作PET載體酶。所述酶可進(jìn)一步按如下方法純化用10mM三鹽酸平衡一個(gè)1毫升MonoQ柱(Pharmacia)，PH值為8.0，將新鮮的酶置于柱上，用氯化鈉以1.0毫升/分鐘的速度進(jìn)行梯度淋洗(0～0.5M NaCl在10mM三鹽酸中，PH＝8.0)。收集1毫升的流出組分。將酶在PH值的范圍為3～7的McIlvaine緩沖溶液(檸檬酸/正磷酸氫二鈉，數(shù)據(jù)見(jiàn)Biochemical Research(生化研究)，第3版，Dawson，Elliot，Elliot，Jones，牛津科學(xué)出版社，牛津大學(xué)印刷，1987年)或PH值的范圍為8～9的含有氯化鉀/硼酸的緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定。該測(cè)定是在37℃和最終FAXX濃度為33μM的條件下進(jìn)行的。根據(jù)Faulds，C.B.和Williamson，G.，在Microbiology(微生物學(xué))，1994年，140卷，第779～787頁(yè)上發(fā)表的方法對(duì)由FAXX釋放出的阿魏酸在335nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)3分鐘。
測(cè)定的結(jié)果示于圖1中。從圖1可以推導(dǎo)出，本發(fā)明的酶在PH約為5.5和約為8.5時(shí)表現(xiàn)出50％的活性。為了決定在用FAXX作為底物時(shí)本發(fā)明的酶的最適溫度，將FAXX以33μM的濃度進(jìn)行使用并且在PH＝6.0的100mM的MOPS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定。用恒溫控制分光光度計(jì)將孵化溫度從20℃～70℃變化。對(duì)由FAXX釋放出的阿魏酸在335nm處按照上述方法進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果如圖2所示。動(dòng)力學(xué)本發(fā)明酶的Km和Vmax用FAXX和Ara2F(O-[2-O-(反阿魏酰基)-α-呋喃型阿拉伯糖基]-(1-5)-L-呋喃型阿拉伯糖作為底物進(jìn)行測(cè)定。使用FAXX的濃度范圍為3.72～49.18μM，使用Ara2F的濃度范圍為4.46～122.92μM。在溫度為37℃，PH＝6.0的100mM的MOPS((3-[N-嗎啉]-丙烷磺酸))帶有90納克酶的緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于在兩種底物中的阿魏酸的釋放在335nm處按照上述方法進(jìn)行測(cè)量。
基于上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所決定本發(fā)明酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)如下底物 KmVmaxFAX3.0±0.3μM35.6±0.9微摩爾/分鐘/毫克Ara2F 234±27μM 19.6±1.7微摩爾/分鐘/毫克因此，當(dāng)在上述條件下使用FAXX作為底物測(cè)量時(shí)本發(fā)明的酶具有約3.0的Km和約35的Vmax。
本發(fā)明的酶對(duì)阿魏酸甲酯、香豆酸基酯和P-香豆酸甲酯的特定活性的測(cè)定是在37℃，含有100mMMOPS緩沖溶液(帶有0.02％的疊氮化合物)，PH＝6.0，44納克酶和1mM的上述底物的條件下進(jìn)行的。在孵化15分鐘以后，煮沸終止該反應(yīng)，并用反相HPLC測(cè)定所釋放的自由酸(Kroon，P.A.和Williamson，G.，Biotechnol.Appl.Biochem.，1996年，23卷263～267頁(yè))。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示。
此外，本發(fā)明的酶對(duì)乙酸對(duì)硝基苯基酯、乙酸α-萘基酯、丁酸α-萘基酯、己酸α-萘基酯、辛酸α-萘基酯和月桂酸α-萘基酯的特異活性的測(cè)定根據(jù)Ferreira，L.M.A.等所描述的方法進(jìn)行(Biochem.J.，1993年294卷，349～355頁(yè))。上述測(cè)定結(jié)果如下所示。
U*定義為給出1毫摩爾/分鐘的酯水解的酶的量。序列清單(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名字生物技術(shù)和生物科學(xué)研究委員會(huì)(B)街區(qū)Polaris House，North Star Avenue(C)城市Swindon(D)州(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵編SN2 1UH(ii)發(fā)明名稱酚酸酯酶及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)4(iv)可機(jī)讀形式(A)培養(yǎng)基類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度825個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(vi)最初來(lái)源(A)生物體Piromyces equi(ix)特征(A)名字/鍵CDS(B)座位1..822(xi)序列描述SEQ ID NO1AAC AGC GGT CCA ACT GTT GAA TAC TCT ACT GAT GTT GAC TGT TCC GGT 48Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr Asp Val Asp Cys Ser Gly1 5 10 15AAG ACC CTT AAG AGT AAC ACC AAC CTT AAC ATC AAT GGT CGT AAG GTT 96Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn Ile Asn Gly Arg Lys Val20 25 30ATT GTA AAA TTC CCA AGC GGC TTC ACT GGT GAC AAG GCT GCT CCA CTT 144Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly Asp Lys Ala Ala Pro Leu35 40 45CTT ATT AAC TAC CAT CCA ATT ATG GGT AGT GCT TCT CAA TGG GAA AGT 192Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser Ala Ser Gln Trp Glu Ser50 55 60GGT TCT CAA ACT GCT AAG GCT GCT TTA AAT GAT GGT GCC ATC GTT GCT 240Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn Asp Gly Ala Ile Val Ala65 70 75 80TTC ATG GAT GGT GCT CAA GGT CCA ATG GGA CAA GCT TGG AAC GTT GGT 288Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Gln Ala Trp Asn Val Gly85 90 95CCA TGT TGT ACT GAT GCT GAT GAT GTT CAA TTC ACT CGT AAC TTC ATT 336Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln Phe Thr Arg Asn Phe Ile100105 110AAG GAA ATC ACT AGT AAG GCT TGT GTT GAT CCA AAG CGT ATC TAT GCT 384Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp Pro Lys Arg Ile Tyr Ala
115 120 125GCT GGT TTC TCT ATG GGT GGT GGT ATG TCT AAC TAT GCT GGT TGT CAA 432Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser Asn Tyr Ala Gly Cys Gln130 135 140CTT GCT GAT GTT ATT GCT GCT GCT GCT CCA TCA GCC TTT GAT CTT GCC 480Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Phe Asp Leu Ala145 150 155 160AAG GAA ATT GTT GAT GGT GGT AAA TGT AAA CCA GCT CGT CCA TTC CCA 528Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys Pro Ala Arg Pro Phe Pro165 170 175ATC CTT AAC TTC CGT GGT ACT CAA GAT AAC GTT GTT ATG TAC AAC GGT 576Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn Val Val Met Tyr Asn Gly180 185 190GGT CTT TCT CAA GTT GTT CAA GGT AAG CCA ATT ACT TTC ATG GGT GCC 624Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro Ile Thr Phe Met Gly Ala195 200 205AAG AAC AAC TTC AAG GAA TGG GCT AAG ATG AAC GGA TGT ACT GGT GAA 672Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met Asn Gly Cys Thr Gly Glu210 215 220CCA AAA CAA AAC ACT CCA GGT AAC AAC TGT GAA ATG TAC GAA AAC TGT 720Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys Glu Met Tyr Glu Asn Cys225 230 235 240AAG GGT GGT GTT AAG GTT GGT CTT TGC ACT ATC AAC GGT GGT GGT CAC 768Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr Ile Asn Gly Gly Gly His245 250 255GCT GAA GGT GAC GGT AAA ATG GGT TGG GAC TTT GTT AAA CAA TTC TCT 816Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp Phe Val Lys Gln Phe Ser260 265 270CTC CCA TAA825Leu Pro(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度274個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr Asp Val Asp Cys Ser Gly1 5 10 15Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn Ile Asn Gly Arg Lys Val20 25 30Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly Asp Lys Ala Ala Pro Leu35 40 45Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser Ala Ser Gln Trp Glu Ser50 55 60Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn Asp Gly Ala Ile Val Ala65 70 75 80Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly Gln Ala Trp Asn Val Gly85 90 95Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln Phe Thr Arg Asn Phe Ile100 105 110Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp Pro Lys Arg Ile Tyr Ala115 120 125Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser Asn Tyr Ala Gly Cys Gln130 135 140Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro Ser Ala Phe Asp Leu Ala145 150 155 160Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys Pro Ala Arg Pro Phe Pro165 170 175Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn Val Val Met Tyr Asn Gly180 185 190Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro Ile Thr Phe Met Gly Ala195 200 205Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met Asn Gly Cys Thr Gly Glu210 215 220Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys Glu Met Tyr Glu Asn Cys225 230 235 240Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr Ile Asn Gly Gly Gly His245 250 255Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp Phe Val Lys Gln Phe Ser260 265 270Leu Pro(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1611個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(vi)最初來(lái)源(A)生物體Piromyces equi(ix)特征(A)名字/鍵CDS(B)座位1..1608(xi)序列描述SEQ ID NO3ATG AAG ACT AGC ATT GTA TTA TCT ATC GTT GCT TTA TTT TTA ACA TCC 48Met Lys Thr Ser Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Leu Phe Leu Thr Ser275 280 285 290AAA GCT TCT GCT GAT TGT TGG TCA GAA AGA TTA GGT TGG CCA TGC TGT 96Lys Ala Ser Ala Asp Cys Trp Ser Glu Arg Leu Gly Trp Pro Cys Cys295 300 305AGT GAC AGC AAT GCC GAA GTA ATC TAC GTC GAT GAC GAT GGT GAT TGG 144Ser Asp Ser Asn Ala Glu Val Ile Tyr Val Asp Asp Asp Gly Asp Trp310 315 320GGT GTT GAA AAT AAT GAC TGG TGT GGT ATC CAA AAG GAA GAA GAA AAC 192Gly Val Glu Asn Asn Asp Trp Cys Gly Ile Gln Lys Glu Glu Glu Asn325 330 335AAT AAC TCA TGG GAT ATG GGT GAT TGG AAC CAA GGT GGT AAC CAA GGT 240Asn Asn Ser Trp Asp Met Gly Asp Trp Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly340 345 350GGC GGT ATG CCA TGG GGC GAC TTT GGC GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG 288Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met355 360 365 370CAA TGG GGT GAC TTC GGT GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGC 336Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly375 380 385GAC TTC GGT GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAC TTT GGC 384Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly390 395 400GGT AAC CAA GGT GGT AAC CAA GGC GGT GGT ATG CCA TGG GGC GAC TTT 432Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe405 410 415GGA GGA AAC CAA GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAT 480Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp420 425 430TTC GGA GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTT GGA GGA 528Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly435 440 445 450AAC CAA GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAT TTC GGA 576Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly455 460 465GGT AAC CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTT GGA GGA AAC CAA 624Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln470 475 480GGA GGT AAC CAA GGT GGC GGT ATG CCA TGG GGT GAC TTC GGA GGT AAC 672Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn485 490 495CAA GGT GGT GGT ATG CAA TGG GGC GAT TTC GGA GGT AAT CAA GGT GGT 720Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly
500 505 510GGT ATG CAA TGG GGC GAC TTC GGC GGT AAC CAA GGA GGT AAC CAA GAT 768Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Asp515 520 525 530TGG GGT AAC CAA GGT GGT AAC AGC GGT CCA ACT GTT GAA TAC TCT ACT 816Trp Gly Asn Gln Gly Gly Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr535 540 545GAT GTT GAC TGT TCC GGT AAG ACC CTT AAG AGT AAC ACC AAC CTT AAC 864Asp Val Asp Cys Ser Gly Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn550 555 560ATC AAT GGT CGT AAG GTT ATT GTA AAA TTC CCA AGC GGC TTC ACT GGT 912Ile Asn Gly Arg Lys Val Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly565 570 575GAC AAG GCT GCT CCA CTT CTT ATT AAC TAC CAT CCA ATT ATG GGT AGT 960Asp Lys Ala Ala Pro Leu Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser580 585 590GCT TCT CAA TGG GAA AGT GGT TCT CAA ACT GCT AAG GCT GCT TTA AAT 1008Ala Ser Gln Trp Glu Ser Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn595 600 605 610GAT GGT GCC ATC GTT GCT TTC ATG GAT GGT GCT CAA GGT CCA ATG GGA 1056Asp Gly Ala Ile Val Ala Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly615 620 625CAA GCT TGG AAC GTT GGT CCA TGT TGT ACT GAT GCT GAT GAT GTT CAA 1104Gln Ala Trp Asn Val Gly Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln630 635 640TTC ACT CGT AAC TTC ATT AAG GAA ATC ACT AGT AAG GCT TGT GTT GAT 1152Phe Thr Arg Asn Phe Ile Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp645 650 655CCA AAG CGT ATC TAT GCT GCT GGT TTC TCT ATG GGT GGT GGT ATG TCT1200Pro Lys Arg Ile Tyr Ala Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser660 665 670AAC TAT GCT GGT TGT CAA CTT GCT GAT GTT ATT GCT GCT GCT GCT CCA1248Asn Tyr Ala Gly Cys Gln Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro675 680 685 690TCA GCC TTT GAT CTT GCC AAG GAA ATT GTT GAT GGT GGT AAA TGT AAA1296Ser Ala Phe Asp Leu Ala Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys695 700 705CCA GCT CGT CCA TTC CCA ATC CTT AAC TTC CGT GGT ACT CAA GAT AAC1344Pro Ala Arg Pro Phe Pro Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn710 715 720GTT GTT ATG TAC AAC GGT GGT CTT TCT CAA GTT GTT CAA GGT AAG CCA1392Val Val Met Tyr Asn Gly Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro725 730 735ATT ACT TTC ATG GGT GCC AAG AAC AAC TTC AAG GAA TGG GCT AAG ATG1440Ile Thr Phe Met Gly Ala Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met740 745 750AAC GGA TGT ACT GGT GAA CCA AAA CAA AAC ACT CCA GGT AAC AAC TGT1488Asn Gly Cys Thr Gly Glu Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys755 760 765 770GAA ATG TAC GAA AAC TGT AAG GGT GGT GTT AAG GTT GGT CTT TGC ACT1536Glu Met Tyr Glu Asn Cys Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr775 780 785ATC AAC GGT GGT GGT CAC GCT GAA GGT GAC GGT AAA ATG GGT TGG GAC1584Ile Asn Gly Gly Gly His Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp790 795 800TTT GTT AAA CAA TTC TCT CTC CCA TAA 1611Phe Val Lys Gln Phe Ser Leu Pro805 810(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度536個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Thr Ser Ile Val Leu Ser Ile Val Ala Leu Phe Leu Thr Ser1 5 10 15Lys Ala Ser Ala Asp Cys Trp Ser Glu Arg Leu Gly Trp Pro Cys Cys20 25 30Ser Asp Ser Asn Ala Glu Val Ile Tyr Val Asp Asp Asp Gly Asp Trp35 40 45Gly Val Glu Asn Asn Asp Trp Cys Gly Ile Gln Lys Glu Glu Glu Asn50 55 60Asn Asn Ser Trp Asp Met Gly Asp Trp Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly65 70 75 80Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met85 90 95Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly100 105 110Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly
115 120 125Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe130 135 140Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp145 150 155 160Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly165 170 175Asn Gln Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly180 185 190Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln195 200 205Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Met Pro Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn210 215 220Gln Gly Gly Gly Me5 Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly225 230 235 240Gly Met Gln Trp Gly Asp Phe Gly Gly Asn Gln Gly Gly Asn Gln Asp245 250 255Trp Gly Asn Gln Gly Gly Asn Ser Gly Pro Thr Val Glu Tyr Ser Thr260 265 270Asp Val Asp Cys Ser Gly Lys Thr Leu Lys Ser Asn Thr Asn Leu Asn275 280 285Ile Asn Gly Arg Lys Val Ile Val Lys Phe Pro Ser Gly Phe Thr Gly290 295 300Asp Lys Ala Ala Pro Leu Leu Ile Asn Tyr His Pro Ile Met Gly Ser305 310 315 320Ala Ser Gln Trp Glu Ser Gly Ser Gln Thr Ala Lys Ala Ala Leu Asn325 330 335Asp Gly Ala Ile Val Ala Phe Met Asp Gly Ala Gln Gly Pro Met Gly340 345 350Gln Ala Trp Asn Val Gly Pro Cys Cys Thr Asp Ala Asp Asp Val Gln355 360 365Phe Thr Arg Asn Phe Ile Lys Glu Ile Thr Ser Lys Ala Cys Val Asp370 375 380Pro Lys Arg Ile Tyr Ala Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Gly Met Ser385 390 395 400Asn Tyr Ala Gly Cys Gln Leu Ala Asp Val Ile Ala Ala Ala Ala Pro405 410 415Ser Ala Phe Asp Leu Ala Lys Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Cys Lys420 425 430Pro Ala Arg Pro Phe Pro Ile Leu Asn Phe Arg Gly Thr Gln Asp Asn435 440 445Val Val Met Tyr Asn Gly Gly Leu Ser Gln Val Val Gln Gly Lys Pro450 455 460Ile Thr Phe Met Gly Ala Lys Asn Asn Phe Lys Glu Trp Ala Lys Met465 470 475 480Asn Gly Cys Thr Gly Glu Pro Lys Gln Asn Thr Pro Gly Asn Asn Cys485 490 495Glu Met Tyr Glu Asn Cys Lys Gly Gly Val Lys Val Gly Leu Cys Thr500 505 510Ile Asn Gly Gly Gly His Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met Gly Trp Asp515 520 525Phe Val Lys Gln Phe Ser Leu Pro530 53權(quán)利要求
1.具有酚酸酯酶活性的酶，其特征在于當(dāng)其在含有33μM FAXX作為底物的檸檬酸/正磷酸氫二鈉的緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所述酶具有高于6.5的最適PH值和高于45℃的最適溫度。
2.按照權(quán)利要求1的酶，其特征在于所述酶具有阿魏酸酯酶活性和/或香豆酸酯酶活性。
3.按照權(quán)利要求1或2的酶，其特征在于所述酶具有約7.0的最適PH值和/或約55℃的最適溫度。
4.按照權(quán)利要求1～3的任意一種酶，其特征在于所述酶能從Piromyces SP.，優(yōu)選在國(guó)際微生物研究所(IMI)登記號(hào)為375061保藏的Piromyces equi得到。
5.按照權(quán)利要求1～4的任意一種酶，其特征在于所述酶含有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中給出的氨基酸序列或其功能性衍生物。
6.按照權(quán)利要求1～5的任意一種酶，其特征在于所述酶用在SEQID NO1或SEQ ID NO3中給出的DNA序列、其功能性衍生物或同系物進(jìn)行編碼。
7.一種具有酚酸酯酶活性的用DNA分子編碼的酶，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中給出的DNA序列、其功能性衍生物或同系物。
8.編碼按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶的DNA分子，其特征在于所述DNA分子含有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中給出的DNA序列、其功能性衍生物或同系物。
9.按照權(quán)利要求7或8的DNA分子還進(jìn)一步含有能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述酶的載體序列。
10.含有按照權(quán)利要求7～9的一個(gè)或多個(gè)DNA分子的轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或生物。
11.制備具有酚酸酯酶活性的酶或酶制劑的方法，其特征在于所述酶是從按照權(quán)利要求10的細(xì)胞或生物中分離出來(lái)的。
12.一種酶制劑，該酶制劑含有按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或可通過(guò)按照權(quán)利要求11的方法獲得的酶。
13.按照權(quán)利要求12的酶制劑，該酶制劑進(jìn)一步含有一種或多種的多糖改性和/或降解的酶。
14.按照權(quán)利要求13的酶制劑，其特征在于所述多糖改性和/或降解的酶選自包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、內(nèi)葡聚糖酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、果膠酶、乙酰酯酶、甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶和其它糖基水解酶的組中。
15.按照權(quán)利要求11～14的任意一種酶制劑，該酶制劑進(jìn)一步含有一種或多種的選自包括淀粉酶、蛋白酶、α-半乳糖苷酶、植酸酶和脂酶的組中的酶。
16.按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑在用于從含有酚酸部分的底物釋放或制備酚酸的方法中的應(yīng)用。
17.按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑在生產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
18.按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑在生產(chǎn)食物中的應(yīng)用。
19.按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑在生產(chǎn)紙張中的應(yīng)用。
20.按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑在用于將植物材料或木質(zhì)素纖維廢物生物轉(zhuǎn)化成糖的方法中的應(yīng)用。
21.按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑在用于改善家蓄飼料的谷類(lèi)植物的可消化性中的應(yīng)用。
22.飼料添加劑，該添加劑含有按照權(quán)利要求1～6的任意一種酶和/或按照權(quán)利要求11～15的任意一種酶制劑。
23.一種飼料，該飼料含有按照權(quán)利要求22的飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有酚酸酯酶活性的酶,基因編碼所述酶及制備和使用所述酶的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1255165SQ98804186
公開(kāi)日2000年5月31日 申請(qǐng)日期1998年4月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月14日
發(fā)明者伊恩·約翰·菲林漢姆, 杰弗里·彼得·黑茲爾伍德, 哈里·約翰·吉爾伯特 申請(qǐng)人:巴布拉漢姆研究院, 泰恩河畔紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)