專利名稱：線蟲誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于在植物細(xì)胞中表達(dá)DNA序列的線蟲誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)DNA序列。本發(fā)明還包括含有有效地連接于在植物細(xì)胞中待表達(dá)的DNA上的該調(diào)節(jié)DNA序列的嵌合DNA，以及細(xì)胞中含有這類嵌合DNA的植物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及建立抗植物寄生線蟲或至少其對(duì)植物寄生線蟲敏感性降低的植物以及細(xì)胞、植物及其部分的方法。
現(xiàn)有技術(shù)在國(guó)際專利申請(qǐng)WO92/17054中，公開了鑒定及隨后從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離應(yīng)答線蟲調(diào)節(jié)DNA序列的方法。
在WO92/21757中，公開了幾種從番茄(Lycopersicon esculentum)中分離到的調(diào)節(jié)DNA序列，這些序列對(duì)南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)具有應(yīng)激性。這些調(diào)節(jié)序列中有些是經(jīng)線蟲刺激的(LEMMI’S，番茄與南方根結(jié)線蟲)，而其它似乎為線蟲所抑制。是否任何可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)序列可被更大范圍的線蟲所刺激尚不清楚。
另一種為南方根結(jié)線蟲所誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列公開在WO93/06710中。這種調(diào)節(jié)序列TobRb7不利的一面是它不能為眾多種類的胞囊線蟲(其中包括胞囊線蟲屬(Heterodera)和球形胞囊線蟲屬(Globodera)的種)所激活，這就使得TobRb7序列不適合用于旨在抗線蟲(如馬鈴著中抗胞囊線蟲)的嵌合構(gòu)建體。
本發(fā)明的目的是提供既能為胞囊線蟲，又為根結(jié)線蟲所誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)DNA序列，以及在這些DNA控制下在線蟲取食結(jié)構(gòu)中表達(dá)異源DNA序列的應(yīng)用，優(yōu)選但不必須的是基本上以取食位點(diǎn)特異的方式。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種從擬南芥中獲得的DNA片段，當(dāng)其重新導(dǎo)入植物體時(shí)，該DNA片段能提高根結(jié)線蟲和胞囊線蟲所誘導(dǎo)的相關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明，在SEQ ID NO1中1～3484的核苷酸序列是優(yōu)選的。同時(shí)，也構(gòu)思了當(dāng)其重新導(dǎo)入植物體時(shí)能提高根結(jié)線蟲和胞囊線蟲所誘導(dǎo)的相關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄之本發(fā)明的DNA片段的部分或變異體。本發(fā)明更進(jìn)一步優(yōu)選的方面包括基本上特異于線蟲取食位點(diǎn)的調(diào)節(jié)DNA片段。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案包括含沿轉(zhuǎn)錄方向的本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA片段以及在其轉(zhuǎn)錄控制下待表達(dá)的DNA序列之嵌合DNA序列，而且在該DNA片段的轉(zhuǎn)錄控制下的表達(dá)并不自然發(fā)生。本發(fā)明的嵌合DNA序列中優(yōu)選的DNA序列是那些其表達(dá)引起植物細(xì)胞破壞物產(chǎn)生的DNA序列，如芽孢桿菌RNA酶。在一種不同的實(shí)施方案中，細(xì)胞破壞物包括互補(bǔ)對(duì)細(xì)胞存活所必需的RNA的RNA。而在另一種實(shí)施方案中，待表達(dá)的DNA序列引起對(duì)誘導(dǎo)線蟲有毒物質(zhì)的產(chǎn)生。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的進(jìn)一步應(yīng)用包括含本發(fā)明的DNA片段或嵌合DNA序列的復(fù)制子、含有這類復(fù)制子的微生物、以及基因組已整合了本發(fā)明嵌合DNA序列的植物細(xì)胞。進(jìn)一步的應(yīng)用實(shí)施方案是基本上由本發(fā)明的細(xì)胞組成的植物根系，以及基本上由本發(fā)明的細(xì)胞組成的長(zhǎng)成植物，優(yōu)選的是雙子葉植物，更優(yōu)選的是馬鈴薯植物。還構(gòu)思了嫁接于本發(fā)明的根系上的植物，以及選自種子、花、塊莖、根、葉、果實(shí)、花粉中的植物部分和包括這類植物的木材和作物。
本發(fā)明也包括本發(fā)明的DNA片段應(yīng)用于鑒定在植物體中能提高相關(guān)DNA序列轉(zhuǎn)錄的亞片段。也構(gòu)思了應(yīng)用本發(fā)明的嵌合DNA序列轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列的片段、部分或變異體用于建立雜合調(diào)節(jié)DNA序列的用途。
下面的圖示進(jìn)一步描述了本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)介

圖1 雙元載體pMOG23質(zhì)粒圖譜。圖2 雙元載體pMOG800質(zhì)粒圖譜。圖3 雙元載體pMOG553質(zhì)粒圖譜。圖4 雙元載體pMOG819質(zhì)粒圖譜。圖5 雙元載體pMOG821質(zhì)粒圖譜。圖6 幾種pMOG821轉(zhuǎn)化擬南芥品系的線蟲取食位點(diǎn)(NFS)之外的表達(dá)模式。圖7 用于構(gòu)建抗線蟲植物的雙元系統(tǒng)中的NFS破壞 基因(disrupter gene)及中和基因(neutraliser gene)圖譜。圖8 雙元載體pMOG944質(zhì)粒圖譜。
本發(fā)明的數(shù)種實(shí)施方法及各種短語的含義詳述如下。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了可從擬南芥中獲得的調(diào)節(jié)DNA序列，該序列能為根結(jié)線蟲和胞囊線蟲所誘導(dǎo)，且對(duì)植物根中特殊的線蟲取食結(jié)構(gòu)中任何相關(guān)DNA所編碼的化合物的表達(dá)表現(xiàn)出高度偏愛。在先申請(qǐng)WO92/17054中，一種分離調(diào)節(jié)DNA序列的方法已公開并要求專利保護(hù)，在此導(dǎo)入作為參考。
原則上，本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列可用于在任何所選植物中表達(dá)任何異源DNA，方法是將所述的DNA置于該調(diào)節(jié)DNA序列的控制之下，用公知方法將獲得的嵌合DNA序列轉(zhuǎn)化植物。各種根結(jié)線蟲(如南方根結(jié)線蟲)和胞囊線蟲(如甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)和馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida))(表2列出的線蟲比較全面，但絕不僅限于此)一旦對(duì)根感染就表達(dá)異源DNA。有利地，為建立對(duì)植物寄生線蟲的敏感性降低的植物，異源DNA可用編碼對(duì)植物寄生線蟲有毒或有抑制作用的物質(zhì)的基因組成。這類有毒物質(zhì)的例子眾多，如蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)的內(nèi)毒素(如EP 0 352 052)、凝集素等等。
建立對(duì)植物寄生線蟲敏感性降低的植物是本發(fā)明的更優(yōu)選目標(biāo)，敏感性降低在于植物根的特化的取食結(jié)構(gòu)的破壞，這是通過在本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列控制下表達(dá)毒害植物的物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的。此方法總的原則已在國(guó)際專利申請(qǐng)WO92/21757、WO93/10251和WO94/10320中公開并要求專利保護(hù)，在此導(dǎo)入作為參考。出于一致性的緣故，這種毒害植物的物質(zhì)稱為線蟲取食位點(diǎn)(NFS)破壞物。
雖然本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列對(duì)線蟲取食結(jié)構(gòu)基本上特異，但是，由于它在非靶標(biāo)(即非NFS)組織中的表達(dá)，在其控制下的NFS破壞物的表達(dá)可能對(duì)植物的活力和/或產(chǎn)量有不利影響。此外，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列在轉(zhuǎn)化方法中的組織培養(yǎng)階段是有活性的，從而使此階段必須利用中和物。為了減少或消除(可能是潛在的)不利影響，特別優(yōu)選本發(fā)明的嵌合NFS破壞構(gòu)建體與中和基因構(gòu)建體的結(jié)合使用。有關(guān)構(gòu)建抗線蟲植物的這種所謂的雙元方法的詳細(xì)資料示于WO93/10251中。根據(jù)這種方法，將NFS破壞基因(基因A)置于一種至少在NFS中有活性的啟動(dòng)子的控制之下，優(yōu)選地是在NFS外沒有或幾乎沒有活力的啟動(dòng)子，而在NFS外所不希望的毒害植物的作用通過中和基因(基因B)的表達(dá)而中和，其中的中和基因至少在破壞物產(chǎn)生的組織(NFS除外)中表達(dá)。
根據(jù)雙元方法，適合的啟動(dòng)子A定義為驅(qū)使編碼NFS內(nèi)破壞物的下游基因表達(dá)的啟動(dòng)子，使破壞物的表達(dá)水平達(dá)到足以對(duì)NFS的代謝和/或功能和/或存活造成損害的程度；雖然在NFS外的組織中啟動(dòng)子優(yōu)選的是無活性的，但并不是必須如此；至少啟動(dòng)子在NFS外具有的活性水平不應(yīng)使基因A編碼的破壞物不能完全為基因B之產(chǎn)物中和。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列的特性如mnemonic#25.1所示，就象此處實(shí)施例所描述的一樣，它們?cè)陔p元方法中很有應(yīng)用價(jià)值。很明顯，本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列中可能存在眾多突變，只要這些突變體沒有根本改變其意圖使用的特性，這類突變體也不偏離本發(fā)明。
此外，如本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知的，植物基因的調(diào)節(jié)區(qū)域是由種類不同的亞區(qū)域所組成，就基因表達(dá)而言不同亞區(qū)域帶有不同的目的特性。如此處所指的亞區(qū)域的例子即是轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子，但也是轉(zhuǎn)錄的沉默子。這些元件可能是以通用(組成型)方式或組織特異性方式發(fā)生作用的。本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列中可在幾處進(jìn)行刪除，而且檢測(cè)亞片段相關(guān)DNA的表達(dá)模式。多種如此獲得的亞片段，甚至其組合可用在構(gòu)建線蟲抗性的方法中或包括在植物中異源DNA的表達(dá)的其它應(yīng)用之中。功能亞區(qū)域及其在促進(jìn)或抑制基因在植物中表達(dá)的應(yīng)用也包括在本發(fā)明中。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語NFS破壞物和中和物包括一系列經(jīng)選擇的化合物，它們?yōu)榛虍a(chǎn)物(蛋白質(zhì)，或RNA或反義RNA)對(duì)NFS或其中的細(xì)胞器之代謝和/或功能和/或存活有損害作用的DNA所編碼。其中中和物當(dāng)在同一細(xì)胞中與破壞物同時(shí)表達(dá)時(shí)，抑制破壞物的活性。優(yōu)選的破壞物和中和物的組合是，如從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中獲得的芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑(Hartley，1988，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，202，913-915)，限制性內(nèi)切酶核酸/相應(yīng)的甲基化酶，如從大腸桿菌(E. coli)獲得的EcoRI(Green等，1981，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，256，2143-2153)與EcoRI甲基化酶，或相似的組合，如在II型限制性修飾系統(tǒng)評(píng)述中所描述的(Wilson，1991，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，19，2539-2566)，細(xì)菌素與相應(yīng)的免疫蛋白質(zhì)，如大腸桿菌素與從大腸桿菌中所獲得的免疫蛋白質(zhì)(Lau等，1985，核酸研究，12，8733-8745)，或任何破壞物編碼基因，其可通過在啟動(dòng)子-B控制下同時(shí)產(chǎn)生的反義RNA被中和，如編碼Diptheria毒素鏈A的DNA序列(Czako和An，1991，植物生理(Plant Physiol.)，95，687-692)，RNA酶如RNA酶T1，核糖核酸酶或蛋白酶。更進(jìn)一步的可能是獲得一種編碼針對(duì)一種mRNA有核酶活性的基因，其中該mRNA編碼對(duì)植物有毒的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面是破壞物和中和物的組合，其分別包括對(duì)編碼細(xì)胞存活所必需的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物的內(nèi)源基因有抑制作用的基因及中和基因，中和基因是一種編碼能夠取代內(nèi)源蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物的功能的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物的基因。這類破壞基因可選自下列(a)編碼針對(duì)內(nèi)源RNA轉(zhuǎn)錄物的核酶基因，(b)轉(zhuǎn)錄時(shí)所產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物與細(xì)胞存活所必需的內(nèi)源基因之RNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)或至少部分互補(bǔ)的基因，這種方法稱為基因表達(dá)反義抑制(公開于EP-A240 208)，和(c)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物與細(xì)胞存活所必需的內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄物完全一樣或至少非常相似的基因，這種仍然未知的基因表達(dá)抑制方式稱為共抑制(Napoli C.等公開于1990，植物細(xì)胞(The Plant Cell)，2279-289)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是，應(yīng)用反義基因抑制細(xì)胞存活所必需的內(nèi)源基因的表達(dá)，由于本發(fā)明的調(diào)節(jié)DNA序列融合于該反義基因上游，從而使這些基因在線蟲取食結(jié)構(gòu)中表達(dá)。
如所述，反義基因?qū)Υ婊钏匦璧膬?nèi)源基因的抑制所導(dǎo)致的破壞作用為啟動(dòng)子B控制下的中和基因B的表達(dá)所中和，當(dāng)基因B表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)物與內(nèi)源存活基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽完全一樣或很相似，從而能夠替代內(nèi)源基因產(chǎn)物在宿主植物中的功能。優(yōu)選的，中和基因所編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列與內(nèi)源存活基因RNA轉(zhuǎn)錄物間存在差異，以避免可能的共抑制作用。因此，優(yōu)選的，中和基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽與內(nèi)源存活基因編碼的蛋白質(zhì)功能基本相同，但介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄物卻不同；適合于這種描述的中和基因能通過從不同的植物種或甚至不同的非植物種如酵母、真核動(dòng)物和原核生物的基因數(shù)據(jù)庫篩選而獲得。優(yōu)選地，破壞性反義轉(zhuǎn)基因與中和性有義轉(zhuǎn)基因編碼的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列一致性低于90％，更優(yōu)選地低于80％；甚至更優(yōu)選地，所述中和性有義轉(zhuǎn)基因編碼在氨基酸序列上與破壞基因產(chǎn)物不一致的蛋白質(zhì)或多肽基因產(chǎn)物，而且其中中和轉(zhuǎn)基因編碼的轉(zhuǎn)錄物之核苷酸序列的一致性低于75％。
反義破壞基因的靶基因選自編碼細(xì)胞存活所必需的酶的基因，這些酶也稱為看家酶，但優(yōu)選地應(yīng)為細(xì)胞核所編碼的單拷貝基因，雖然小型的基因家族也適合于本發(fā)明的目的。更進(jìn)一步地說，該基因的反義表達(dá)作用必須不能由于從這類酶正常合成酶產(chǎn)物的其它細(xì)胞或細(xì)胞器中的轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散而變得無效。優(yōu)選地，選擇編碼膜轉(zhuǎn)移酶的基因，因?yàn)樗鼈儏⑴c建立細(xì)胞器跨膜化學(xué)梯度。從定義上說，通過反義表達(dá)對(duì)這類蛋白質(zhì)的抑制，并不能通過底物在這些蛋白質(zhì)所在膜的跨膜擴(kuò)散而消除。被轉(zhuǎn)移的化合物并不局限于有機(jī)分子，它可以是無機(jī)性質(zhì)的，如P、H、OH或電子。
優(yōu)選地，這些膜轉(zhuǎn)移酶應(yīng)處于在寄生期間數(shù)量增加的細(xì)胞器，因此，顯示了在含有NFS的細(xì)胞中這類細(xì)胞器的關(guān)鍵作用。這類細(xì)胞器的特定例子是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞間連絲(Hussey等，1992，原生質(zhì)(Protoplasma)，167，55-65；Magnusson和Golinowski 1991，加拿大植物學(xué)雜志(Can.J.Botany)，69，44-52)。表1以舉例的方式列出了一些目標(biāo)酶，但本發(fā)明并不局限于本表中所提及的酶。更詳細(xì)的資料可從植物生物化學(xué)叢書(編者，Stumpf和Conn，1988-1991，1-16卷，學(xué)術(shù)出版社)或植物生理學(xué)百科全書(New Series，1976，Springer-Verlag，Berlin)中獲得。
雖然僅僅在一些情況下分離到了編碼這些酶的基因，因此，一般來說基因的拷貝數(shù)并不知，進(jìn)行這些工作的必要標(biāo)準(zhǔn)也在本發(fā)明中進(jìn)行了描述。表1 在NFS中反義表達(dá)的目標(biāo)酶舉例
合適的啟動(dòng)子B定義為在基因A表達(dá)的基本上所有細(xì)胞中都能驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子，前提是在線蟲取食結(jié)構(gòu)中并不驅(qū)動(dòng)或并不有效驅(qū)動(dòng)表達(dá)。(其中‘基本上所有細(xì)胞’的含義是指至少那些必須存活的以使正常植物生長(zhǎng)或這類植物的商業(yè)應(yīng)用的發(fā)育所需求的細(xì)胞)。如所示植物，其中破壞作用在宿主植物所有細(xì)胞中并未完全中和，雖然如此，這些植物還是存活且適合于商業(yè)應(yīng)用?？商峒暗氖窃谛廴锛?xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的破壞基因的植物，這可能產(chǎn)生雄性不育植物，這一點(diǎn)在有些作物中被看作是有商業(yè)吸引力的特征。啟動(dòng)子B類型中適合的例子可從植物或植物病毒中獲得，或者用化學(xué)合成。調(diào)節(jié)DNA序列也可以包括增強(qiáng)子序列，如在CaMV的35S啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子序列(Kay等，1987，科學(xué)(Science)，236，1299-1302)，和mRNA穩(wěn)定序列，如苜?；ㄈ~病毒RNA4的先導(dǎo)序列(Brederode等，1980，核酸研究，8，2213-2223)，或者以相似方式起作用的其它任何序列。
另外，為在所有或?qū)嶋H上所有植物組織中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，可用第二啟動(dòng)子-B’/基因-B互補(bǔ)啟動(dòng)子-B/基因-B，其表達(dá)模式在既沒有啟動(dòng)子-B又沒有啟動(dòng)子-B’驅(qū)動(dòng)表達(dá)的NFS中，第二啟動(dòng)子-B’/基因-B的表達(dá)能部分覆蓋或完全互補(bǔ)啟動(dòng)子-B/基因-B。同樣，包括(或部分包括)不同啟動(dòng)子的組合以實(shí)現(xiàn)屬于以上所述所需的表達(dá)模式的雜合啟動(dòng)子，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的，啟動(dòng)子-B是花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子或其衍生啟動(dòng)子，它們通常被認(rèn)為是植物組織中組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子(Odell等，1985，自然(Nature)，313，810-812)。另一種優(yōu)選的啟動(dòng)子-B例子是強(qiáng)根啟動(dòng)子roID(Leach和Aoyagi，1991，植物科學(xué)(Plant Sci.)，7969-76)，其獲自發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的質(zhì)粒pRiA4；ORF15的5’側(cè)翼區(qū)(Slightom等，1986，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，261108-121)。其它組成型的啟動(dòng)子，如胭脂堿合成酶啟動(dòng)子(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)或玄參花葉病毒啟動(dòng)子(EP-A 426 641)，用作啟動(dòng)子-B時(shí)的適用性，可通過與標(biāo)記基因如GUS的融合、這些構(gòu)建體對(duì)植物的轉(zhuǎn)移及用植物寄生線蟲(PPN)感染這些轉(zhuǎn)基因植物后的組織化學(xué)分析而進(jìn)行檢測(cè)(Jefferson，1987，植物分子生物學(xué)報(bào)告(Plant Mol.Biol.Reporter)，5387-405)。
其它調(diào)節(jié)序列如終止子序列和多腺苷酸化信號(hào)包括在植物中起這種作用的任何序列，其選擇屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)水平內(nèi)。這類序列的一個(gè)例子是根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶(nos)基因的3’側(cè)翼區(qū)域(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)。
這種雙元方法更詳細(xì)的資料可見于WO93/10251(在此引入作為參考)。
植物種類的選擇主要決定于農(nóng)業(yè)上發(fā)生植物寄生線蟲感染造成損害總量的估計(jì)和植物種類對(duì)轉(zhuǎn)化的適應(yīng)性。在農(nóng)業(yè)實(shí)踐中為植物寄生線蟲所侵害的且可通過本發(fā)明的方法使其對(duì)植物寄生線蟲的敏感性顯著降低的植物屬，現(xiàn)列于表2，但并不局限于表中所列的屬。
本發(fā)明說明書中所指的線蟲種類包括改變宿主細(xì)胞為特殊適用的取食結(jié)構(gòu)的所有植物寄生線蟲，且范圍包括從遷移性的表寄生種(如導(dǎo)管線蟲屬的種(Xiphinema spp.))到更進(jìn)化的固定性內(nèi)寄生種(如胞囊線蟲、根結(jié)線蟲和旋繞線蟲(Rotylenchulinae))。表2列出了一些寄生線蟲，但本發(fā)明并不局限于此表所列的種。更詳細(xì)的種類見Zuckerman等(編者，植物寄生線蟲(Plant Parasitic Nematodes)，卷I，1971，紐約，139-162)。表2 植物寄生線蟲舉例及其主要宿主植物
<p>在本發(fā)明中，與對(duì)照植物相比，如果在植物根表發(fā)育的成熟雌線蟲總數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性降低，則說該植物顯示出了對(duì)植物寄生線蟲敏感性降低的特性。根據(jù)成熟雌線蟲的總數(shù)將植物分類為對(duì)胞囊線蟲和根結(jié)線蟲的敏感性/抗性是常規(guī)技術(shù)(如LaMondia，1991，植物病害(Plant Disease)，75453-454；Omwega等，1990，植物病理學(xué)報(bào)(Phytopathol.)，80745-748)。
根據(jù)本發(fā)明，NFS應(yīng)包括起始取食細(xì)胞，其指在線蟲侵入的誘導(dǎo)下該細(xì)胞或數(shù)目非常有限的細(xì)胞注定變?yōu)榫€蟲取食結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，NFS破壞物并不局限于僅僅對(duì)NFS有不利作用的物質(zhì)；而且另外構(gòu)思了通過直接的相互作用對(duì)線蟲的發(fā)育有不利影響的破壞作用。
含有如本發(fā)明所述DNA序列的重組DNA導(dǎo)入宿主植物可采用數(shù)種技術(shù)。這些技術(shù)包括但并不局限于應(yīng)用鈣/聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、顯微注射法及(包被的)粒子轟擊法(Potrykus，1990，生物技術(shù)(Bio/Technol.)8535-542)。
除這些所謂的直接DNA轉(zhuǎn)化方法外，運(yùn)用載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也廣泛應(yīng)用，如病毒載體(如CaMV)和細(xì)菌載體(如從農(nóng)桿菌屬獲得的載體)(Potrykus，1990，生物技術(shù)，8535-542)。應(yīng)用本領(lǐng)域所知方法挑選或篩選后，經(jīng)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體、細(xì)胞和植物部分可再生成整個(gè)植株(Horsch等，1985，科學(xué)，2251229-1231)。轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)的選擇對(duì)本發(fā)明來說并不關(guān)鍵。
依本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案，利用所謂的雙元載體系統(tǒng)(公開于EP-A 120 516)，在該系統(tǒng)中應(yīng)用含帶毒性基因的輔助質(zhì)粒和一種相容性質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株、含有需轉(zhuǎn)移的基因構(gòu)建體的雙元載體。這種載體既能在大腸桿菌中又能在農(nóng)桿菌中復(fù)制；此處所用的一個(gè)質(zhì)粒衍生自雙元載體Bin19(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)。此實(shí)施例中應(yīng)用的雙元載體含T-DNA左邊界和右邊界間的序列、編碼卡那霉素抗性的NPTII基因(Bevan，1984，核酸研究，128711-8721)和一個(gè)克隆所需基因構(gòu)建體的多克隆位點(diǎn)。
最新科學(xué)進(jìn)展表明，原則上單子葉植物能夠轉(zhuǎn)化，并且能從經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成可育的轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)這些作物的再生性組織培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)及遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞的有力方法為轉(zhuǎn)化提供了方便。現(xiàn)在，單子葉植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是外植體或懸浮細(xì)胞的微粒轟擊法、直接DNA吸收或電穿孔法(Shimamoto等，1989，自然，338274-276)。通過導(dǎo)入吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因獲得了轉(zhuǎn)基因玉米，該基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(一種使除草劑膦絲菌素失活的酶)，通過微粒轟擊法導(dǎo)入玉米懸浮培養(yǎng)液的胚胎發(fā)生細(xì)胞(Gordon-Kamm，1990，植物細(xì)胞(Plant Cell)，2603-618)。遺傳物質(zhì)導(dǎo)入其它單子葉植物如小麥、大麥的糊粉原生質(zhì)體中已有報(bào)道(Lee，1989，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，13；21-30)。通過選擇成熟、致密且節(jié)狀的胚胎發(fā)生愈傷組織用于建立胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，從中再生出小麥植株(Vasil，1990，生物技術(shù)，8429-434)。用于這些作物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的結(jié)合使本發(fā)明能應(yīng)用于單子葉植物，這些方法也可應(yīng)用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化和再生。
以下實(shí)施例僅為描述之用，并不意在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)驗(yàn)部分DNA方法所有DNA方法都按Maniantis描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(分子克隆(Molecular Cloning)，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1990)。擬南芥的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化采用Valvekens等人所述的方法，即擬南芥(生態(tài)型C24)的根段與含有合適雙元載體的農(nóng)桿菌菌株MOG101共培養(yǎng)的方法(1998，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)855536-5540)。具體步驟如下擬南芥的種子發(fā)芽前在4℃下春化7天。于70％乙醇中種子表面消毒2分鐘，再用5％次氯酸鈉/0.5％NaDodSO4處理15分鐘，用無菌蒸餾水沖洗5次，然后置于裝有萌發(fā)培養(yǎng)基(GM)(表3)的150×25毫米的培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)。培養(yǎng)皿用透氣性的醫(yī)用膠帶(Urgopore，Chenove France)密封。植株于22℃，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的周期條件下培養(yǎng)。組織培養(yǎng)過程的培養(yǎng)室條件同上。所有的植物培養(yǎng)基用0.5克/升(1M KOH調(diào)至pH5.7)2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖，固體培養(yǎng)基加0.8％Difco Bacto瓊脂，121℃蒸氣滅菌15分鐘。激素和抗生素分別溶解于二甲亞砜和水中，然后加入滅菌后降溫至65℃的培養(yǎng)基中。
完整的根在0.5/0.05固體培養(yǎng)基(表3)上培養(yǎng)3天。然后把根切成約0.5厘米長(zhǎng)的小段(此處稱為外植體)，轉(zhuǎn)移至10毫升0.5/0.05液體培養(yǎng)基中；加入0.5-1.0毫升培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物。輕輕振蕩2分鐘，使根外植體與細(xì)菌混合。
然后，將根外植體放于無菌濾紙上以移除大部分液體培養(yǎng)基，再在0.5/0.05瓊脂上共培養(yǎng)48小時(shí)。然后外植體用含萬古霉素1000毫克/升(Sigma)的0.5/0.05液體培養(yǎng)基清洗。將其吸干培養(yǎng)于補(bǔ)加萬古霉素750毫克/升和卡那霉素50毫克/升的0.15/5瓊脂(表3)培養(yǎng)基。用含嵌合neo基因的農(nóng)桿菌感染3周后，在黃色根外植體背景上形成了綠色卡那霉素抗性(KmR)的愈傷組織。這時(shí)，將根外植體移至僅含萬古霉素500毫克/升和卡那霉素50毫克/升的新鮮0.15/5瓊脂培養(yǎng)基。3周后，多數(shù)綠色愈傷組織形成了芽。將轉(zhuǎn)化的芽轉(zhuǎn)移至含GM的150×25毫米的培養(yǎng)皿中以生根或形成種子或兩者都形成。在這些培養(yǎng)皿中，許多再生體未生根就形成種子。生根的植株也可移至土壤中以結(jié)籽。為獲得具初始根的材料，對(duì)上述方法進(jìn)行如下修改，6毫克無菌的擬南芥C24種子于50毫升GM(250毫升三角燒瓶)中進(jìn)行萌發(fā)，條件為在弱光下，于培養(yǎng)室中旋轉(zhuǎn)振蕩(100轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)9天。轉(zhuǎn)基因植株再生于選擇性培養(yǎng)基(卡那霉素50毫克/升)上形成的芽，生根后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基或土壤。表3 植物培養(yǎng)基
L升；IAA，吲哚-3-乙酸；Kin激動(dòng)素；2ipAdeN6-(2-異戊烯基)腺嘌呤；CIM愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；SIM芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MSMurashige和Skoog培養(yǎng)基；B5Gamborg B5培養(yǎng)基。馬鈴薯轉(zhuǎn)化應(yīng)用Hoekema等人(1989，生物技術(shù)7273-278)所描述的方法，稍作修改后用于馬鈴薯(Solanum tuberosum var.Kardal)的轉(zhuǎn)化。
去皮后表面消毒的馬鈴薯塊莖切成2毫米厚的薄片，然后沿薄片邊沿切出直徑1厘米的小片。將這些小片放于WM培養(yǎng)基中(Murashige和Skoog培養(yǎng)基，含有1毫克/升鹽酸硫胺素，0.5毫克/升鹽酸吡哆醇VB6，0.5毫克/升煙酸，100毫克/升肌醇，30克/升蔗糖，0.5克/升MES，pH5.8)。用根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105接種，方法是用100ml新鮮WM替換WM培養(yǎng)基，新鮮的WM培養(yǎng)基中含有在LB(加上合適抗生素)中生長(zhǎng)至OD600為0.5-0.7的10ml新鮮農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的重懸浮沉淀。(Hood等，1993，轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Research)2208-218)。這些塊莖小片在農(nóng)桿菌懸浮液中培養(yǎng)20分鐘后，移至CM固體培養(yǎng)基(在WM培養(yǎng)基中補(bǔ)加入8克/升瓊脂，3.5毫克/升核苷玉米素，0.03毫克/升吲哚乙酸)，密度為每皿放置20片外植體。2天后，小片轉(zhuǎn)移至PM培養(yǎng)基中(在CM培養(yǎng)基中補(bǔ)加200毫克/升頭孢氨噻和100毫克/升的萬古霉素)，選擇抗農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體。3天后，小片再轉(zhuǎn)移至SIM平板(在CM培養(yǎng)基中補(bǔ)加250毫克/升羧芐青霉素和100毫克/升卡那霉素)，密度為每皿10片外植體，用于轉(zhuǎn)化芽的再生選擇。2周后，這些組織小片再轉(zhuǎn)移至新鮮的SIM培養(yǎng)基中，再過3周后，轉(zhuǎn)移至SEM培養(yǎng)基(激素濃度低10倍的SIM培養(yǎng)基)。經(jīng)過約8-9周共培養(yǎng)后，芽長(zhǎng)至能從愈傷組織上切下的大小，然后將其移至含10毫升RM培養(yǎng)基的玻璃管(Sigma，目錄號(hào)c5916)(含0.5x MS鹽類，0.5x維生素，10克/升蔗糖，100毫克/升頭孢氨噻，50毫克/升萬古霉素和50毫克/升卡那霉素的WM培養(yǎng)基)，進(jìn)行體外生根和營(yíng)養(yǎng)繁殖。線蟲處理、植物根的生長(zhǎng)和感染擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，種于含B5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，B5培養(yǎng)基含20克/升葡萄糖和20毫克/升卡那霉素。平板于4℃培養(yǎng)3天后，于22℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)2周。然后將卡那霉素抗性植株轉(zhuǎn)移至裝土的半透明塑料試管中(30×15×120毫米，Kelderplastibox b.v.，荷蘭)。將試管傾斜放置(與垂軸成60度)，使根生長(zhǎng)于試管的靠下一側(cè)。這樣就能通過肉眼觀察感染過程和且便于從土壤中移出根系進(jìn)行GUS分析。感染是通過注射含2期線蟲的懸浮液到土壤中，接種量為每一根系500頭(懸浮于3毫升水中)甜菜胞囊線蟲或300頭南方根結(jié)線蟲。
相類似地，將在含卡那霉素的RM培養(yǎng)基上生根的馬鈴薯轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)移至裝土的半透明塑料試管中(30×15×120毫米，Kelder plastiboxb.v.，荷蘭)，將試管傾斜放置，在22℃、16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的周期下培養(yǎng)2周。感染是通過注射含2期線蟲的懸浮液于土壤中而完成的，接種量為每一根系500頭(懸浮于3毫升水中)馬鈴薯白線蟲。GUS檢測(cè)感染過程中不同時(shí)期GUS活性的檢測(cè)通過如下方式徹底清洗根系，除去根上大部分粘著的土壤，然后將根培養(yǎng)于X-Gluc溶液中(1毫克/毫升X-Gluc，50mM NaPO4(pH7)，1mM K4Fe(CN)6，1mMKK3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X100)，37℃過夜。用70％乙醇溫育組織幾小時(shí)，從組織中除去葉綠素后，在顯微鏡下觀察GUS染色。DNA序列測(cè)定測(cè)序是通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成的。
實(shí)施例1雙元載體pMOG800的構(gòu)建雙元載體pMOG800由pMOG23衍生而來(圖1，于1990年1月29日保藏于真菌菌種保藏中心，Oosterstraat 1，Baarn，荷蘭，保藏號(hào)CBS102.90)，在其上于EcoRI和SmaI間導(dǎo)入了一個(gè)額外的KpnI限制性酶切位點(diǎn)至多位點(diǎn)接頭上。該質(zhì)粒包含有在T-DNA左和右邊界間的卡那霉素抗性基因，用于轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的選擇(圖2)。帶有pMOG800的大腸桿菌DH5α，于1993年8月12日保藏于真菌菌種保藏中心，Oosterstraat 1，Baarn，荷蘭，保藏號(hào)CBS414.93。
實(shí)施例2無啟動(dòng)子GUS構(gòu)建體pMOG553的構(gòu)建該載體的構(gòu)建記述于Goddijn等人，1993，植物雜志，4863-873。這篇文獻(xiàn)中有一個(gè)錯(cuò)誤，其構(gòu)建體中包含位于β-葡糖苷酸酶基因后的CaMV35S RNA終止子而不是所示的nos終止子。該雙元載體在T-DNA邊界間的序列可得自EMBL數(shù)據(jù)庫，保藏號(hào)X84105。pMOG553攜帶用于植物轉(zhuǎn)化的HygR標(biāo)記(圖3)。
實(shí)施例3擬南芥中限定的NFS偏好啟動(dòng)子片段的鑒定和分離雙元載體pMOG553通過三親交配轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌菌株MOG101，該菌株的情況詳細(xì)記述于WO93/10251。將所得菌株用于擬南芥根的轉(zhuǎn)化。用這種方法獲得了1100多株轉(zhuǎn)基因擬南芥植物品系。轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)至成熟、自花授粉且收獲所得的種子(S1)，并進(jìn)行春化。然后將S1種子放于含10毫克/升潮霉素和0.6％瓊脂固化的營(yíng)養(yǎng)液(Goddijn等，1993，植物雜志，4863-873)上萌發(fā)，在4℃下經(jīng)過4天的吸漲期。第5天將這些平板移至室溫和適宜光照(1000lux，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)條件下萌發(fā)。14天齡的小苗轉(zhuǎn)移至裝土斜放的半透明塑料試管(30×15×120毫米)，5000lux，20℃下繼續(xù)培養(yǎng)。用這種方法培養(yǎng)的植物根系的大部分長(zhǎng)于試管下側(cè)的土壤和試管的交界面上。2周后，按實(shí)驗(yàn)部分所描述的方法用線蟲對(duì)根進(jìn)行感染。接種后于不同時(shí)間(從2天到14天)按實(shí)驗(yàn)部分所描述的方法分析根系的GUS活性。品系pMOG553#25被鑒定為一種在分別為甜菜胞囊線蟲和南方根結(jié)線蟲所誘導(dǎo)的合胞體和巨大細(xì)胞中有相當(dāng)強(qiáng)GUS表達(dá)活性的品系。該品系未感染的對(duì)照植株(以及感染的植株)中的基部維管柱、嫩側(cè)根的根尖和植株的多種綠色部分中檢測(cè)到的GUS表達(dá)很弱。
品系pMOG553#25以1∶3的比例進(jìn)行分離，說明GUS構(gòu)建體處于基因組的一個(gè)位點(diǎn)上。通過Southern分析，鑒定出了4種不同的可能連鎖的T-DNA拷貝。為了確定這4種處于右T-DNA邊界側(cè)翼的植物序列中哪種使GUS在合胞體中表達(dá)，構(gòu)建了品系pMOG553#25的基因組DNA文庫。用SauIIIa部分降解DNA且用核苷酸T和G部分補(bǔ)齊降解片段的懸垂位點(diǎn)后，該片段被連接到XhoI降解的λGEM11臂上，而在其上的限制性酶切位點(diǎn)已被核苷酸G和A部分補(bǔ)齊。此部分補(bǔ)齊使SauIIIa酶切位點(diǎn)與XhoI酶切位點(diǎn)相匹配，從而阻止在λ載體上多點(diǎn)插入克隆。
用gusA探針篩選了大約300,000個(gè)重組噬菌體。通過限制性酶切分析和陽性克隆的部分序列測(cè)定，分離到代表所有4個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)的克隆tag1-tag4。下列RB側(cè)翼的亞片段克隆于pMOG819中的gusA前，插入tag1的一個(gè)4.0kb SamI片段得到pMOG821，插入tag2的一個(gè)1.2kb的BamHI片段得到pMOG820，插入tag3的一個(gè)1.6kb的SamI片段得到pMOG847和插入tag4一個(gè)2.7kb BamHI片段得到pMOG848。在pMOG820、pMOG821、pMOG847和pMOG848的構(gòu)建體中，基因gusA和側(cè)翼植物序列之間的實(shí)際序列仍保留著，因?yàn)锽amHI和SamI在起始標(biāo)記載體pMOG553的右側(cè)T-DNA邊界與gusA編碼區(qū)間切開。
實(shí)施例4無啟動(dòng)子GUS構(gòu)建體pMOG819的構(gòu)建該載體的構(gòu)建是通過克隆pMOG553的GUS內(nèi)含子編碼區(qū)(Vancanneyt等，1990，分子基因遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，220245-250)作為于pMOG800的多位點(diǎn)接頭上的BamHI-EcoRI片段而形成的。雙元載體pMOG819(圖4)用來導(dǎo)入克隆的啟動(dòng)子片段以用于植物轉(zhuǎn)化后的進(jìn)一步表達(dá)分析。
實(shí)施例5重新導(dǎo)入擬南芥后的啟動(dòng)子片段分析為了確定克隆的啟動(dòng)子片段的組織特異性活性，將所獲得的pMOG820、pMOG821、pMOG847和pMOG848克隆轉(zhuǎn)移至根癌農(nóng)桿菌，然后將相應(yīng)的菌株轉(zhuǎn)化野生型的擬南芥植物。每種構(gòu)建體產(chǎn)生19-31個(gè)轉(zhuǎn)化子。從初級(jí)轉(zhuǎn)化子中收獲種子，然后種植用于按實(shí)驗(yàn)部分的描述進(jìn)行甜菜胞囊線蟲感染的分析。線蟲感染后GUS分析表明，只有用pMOG821(tag1)轉(zhuǎn)化的植株在合胞體中表達(dá)了報(bào)告基因。
這個(gè)結(jié)果證明處于tag1右邊界側(cè)翼的植物序列(以下簡(jiǎn)稱為#25.1)使GUS在合胞體中得以表達(dá)。這種表達(dá)見于經(jīng)檢測(cè)的29株pMOG821品系中的21株中。在部分側(cè)根的維管組織和一些暴露于空氣中的植物組織中也有微弱表達(dá)。合胞體外的GUS表達(dá)在品系與品系之間顯示出很大的變化(見圖6)。
即使此側(cè)GUS活性一般比在合胞體內(nèi)要弱得多，也沒有一種合胞體陽性品系對(duì)取食位點(diǎn)是完全特異的。
發(fā)現(xiàn)在甜菜胞囊線蟲誘導(dǎo)形成的合胞體中表達(dá)GUS的相同品系，用南方根結(jié)線蟲感染誘導(dǎo)所產(chǎn)生的巨大細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有GUS的表達(dá)。這說明#25.1序列可以作為一種近似取食位點(diǎn)特異的啟動(dòng)子，用于構(gòu)建其對(duì)南方根結(jié)線蟲和甜菜胞囊線蟲的敏感性降低的植物。
在組織培養(yǎng)階段，觀察到#25.1調(diào)節(jié)序列作為一種啟動(dòng)子仍然有活性，如果#25.1啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)移至擬南芥，而擬南芥含有在其控制之下的植物細(xì)胞破壞基因(如芽孢桿菌RNA酶，見實(shí)施例7和8)，這就必須應(yīng)用中和基因。
實(shí)施例6品系pMOG553#25中的啟動(dòng)子tag1-4的序列確定位于tag2-4右側(cè)T-DNA邊界側(cè)翼的植物序列已部分確定。tag1的4kb SamI片段已完全測(cè)序。該序列顯示出該序列的最遠(yuǎn)端(5’)的0.5kb來源于λ載體，其余3448bp為植物啟動(dòng)子序列。測(cè)序是用CsCl純化的DNA，采用引物步行(walking)策略進(jìn)行，應(yīng)用Pharmacia自動(dòng)測(cè)序儀ALF完成的。應(yīng)用熒光dATP與自動(dòng)讀出測(cè)序試劑盒結(jié)合。此方法已為Voss等人所描述(1992，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)，3153-155)。該序列已在SEQ ID NO4描述。
實(shí)施例7芽孢桿菌RNA酶前#25.1的克隆從pMT416(Hartley 1988，分子生物學(xué)雜志，202913-915)中由PCR擴(kuò)增包含有芽孢桿菌RNA酶編碼區(qū)的片段，所用的引物為5’CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG 3’和 5’CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG 3’。這些引物導(dǎo)入在BamHI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)側(cè)翼，利于該片段的克隆。將該片段克隆于胭脂堿終止子序列的上游，終止子序列在含有一個(gè)Taq啟動(dòng)子控制下的額外的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因的載體上(在細(xì)菌中克服芽孢桿菌RNA酶的毒性所必需)。為消除芽孢桿菌RNA酶表達(dá)所產(chǎn)生的毒害作用，在隨后克隆步驟中，在芽孢桿菌RNA酶的StyI位點(diǎn)插入了一個(gè)ST-LS1內(nèi)含子。在芽孢桿菌RNA酶的翻譯起始密碼子處通過重組PCR創(chuàng)建了一個(gè)NcoI位點(diǎn)，所用引物為5’CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG3’和 5’CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC3’，從而構(gòu)建了pOG16.1。然后，芽孢桿菌RNA酶編碼區(qū)側(cè)翼的BamHI位點(diǎn)通過用BamHI切開pOG16.1而被破壞，用Klenow聚合酶去除懸垂末端并重新連接，形成pFL17。芽孢桿菌RNA酶的5’非翻譯序列經(jīng)進(jìn)一步修飾與起始品系pMOG553#1164中相應(yīng)序列的類似，方法是經(jīng)下列寡核苷酸5’GATCTAGACTCGAGAAGCTTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCC 3’與 5’CATGGGGGACTGACCTACCCGGGGATCCAAGCTTCTCGAGTCTA3’的退火，將pOG16.1的BgIII位點(diǎn)與NcoI位點(diǎn)間形成的接頭連接起來，形成了克隆pFL18。品系25tag1的4kb啟動(dòng)子作為一個(gè)BamHI片段從pMOG821克隆出來，并插于克隆pFL18的單一BamHI位點(diǎn)上，緊鄰芽孢桿菌RNA酶編碼區(qū)的5’端，恢復(fù)品系25的初始序列內(nèi)容至芽孢桿菌RNA酶翻譯起始密碼子，形成了pFL38。
實(shí)施例8rolD-B*的構(gòu)建pFL11構(gòu)建體于雙元載體中含有一個(gè)嵌合芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因。該構(gòu)建體是依下列方法克隆的。芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼區(qū)位于構(gòu)建體pMT316(Hartley，1988，分子生物學(xué)雜志，202913-915)的HindIII/BamHI片段上。通過該位點(diǎn)的接頭5’AGCTCGGATCCG 3’(SEQ ID NO18)自身退火連接而使HindIII位點(diǎn)變?yōu)锽amHI位點(diǎn)。然后，形成的BamHI片段克隆到pMOG180表達(dá)盒中雙增強(qiáng)CaMV 35S啟動(dòng)子與nos終止子之間(描述于WO93/10251)，形成了pOG30。應(yīng)用接頭5’GGCTGCTCGAGC3’(SEQ ID NO19)，nos終止子3’端的HindIII位點(diǎn)變成了XhoI位點(diǎn)，應(yīng)用接頭5’AATTGACGAAGCTTCGTC 3’(SEQ ID NO20)，啟動(dòng)子5’端的EcoRI位點(diǎn)變成了HindIII位點(diǎn)。然后用發(fā)根農(nóng)桿菌RoID基因的啟動(dòng)子替代35S啟動(dòng)子。這個(gè)啟動(dòng)子作為HindIII/BamHI片段而被從獲自F.Leach(Leach和Aoyagi，1991，植物科學(xué)(Plant Sci.)，7969-76)的pDO2構(gòu)建體中切除。包含有啟動(dòng)子和終止子的芽孢桿菌RNA酶抑制劑基因通過HindIII和XhoI的酶解被從所獲得的克隆pOG38中切除，插入pMOG800的多位點(diǎn)接頭的各自位點(diǎn)，形成了pFL11。
實(shí)施例9用pMOG944轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株及其對(duì)馬鈴著白線蟲抗性增加的檢測(cè)雙元載體pMOG944轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌，所得菌株用于馬鈴薯栽培品種Kardal塊莖小片的轉(zhuǎn)化，如實(shí)驗(yàn)部分所述?？偣搏@得了80個(gè)轉(zhuǎn)基因品系。這些品系通過小苗切段(每段至少含一個(gè)節(jié))進(jìn)行無性繁殖，體外生根。如實(shí)驗(yàn)部分描述，每品系15株進(jìn)行抗馬鈴薯白線蟲抗性增加檢測(cè)。預(yù)期用含有芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑構(gòu)建體的pMOG944轉(zhuǎn)化馬鈴著植株，顯示出對(duì)馬鈴薯白線蟲敏感性降低，因?yàn)樵诰€蟲取食結(jié)構(gòu)里(或發(fā)育過程中)線蟲誘導(dǎo)的芽孢桿菌RNA酶表達(dá)。
以上實(shí)施例僅僅作為本發(fā)明的描述，并不意味本發(fā)明僅限于此。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，很容易進(jìn)行眾多的修改，但這些都落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名MOGEN International nv(B)街道Einsteinweg 97(C)城市Leiden(D)州Zuid-Holland(E)國(guó)家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)NL-2333 CB(G)電話31-71 5258282(H)傳真31-71 5221471(ii)發(fā)明名稱線蟲誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)DNA序列(iii)序列數(shù)目8(iv)計(jì)算機(jī)可讀信息(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3484個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii) 分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)非(iii)反義非(vi)初始來源(A)生物擬南芥(B)菌株C24(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3481..3484(D)其它信息/密碼子起始＝3482(xi)SEQ ID NO1的序列描述AAGCTAGATC TAGACTCGAG AAGCTTGGAT CCCCGGGTAT ATGAAAGAGA CGACCACTGC60CAGGGACGAA AGTGCAATGC GCATACCTCA GTGGCGTGGA GTGCAGGTAT ACAGATTAAT120CCGGCAGCGT CCGTCGTTGT TGATATTGCT TATGAAGGCT CCGGCAGTGG CGACTGGCGT180ACTGACGGAT TCATCGTTGG GGTCGGTTAT AAATTCTGAT TAGCCAGGTA ACACAGTGTT240ATGACAGCCC GCCGGAACCG GTGCGGTTTT TTGTGGGGTG AATATGCAGT AAAGATTTCA300GGAGTCCTGA AAGACGGCAC AGGAAAACCG GTACAGAACT GCACCATTCA GCTGAAAGCC360AGACGTAACA GCACCACGGT GGTGGTGAAC ACGGTGGGCT CAGAGAATCC GGATGAAGCC420TGCTTTTTTA TACTAAGTTG GCATTATAAA AAAGCATTGC TTATCAATTT GTTGCAACGA480ACAGGTCACT ATCAGTCAAA ATAAAATCAT TATTTGATTT CAATTTTGTC CCACTCCCTG540CCTCTGTCAT CACGATACTG TGATGCCATG GTGTCCGACT TATGCCCGAG AAGATGTTGA600GCAAACTTAT CGCTTATCTG CTTCTCATAG AGTCTGCAGA CAAACTGCGC AACTCGTGAA660AGGTAGGCGG ATCTGGGTCG ACTCTAGGCC TCACTGGCTA ATACGACTCA CTATAGGGAG720CTCGACTTCC CTCAACATAC TCATGTACGT AAGATTCACT CTACATGTTG ACCCATGCAC780GTACCAAGTT CTTCATATAC AAGAATGAGA TTTAAGTGAA CTTCTAGATG AGTTAAAACT840GAATATTACA GAAACAACGA CAGGAGTTTT CTCTCCAAAT CTATGAATTC TCCGAAGAAA900AGATTGAGCT GACATTTGCT ACAGCTTTTT GGTAATTTTG TGGAATTGAC ATGTGATACA960TGAATATATC TATGTAGAGT GAAAGAAAAT TAATGATGGT TAGCATAACT TTTCAGGACA1020TTACTAAATG CTGATAGAGA AAATGATAGA TACGGCCGAG AAGAGTGGAA TCGAAGGAAG1080AATCATTAAC CTTTCCTCTG TGATTCACAG TTGGGTCAAG CCTGATTGTT TCTCCTTCCC1140TAACTTACTC CATCCATTAG GTAATCTACA TTCGTTTCAT TTTTTACGCG TGAAAGTATC1200TAAGAAAAAA GGTATCTCAA AAATATATTT ATCATTAGGT TTATGTAATT AAGTTTAATT1260TGTAATTGTG TTTTGTAATC GTCTAGTAGG TATACGGGAC AAGGGCATAT GCTCAGTCAA1320AGTTGGCCAC AATTTTACAT GCCAAAGCCT TGAGCAAGCA ATTAAAGGTA TATTTCAAAA1380TTAATAATTA CATCTTTCTT TTTTGTTTAA TTTTTTTCAC GTAAACTAAT AATCAGAAAT1440ATTTATCACT GAATGTGCTT ACAGGACAGA AATGCAAACG TGACGATAAA TGCAGTCCAT1500CCAGGAACTG TTAAACTGGA ATTATCAGAG CACACAAGGG TCTTTTTACA GGTAAAACAA1560AACTTTTTTT TCCATACATA TATATAGAAA TGCAAAAGGA ATCTAATAAG TAAGAAAAAA1620AAAATCCTAA AACCATTGAT GTGGTTTTCA ATGATATGCA TATGCAGATT CTCTGCTTTT1680TTGCAATAGC TTCGAAAATG CCTGCTAAAA TCTATAAAAG CCAGGAGGTG TGAATAATAT1740ATAGCCTTAC CTTTTAAGCT CTAAATAGTA CAATAAAGGC CTAACAGTCA TTCTCTTTAG1800CCTGACACTA GATTCCTTTT TGTTTCGTTT TTTGTATCCC AAATCAAGGT TTTGTCATCA1860TCAATATTCA TGCATAGACT CATATACATA CATGCCACTA AGAATCAAAA TTTACGTTGA1920ATGATTGTAC ACTTTAGATG ATTTTAATCG CCTCTTCTTG CAATTTCTGT TTCTTCACTT1980CTTTTAGCTC CTTCTTGCTC TATTTGCTTT CCAAATTCCA TGTTCCACTC CAGATCCCTA2040GAAGTGAGAA ATGCAATGCA AACATGCACC TAAGCCTAAA CATGAATGCA AATGATGAAA2100CTAAAAGAGC GAAGCTAAAA ACCAAACAAA AACACAGATA TCAGCAAACT AGACAAAATA2160ATAAATAGTT TGTTTTTTTT GTTGTTGTTG AAATAGTGGA TATATTTTTG TGTTTCTAAT2220ATTAATTACT ATATCATTTA ATCTTATAAG TTTTTTTGGG TTAATTTAAG TGTAATTTAA2280TATTTCACAT GTAACAAGAA CTCCATTTTA TTCTTGTCCG GTTCTTGAAT AAGATGTGAA2340AGTATTGTAT CAATTGATGA TGATGAATGC ATGTGTGCTA ACCATTTACG TTATCTTTTT2400TTCACGATAA ATAAACGAAA GTTGTTTGGT ATGTGAACAA AGAAATCAAT TTCAAAATTA2460TTTTCAAAAA GTACAATTTC TTCCATTGTT TTCACAATAA GAGAACTAAA GTTATTTGGT2520ATGTGATCTT CTATATATAA AAAAAAAATC CATCGTCGAA ACTAAGATTT TGTTTTTCTA2580TATATCTTTT AAAATGTAAT AAATATTAGG TAATATTATG TTTTTCTATT GTATTTTTTT2640TTTCAATAAC CTTTACTATT TTAAATCTAT CTGCAAATAT TATTTTATTT GAAAGGTAAA2700AAATTTTGGA TTTAGTATTT GTCATATGAT ATCTGATTAT GGTTTTCAGG AGCCGATTAG2760ATGTCACTTT TTAGTCATTG GTTTTAGCTT TCATCAACGC TTTTGAAAAT TGAACTCAAA2820TTATTTTGGC CTAACTTATG TCATTCAACT AAAAGACATT ACAATAACTG TTGTCTAAAG2880ACTAAAGAAA GATCTTAAAT TTAAGAAAGA AGATACTATT TGTCAAAAGA GGACTAAAAT2940GCTAAATTTC AGAAAGAAAA TGAAGGAAGG TGGTGGGAAG TGTGTGTGAT TTAACTTGAT3000ATTGGGAAAA GCACGTAATA ACAACTAAGT TAGGAGAAAA GTAAGCAAAA AAAAAAAAAG3060ATAAACGCGG ACACACACAG CTAACACGCA CATCACATCA CTACAAAGAG GATGCAGTGT3120CATGAATTGC GTTTGCTTCT AAAATCTGTA ACCGATAATC CATCTTGTTT CAGAAAAATA3180AATGTATTCG TTCGCCGGCT TGAATTCGAC GCGATAAGGC CGAGGAAAGA CATCTTGCTA3240GACGCTCTTT GTTTACTATA TAGTCTTAAT TTTGGTGGAG TAGGTCGGTG TGAATAAGGA3300AATATAAAAG CCTATTGGGT CAAGTAAGGC CCAATAATAG ATTACTGTTT ATATAAAATA3360TTACTGTTTA TATAAGATAT TAGACTAAAC TTTAGTCTAA TCAGATTATA ACATTTTTTT3420TATTTTTATC TCACTCTTCT TCCTCTTCCA AAGCTTGGAT CCCCGGGTAG GTCAGTCCCT3480T ATG3484Met1(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met1(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(xi)SEQ ID NO3的序列描述CGGACTCTGG ATCCGGAAAG TG22(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(xi)SEQ ID NO4的序列描述CTGCTCGAGC CTAGGCACAG GTTATCAACA CGTTTG36(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(xi)SEQ ID NO5的序列描述CTTACTCGAG CCATGGTAAG TTTCTGC27(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度44個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(xi)SEQ ID NO6的序列描述GATCTAGACT CGAGAAGCTT GGATCCCCGG GTAGGTCAGT CCCC44(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度44個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii) 分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(xi)SEQ ID NO7的序列描述CATGGGGGAC TGACCTACCC GGGGATCCAA GCTTCTCGAG TCTA44(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii) 分子類型cDNA(iii)假設(shè)非(xi)SEQ ID NO8的序列描述AGCTCGGATC CG1權(quán)利要求
1.一種可從擬南芥中獲得的DNA片段，當(dāng)其重新導(dǎo)入植物時(shí)，能夠提高根結(jié)線蟲和胞囊線蟲所誘導(dǎo)的相關(guān)DNA序列，優(yōu)選地包括在SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。
2.權(quán)利要求1的DNA片段的變異體或部分，當(dāng)其重新導(dǎo)入植物時(shí)，能夠提高根結(jié)線蟲和胞囊線蟲所誘導(dǎo)的相關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄。
3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的DNA片段，其基本上是線蟲取食位點(diǎn)特異的。
4.一種嵌合DNA序列，其包括含沿轉(zhuǎn)錄方向的權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的DNA片段，和在其轉(zhuǎn)錄控制下的待表達(dá)的DNA序列，而該DNA片段轉(zhuǎn)錄控制下的表達(dá)并不是自然發(fā)生的，優(yōu)選地其中待表達(dá)的DNA序列的表達(dá)引起植物細(xì)胞破壞物，優(yōu)選的為芽孢桿菌RNA酶的產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求4的嵌合DNA序列，其中所說的細(xì)胞破壞物包括互補(bǔ)細(xì)胞存活所必需的RNA的RNA。
6.權(quán)利要求4的嵌合DNA序列，其中待表達(dá)的DNA序列引起對(duì)誘導(dǎo)的線蟲有毒的物質(zhì)產(chǎn)生。
7.一種包含權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的嵌合DNA序列的復(fù)制子。
8.一種復(fù)制子，其包含沿轉(zhuǎn)錄方向的權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的DNA片段和至少一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)用于在該DNA片段控制下的待表達(dá)的DNA序列插入。
9.一種包含權(quán)利要求7或8中任一項(xiàng)的復(fù)制子的微生物。
10.一種基因組中摻入了權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的嵌合DNA序列的植物細(xì)胞。
11.一種基本上由權(quán)利要求10的細(xì)胞組成的植物根系。
12.一種基本上由權(quán)利要求10的細(xì)胞組成的植物，優(yōu)選地是雙子葉植物，更優(yōu)選地是馬鈴薯植株。
13.一種嫁接于權(quán)利要求11的根系上的植物。
14.一種從權(quán)利要求12或13的植物的種子、花、塊莖、根、葉、果實(shí)、花粉和木材中所選出的植物部分。
15.一種基本上由權(quán)利要求12至13的植物組成的作物。
16.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的DNA片段的用途，其用于鑒定能夠促進(jìn)相關(guān)DNA序列在植物中轉(zhuǎn)錄的亞片段。
17.權(quán)利要求4或5的嵌合DNA用于轉(zhuǎn)化植物的用途。
18.權(quán)利要求2的DNA片段部分或變異體用于建立雜合調(diào)節(jié)DNA序列的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種獲自擬南芥的DNA片段,當(dāng)其重新導(dǎo)入植物后能夠促進(jìn)根結(jié)線蟲和胞囊線蟲誘導(dǎo)的相關(guān)DNA的轉(zhuǎn)錄,以及所述DNA片段的用途。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1240483SQ97180770
公開日2000年1月5日 申請(qǐng)日期1997年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月18日
發(fā)明者S·A·奧爾, F·M·范德利, O·J·M·格迪恩, J·克拉普, P·C·希蒙斯 申請(qǐng)人:莫根國(guó)際股份有限公司