專利名稱：能賦予植物多種性狀的dna構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請請求美國臨時(shí)系列申請第60/035,350號和第60/062,870號的優(yōu)先權(quán)(benefit)。
本發(fā)明涉及能賦予植物多種性狀的DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
1986年，發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒(“TMV”)外殼蛋白基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)可賦予煙草對TMV的抗性(Powell-Abel，P.，et al.，“在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)煙草花葉病毒外殼蛋白基因可延緩此疾病的發(fā)生”Science，232738-43(1986))，過去的十年中，對植物病毒性疾病的控制已取得了很大的進(jìn)步。大約在上述發(fā)現(xiàn)的同時(shí)，人們提出了病原體誘導(dǎo)的抗性(“PDR”)的概念，即病原體基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，可賦予植物對同源或相關(guān)病原體感染的抗性(Sanford，J.C.，et al.“寄生蟲誘導(dǎo)的抗性的概念-從寄生蟲自身基因組中衍生出抗性基因，”J.Theor.Biol.，113395-405(1985))。從那時(shí)起，大量的報(bào)道證實(shí)，PDR是一種開發(fā)抵抗多種不同病毒的轉(zhuǎn)基因植物的有用策略(Lomonossoff，G.P.，“病原體誘導(dǎo)的對植物病毒的抗性，”Ann.Rev.Photopathol.，33323-43(1995))。
僅僅在Beachy及其同事的報(bào)道發(fā)表八年之后(Powell-Abel，P.，et al.，“在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)煙草花葉病毒外殼蛋白基因可延緩此疾病的發(fā)生，”Science，232738-43(1986))，Grumet，R.在PlantBreeding Reviews，1247-49(1994)中，以“用基因工程的方法產(chǎn)生抗病毒植物”為題，綜述了關(guān)于PDR的文獻(xiàn)，并列舉了對至少11種不同類群(group)的植物病毒具有抗性的成功的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物。其中的絕大多數(shù)報(bào)道都利用了目標(biāo)控制病毒的外殼蛋白基因。盡管轉(zhuǎn)基因植物的嘗試目前大部分還僅限于實(shí)驗(yàn)室和溫室實(shí)驗(yàn)中，但日益增加的報(bào)道表明，這種抗性在大田條件下也是有效的(例如，Grumet，R.，“用基因工程的方法產(chǎn)生抗病毒植物，”Plant Breeding Reviews，1247-49(1994))。APHIS/USDA已對兩種抗病毒作物解除管制，允許其在USA境內(nèi)的自然環(huán)境中不受限制地種植。對西瓜花葉病毒2和小胡瓜黃色花葉病毒具有抗性的倭瓜已成功地實(shí)現(xiàn)了商品化(Fuchs，M.，et al.，“表達(dá)西瓜花葉病毒2和小胡瓜黃色花葉病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因雜交倭瓜ZW-20具有對兩種馬鈴薯病毒混合感染的抗性”，Bio/Technology，131466-73(1995)；Tricoli，D.M.，et al.，“包含一種或多種病毒外殼蛋白基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因倭瓜對黃瓜花葉病毒，西瓜花葉病毒2和小胡瓜黃色花葉病毒抗性的大田評估，”Bio/Technology 131458-65(1995))。此外，抗木瓜環(huán)斑病毒的轉(zhuǎn)基因木瓜也已開發(fā)(Fitch，M.M.M.，et al.，“來自于用木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因轟擊的組織得到木瓜具有病毒抗性，”Bio/Technology，101466-72(1992)；Tennant，P.F.，et al.，“轉(zhuǎn)入外殼蛋白基因的木瓜和經(jīng)典交叉保護(hù)的木瓜對木瓜花葉病毒分離株保護(hù)性的差異”，Phytopathology，841359-66(1994))。最近，USDA/APHIS對這種抗性轉(zhuǎn)基因木瓜已經(jīng)解除管制。此轉(zhuǎn)基因木瓜之所以能及時(shí)的解除管制，是由于夏威夷的木瓜業(yè)正遭受木瓜環(huán)斑病毒的毀滅性破壞。毫無疑問，在不遠(yuǎn)的將來，更多的作物將被解除管制和實(shí)現(xiàn)商品化。
令人感興趣的是，盡管對各種形式病原體誘導(dǎo)的抗性的作用機(jī)理知之甚少，但在抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)上卻已經(jīng)取得很大的進(jìn)步(Lomonossoff，G.P.，“病原體誘導(dǎo)的對植物病毒的抗性，”Ann.Rev.Photopathol.，33323-43(1995))。雖然大量的報(bào)道是用賦予抗性的外殼蛋白基因進(jìn)行的，但越來越多的報(bào)道表明，病毒復(fù)制酶(Golemboski，D.B.，et al.，“用煙草花葉病毒非結(jié)構(gòu)基因序列轉(zhuǎn)化的植物具有病毒抗性，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876311-15(1990))、移動蛋白(例如，Beck，D.L.，et al.，“破壞病毒移動可賦予植物對三基因塊(triple Gene block)植物病毒的系統(tǒng)感染的廣譜抗性，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9110310-14(1994))、馬鈴薯Y病毒組的NIa蛋白酶(例如，Maiti，I.B.，et al.，“表達(dá)馬鈴薯Y病毒組蛋白酶基因的植物具有對病毒感染的抗性，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906110-14(1993))，以及其他的病毒基因也是行之有效的。由此可得出植物病毒基因組的任何一部分都可引致PDR的結(jié)論。而且，以可翻譯和不可翻譯的有義鏈的形式以及罕見的反義鏈形式存在的病毒基因都是行之有效的(例如，Baulcombe，D.C.，“轉(zhuǎn)基因植物中病原體誘導(dǎo)的抗病毒機(jī)理，”Plant Cell，81833-44(1996)；Dougherty，W.G.，et al.，“轉(zhuǎn)基因和基因抑制告訴我們一些新東西？，”Current Opinion in Cell Biology，7399-05(1995)；Lomonossoff，G.P.，“病原體誘導(dǎo)的對植物病毒的抗性，”Ann.Rev.Photopathol.，33323-43(1995))。
RNA介導(dǎo)的抗性是PDR的一種形式，其中明確表明病毒蛋白在賦予轉(zhuǎn)基因植物抗性中不起作用。第一批RNA介導(dǎo)的抗性的明顯實(shí)例是1992年報(bào)道的煙草蝕刻病毒(Tobacco Etch Virus)(“TEV”)馬鈴薯Y病毒組(Lindbo，et al.，“在表達(dá)馬鈴薯Y病毒組外殼蛋白核苷酸序列的變體的轉(zhuǎn)基因煙草中表現(xiàn)出的針對該病毒免疫的病原體誘導(dǎo)抗性以及抗性表型，”Mol.Plant Microbe Interact.，5144-53(1992)、Van Der Vlugt，R.A.A.等，“在轉(zhuǎn)化病毒燕麥蛋白順反子的煙草中由有義RNA介導(dǎo)的對PVY的保護(hù)的證明”PlantMol.Biol.，20631-39(1992)中描述的馬鈴薯病毒Y(“PVY”)馬鈴薯病毒組、de Hann，P.，et al.，“RNA介導(dǎo)的對番茄斑萎病毒具有抗性的轉(zhuǎn)基因煙草的特征研究，”Bio/Technology，101133-37(1992)中描述的番茄斑萎病毒(“TSWV”tospovirus)。其他人進(jìn)一步證實(shí)了針對以下病毒的RNA介導(dǎo)的抗性的存在馬鈴薯Y病毒組(Smith，H.A.，et al.，“不可翻譯的有義RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物的病毒抗性表達(dá)，調(diào)控和非必需RNA的命運(yùn)，”Plant Cell，61441-53(1994))、馬鈴薯X病毒組病毒(Muller，E.，et al.，“同源依賴性抗性植物的轉(zhuǎn)基因病毒抗性與同源依賴性的基因沉默有關(guān)，”Plant Journal，71001-13(1995))及番茄斑萎病毒和其他topsoviruses(Pang，S.Z.，et al.，“轉(zhuǎn)基因Benthamiam煙草植物對蕃茄斑萎病毒和鳳仙花壞死斑Tospo-viruses病毒的抗性N蛋白和N基因RNA參與抗性的證據(jù)，”Phvtopathology，84243-49(1994)；Pang，S.-Z.，et al.，轉(zhuǎn)基因煙草抗番茄斑萎病毒和鳳仙花壞死斑Tospo-viruses病毒的不同保護(hù)機(jī)制，”Bio/Technology11819-24(1993))。更近期的工作表明，RNA介導(dǎo)的抗性也發(fā)生在豇豆花葉病毒組的豇豆花葉病毒(comovirus cowpea mosaic virus)(Sijen，T.，et al.，“RNA介導(dǎo)的病毒抗性重復(fù)轉(zhuǎn)基因的作用和靶區(qū)域描繪”，Plant Cell，82227-94(1996)))和SMV南瓜花葉病毒(Jan，F(xiàn).-J.，et al.，“轉(zhuǎn)化了SMV南瓜花葉病毒外殼蛋白基因的南瓜植物的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析，”Phytopathology，86S16-17(1996))。
Dougherty及其同事對TEV和PVY進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)在闡明RNA介導(dǎo)的抗性機(jī)制方面取得了很大進(jìn)展。使用TEV，Lindbo，J.A.，“在表達(dá)馬鈴薯Y病毒組外殼蛋白核苷酸序列一種變體的轉(zhuǎn)基因煙草中表現(xiàn)出的針對該病毒免疫的病原體誘導(dǎo)抗性以及抗性表型，”Mol.PlantMicrobe Interact.，5144-53(1992)和Lindbo，J.A.et al.，“煙草蝕刻病毒外殼蛋白基因序列不可翻譯的轉(zhuǎn)錄能夠干擾煙草蝕刻病毒在轉(zhuǎn)基因植物和原生質(zhì)體中的復(fù)制”Virology，189；725-33(1992)，兩篇文獻(xiàn)利用TEV表明，接種TEV后，表達(dá)可翻譯的全長外殼蛋白基因、截短的可翻譯的外殼蛋白基因、反義外殼蛋白基因和不可翻譯的外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植物的表型反應(yīng)各不相同。轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出了抗性、康復(fù)(接種過的植株開始表現(xiàn)為系統(tǒng)性感染但隨后生出的葉子則無癥狀且抗病毒)或易感染表型。進(jìn)一步，他們還指出，同易感植株葉子相比，抗性植株的葉子和康復(fù)植株的無癥狀葉子具有相對低水平的穩(wěn)定狀態(tài)的RNA(Lindbo，J.A.，et al.，“轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)產(chǎn)生的高特異性抗病毒狀態(tài)基因表達(dá)調(diào)控和病毒抗性有關(guān)，”Plant Cell，51749-59(1993))。但是，核失控(run off)實(shí)驗(yàn)表明，與那些易感植物相比(具有較高穩(wěn)定狀態(tài)的RNA水平)，具有較低水平的穩(wěn)定狀態(tài)RNA的植物中來自病毒的所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平更高。為了解釋這些現(xiàn)象，提出了“抗性狀態(tài)和所轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄本積累穩(wěn)定態(tài)水平的降低，是由細(xì)胞水平上的旨在使特定RNA序列失活的細(xì)胞質(zhì)活性介導(dǎo)的”(Lindbo，J.A.，et al.，“轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)產(chǎn)生的高特異性抗病毒狀態(tài)基因表達(dá)調(diào)控和病毒抗性有關(guān)，”PlantCell，51749-59(1993))。該現(xiàn)象也表明，低水平的穩(wěn)定態(tài)RNA可能是由于轉(zhuǎn)錄后基因沉默形成的，為了解釋純合的轉(zhuǎn)基因植物中β-1，3-葡聚糖酶轉(zhuǎn)基因的表達(dá)抑制，de Carvalho，F(xiàn).，等人在“純合的植物中的β-1，3-葡聚糖酶轉(zhuǎn)基因的表達(dá)抑制，”EMBOJ.，112596-602(1992)一文中，首次提出了轉(zhuǎn)錄后基因沉默這種現(xiàn)象。
一個(gè)RNA閾值模型被用來解釋上述發(fā)現(xiàn)(Lindbo，J.A.，et al.，“轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)的高特異的抗病毒狀態(tài)基因表達(dá)調(diào)控和病毒抗性有關(guān)，”Plant Cell，51749-59(1993))?；緛碚f，該模型認(rèn)為存在一種細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞降解機(jī)制限制植物細(xì)胞中的RNA水平，當(dāng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本高于閾值水平時(shí)，該機(jī)制被激活。降解機(jī)制對高于閾值水平的轉(zhuǎn)錄是特異的；如果高于某一閾值水平的轉(zhuǎn)錄本是一病毒轉(zhuǎn)基因，因?yàn)榻到鈾C(jī)制也可以使入侵病毒的特異性序列失活，因而轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出抗病毒狀態(tài)。該模型還解釋了轉(zhuǎn)基因植物的“康復(fù)”現(xiàn)象，系統(tǒng)入侵的病毒RNA在一些具有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因植物中激發(fā)這種現(xiàn)象。具有三個(gè)以上轉(zhuǎn)基因拷貝的植物無須病毒的入侵就可使之超過閾值水平(Goodwin，J.，et al.，“遺傳和生化分析轉(zhuǎn)基因RNA介導(dǎo)的病毒抗性，”Plant Cell，895-105(1996)；Smith，H.A.，et al.，“不可翻譯的有義RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物對病毒的抗性表達(dá)，調(diào)控和非必需RNA的命運(yùn)，”Plant Cell，61441-53(1994))。盡管降解機(jī)制尚不明了，但有人提出了這樣一種觀點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)依賴于RNA的RNA聚合酶(”RdRp”)結(jié)合于轉(zhuǎn)錄本，生成多個(gè)小片段的反義RNA，然后反義RNA再結(jié)合別的轉(zhuǎn)錄本形成雙鏈，從而被特異識別RNA-RNA雙鏈的核酸酶降解。該降解機(jī)制的序列特異性解釋了RNA介導(dǎo)的抗性的特異性。
Baulcombe及其同事就PVX所做的工作(English，J.J.，et al.，“表現(xiàn)出核基因沉默的轉(zhuǎn)基因植物中病毒積累的抑制，”Plant Cell，8179-88(1996)；Mueller，E.，et al.，“同源依賴性抗性植物的轉(zhuǎn)基因病毒抗性與同源依賴性基因的沉默有關(guān)，”Plant Journal，71001-13(1995))進(jìn)一步證實(shí)和拓展了Dougherty及其同事的研究成果。提出了一個(gè)由Dougherty及其同事提出的RNA閾值模型改進(jìn)而得到的異常RNA模型。該模型的特點(diǎn)與Dougherty的模型大體相似，不同之處在于，前者認(rèn)為RNA的水平并不是激活細(xì)胞降解機(jī)制的唯一促因，轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的異常RNA在激活能夠降解特異性RNA的細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞降解機(jī)制中發(fā)揮重要作用。異常RNA的產(chǎn)生可以通過轉(zhuǎn)基因在染色體上的位置和通過轉(zhuǎn)基因DNA的甲基化作用而加強(qiáng)。異常RNA的確切實(shí)質(zhì)還不清楚，但它的一個(gè)特征使它成為與宿主編碼的RdRp結(jié)合生成反義RNA的優(yōu)選模板(Baulcombe，D.C.，“轉(zhuǎn)基因植物中病原體誘導(dǎo)的抗病毒機(jī)理，”Plant Cell，81833-44(1996)；English，J.J.，et al.，“表現(xiàn)出核基因沉默的轉(zhuǎn)基因植物中病毒積累的抑制，”Plant Cell，8179-88(1996))。因此該模型也認(rèn)為RdRp和反義分子參與降解機(jī)制。Baulcombe及其同事證實(shí)表現(xiàn)低穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)基因水平的植物含有多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因，而低穩(wěn)定狀態(tài)的RNA和伴隨的抗性狀態(tài)是由于轉(zhuǎn)錄后基因的沉默形成的。同源依賴性抗性，這一術(shù)語被提出來描述表現(xiàn)出同源依賴性基因沉默的植株的抗性(Mueller，E.，et al.，“同源依賴性抗性植物的轉(zhuǎn)基因病毒抗性與同源依賴性的基因沉默有關(guān)，”Plant Journal，71001-13(1995))。
用TSWV tospovirus(Pang，S.Z.，et al.，“轉(zhuǎn)基因萵苣中轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)基因沉默和由此引起的tospovirus抗性受轉(zhuǎn)基因劑量和植物發(fā)育的影響，”Plant Journal，9899-09(1996)；Prins，M.，et al.，“基因工程RNA介導(dǎo)的抗TSWV是序列特異的，”Mol.Plant MicrobeInteract.，9416-18(1996))和豇豆花葉病毒(Sijen，T.，et al.，“RNA介導(dǎo)的病毒抗性重復(fù)轉(zhuǎn)基因和靶區(qū)域花紋化的作用，”PlantCell，82227-94(1996))的實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)基因植物也表現(xiàn)抗性是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的結(jié)果。Pang，S.Z.，et al.，“轉(zhuǎn)基因萵苣中轉(zhuǎn)錄后基因沉默和由此產(chǎn)生的tospovirus抗性受轉(zhuǎn)基因劑量和植物發(fā)育的影響，”Plant Journal，9899-09(1996)表明，表達(dá)TSWV N基因的轉(zhuǎn)基因萵苣轉(zhuǎn)錄后基因的沉默受基因的劑量和植物發(fā)育階段的影響。對于表達(dá)病毒基因的轉(zhuǎn)基因植物，此前雖然沒有報(bào)道過，發(fā)育階段對所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默以及轉(zhuǎn)錄后基因沉默對抗性的影響，但是在表達(dá)其它基因的植物中卻有相關(guān)報(bào)道(de Carvalho，F(xiàn).，et al.，“純合的植物中的β-1，3-葡聚糖酶轉(zhuǎn)基因的表達(dá)抑制，”EMBO J.，112595-602(1992))。轉(zhuǎn)錄后基因沉默也可以解釋轉(zhuǎn)基因煙草中低水平穩(wěn)定狀態(tài)的N基因RNA與高而特異的抗性之間的正比相關(guān)(Pang，S.Z.，et al.，“轉(zhuǎn)基因煙草保護(hù)煙草不受TSW和INST侵害的不同機(jī)制，”Bio/Technology，11819-24(1993))。Prins，M.，et al.，“基因工程RNA介導(dǎo)的抗TSWV是序列特異的，”MolecularPlant Microbe Interacttions，9416-18(1996))也報(bào)道了表達(dá)N基因和mRNA非結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象。令人感興趣的是，發(fā)現(xiàn)用TSWV基因組其他部分轉(zhuǎn)化的煙草無抗性。作為一種解釋，他們認(rèn)為，那些不能賦予抗性的基因片段不符合能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的條件。Sijen，T.，et al.，“RNA介導(dǎo)的病毒抗性重復(fù)轉(zhuǎn)基因和靶區(qū)域花紋化的作用，”Plant Cell，82227-94(1996)一文中指出，表達(dá)移動蛋白、復(fù)制酶或外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的抗性是由于轉(zhuǎn)錄后基因的沉默。這些資料還指出，移動蛋白轉(zhuǎn)基因的mRNA的3’端區(qū)域是沉默機(jī)制的初始靶區(qū)域。
本發(fā)明涉及生產(chǎn)改良的抗病植物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一個(gè)由包括一個(gè)性狀DNA分子和一個(gè)沉默子DNA分子(silencer DNA moleculer)的融合基因形成的DNA構(gòu)建體。性狀DNA分子的長度不足以把預(yù)期性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。所述沉默子DNA分子可操作地偶聯(lián)到上述性狀DNA分子上，使得二者的聯(lián)合長度足以把預(yù)期性狀賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明公開了表達(dá)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞、植株和包含有DNA構(gòu)建體的植物種子。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是，該DNA構(gòu)建體可以是一個(gè)包括多個(gè)性狀DNA分子的融合基因，并且其中至少有一些性狀DNA分子的長度不足以把預(yù)期性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。但是，上述多個(gè)性狀DNA分子聯(lián)合長度足以把預(yù)期性狀賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的植物，并導(dǎo)致該融合基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。本發(fā)明公開了表達(dá)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞、植株和包含有該實(shí)施方案的DNA構(gòu)建體的植物種子。
本發(fā)明具體涉及制備能抵抗多種病毒的植物。眾所周知，特定的植物類型常常對不止一種病毒易感。盡管PDR能很好地控制植物病毒帶來的危害，但是要把抗多種病毒的抗性引入到特定的植物中卻面臨著許多挑戰(zhàn)。例如，鑒定和獲得用來轉(zhuǎn)化植物的病毒全長基因費(fèi)用昂貴且費(fèi)時(shí)。而且，由于這些基因可能太大而不得不將其裝入到不同的表達(dá)系統(tǒng)中，因而必須分開轉(zhuǎn)入植物。
本發(fā)明沒有試圖用全長的病毒基因轉(zhuǎn)化植物，而是用這些基因中短的片段把能夠抵抗多個(gè)病毒病原體的抗性賦予所轉(zhuǎn)化的植物。與全長基因相比，獲取這些短的基因片段更加容易且節(jié)省費(fèi)用，所有這些基因片段的自身長度都不足以把預(yù)期形狀賦予植物。不必要把每個(gè)片段所對應(yīng)的獨(dú)立啟動子都引入到植物中；而只需要單一的啟動子。而且，這些病毒基因片段可以優(yōu)選地整合入一個(gè)載體系統(tǒng)，從而使轉(zhuǎn)化一次產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
這種制備對多種病毒具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的簡單策略可能會給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來深遠(yuǎn)的影響。一個(gè)例子就是木瓜環(huán)斑病毒(papayaringspot virus)(“PRV”)。已經(jīng)用來自夏威夷的木瓜環(huán)斑病毒株的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化得到了轉(zhuǎn)基因木瓜，該轉(zhuǎn)基因木瓜在溫室和長期大田條件下具有高度的抗病毒性。但是，此木瓜對來自世界其它地方的病毒株仍高度易感，如牙買加，泰國和巴西等。顯然，PRV在木瓜中的抗性是高度特異的，要在世界范圍控制該病毒需要用各國靶病毒株的外殼蛋白基因做大量的轉(zhuǎn)基因木瓜系。利用本發(fā)明，用總共小于1000bp的病毒基因片段加上一個(gè)大約400bp的沉默子DNA就可培育出抗所有PRV病毒株的轉(zhuǎn)基因木瓜；相比而言，單個(gè)PRV外殼蛋白基因就長達(dá)約1000bp。
本發(fā)明的另一個(gè)用途是可賦予抗多種不同病毒的抗性。例如，在馬鈴薯中，利用本發(fā)明可賦予抗馬鈴薯卷葉病毒，馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯X病毒的抗性。為達(dá)到這種抗性效果，根據(jù)本發(fā)明，可以構(gòu)建出一個(gè)受單一啟動子作用的包含馬鈴薯卷葉病毒復(fù)制酶的部分編碼基因，馬鈴薯Y病毒外殼蛋白的部分編碼基因和馬鈴薯X病毒移動蛋白的部分編碼基因的構(gòu)建體，并用其轉(zhuǎn)化馬鈴薯。結(jié)果，一次轉(zhuǎn)化就可得到具有抗馬鈴薯卷葉病毒，馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯X病毒抗性的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。與把每一個(gè)全長基因加各自的啟動子一起整合到一個(gè)表達(dá)載體或不同載體形成的構(gòu)建體的方法相比，本發(fā)明取得了巨大進(jìn)步。
本發(fā)明的另一個(gè)用途是賦予葫蘆科植物抗大量病毒的抗性。例如，對于倭瓜，可利用本發(fā)明賦予其對zuccinni黃化葉病毒、木瓜環(huán)斑病毒、西瓜花葉病毒II和倭瓜花葉病毒的抗性。例如，可構(gòu)建一個(gè)受單一啟動子控制的包含來自上述每種病毒的外殼蛋白的部分編碼基因或復(fù)制酶的部分編碼基因的構(gòu)建體，并將其轉(zhuǎn)化入倭瓜。得到的轉(zhuǎn)基因倭瓜能夠抵抗上述所有病毒。
除了賦予植株對多種病毒病的抗性以外，利用本發(fā)明能夠賦予植物其他性狀。常希望能夠把大量疾病抗性之外的其它性狀通過轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入植物。例如，顏色，酶的產(chǎn)生等都可以是所希望賦予植物的性狀。但是，把多種這樣的性狀轉(zhuǎn)化植物時(shí)同樣會遇到上述的轉(zhuǎn)化疾病抗性時(shí)所遇到的困難。同樣，利用本發(fā)明能夠消除在轉(zhuǎn)化疾病抗性以外的其他性狀時(shí)所遇到的這些問題。
在用多種性狀轉(zhuǎn)化植物時(shí)，可能會遇到的這樣一個(gè)問題，即并非所有的性狀都能轉(zhuǎn)化成功。例如，要賦予轉(zhuǎn)基因植物以4種新性狀，因?yàn)槊恳粋€(gè)表達(dá)事件發(fā)生的可能性是10％，所以使得根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)出獲得所有這些性狀的植株的可能性遠(yuǎn)高于用受各自啟動子控制的全長性狀基因轉(zhuǎn)化植物時(shí)的可能性。更具體地說，后者表達(dá)所有這四個(gè)性狀的概率是0.0001(即，0.1×0.1×0.1×0.1)，而本發(fā)明的概率是0.1。
附圖簡述

圖1給出的是就TSWV-BL的N基因而言時(shí)所轉(zhuǎn)基因的圖例。
圖2顯示了轉(zhuǎn)基因植物抗TSWL-BL感染的保護(hù)。用nptII ELISA試劑盒(5 prime到3 prime，Inc)，通過DAS-ELISA實(shí)驗(yàn)對所選擇品系R1植株(一個(gè)1/2N高表達(dá)子8-127和一個(gè)1/2N低表達(dá)子8-2，經(jīng)Northern印跡分析確定的)進(jìn)行nptII活性分析。用ELISA陰性非轉(zhuǎn)基因的分離子(nptII ELISA的讀數(shù)為0.00-0.02OD405nm)作為對照。隨后用TSWV-BL對同一植株攻擊。每隔一天檢測植株是否出現(xiàn)系統(tǒng)感染，任何在未接種葉子上表現(xiàn)癥狀的植株被記錄為系統(tǒng)感染。
圖3A-B顯示1/2N低表達(dá)子8-2中所轉(zhuǎn)基因的沉默。圖3A為8-2和8-127 R1植株的Northern印跡分析。從轉(zhuǎn)基因植株中分離總RNA(每泳道15μg)并用Northern印跡分析。泳道1-6為沉默的8-2R1植株；泳道7-12為未沉默的8-127 R1植株；泳道13為非轉(zhuǎn)基因的對照。圖3B為對R1植株的核失控轉(zhuǎn)錄分析。瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性酶解消化的N基因、nptII和肌動蛋白片段，并轉(zhuǎn)移到膜上然后與標(biāo)記過的核RNA雜交。本分析所用的胞核分離自8-2 R1和8-127 R1植株。
圖4比較了表達(dá)不同長度N基因片段的植株中的轉(zhuǎn)錄本積累。泳道1和2為具有全長N基因的病毒易感R1植株，基因未沉默；泳道3為具有2/2N基因的沉默了的病毒抗性的R1植株；泳道4為具有2/2N基因的未沉默的病毒易感R1植株；泳道5～8為4個(gè)具有3/4N基因的未沉默的病毒易感R1植株；泳道9～12為具有5/8N基因的未沉默的病毒易感R1植株。
圖5顯示的是包括GFP/N融合基因的R1植株的Northern分析。當(dāng)植株在5～6葉階段時(shí)，收集葉片分離RNA。每泳道加10μg總RNA用于Northern分析，其中所用探針為TSWV-BL的N基因(上排)或GFP基因(下排)。摘去用于RNA分析的葉片樣品之后，用TSWV-BL接種該植株，并根據(jù)在接種后14天是否出現(xiàn)系統(tǒng)性癥狀而分別標(biāo)記為抗性(“R”)和易感(“S”)。泳道1～2，為GFP+5/8N-1 R1植株；泳道3～6，為GFP+3/4N-5 R1植株；泳道7，為GFP+3/4N-6 R1植株；泳道8，為GFP+3/4N-23 R1植株；泳道9～10和12，為GFP+3/4N-8 R1植株；泳道11為未轉(zhuǎn)化的植株。
圖6為用于本研究的所轉(zhuǎn)基因的圖例。一個(gè)不可翻譯的N基因片段同GFP或CP-TuMV基因轉(zhuǎn)錄融合。每一個(gè)轉(zhuǎn)基因都受雙加強(qiáng)的CaMV35S啟動子、苜?；ㄈ~病毒的5’端非翻譯前導(dǎo)序列和胭脂堿合成酶基因的3’端非翻譯區(qū)控制。把這個(gè)完整的表達(dá)彈夾插入植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19(Clontech Labotatories，Inc.)，然后，利用根癌土壤桿菌Agrobacterium tumafaciens LBA4404通過葉盤轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到nicotiana benthamiana。2/2N是第二個(gè)半長基因片段，3/4N是第3個(gè)1/4長的基因片段，5/8N為第5個(gè)TSWV-BL的N基因的1/8長片段。Pang et al.，“非靶DNA序列可減少在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生RNA介導(dǎo)的Tospovirus抗性所必需的所轉(zhuǎn)基因的長度，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，948261-66(1997)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
圖7為TMV-GFP和TMV-GFP-NP的模式圖。TMV-GFP由C.A.Holt博士提供。在NotI位點(diǎn)處，把TSWV的N基因序列與GFP轉(zhuǎn)錄融合。體外轉(zhuǎn)錄按Casper et al.，“來自煙草花葉病毒載體的綠色熒光蛋白編碼基因的表達(dá)，”Gene，173；69-73(1996)中描述的方法進(jìn)行，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一個(gè)由包括一個(gè)性狀DNA分子和一個(gè)沉默子DNA分子的融合基因形成的DNA構(gòu)建體。性狀DNA分子的長度不足以把預(yù)期性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。所述沉默子DNA分子操作偶聯(lián)到上述性狀DNA分子上，使得二者的聯(lián)合長度足以把預(yù)期性狀賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是，該DNA構(gòu)建體可以是一個(gè)包括多個(gè)性狀DNA分子的融合基因，并且其中至少有一些性狀DNA分子的長度不足以把預(yù)期性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。但是，上述多個(gè)性狀DNA分子聯(lián)合長度足以把預(yù)期性狀賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的植物，并影響該融合基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。
本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選方面是，該DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，其中各個(gè)性狀DNA分子的長度不足以把預(yù)期性狀賦予該性狀DNA分子單獨(dú)所轉(zhuǎn)化的植物。可能其中一些性狀DNA分子的長度足以賦予植物它們相應(yīng)的性狀，但是，決非所有這樣的DNA分子都有如此長度。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及與植物異源的性狀DNA分子的用途--例如，可以把疾病抗性賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化植物的DNA分子。本發(fā)明在賦予植株抗各種病原體抗性方面是有用的，這些病原體包括病毒、細(xì)菌、真菌、類病毒、植物原生質(zhì)、線蟲和昆蟲。本發(fā)明也可以用于賦予哺乳動物遺傳性狀。按本發(fā)明的方法可以賦予抗特別是以下病毒的抗性番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、番茄斑點(diǎn)病毒(tomato nottle virus)、番茄黃色卷葉病毒或其組合。按本發(fā)明的方法可以賦予植物抗特別是以下細(xì)菌的抗性青枯假單胞菌、丁香假單胞菌煙草致病變種、野油菜黃單孢菌天竺葵致病變種和根癌土壤桿菌。按本發(fā)明的方法可以賦予植物抗特別是以下細(xì)菌的抗性尖孢鐮孢和蔓延疫霉。適合的DNA分子包括一個(gè)編碼外殼蛋白的DNA分子、一個(gè)編碼復(fù)制酶的DNA分子、一個(gè)非編碼蛋白的DNA分子、一個(gè)編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子或其組合。
賦予植物疾病抗性的DNA分子在DNA構(gòu)建體中可以是有義方向?？商娲?，也可以是反義方向。反義RNA技術(shù)涉及產(chǎn)生互補(bǔ)于靶基因信使RNA分子的RNA分子；反義RNA可潛在地阻斷所有靶基因的表達(dá)。就抗病毒而言，植物表達(dá)相對于病毒RNA的反義RNA分子(也就是說，反義RNA是一種與被感染病毒編碼的正義RNA互補(bǔ)的RNA分子)。這些植物可以表現(xiàn)出對該病毒易感性的輕微減輕。這樣的互補(bǔ)RNA被稱之為反義RNA。
本發(fā)明也可以用于賦予植株抗病性狀以外的其他性狀。例如，能賦予植物遺傳性狀的DNA分子能夠用做本發(fā)明所述的DNA性狀分子。在本發(fā)明的這一方面，合適的性狀DNA分子可以編碼預(yù)期的顏色、酶的生成及其組合。
用于本發(fā)明的沉默子DNA分子可以選自任何實(shí)際上能導(dǎo)致基因沉默的核酸。這涉及到降解與所轉(zhuǎn)基因mRNA同源的mRNA的細(xì)胞機(jī)制。沉默子DNA分子可以同植株異源，無需與性狀DNA分子在植物中相互作用，沉默子DNA分子可以位于性狀DNA分子的3’端。例如，沉默子DNA分子可以是一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子、一個(gè)植物DNA分子或其組合。
盡管不希望受理論的束縛，但通過使用本發(fā)明的構(gòu)建體，可以確信實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。更具體地說，相信沉默子DNA分子可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)異源RNA的水平超過閾值。這樣就激活了降解機(jī)制，從而成功地獲得病毒抗性。
有可能適當(dāng)?shù)亟M配本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，可以使本發(fā)明的性狀和沉默子DNA分子編碼出可翻譯的RNA分子。因此，RNA分子就能在核糖體中翻譯生成由所述DNA構(gòu)建體編碼的蛋白。把編碼感興趣的DNA構(gòu)建體的克隆基因和作為病毒調(diào)控序列的合成雙鏈寡核苷酸(即，一5’端非翻譯序列)連接在一起，可以增加以這種方式生產(chǎn)的蛋白的產(chǎn)量。參見Gehrke的第4,820,639號美國專利和Wilson的第5,849,527號美國專利，這兩篇文獻(xiàn)在此引入作為參考。
替代地，適當(dāng)?shù)亟M配本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以使本發(fā)明的性狀和沉默子DNA分子編碼出不可翻譯的mRNA。通過向所述DNA分子中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)提前終止密碼子、添加一個(gè)或多個(gè)(多個(gè)3聯(lián)堿基除外)使閱讀框移位、除去翻譯起始密碼子等手段，可以成功實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。參見Dougherty等人的第5,583,021號美國專利，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
利用傳統(tǒng)的重組DNA技術(shù)可以把目的DNA構(gòu)建體整合入細(xì)胞。通常，這種操作涉及把DNA構(gòu)建體插入與該構(gòu)建體異源的表達(dá)系統(tǒng)(即不是正常出現(xiàn)的情況)?？梢园言摦愒碊NA構(gòu)建體以合適的有義方向和正確的讀框插入表達(dá)系統(tǒng)或載體。載體包含有轉(zhuǎn)錄插入序列的必須元件。
Cohen和Boyer的第4,237,224號美國專利，在此引入作為參考，該專利描述了用限制酶切割和DNA連接酶連接構(gòu)建以重組質(zhì)粒形式存在的表達(dá)系統(tǒng)。然后，通過轉(zhuǎn)化把這些重組質(zhì)粒導(dǎo)入單細(xì)胞培養(yǎng)物中并復(fù)制，單細(xì)胞培養(yǎng)物包括原核有機(jī)體和生長在組織培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞。
也可以把重組基因?qū)氩《荆缍幻绮《??？赏ㄟ^將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染病毒的細(xì)胞來獲得重組病毒。
合適的載體包括，但不限于下面的病毒載體和質(zhì)粒載體，病毒載體包括lambda載體系統(tǒng)gt11、gtWES.tB、Charon4等，質(zhì)粒載體是指PBR322、PBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluscript II SK+/-或KS+/-(參照“StrataGene cloning system”目錄(1993)，StrataGene，La Jolla，Calif，在此引入作為參考)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見F.W.Studier等，“用T7RNA聚合酶指導(dǎo)的克隆基因的表達(dá)，”Gene Expression Technology vol.185(1990)，在此引入作為參考)及其任意衍生物?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化，具體地說是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞接合、帶動轉(zhuǎn)移或電穿孔，把重組分子導(dǎo)入細(xì)胞。用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法，把DNA序列克隆入載體中，該方法的具體描述見Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，冷泉實(shí)現(xiàn)室，冷泉港，紐約(1989)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
各種宿主-載體系統(tǒng)可以用來實(shí)施此發(fā)明?；镜囊粭l是，載體系統(tǒng)必須與所用的宿主細(xì)胞兼容。宿主載體系統(tǒng)包括，但不限于以下噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；含有酵母載體的酵母等微生物；病毒(如痘苗病毒、腺病毒等)轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；病毒(如桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞；細(xì)菌感染的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá)元件在強(qiáng)度和特異性上是不同的。根據(jù)所用的宿主載體系統(tǒng)的不同，可以從大量合適的轉(zhuǎn)錄并且也可能是翻譯的元件中任意選用一種。
不同的遺傳信號和加工過程控制著基因表達(dá)中的許多階段(例如，DNA的轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)的翻譯)。
DNA的轉(zhuǎn)錄依賴于啟動子的存在，啟動子是一段能引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合從而啟動mRNA合成的DNA序列。真核生物的啟動子序列與原核生物不同。而且，真核生物的啟動子和伴隨的遺傳信號在原核系統(tǒng)內(nèi)可能不被識別或不能發(fā)揮作用，反之，原核生物的啟動子在真核細(xì)胞中也不被識別且不能發(fā)揮作用。
相似地，原核生物mRNA翻譯依賴于合適的不同于真核生物的原核信號。原核生物mRNA的有效翻譯需要mRNA上的一個(gè)稱為Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該序列是位于起始密碼子之前的一小段mRNA短核苷酸序列，起始密碼子通常是編碼蛋白質(zhì)氨基端甲硫氨酸的AUG。SD序列互補(bǔ)于16SrRNA(核糖體RNA)的3’端，它可能是通過與rRNA形成雙鏈來啟動mRNA與核糖體的結(jié)合從而使核糖體正確定位。關(guān)于最大基因表達(dá)的詳細(xì)綜述，請參見Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68473(1979)，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
啟動子的強(qiáng)度(即它們啟動轉(zhuǎn)錄的能力)各不相同。在表達(dá)一個(gè)克隆的基因時(shí)，如果要想獲得基因的高水平轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，就需要選用強(qiáng)的啟動子。根據(jù)所用宿主細(xì)胞體系的不同，可以從大量合適的啟動子中任意選用一種。例如，當(dāng)在E.coli、它的噬菌體或質(zhì)粒中克隆時(shí)，可以使用以下啟動子來指導(dǎo)鄰接DNA片段的高水平轉(zhuǎn)錄如T7噬菌體啟動子、lac啟動子、trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、入大腸桿菌噬菌體的PR和PL啟動子及其他包括但不限于，lacUV5、ompF、bla、lpp等。此外，雜合啟動子trp-lacUV5(tac)以及通過重組DNA或其它合成DNA技術(shù)得到的其他E.coli啟動子可以用于插入基因的轉(zhuǎn)錄。
可以選用這樣的細(xì)菌宿主細(xì)胞和表達(dá)載體，即它們能夠抑制除特意誘導(dǎo)的啟動子之外的其他啟動子的活性。在某些操作中，加入特異的誘導(dǎo)物是實(shí)現(xiàn)插入DNA有效轉(zhuǎn)錄所必須的條件。例如，lac操縱元受乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的誘導(dǎo)。其它各種操縱元如trp，pro等均受不同的控制。
原核細(xì)胞基因的有效轉(zhuǎn)錄也需要特異的起始信號。通過分別測量基因特異mRNA和合成的蛋白質(zhì)的數(shù)量，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始信號的“強(qiáng)度”各不相同。一個(gè)含有啟動子的DNA表達(dá)載體中也可以包含各種“強(qiáng)度”的轉(zhuǎn)錄起始信號的任一組合。
一旦將DNA構(gòu)建體克隆入表達(dá)載體，下一步就是轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。根據(jù)所用載體/宿主系統(tǒng)的不同，可以用上述各種轉(zhuǎn)化形式完成轉(zhuǎn)入。適合的宿主細(xì)胞包括，但不限于，細(xì)菌、病毒、植物及類同的細(xì)胞。
本發(fā)明也可以利用操作偶聯(lián)在融合基因的末端的終止序列來終止轉(zhuǎn)錄。合適的終止序列包括3’端非翻譯區(qū)的終止區(qū)。這可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的終止和在轉(zhuǎn)錄的mRNA序列的3’端后面加聚腺苷酸化核糖核苷酸。終止區(qū)或3’端非翻譯區(qū)是另外一個(gè)便利條件。終止區(qū)可以同啟動子區(qū)域同源，也可有別的來源，優(yōu)選地包含一個(gè)終止子和為聚腺苷酸化編碼的序列。合適的3’端非翻譯區(qū)包括但不限于(1)3’端轉(zhuǎn)錄但不翻譯的區(qū)域，其中包含有土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；蛉珉僦瑝A合成酶(NOS)基因或35S啟動子終止子基因的聚腺苷化信號；(2)植物基因，如大豆7S儲藏蛋白基因和豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶氧化酶(ssRUBISCO)E9基因小的亞單位。
在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，可以用微量加液器把上述位于載體中的DNA構(gòu)建體直接微注射到植物細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)用機(jī)械方法轉(zhuǎn)化重組的DNA。Crossway，Mol.Gen.Genetics，202179-85(1985)，在此引入作為參考。也可用聚乙二醇把遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。Krens等，Nature，29672-74(1982)，其在此引入作為參考。
DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一種方法是微粒轟擊(也稱為biolistic轉(zhuǎn)化)宿主細(xì)胞。這可通過幾種方式中的一種來完成。第一種是向細(xì)胞發(fā)射惰性或生物活性微粒。該技術(shù)公開于Sanford等人的美國專利US4,945,050，US5,036,006和US5,100,792，在此引入作為參考。通常，該程序涉及在能有效穿過細(xì)胞外表面并整合入細(xì)胞內(nèi)部的條件下，向細(xì)胞發(fā)射惰性或生物活性微粒。當(dāng)用惰性微粒時(shí)，可以通過用含有異源DNA構(gòu)建體的載體包裹微粒，把含有DNA構(gòu)建體的載體導(dǎo)入細(xì)胞?？商娲?，用載體包裹，當(dāng)微?；罨屑?xì)胞后載體得以進(jìn)入細(xì)胞。也可用生物活性微粒(例如包含有載體和異源DNA構(gòu)建體的干細(xì)菌細(xì)胞)來轟擊植物細(xì)胞。
另一種導(dǎo)入方法是原生質(zhì)體與其他實(shí)體的融合，該實(shí)體可以是微細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體或其它脂類物質(zhì)包裹的可融合微體。Fraley，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，在此引入作為參考。
也可以用電穿孔把DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞。Fromm et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825824(1985)，在此引入作為參考。在此技術(shù)中，在含有表達(dá)彈夾的質(zhì)粒存在的條件下，通過電穿孔導(dǎo)入植物原生質(zhì)體。高場強(qiáng)的電脈沖可以反復(fù)使生物膜可通透從而允許質(zhì)粒導(dǎo)入。電穿孔的原生質(zhì)體重整細(xì)胞壁、分裂并再生。
將DNA分子引入植物細(xì)胞的另一種方法是用所轉(zhuǎn)基因后的根癌土壤桿菌和發(fā)根病土壤桿菌感染植物細(xì)胞。在本領(lǐng)域公知的合適條件下，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞發(fā)育形成芽或根，并進(jìn)一步發(fā)育成植株。通常，該程序涉及用細(xì)菌懸液接種植物組織，并把該組織在25-28℃的無抗生素的再生培養(yǎng)基中孵育48-72小時(shí)。
土壤桿菌屬為革蘭氏陰性的根瘤菌科的代表屬。它可以引起細(xì)菌性根癌病(A.tumefaciens)和毛根病(A.rhizoGenes)。患這兩種病的植物細(xì)胞被誘導(dǎo)生成稱為冠癭堿的氨基酸衍生物，該衍生物只能被細(xì)菌代謝。負(fù)責(zé)表達(dá)冠癭堿細(xì)菌基因是嵌合表達(dá)彈夾控制元件的一個(gè)方便的來源。此外，可以用檢測冠癭堿存在與否來鑒定被轉(zhuǎn)化的組織。
異源的遺傳序列可通過根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根病土壤桿菌的Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的植物細(xì)胞。土壤桿菌屬細(xì)菌感染植物細(xì)胞時(shí)，Ti或Ri質(zhì)粒可以被傳遞給植物細(xì)胞，并穩(wěn)定地整合入植物基因組。J.Schell，Science，2371176-83(1987)，在此引入作為參考。
轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞必須能夠再生。
植株從培養(yǎng)的原生質(zhì)體中再生的描述參見Evans et al.，的描述，Handbook Of Plant Cell Culture，Vol 1(MacMillan PublishingCo.，New York，1983)；和Vasil I.R.(ed.)Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants.Acad.Press，Orlando，Vol.1，1984，和Vol.III(1986)，在此引入作為參考。
眾所周知，實(shí)際上所有的植株可以從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織再生，包括但不限于，甘蔗、甜菜、棉花、果樹和豆類的所有主要種。
再生方法隨不同的植物種而各不相同，但一般首先需要提供所轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的懸浮液和包含外植體的培養(yǎng)皿。愈傷組織(callustissue)首先形成，愈傷組織被誘導(dǎo)發(fā)芽并接著植根。可替代地，愈傷組織也可誘導(dǎo)生成胚胎。這些胚胎可象天然胚胎一樣發(fā)芽形成植株。培養(yǎng)基一般包括各種氨基酸和激素如茁長素和細(xì)胞分裂素。向培養(yǎng)基加谷氨酸和脯氨酸也是有利的，尤其是對玉米和苜蓿。有效的再生依賴于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史。如果控制這三個(gè)可變因素，再生則可以產(chǎn)生和重復(fù)。
在表達(dá)彈夾被穩(wěn)定地整合入轉(zhuǎn)基因植株后，可以通過有性雜交轉(zhuǎn)化給其它植株。根據(jù)雜交種類的不同，可從大量標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中選用任何一種。
一旦產(chǎn)生了這種類型的轉(zhuǎn)基因植株，植株自身就可以用常規(guī)培養(yǎng)方法來培養(yǎng)，從而使DNA構(gòu)建體出現(xiàn)在得到的植株中。可替代地，可從轉(zhuǎn)基因植株中回收轉(zhuǎn)基因種子。然后，用傳統(tǒng)的方法把這些種子種植在土壤中并培養(yǎng)生成轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明可以與各種植物或其種子結(jié)合使用。合適的植物包括雙子葉植物和單子葉植物。更具體地說，有用的作物包括苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬、圓白菜、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、鳳梨、大豆、煙草、西紅柿、高粱、木瓜和甘蔗。合適的觀賞植物的實(shí)例是擬南芥菜、非洲紫苣苔、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨和百日菊。
實(shí)施例實(shí)施例1-克隆和轉(zhuǎn)化以番茄斑萎病毒(TSWV-BL)萵苣分離株的N基因(Pang，S.-Z.，et al.，“表達(dá)番茄斑萎病毒核衣殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物對該病毒異源分離株的抗性，”Phytopathology，821223-29(1992)，在此引入作為參考)為模板，用表1所列引物來構(gòu)建不同長度N基因片段。
表1.克隆所用的引用名稱 位置 序列用于N基因片段91-842776-27445′-AGCTAATCTAGAACCATGGATGACTCACTAAGGAAAGCATTGTTGC(SEQ.ID.NO.1)93-892669-26505′-TACAGTTCTAGAACCATGGTCTGGAAAACCTTGACCAG(SEQ.ID.NO.2)93-852576-25565′-TACAGTTCTAGAACCATGGTAAAGCGATTTTACTTTTGGTA(SEQ.ID.NO.3)92-552373-23545′-AGATTCTCTAGACCATGGTGACTTGATGAGCAAAGTCTGTGAGGCTTGC(SEQ.ID.NO.4)93-912266-22485′-TACAGTTCTAGAACCATGGAAAATACAAGGATCTCGGG(SEQ.ID.NO.5)93-872153-21335′-TACAGTTCTAGAACCATGGTAGAAGGGGAAAGAGTATGCTG(SEQ.ID.NO.6)90-471918-19375′-AGCATTGGATCCATGGTTAACACACTAAGCAAGCAC(SEQ.ID.NO.7)93-862158-21775′-TCTTGAGGATCCATGGCTGATCTTCATTCATTTCAA(SEQ.ID.NO.8)93-902269-22885′-TCTTGAGGATCCATGGATCCTGATATATAGCCAAGA(SEQ.ID.NO.9)92-532383-24025′-TACAGTGGATCCATGGTTAAGGTAATCCATAGGCTTGAC(SEQ.ID.NO.10)93-842577-25975′-TCTTGAGGATCCATGGCTTAATAACCTTCATTATGC(SEQ.ID.NO.11)93-882671-26905′-TCTTGAGGATCCATGGAAAAGTCTTGAAGTTGAATG(SEQ.ID.NO.12)94-265 2556-25305′-AGCTAATCTAGAACCATGGATGAAAAATTACCATAAAGAAAACTTCAGAC(SEQ.ID.NO.13)94-266 2182-22065′-AGCATTGGATCCATGGTTAGTTACCTAGTTTTCTTTTCAGCACAGTGCAAACT(SEQ.ID.NO.14)5′TuMV -- 5′-TTGACTCCATGGCAGGTGAAACGCTTGAGG(SEQ.ID.NO.15)3′TuMV -- 5′-GTCGTACCATGGCGAGAATACTAACGAGTAAAC(SEQ.ID.NO.16)用于GFP基因5′gfp NA 5′-TGAACATCTAGAACCATGGGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG(SEQ.ID.NO.17)3′gfp NA 5′-TGAACAGGATCCATGGTCTACGAATGCTATTATTTGTATAGTTC(SEQ.ID.NO.18)擴(kuò)增N基因片段所用各種引物的核苷酸位置公開于Pang et al.，“表達(dá)番茄斑萎病毒核衣殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物對該病毒異源分離株的抗性，”Phytopathology，821223-29(1992)中，該文獻(xiàn)在此引入作為參考。N基因片段的正向引物設(shè)計(jì)包含一個(gè)讀框外的ATG和/或終止密碼子以保證產(chǎn)生不可翻譯的N基因轉(zhuǎn)錄本。PCR擴(kuò)增的N基因片段(表2)以有義方向克隆到植物表達(dá)載體pBI525的NcoI位點(diǎn)(Pang，S.-Z.，et al.，“表達(dá)番茄斑萎病毒核衣殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物對該病毒異源分離株的抗性，”Phytopathology，821223-29(1992)，在此引入作為參考)。
表2 表達(dá)N基因片段的R1植株對接種TSWV-BL分離株的反應(yīng)
將TSWV-BL感染后的N.Benthamiana植株的葉片抽提物的30倍稀釋液用于5-7葉齡植株的三個(gè)頂葉上。在至少45天的觀察期間內(nèi)每隔一天記錄數(shù)據(jù)。反應(yīng)可分為三種表型1)高度易感(”HS”)，接種后5-10天可觀察到一般系統(tǒng)癥狀；2)高度耐受(“HT”)，系統(tǒng)癥狀明顯推遲(接種后超過10天)；3)高度抵抗(“HR”)，植株整個(gè)生活周期無癥狀。關(guān)于TSWV-BL的N基因的說明參見圖1。為構(gòu)建各種N基因片段同綠色熒光蛋白(“GFP”)的融合體，用GFP引物(表1)從pGFP質(zhì)粒(Clontech，Palo Alto，CA)擴(kuò)增可翻譯的GFP開放閱讀框并轉(zhuǎn)錄融合(transcriptionalfusion)克隆在pBI525中N基因片段2/2N，3/4N和5/8N的5’端NcoI位點(diǎn)內(nèi)。得到的GFP/N融合體含有可翻譯的GFP開放閱讀框和接著的作為GFP基因的3’端非翻譯區(qū)的不同長度的N基因片段。
上述得到的植株表達(dá)載體用HindIII和EcoRI(如果需要可部分消化)消化，分離包含有相應(yīng)基因表達(dá)框的HindIII-EcoRI片段并插入pBIN19的相同位點(diǎn)。得到的二元載體轉(zhuǎn)入根癌土壤桿菌LBA4404，然后用包含該載體的該根癌土壤桿菌接種N.benthamiana植株的葉盤，基本上按照Horsch等描述的方法進(jìn)行。(Horsch，R.B.，et，al.，“一種將基因轉(zhuǎn)入植物的簡便和常用方法，”Science、2271229-31(1985)，在此引入作為參考)。
實(shí)施例2-轉(zhuǎn)基因植物的ELISA實(shí)驗(yàn)和Northern blot分析。
用nptII ELISA試劑盒，通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(”DAS-ELISA”)來檢測轉(zhuǎn)基因植物中的nptII酶(5 Prime to 3Prime，INC)。RNA印跡具體操作參見以前文獻(xiàn)(Pang，S.Z.，et al.，“轉(zhuǎn)基因煙草保護(hù)煙草不受番茄斑萎病毒和鳳仙花壞死環(huán)斑病毒感染的不同機(jī)制，”Bio/Technology，11819-24(1993)，在此引入作為參考)。
實(shí)施例3-轉(zhuǎn)基因植株的接種根據(jù)以前文獻(xiàn)(Pang，S.-Z.，et al.，“表達(dá)番茄斑萎病毒核衣殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物對該病毒異源分離株的抗性，”Phytopathology，821223-29(1992)，在此引入作為參考)進(jìn)行接種。在至少兩個(gè)月的期間內(nèi)，每隔一天記錄系統(tǒng)癥狀。
實(shí)施例4-分離核和核失控轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)分離核和核失控轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的具體操作參見以前文獻(xiàn)(Pang，S.Z.，et al.，“轉(zhuǎn)基因萵苣中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默以及由此導(dǎo)致的抗tospovirus抗性受轉(zhuǎn)基因劑量和植物發(fā)育的影響，”Plant Journal，9899-09(1996)，在此引入作為參考)。
實(shí)施例5-小的N基因片段(92-235bp)不能誘發(fā)RNA介導(dǎo)的tospovirus抗性。
不可翻譯的長度為92-453bp的N基因片段(表2)用合適的5’端和3’端引物(表1)PCR擴(kuò)增。為了防止截短的N蛋白的翻譯，5’端引物設(shè)計(jì)為包含一個(gè)讀框外的ATG并在其后加終止密碼子。把代表整個(gè)N基因不同區(qū)段的N基因片段(圖1；表2)以有義方向克隆到植物表達(dá)載體pBI525中。該載體使用了雙加強(qiáng)的CaMV 35S啟動子，苜?；ㄈ~病毒(“AIMV”)的5’端非翻譯區(qū)和胭脂堿合成酶基因的3’端非翻譯區(qū)。通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用獲得的表達(dá)彈夾獲得轉(zhuǎn)基因的N.benthamiana植株。
為了從R1轉(zhuǎn)基因群體中鑒別出非轉(zhuǎn)基因分離株，首先用nptIIELISA對R1轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行篩選。為了排除接種期間遺漏和人為偏差的可能性，來自每一品系的非轉(zhuǎn)基因分離株與轉(zhuǎn)基因的R1植株一起接種作為內(nèi)對照。此外，每一個(gè)接種實(shí)驗(yàn)還包含未轉(zhuǎn)化的N.benthamiana植株。圖2和表2總結(jié)了接種后的R1植株對TSWV-BL的反應(yīng)。與陰性對照植株對病毒絕對易感不同，表達(dá)大的N基因片段(387-453bp，N基因的一半)可以使20-51％的R1植株中具有高度的抗TSWV-BL抗性，使4-22％的R1植株對tospovirus感染產(chǎn)生耐受。此外還表明，R1植株對密切相關(guān)的TSWV-10W分離株有抗性，而對關(guān)系遠(yuǎn)的鳳仙花壞死環(huán)斑病毒(“INSV”)(Law，M.D.，et al.，”鳳仙花壞死環(huán)斑病毒的M RNA具有雙義基因組結(jié)構(gòu)，”Virologv.188732-41(1992)，在此引入作為參考)或落花生環(huán)斑病毒(“GRSV”)(Pang，S.Z.，et al.，“一株典型的(distinct)tospovirus的生物學(xué)特性及其mRNA的序列分析，”Phytopathology，83728-33(1993)，在此引入作為參考)分離株則無抗性。所選品系的Northern分析表明，抗性表型與N基因片段轉(zhuǎn)錄本的低水平積累相關(guān)(圖3A)。為進(jìn)一步證實(shí)N基因片段的穩(wěn)定態(tài)mRNA積累水平的降低是由于所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)節(jié)導(dǎo)致的，進(jìn)行了核失控轉(zhuǎn)錄分析。用內(nèi)源性的肌動蛋白作為對照，發(fā)現(xiàn)N基因片段在沉默的子代中的轉(zhuǎn)錄效率高于非沉默的高表達(dá)子代(圖3B)。這些結(jié)果一起表明，觀察到的抗性是轉(zhuǎn)錄后所轉(zhuǎn)基因沉默的結(jié)果，這種現(xiàn)象影響了穩(wěn)定態(tài)mRNA的積累但不影響轉(zhuǎn)錄效率。
類似地，用TSWV-BL和其他的tospovirus分離株接種表達(dá)小的N基因片段(92-235bp，1/4到1/8 NP)的R1植株，所有的植株都對tospovirus易感(表2)。對所選R1植株的RNA印跡分析表明，N基因片段的轉(zhuǎn)錄水平同所轉(zhuǎn)基因的長度相關(guān)。如圖4所示，非沉默的R1植株中，較大的所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄本的積累水平通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于那些較小的所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄本的積累水平(圖4)。該結(jié)果表明，小的N基因片段在核中沒有被有效地轉(zhuǎn)錄，或者雖以近似的效率轉(zhuǎn)錄但在胞質(zhì)中未經(jīng)正確的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)或不穩(wěn)定。因此，在那些轉(zhuǎn)入了小的所轉(zhuǎn)基因的植株中，沒有誘導(dǎo)形成所轉(zhuǎn)基因的沉默。事實(shí)上，用核失控轉(zhuǎn)錄分析對大量表達(dá)小的N基因片段的代表品系進(jìn)行的分析表明，沒有得到任何證據(jù)能夠證明在任何一個(gè)所測試系中發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
實(shí)施例6-小的N基因片段與GFP的融合體可賦予RNA介導(dǎo)的tospovirus抗性。
小的N基因片段不能賦予RNA介導(dǎo)的抗性可能是由于轉(zhuǎn)基因太小而不能表達(dá)和不能高水平的積累(例如，無效轉(zhuǎn)錄、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)或低穩(wěn)定性)或著是由于N基因片段太小而低于入侵病毒基因組反式失活所需同源區(qū)的最低長度。按照上述方法，把各種N基因片段(110、218和453bp)融合到GFP基因的3’端區(qū)域。該融合體在植物細(xì)胞中的表達(dá)可產(chǎn)生包括功能性GFP開放閱讀框以及作為3’端非翻譯區(qū)緊接其后的各種N基因片段的轉(zhuǎn)錄本。用同源分離株TSWV-BL接種表達(dá)這些融合體R0植株，接種結(jié)果總結(jié)于表3。作為對照，單獨(dú)表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因R0植株在接種后5～10天呈現(xiàn)典型的系統(tǒng)癥狀。另一方面，所有的GFP/N融合體可賦予不同水平的抗TSWV-BL的抗性(表3)，包括那些單獨(dú)在植株中表達(dá)時(shí)不能提供對TSWV-BL保護(hù)的小的N基因片段(110bp～218bp)(表2)。表3表達(dá)GFP/N融合體的R0植株對接種TSWV-BL分離株的反應(yīng)
a將TSWV-BL感染后的N.Benthamiana植株的葉片抽提物的30倍稀釋液用于5-7葉齡植株的三個(gè)頂葉上。在至少45天的觀察期間內(nèi)每隔一天記錄數(shù)據(jù)。反應(yīng)可分為三種表型1)高度易感(”HS”)，接種后5-10天可觀察到系統(tǒng)癥狀；2)高度耐受(“HT”)，系統(tǒng)癥狀明顯推遲(接種后超過10天)；3)高度抵抗(“HR”)，植株整個(gè)生活周期無癥狀。
用類似的方法接種來自所選R0品系的R1子代，它們表現(xiàn)出類似水平的對TSWV-BL的保護(hù)(表4)。表4.表達(dá)GFP/N融合體的R1植株對接種TSWV-BL分離株的反應(yīng)
a將TSWV-BL感染后的N.Benthamiana植株的葉片抽提物的30倍稀釋液用于5-7葉齡植株的三個(gè)頂葉上。在至少45天的觀察期間內(nèi)每隔一天記錄數(shù)據(jù)。反應(yīng)可分為三種表型1)高度易感(”HS”)，接種后5-10天可觀察到系統(tǒng)癥狀；2)高度耐受(“HT”)，系統(tǒng)癥狀明顯推遲(接種后超過10天)；3)高度抵抗(“HR”)，植株整個(gè)生活周期無癥狀。
這些R1植株也表現(xiàn)出對密切相關(guān)的TSWV-10W分離株有抗性，而對關(guān)系遠(yuǎn)的INSV或GRSV分離株則無抗性。這些結(jié)果說明GFP基因引起基因沉默，從而降解GFP、小的目標(biāo)N基因片段以及那些來自入侵病毒的激發(fā)起植株抗性的同源序列。但是，最小的GFP-5/8N的融合體(有110bp同源)幾乎無法激起抗TSWV-BL的抗性，這一點(diǎn)可以從被保護(hù)R0植株的數(shù)目較少及保護(hù)質(zhì)量上反映出來(表3和4)，這一點(diǎn)說明，110bp的核苷酸序列接近反式失活以及由此獲得抗病毒抗性所需的最短同源序列。此外，用N基因和GFP基因兩者作為探針，通過RNA印跡分析一些表達(dá)融合體的R1植株(圖5)。RNA印跡分析結(jié)果表明所觀察到的抗性又與融合基因轉(zhuǎn)錄本的低水平積累相關(guān)，這就表明在單獨(dú)表達(dá)N基因片段的植株體內(nèi)或表達(dá)GFP/N融合體的植株體內(nèi)所運(yùn)行的抗性機(jī)制相同。
已經(jīng)獲得了許多單獨(dú)表達(dá)TSWV N基因不同區(qū)段或者與非病毒序列，GFP，融合表達(dá)的植株品系。所轉(zhuǎn)基因的長度小于N基因的1/4(235bp)時(shí)，單獨(dú)表達(dá)雖然無效，但它與GFP基因融合表達(dá)就能使侵入的同源的tospovirus轉(zhuǎn)錄后反式失活。該結(jié)果表明小N轉(zhuǎn)基因單獨(dú)不能誘導(dǎo)同源依賴性的病毒抗性并不是由于它們與被沉默的所轉(zhuǎn)基因(此處為病毒基因組)之間的同源長度不夠，而是因?yàn)樗鼈儾荒苷T導(dǎo)基因沉默。這樣，本研究就把誘導(dǎo)所轉(zhuǎn)基因沉默的能力與提供同源依賴性的反式失活的能力區(qū)分了開來。
實(shí)施例7-小的N基因片段與GFP或TuMV-CP的融合體可賦予RNA介導(dǎo)的多種抗性與GFP的3’端的融合的各種N基因片段(2/2N，3/4N和5/8N)可以賦予轉(zhuǎn)基因植物的R0和R1子代抗Tospovirus的抗性(表3和4)。English，et al.，“表現(xiàn)為核基因沉默的轉(zhuǎn)基因植物可抑制病毒的積累，”Plant Cell，8179-88(1996)，在此引入作為參考，該文獻(xiàn)報(bào)道由于被沉默的植物中的降解機(jī)制可識別入侵的嵌合病毒中的被沉默序列，所以帶有被沉默的所轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可使含有所轉(zhuǎn)基因序列的嵌合病毒失活。因?yàn)镚FP和N片段在TSWV抗性植株中都被沉默(圖5)，所以為了測定具有GFP/N融合體的轉(zhuǎn)基因植物是否對TSWV和具有GFP序列的嵌合病毒都具有抗性，分別用TSWV、TMV-GFP和TMV-GFP-NP接種具有GFP/N融合體的R2轉(zhuǎn)基因植物(圖7)。如表5所示，具有GFP/N融合體的轉(zhuǎn)基因植株對TSWV和TMV-GFP有抗性。該資料表明連有沉默子(此處為GFP)的小N片段可賦予轉(zhuǎn)基因植物多種抗性。
表5表達(dá)GFP-2/2N，GFP-3/4N和GFP-5/8N的轉(zhuǎn)基因植株R2子代對TSWV、TMV-GFP和TMV-GFP-NP的反應(yīng)TSWV TMV-GFP TMV-GFP-NPn R Sn R Sn R SGFP-2/2N4-11(8)37321 12 9NT NTGFP-3/4N3-10(5)19326 26 04 4 04 4 03-10(6)25035 35 0NT NTGFP-5/8N2-6(1)3 38 38 04 4 04 4 0對照 12 0 12 12 1 11 12 1 11把TSWV-BL感染的葉片抽提物(1/30)(Pang et al.，“非靶DNA序列可減小RNA介導(dǎo)的Tospovirus抗性轉(zhuǎn)基因植物必需的轉(zhuǎn)基因長度，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，948261-66(1997)，在此引入作為參考)或體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的TMV-GFP的傳染性轉(zhuǎn)錄本(Casper etal.，“在基于煙草花葉病毒的載體上表達(dá)綠色熒光蛋白編碼基因，”Gene，17369-73(1996)，在此引入作為參考)施加到5～7葉齡的N.Benthamiana的3個(gè)頂葉上。當(dāng)用TMV-GFP感染時(shí)，易感(S)植株在TSWL接種5-10天后表現(xiàn)出典型的系統(tǒng)癥狀或者當(dāng)用TMV-GFP感染時(shí)，在被注射葉上表現(xiàn)2-5 DPI的綠色熒光或在頂葉上表現(xiàn)4-6DPI的綠色熒光?？剐?R)植株在30 DPI時(shí)仍無癥狀。
其他的DNA所轉(zhuǎn)基因(除GFP DNA以外)也可以用來與N基因片段連接并誘導(dǎo)沉默。如果“沉默的”DNA來源于病毒，它可以作為賦予抗性、導(dǎo)致多種抗性的病毒源的所轉(zhuǎn)基因。這一點(diǎn)可以通過連接到turnip mosaic potyvirus(TuMV)外殼蛋白基因上并轉(zhuǎn)移入N.Benthamiana中的TSWV的1/4和1/8N基因片段來檢測(圖6)。用TuMV和TSWV接種R1子代。接種過的R1植株對TSWV-BL和TuMV的反應(yīng)總結(jié)于表6。同陰性對照植物完全對病毒易感不同的是，用TuMVCP-3/4N轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中有4個(gè)品系以及用TuMV CP-5/8N轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中有1個(gè)品系具有抗TuMV和TSWV的抗性。表6連接在TuMV的CP上的節(jié)段對接種TuMV ESC8和TSWV-BL的反應(yīng)對TSWV的反應(yīng)對TuMV的反應(yīng)#測試總數(shù) S DR#測試總數(shù) SDRCP-3/4N55-3 101000 1073055-4 115 42 1272355-23 121200 1212 0055-6 8 2 42 1012755-10 121200 1037055-9 281873 29881355-17 161411 1662855-21 131300 21531355-15 171700 1111 0055-20 141400 17401355-14 161600 1616 0055-19 171700 1818 0055-8 161600 2039855-13 161600 2015 5055-16 161600 1910 7255-12 202000 1313 0055-2 171700 1515 0055-11 191900 23412 7CP-5/BN125-7 191180 1918 10125-8 151500 1616 00125-9 181800 1717 00125-10242400 2121 00125-11121200 1414 00125-12201442 1915 22125-13141400 1414 00125-14212100 2121 00125-15111100 1212 00125-17171700 1111 00125-18111100 1010 00125-19111100 9 900125-20161600 8 800125-21121200 1212 00
將TuMV-ESC8或TSWV-BL的30倍稀釋的葉片抽提物施用到5-7葉齡植株的3個(gè)頂葉上。在至少45天的觀察期間內(nèi)每隔一天記錄數(shù)據(jù)。反應(yīng)可分為三種表型1)易感(S)，接種后5-8天可觀察到系統(tǒng)性癥狀；2)推遲(D)，系統(tǒng)性癥狀的出現(xiàn)明顯推遲(同對照易感的植株相比推遲3-16天)；3)抵抗(R)，植株在整個(gè)生活周期內(nèi)生長和發(fā)育正常，即使在一些新生葉上出現(xiàn)了弱的花十病的癥狀，但當(dāng)葉片發(fā)育到后期階段完全伸展開后癥狀就消失了。這些弱的花十病的癥狀似乎并不影響任何階段植株的正常生長和發(fā)育。
該數(shù)據(jù)說明了以下幾點(diǎn)1)基因沉默可以被GFP、TSWV和TuMV所轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)；2)1/2N的基因長度而不是1/4和1/8N的基因長度可賦予抗性；3)當(dāng)將病毒基因連接到一個(gè)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的DNA分子(即GFP)之后，可顯著減小賦予抗性所需的病毒所轉(zhuǎn)基因(TSWV N基因)的最小長度(即減少到1/8N基因以下)；4)誘導(dǎo)所連接病毒基因片段沉默的DNA本身可以是病毒基因，如所示的TuMV。這些結(jié)果為發(fā)展一種用于構(gòu)建抗多種病毒抗性的簡便有效的新策略打下了基礎(chǔ)，即將幾個(gè)小的病毒DNA片段和一沉默子DNA(GFP，病毒序列以及來自植物、動物和其它有機(jī)體的任何感興趣的基因)相連接。這些資料也提出了發(fā)展一種簡便、有效的新策略，用來控制和調(diào)控基因表達(dá)、酶和蛋白的生成以及轉(zhuǎn)基因植物中的任何感興趣的表型的可能性。
小的N基因片段不能誘導(dǎo)所轉(zhuǎn)基因沉默可能是由于細(xì)胞核中的無效轉(zhuǎn)錄、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)或細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄本的低穩(wěn)定性。該結(jié)論同RNA印跡分析的結(jié)果一致，表明小的所轉(zhuǎn)基因片段的轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞質(zhì)中的積累水平遠(yuǎn)低于大的所轉(zhuǎn)基因(圖4)。小的所轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄本積累水平的降低可能是由于轉(zhuǎn)錄起始機(jī)器(machinery)和轉(zhuǎn)錄終止機(jī)器之間的空間干擾而產(chǎn)生的。可替代地，小的N基因的轉(zhuǎn)錄本可能丟失了有效mRNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和/或保持穩(wěn)定所必須的嚴(yán)格的BNA序列元件，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中成熟mRNA的積累大大減少(Caponigro，G.，et al.，“mRNA在芽殖酵母中轉(zhuǎn)換的機(jī)制和控制”Microbiological Reviews.60233-49(1996)，在此引入作為參考)。把GFP基因連接加到小的所轉(zhuǎn)基因上，可能只是增強(qiáng)了對于所轉(zhuǎn)基因長度的轉(zhuǎn)錄能力，或者是GFP基因?yàn)槌墒靘RNA的積累提供了所需的RNA序列元件。
另一方面，被沉默的所轉(zhuǎn)基因的反式失活需要同源序列短的多。這樣，短至110bp的轉(zhuǎn)基因與GFP表達(dá)為融合體時(shí)，可以使入侵病毒的基因組反式失活。這種短的同源序列可能是與入侵病毒相互作用形成RNA雙鏈，從而成為細(xì)胞降解的靶序列。最小的融合體所轉(zhuǎn)基因GFP-5/8N不足以賦予病毒抗性(表3和4)，這個(gè)觀察結(jié)果表明110bp(1/8NP)的同源序列可能接近了被沉默的基因(本例中為病毒基因組)的反式失活所需的同源序列的最短長度。這同最近的觀察結(jié)果一致Sijen，T.，et al.，“RNA介導(dǎo)的病毒抗性重復(fù)轉(zhuǎn)基因的作用和靶區(qū)域描繪”，Plant Cell，82227-94(1996)，在此引入作為參考。他們表明只有60個(gè)核苷酸的小的同源序列就足以導(dǎo)致一個(gè)重組的PVX分子遭受基因沉默介導(dǎo)的消除過程。他們還表明抗性的頻率和質(zhì)量似乎取決于同源序列的長度以及接種劑量這兩個(gè)因素。
N基因的任何部分(前半段，中段，后半段)都可以賦予轉(zhuǎn)錄后基因沉默介導(dǎo)的病毒抗性(表2)。這一結(jié)果表明，N基因序列的特異性的RNA二級結(jié)構(gòu)對于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因沉默和病毒抗性并非必需。小片段(110-235bp)單獨(dú)表達(dá)時(shí)雖無效，但與GFP基因融合后卻可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默和病毒抗性?？傊D(zhuǎn)錄后基因沉默介導(dǎo)的病毒抗性依賴于所轉(zhuǎn)基因的長度。似乎N基因中的任何大于110bp的片段與GFP的融合都可以賦予抗性。這些結(jié)果也表明，大于某一長度的病毒基因組的任何部分與沉默子DNA(如GFP)的融合都可以賦予抗性。
本研究表明通過將小的病毒基因序列與GFP基因融合可以獲得同源依賴性的病毒抗性。這個(gè)觀察結(jié)果可以得出以下觀點(diǎn)任何大于110bp的病毒序列與穩(wěn)定表達(dá)的正常長度的非病毒所轉(zhuǎn)基因融合都能賦予RNA介導(dǎo)的抗性。如果真是這樣，將會大大加快基因工程病毒抗性的研究，因?yàn)榉蛛x特異的病毒基因如外殼蛋白基因或復(fù)制酶基因是非常費(fèi)力的，尤其是在那些病毒基因組結(jié)構(gòu)尚未完全定性的情況下。應(yīng)該指出，外殼蛋白基因仍將是RNA介導(dǎo)的抗性的最佳選擇之一，因?yàn)樗叨缺磉_(dá)且它的轉(zhuǎn)錄本在感染細(xì)胞中可能非常穩(wěn)定。
表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄后基因沉默介導(dǎo)的抗性的轉(zhuǎn)基因植株可以建立起高度的抗性狀態(tài)并阻止病毒復(fù)制。賦予病毒抗性優(yōu)選含有一個(gè)與各種小的不可翻譯片段病毒基因組融合的沉默子DNA的嵌合所轉(zhuǎn)基因。這樣做有幾個(gè)優(yōu)勢。第一，沉默子DNA可增加被誘導(dǎo)基因的沉默。第二，多個(gè)基因可嵌合在一起將會提供多種病毒抗性。第三，不可翻譯的構(gòu)建體不產(chǎn)生蛋白，從而減少自然發(fā)生的突變體與其他病毒的反向包衣殼作用(transencapsidation)之間互補(bǔ)的可能。第四，小片段還可以減少同別的病毒基因組重組的可能性。
盡管為了說明的需要已對本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但是應(yīng)該理解的是這些詳細(xì)描述僅僅是為了這個(gè)目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不脫離由以下權(quán)利要求限定的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的條件下做某些變通。
序列表(1)一般信息(i)申請人Cornell Research Foundation，Inc.(ii)發(fā)明名稱能賦予植物多種性狀的DNA構(gòu)建體(iii)序列數(shù)18(iv)通訊地址(A)地址Nixon，Hargrave，Devans & Doyle LLP(B)街道Clinton Square，P.O.Box 1051(C)城市Rochester(D)洲紐約(E)國家U.S.A.(F)郵政區(qū)號14603(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)以前申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/035,350(B)申請日期19-FEB-1997(vii)以前申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/062,870(B)申請日期21-OCT-1997(viii)代理人信息(A)姓名Goldman，Michael L.(B)注冊號30，727(C)REFERENCE/DOCKET NUMBER19603/1553(ix)通訊信息(A)電話(716)263-1304(B)電傳(716)263-1600(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度46個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型(xi)序列描述SEQ ID NO1AGCTAATCTA GAACCATGGA TGACTCACTA AGGAAAGCAT TGTTGC 46(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2TACAGTTCTA GAACCATGGT CTGGAAAACC TTGACCAG 38(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3TACAGTTCTA GAACCATGGT AAAGCGATTT TACTTTTGGT A 41(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度49堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4AGATTCTCTA GACCATGGTG ACTTGATGAG CAAAGTCTGT GAGGCTTGC 49(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5TACAGTTCTA GAACCATGGA AAATACAAGG ATCTCGGG 38(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度41堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6TACAGTTCTA GAACCATGGT AGAAGGGGAA AGAGTATGCT G 41(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7AGCATTGGAT CCATGGTTAA CACACTAAGC AAGCAC36(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8TCTTGAGGAT CCATGGCTGA TCTTCATTCA TTTCAA36(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9TCTTGAGGAT CCATGGATCC TGATATATAG CCAAGA36(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TACAGTGGAT CCATGGTTAA GGTAATCCAT AGGCTTGAC 39(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TCTTGAGGAT CCATGGCTTA ATAACCTTCA TTATGC36(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12TCTTGAGGAT CCATGGAAAA GTCTTGAAGT TGAATG36(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度50堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13AGCTAATCTA GAACCATGGA TGAAAAATTA CCATAAAGAA AACTTCAGAC 50(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度53堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14AGCATTGGAT CCATGGTTAG TTACCTAGTT TTCTTTTCAG CACAGTGCAA ACT 53(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15TTGACTCCAT GGCAGGTGAA ACGCTTGACG 30(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GTCGTACCAT GGCGAGAATA CTAACGAGTA AAC 33(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度44堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17TGAACATCTA GAACCATGGG TAAAGGAGAA GAACTTTTCA CTGG 44(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度44堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18TGAACAGGAT CCATGGTCTA CGAATGCTAT TATTTGTATA GTTC 4權(quán)利要求
1.一種含有一個(gè)融合基因的DNA構(gòu)建體，該融合基因包括一個(gè)性狀DNA分子，它的長度不足以把期望的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物以及一個(gè)沉默子DNA分子，它可操作地偶聯(lián)到所述的性狀DNA分子上，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默DNA分子共同把上述性狀賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以把相應(yīng)的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA是一個(gè)病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的病毒的cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子、編碼復(fù)制酶的DNA分子、非編碼蛋白的DNA分子、編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子以及其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的病毒的cDNA分子來自一種植物病毒，該植物病毒選自番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、番茄斑點(diǎn)病毒、番茄黃色卷葉病毒或其組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA分子是植物DNA分子，所述性狀是植物遺傳性狀。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的植物DNA分子影響植物性狀，所述植物性狀選自顏色、酶的生成及其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的一種DNA構(gòu)建體，進(jìn)一步包括一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上的啟動子序列以及一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上用來終止轉(zhuǎn)錄的終止序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的沉默子DNA分子選自一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子、一個(gè)植物DNA分子、一個(gè)病毒基因沉默子及其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA是一個(gè)病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的病毒的cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子、編碼復(fù)制酶的DNA分子、非編碼蛋白的DNA分子、編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子以及及其組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的病毒的cDNA分子來自一種植物病毒，該植物病毒選自番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、非編碼蛋白質(zhì)的DNA分子、番茄斑點(diǎn)病毒、番茄黃色卷葉病毒或其組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA分子是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的植物DNA分子影響植物性狀，所述植物性狀選自顏色、酶的生成及其組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，進(jìn)一步包括一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上的啟動子序列以及一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上用來終止轉(zhuǎn)錄的終止序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的沉默子DNA分子選自一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子、一個(gè)植物DNA分子及其組合。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼可翻譯的RNA分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼不可翻譯的RNA分子。
19.根據(jù)權(quán)利要求2的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA分子中的一個(gè)的長度足以賦予性狀。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的構(gòu)建體導(dǎo)致植株內(nèi)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA和沉默子DNA分子之間互不作用。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的沉默子DNA分子位于所述性狀DNA分子的3’端。
23.一個(gè)包含權(quán)利要求1中所述的DNA構(gòu)建體的DNA表達(dá)載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的一個(gè)DNA表達(dá)載體，其中所述DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以把相應(yīng)的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的一個(gè)DNA表達(dá)載體，其中所述的性狀DNA是病毒cDNA，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的一種DNA表達(dá)載體，其中所述的性狀DNA是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
27.一種用權(quán)利要求1中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的一種DNA宿主細(xì)胞，其中所述DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以把相應(yīng)的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的一種宿主細(xì)胞，其中所述的UM構(gòu)建體存在于一個(gè)表達(dá)載體中。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的一種宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的一種宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
32.一種用權(quán)利要求1中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以把相應(yīng)的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA是一個(gè)植物病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的病毒的cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子、編碼復(fù)制酶的DNA分子、非編碼蛋白的DNA分子、編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子以及及其組合。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物病毒的cDNA分子來自一種病毒，該病毒選自番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、非編碼蛋白的DNA分子、番茄斑點(diǎn)病毒、番茄黃色卷葉病毒或其組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物DNA分子影響植物性狀，所述植物性狀選自顏色、酶的生成及其組合。
39.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步包括一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上的啟動子序列以及一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上用來終止轉(zhuǎn)錄的終止序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的沉默子DNA分子選自一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子、一個(gè)植物DNA分子及其組合。
41.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼可翻譯的RNA分子。
42.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼不可翻譯的RNA分子。
43.根據(jù)權(quán)利要求33的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬、圓白菜、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、鳳梨、大豆、煙草、西紅柿、高粱、木瓜、甘蔗，擬南芥菜、非洲紫苣苔、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨和百日菊。
44.根據(jù)權(quán)利要求32的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的沉默子DNA分子異源于該植物。
45.根據(jù)權(quán)利要求32的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA分子異源于該植物。
46.一種賦予植物性狀的方法，其中包括用權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的一種方法，其中所述DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以把相應(yīng)的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，其中所述的性狀DNA是一個(gè)植物病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的一種方法，其中所述的病毒的cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子、編碼復(fù)制酶的DNA分子、非編碼蛋白的DNA分子、編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子以及其組合。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的一種方法，其中所述的植物病毒的DNA分子來自一種病毒，該病毒選自番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、非編碼蛋白的DNA分子、番茄斑點(diǎn)病毒、番茄黃色卷葉病毒和其組合。
51.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，其中所述的DNA分子是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的一種方法，其中所述的植物DNA分子是用于下面植物的，所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬、圓白菜、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、鳳梨、大豆、煙草、西紅柿、高粱、木瓜、甘蔗、擬南芥菜、非洲紫苣苔、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨、百日菊。
53.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，其中所述的沉默子DNA分子選自一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子、一個(gè)植物DNA分子及其組合。
54.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼可翻譯的RNA分子。
55.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼不可翻譯的RNA分子。
56.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，其中所述的植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬、圓白菜、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、鳳梨、大豆、煙草、西紅柿、高粱、木瓜、甘蔗。合適的觀賞植物的實(shí)例是擬南芥菜、非洲紫苣苔、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨、百日菊。
57.根據(jù)權(quán)利要求47的一種方法，進(jìn)一步包括增殖所述轉(zhuǎn)基因植物的子代。
58.一種用權(quán)利要求1中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以把相應(yīng)的性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的性狀DNA是一個(gè)病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的病毒的cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子、編碼復(fù)制酶的DNA分子、非編碼蛋白的DNA分子、編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子以及其組合。
62.根據(jù)權(quán)利要求60的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的病毒的cDNA分子來自一種病毒，該病毒選自番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、番茄斑點(diǎn)病毒、番茄黃色卷葉病毒或其組合。
63.根據(jù)權(quán)利要求59的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的性狀DNA分子是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的植物DNA分子影響植物性狀，所述植物性狀選自顏色、酶的生成及其組合。
65.根據(jù)權(quán)利要求59的轉(zhuǎn)基因植物種子，進(jìn)一步包括一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上的啟動子序列以及一段可操作地偶聯(lián)到所述融合基因上用來終止轉(zhuǎn)錄的終止序列。
66.根據(jù)權(quán)利要求59的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的沉默子DNA分子選自一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子及其組合。
67.根據(jù)權(quán)利要求60的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的病毒cDNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼可翻譯的RNA分子。
68.根據(jù)權(quán)利要求60的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的病毒cDNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼不可翻譯的RNA分子。
69.根據(jù)權(quán)利要求59的一種轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述的植物種子所對應(yīng)的植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬、圓白菜、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、鳳梨、大豆、煙草、西紅柿、高粱、木瓜、甘蔗、擬南芥菜、非洲紫苣苔、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨、百日菊。
70.一種賦予植物性狀的方法，其中包括種植權(quán)利要求58所述的轉(zhuǎn)基因植物種子以及增殖由所述的轉(zhuǎn)基因植物種子發(fā)育而成的植株。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的一種方法，其中所述的DNA構(gòu)建體包括多個(gè)性狀DNA分子，每一個(gè)性狀DNA分子的長度都不足以賦予所述性狀DNA分子轉(zhuǎn)化的植物以所述性狀。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，其中所述的性狀DNA分子是一個(gè)病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
73.根據(jù)權(quán)利要求72的一種方法，其中所述的病毒cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子，編碼復(fù)制酶的DNA分子，非編碼蛋白質(zhì)的DNA分子，編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子，及其組合。
74.根據(jù)權(quán)利要求72的一種方法，其中所述的病毒的cDNA分子來自一種病毒，該病毒選自番茄斑萎病毒、鳳仙花壞死環(huán)斑病毒，花生環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒、蕪菁花葉病毒、煙草蝕紋病毒、木瓜環(huán)斑病毒、番茄斑點(diǎn)病毒、番茄黃色卷葉病毒或其組合。
75.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，其中所述的性狀DNA分子是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的一種方法，其中所述的植物DNA分子影響植物性狀，所述植物性狀選自顏色、酶的生成及其組合。
77.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，其中所述的沉默子DNA分子選自一個(gè)病毒的cDNA分子、一個(gè)編碼水母綠色熒光蛋白的DNA分子、一個(gè)植物DNA分子及其組合。
78.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼可翻譯的RNA分子。
79.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，其中所述的性狀DNA分子和所述的沉默子DNA分子編碼不可翻譯的RNA分子。
80.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，其中所述的植物種子所對應(yīng)的植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬、圓白菜、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、鳳梨、大豆、煙草、西紅柿、高粱、木瓜、甘蔗、擬南芥菜、非洲紫苣苔、矮牽牛、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨、百日菊。
81.根據(jù)權(quán)利要求71的一種方法，進(jìn)一步包括增殖所述轉(zhuǎn)基因植物的子代。
82.一種含有一個(gè)融合基因的DNA構(gòu)建體，該融合基因包括多個(gè)性狀DNA分子，并且其中至少有一些性狀DNA分子的長度不足以把預(yù)期性狀賦予該性狀DNA分子所轉(zhuǎn)化的植物，但是，上述多個(gè)性狀DNA分子聯(lián)合足以把預(yù)期性狀賦予該DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的植物，并導(dǎo)致該融合基因的沉默。
83.根據(jù)權(quán)利要求82的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA是一個(gè)病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性。
84.根據(jù)權(quán)利要求82的一種DNA構(gòu)建體，其中所述的性狀DNA分子是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀。
85.一種包含權(quán)利要求82中所述的DNA構(gòu)建體的DNA表達(dá)載體。
86.一種用權(quán)利要求82中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
87.一種用權(quán)利要求82中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA分子是一個(gè)病毒的cDNA分子，所述的性狀是對病毒性疾病的抗性，所述的cDNA分子選自編碼外殼蛋白的DNA分子、編碼復(fù)制酶的DNA分子、非編碼蛋白的DNA分子、編碼病毒基因產(chǎn)物的DNA分子以及其組合。
89.據(jù)權(quán)利要求87的一種轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的性狀DNA分子是植物DNA分子，所述的性狀是植物遺傳性狀，所述的DNA分子影響植物性狀，所述植物性狀選自顏色、酶的生成及其組合。
90.一種賦予植物性狀的方法，其中包括用權(quán)利要求82中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物。
91.一種用權(quán)利要求82中所述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子。
92.一種賦予植物性狀的方法，其中包括種植權(quán)利要求91中所述的轉(zhuǎn)基因植物種子以及增殖由所述的轉(zhuǎn)基因植物種子發(fā)育而成的植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及由融合基因形成的DNA構(gòu)建體,所述融合基因包括一個(gè)性狀DNA分子和一個(gè)沉默子DNA分子。該性狀DNA分子具有的長度不足以將期望的性狀傳遞給用該性狀DNA分子轉(zhuǎn)化的植物。沉默子DNA分子與該性狀DNA分子操作偶聯(lián),性狀和沉默子DNA分子聯(lián)合具有足夠的長度將性狀傳遞給用該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。公開了表達(dá)系統(tǒng),宿主細(xì)胞,植物和包含該DNA構(gòu)建體的植物的種子。本發(fā)明也涉及將多種性狀傳遞給植物。
文檔編號C12N1/21GK1252102SQ98804141
公開日2000年5月3日 申請日期1998年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月19日
發(fā)明者S·Z·龐, D·貢薩爾維斯, F·J·詹 申請人:康乃爾研究基金會有限公司