一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，其特征在于：具體步驟包括：(a)制備共生細菌；(b)控制線蟲培養(yǎng)參數；(c)接種共生細菌培養(yǎng)4天后，再接種線蟲；(d)線蟲收獲、清洗和儲存。本發(fā)明固體培養(yǎng)方法通過無菌操作技術，在人工培養(yǎng)基中接種共生細菌和單菌線蟲一級種后進行大量培養(yǎng)，能夠提高侵染期線蟲產量，降低生產成本，并且生產的侵染期線蟲具有很好的致病力，對昆蟲病原線蟲的規(guī)?；a和對地下害蟲的生物防治具有非常重要的意義。
【專利說明】
一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物繁殖培養(yǎng)的技術領域，特別是昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝的技術領域。
【【背景技術】】
[0002]斯氏線蟲科Steinernematidae的斯氏線蟲屬Steinernema線蟲和異小桿線蟲科Heterorhabditidae的異小桿線蟲屬Heterorhabditis線蟲是昆蟲病原線蟲，它們是目前國際上新型的生物殺蟲劑。斯氏線蟲屬和異小桿線蟲屬線蟲分別與腸桿菌科Enterobacteriaceae嗜線蟲桿菌屬Xenorhabdus和發(fā)光桿菌屬Photorhabdus的細菌互惠共生，作為昆蟲的“蛔蟲”與其體內?；詳y帶的共生細菌一起致死寄主昆蟲。與其它生物殺蟲劑相比，這類線蟲具有廣泛的寄主范圍；對寄主具主動搜索能力，特別對土棲性及鉆蛀性害蟲;對人畜、植物及有益生物安全，在歐美的一些國家可以豁免注冊使用；易于大量培養(yǎng)；使用方便;在環(huán)境中可循環(huán)利用;能與多種化學和生物殺蟲劑混用;并可用傳統(tǒng)藥械或灌溉設施來施用等優(yōu)點。
[0003]近年來，作為新型生物殺蟲劑，昆蟲病原線蟲已廣泛應用于農林、牧草和衛(wèi)生害蟲的安全防治，受到國內外學者及商業(yè)部門的高度重視，并走向商品化生產。在工業(yè)化國家的生物農藥市場中，此類線蟲的市場銷售額排生物殺蟲劑第二位。目前全球已有超過60個國家的100多個實驗室在研究此類有益生物。在我國，昆蟲病原線蟲也已經商業(yè)化生產，并應用于防治多種農林、草地、花卉以及衛(wèi)生害蟲等，結果令人鼓舞。
[0004]昆蟲病原線蟲與其共生細菌共同作用殺死寄主昆蟲，它們之間存在互惠共生的共生關系，這種共生關系對致死昆蟲和產業(yè)化培養(yǎng)線蟲極為重要。具體體現在:存在于線蟲腸道內的共生菌需要線蟲的攜帶進入寄主昆蟲體內，并釋放到昆蟲的血腔中；線蟲在寄主間傳輸共生菌，保護共生菌不受土壤環(huán)境的影響，并在抵御寄主防御系統(tǒng)時保護共生菌;共生菌在昆蟲血腔內繁殖，產生毒素和抑菌物質，使昆蟲患敗血癥并快速死亡;共生菌能分解營養(yǎng)物質，為線蟲發(fā)育繁殖提供所需的營養(yǎng)成分，同時共生菌產生抗生素，能抑制其他雜菌的污染，為線蟲的生長發(fā)育繁殖提供良好的環(huán)境條件。共生細菌隸屬腸桿菌科Enterobacteriaceae，呈桿狀，無芽孢，革蘭氏反應陰性，均為兼性厭氧菌，硝酸還原酶陰性，發(fā)光桿菌屬細菌過氧化氫酶反應陽性，嗜線蟲桿菌屬細菌則為陰性。最佳生長溫度多數為28°C，一些細菌可在37?40°C條件下生長。兩屬細菌在離體培養(yǎng)時具有型態(tài)變異現象，分為初生型與次生型，只有初生型細菌能為線蟲提供更好的生長、發(fā)育、繁殖條件，被感染期線蟲所攜帶。因此在昆蟲病原線蟲產業(yè)化培育過程，有效控制原生桿菌的型變是能否實現大量人工培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的關鍵。
[0005]昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)經歷了從活體培養(yǎng)到離體培養(yǎng)的過程，離體培養(yǎng)又從無菌培養(yǎng)到單菌培養(yǎng)。目前，線蟲的商業(yè)化生產主要是通過無菌操作技術于人工培養(yǎng)基中加入單一共生細菌和無菌線蟲完成的，即體外單菌培養(yǎng)系統(tǒng)。根據培養(yǎng)基質可分為固體培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)，兩者在技術上不盡相同?！?br/>【發(fā)明內容】
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[0006]本發(fā)明的目的就是解決現有技術中的問題，提出一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，能夠提高侵染期線蟲產量，降低生產成本，發(fā)展前景好。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明提出了一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，具體步驟包括:
[0008](a)制備共生細菌，準備細菌培養(yǎng)基，準備初生型細菌，根據線蟲品系和培養(yǎng)基組分選擇最優(yōu)的菌株；
[0009](b)控制線蟲培養(yǎng)參數，要求加入的線蟲一級種為僅攜帶一種合適的共生細菌的單菌狀態(tài)，經表面消毒懷卵大母蟲的卵可有效制備無菌一齡線蟲，根據不同線蟲的營養(yǎng)需求選擇線蟲人工培養(yǎng)基，選擇適宜的培養(yǎng)容器和培養(yǎng)溫度；
[0010](C)接種共生細菌，將培養(yǎng)好的共生菌接入消毒后的海綿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4天后接種線蟲；
[0011](d)線蟲收獲、清洗和儲存。
[0012]作為優(yōu)選，所述(a)步驟中，細菌培養(yǎng)基為:蛋白胨水培養(yǎng)基(I%蛋白胨，0.5 %NaCl)，YS肉湯(I %蛋白胨，0.5%，0.3%牛肉浸膏，pH7.0)，營養(yǎng)肉湯和LB培養(yǎng)基(I %蛋白胨，0.5%恥(:1，0.5%酵母)。
[0013]作為優(yōu)選，所述(b)步驟中，大量培養(yǎng)的時候需要有大功率無菌水生產設備，并直接連接到水平送風超凈工作臺，在出水口增加紫外線消毒管，確保水中無雜菌混入，培養(yǎng)容器為高溫滅菌消毒的三角瓶和金屬盒，防污染還要具有通氣的作用，最佳的培養(yǎng)溫度依線蟲品系不同而不同，范圍為19?28°C。
[0014]作為優(yōu)選，所述(c)步驟中，由于共生細菌的增殖速度較快，初始接菌量對線蟲的最后產量沒有明顯影響，線蟲接種量為每培養(yǎng)一億尾線蟲的最佳接種量在20萬尾?60萬尾，線蟲最佳培養(yǎng)周期為24d?28d。
[0015]作為優(yōu)選，所述(d)步驟中，將培養(yǎng)物浸泡靜置分離，線蟲沉降到容器底部，讓線蟲通過篩網，留下海綿等雜質，將篩網連同固體培養(yǎng)物移走，在原液中按10:1加入硅藻土粉，通過壓濾機進行固液分離，可快速收獲清潔的線蟲，線蟲的儲存采用吸附物質保存法，并將封包好的產品保存于4°C的冷庫中。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明采用的昆蟲病原線蟲固體培養(yǎng)方法解決了活體培養(yǎng)方法無法規(guī)?；a昆蟲病原線蟲的問題，離體培養(yǎng)技術的發(fā)展，是提高線蟲產量和規(guī)模的基礎。固體培養(yǎng)方法通過無菌操作技術，在人工培養(yǎng)基中接種共生細菌和單菌線蟲一級種后進行大量培養(yǎng)，能夠提高侵染期線蟲產量，降低生產成本，并且生產的侵染期線蟲具有很好的致病力，對昆蟲病原線蟲的規(guī)?；a和對地下害蟲的生物防治具有非常重要的意義。
[0017]本發(fā)明的特征及優(yōu)點將通過實施例進行詳細說明。
【【具體實施方式】】
[0018]本發(fā)明一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，具體步驟包括:
[0019]步驟一、制備共生細菌，準備細菌培養(yǎng)基，準備初生型細菌，細菌培養(yǎng)基為:蛋白胨水培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%NaCl)，YS肉湯(1%蛋白胨，0.5%，0.3%牛肉浸膏，？!17.0)，營養(yǎng)肉湯和LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%酵母)。
[0020]共生細菌可以從感染期線蟲腸腔中分離得到，也可從被線蟲感染的昆蟲尸體中分離純化，所分離的共生細菌能夠在常規(guī)細菌培養(yǎng)基中生長，為線蟲的單菌培養(yǎng)提供了基礎，細菌的菌株、菌型以及質量影響著線蟲的產量，因此，共生細菌的制備是線蟲培養(yǎng)的第一步。
[0021]初生型細菌能支持線蟲的最優(yōu)繁殖，在線蟲培養(yǎng)過程中必須控制共生細菌發(fā)生型變。斯氏線蟲和異小桿線蟲與共生細菌具有一定程度的?；?，即線蟲一般從自身攜帶的共生細菌中獲得最佳營養(yǎng)，但線蟲在不同的菌株中的生長率和產量不同，根據線蟲品系和培養(yǎng)基組分選擇最優(yōu)的菌株；
[0022]步驟二、控制線蟲培養(yǎng)參數，要求加入的線蟲一級種為僅攜帶一種合適的共生細菌的單菌狀態(tài)，經表面消毒懷卵大母蟲的卵可有效制備無菌一齡線蟲，根據不同線蟲的營養(yǎng)需求選擇線蟲人工培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)容器為高溫滅菌消毒的三角瓶和金屬盒，防污染還要具有通氣的作用，最佳的培養(yǎng)溫度依線蟲品系不同而不同，范圍為19?28°C;大量培養(yǎng)的時候需要有大功率無菌水生產設備，并直接連接到水平送風超凈工作臺，在出水口增加紫外線消毒管，確保水中無雜菌混入；
[0023]如果一級種混有其它雜菌，就會造成培養(yǎng)物的嚴重污染，大幅度降低線蟲產量。
[0024]步驟三、接種共生細菌，將培養(yǎng)好的共生菌接入消毒后的海綿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4天后接種線蟲；由于共生細菌的增殖速度較快，初始接菌量對線蟲的最后產量沒有明顯影響，
[0025]線蟲種群密度與培養(yǎng)基營養(yǎng)狀態(tài)是影響感染期線蟲發(fā)育的主要因素，可能包括激素的參與。隨著線蟲密度的增加其增殖速率減慢。對某一培養(yǎng)基、一定時間內，同一產量范圍增殖倍數最大的接蟲量將是經濟有效的接蟲量，應利用最小的接蟲量發(fā)揮線蟲最大的繁殖潛力，即確定線蟲最大產量時線蟲密度與營養(yǎng)濃度的平衡點。
[0026]線蟲接種量為每培養(yǎng)一億尾線蟲的最佳接種量在20萬尾?60萬尾，線蟲體外培養(yǎng)時間與線蟲種類、培養(yǎng)基組分、接線蟲量及培養(yǎng)溫度有關。最佳的培養(yǎng)時間為培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗殆盡時感染期線蟲產量最大，線蟲最佳培養(yǎng)周期為24d?28d。
[0027]步驟四、線蟲收獲、清洗和儲存。
[0028]將培養(yǎng)物浸泡靜置分離，線蟲沉降到容器底部，讓線蟲通過篩網，留下海綿等雜質，將篩網連同固體培養(yǎng)物移走，在原液中按10:1加入硅藻土粉，通過壓濾機進行固液分離，可快速收獲清潔的線蟲，線蟲的儲存采用吸附物質保存法，并將封包好的產品保存于4°C的冷庫中。
[0029]當線蟲培養(yǎng)到最佳時間后，感染期線蟲的產量最高，其他蟲態(tài)的線蟲比例最小。這時應立即收獲，否則感染期線蟲死亡將導致產量下降。保存的線蟲必須盡量去掉培養(yǎng)物中的雜質和其他蟲態(tài)，否則會影響線蟲的保存時間和質量。
[0030]昆蟲病原線蟲的儲存方法很多，不同方法適應于不同的儲存環(huán)境參數。商業(yè)大量儲存方法目前我們主要使用吸附物質保存法。
[0031 ]通過冷藏保存，保質期可達6個月。
[0032]本發(fā)明離體培養(yǎng)技術的發(fā)展，是提高線蟲產量和規(guī)模的基礎。固體培養(yǎng)方法通過無菌操作技術，在人工培養(yǎng)基中接種共生細菌和單菌線蟲一級種后進行大量培養(yǎng)，能夠提高侵染期線蟲產量，降低生產成本，并且生產的侵染期線蟲具有很好的致病力，對昆蟲病原線蟲的規(guī)?；a和對地下害蟲的生物防治具有非常重要的意義。
[0033]上述實施例是對本發(fā)明的說明，不是對本發(fā)明的限定，任何對本發(fā)明簡單變換后的方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，其特征在于:具體步驟包括: (a)制備共生細菌，準備細菌培養(yǎng)基，準備初生型細菌，根據線蟲品系和培養(yǎng)基組分選擇最優(yōu)的菌株； (b)控制線蟲培養(yǎng)參數，要求加入的線蟲一級種為僅攜帶一種合適的共生細菌的單菌狀態(tài)，經表面消毒懷卵大母蟲的卵可有效制備無菌一齡線蟲，根據不同線蟲的營養(yǎng)需求選擇線蟲人工培養(yǎng)基，選擇適宜的培養(yǎng)容器和培養(yǎng)溫度； (C)接種共生細菌，將培養(yǎng)好的共生菌接入消毒后的海綿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4天后接種線蟲； (d)線蟲收獲、清洗和儲存。2.如權利要求1所述一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，其特征在于:所述(a)步驟中，細菌培養(yǎng)基為:蛋白胨水培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%NaCl)，YS肉湯(1%蛋白胨，0.5%，0.3%牛肉浸膏，PH7.0)，營養(yǎng)肉湯和LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%酵母)。3.如權利要求1所述一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，其特征在于:所述(b)步驟中，大量培養(yǎng)的時候需要有大功率無菌水生產設備，并直接連接到水平送風超凈工作臺，在出水口增加紫外線消毒管，確保水中無雜菌混入，培養(yǎng)容器為高溫滅菌消毒的三角瓶和金屬盒，防污染還要具有通氣的作用，最佳的培養(yǎng)溫度依線蟲品系不同而不同，范圍為19?28°C。4.如權利要求1所述一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，其特征在于:所述(c)步驟中，由于共生細菌的增殖速度較快，初始接菌量對線蟲的最后產量沒有明顯影響，線蟲接種量為每培養(yǎng)一億尾線蟲的最佳接種量在20萬尾?60萬尾，線蟲最佳培養(yǎng)周期為24d?28d。5.如權利要求1所述一種昆蟲病原線蟲的培養(yǎng)工藝，其特征在于:所述(d)步驟中，將培養(yǎng)物浸泡靜置分離，線蟲沉降到容器底部，讓線蟲通過篩網，留下海綿等雜質，將篩網連同固體培養(yǎng)物移走，在原液中按10:1加入硅藻土粉，通過壓濾機進行固液分離，可快速收獲清潔的線蟲，線蟲的儲存采用吸附物質保存法，并將封包好的產品保存于4°C的冷庫中。
【文檔編號】C12R1/01GK106035250SQ201610692071
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月18日
【發(fā)明人】盛錫良, 張斌, 夏博, 李飛
【申請人】浙江綠神天敵生物技術有限公司