專利名稱：山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因以及提高植物耐鹽性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及將外源基因轉(zhuǎn)入植物，使植物的耐鹽及耐旱性提高的方法。
環(huán)境因子、干旱、低溫、高鹽等限制了植物的生長(zhǎng)和農(nóng)作物產(chǎn)量，為應(yīng)答非生物脅迫，細(xì)胞內(nèi)往往積累一些小分子有機(jī)化合物，甜菜堿就是其中之一。藜科．早熟禾科、紫苑等在干旱或鹽堿脅迫下甜菜堿的積累更為明顯。甜菜堿除定位在葉綠體外還存在于微粒體和胞漿中，已知在脅迫下，除參與滲透調(diào)節(jié)外，還對(duì)三羧酸循環(huán)的主要酶和末端氧化關(guān)鍵酶有保護(hù)作用。植物中甜菜堿的生物合成經(jīng)兩步氧化得到，其中涉及膽堿單氧化物酶和甜菜堿醛脫氫酶(BADH,EC1.2,1.8)。這兩個(gè)酶的活性都受鹽和干旱誘導(dǎo)。Saneoka等人證明，含甘氨酸甜菜堿的玉米在鹽脅迫下比缺失型所受損傷明顯下降。
我們從耐鹽性很強(qiáng)的藜科植物山菠菜中克隆了BADH cDNA，并獲得了適用于攜帶該基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的載體，以及具有耐鹽和耐旱性的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的目的之一是提供了編碼山菠菜甜菜堿醛脫氫酶的cDNA序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了將山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化植物并在其中表達(dá)能提高植物耐鹽性和耐旱性的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供了轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因的植物，該轉(zhuǎn)基因植物具有高耐鹽性和耐旱性。
一．編碼山菠菜BADH結(jié)構(gòu)基因的克隆和序列分析及在原核細(xì)胞中表達(dá)檢測(cè)1．植物總DNA和cDNA制備取4g去脈葉組織為材料提取總DNA,cDNA合成按照J(rèn)urgen 1987方法進(jìn)行。
2．山菠菜BADH結(jié)構(gòu)基因克隆及序列特性PCR技術(shù)關(guān)鍵之一是引物設(shè)計(jì)，首先從植物其它醛脫氫酶結(jié)構(gòu)基因中推知BADH中內(nèi)含子的分布情況，再根據(jù)已發(fā)表的菠菜cDNA序列資料設(shè)計(jì)了引物。二個(gè)引物分別用于擴(kuò)增BADH的結(jié)構(gòu)基因。
3．PCR擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)，我們合成的二個(gè)引物分別為引物1,5′AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC3′；引物2,5′TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA3′(2)擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μL含10mmol/L Tris-HCl pH8.350mmo1/L KCL,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L每種dNTP,25pmol每種引物，1μg總DNA模板或200～500ng單鏈cDNA，以及1.25U Taq聚合酶，擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃,10分鐘之后進(jìn)入93.5℃,1分鐘，55℃,1分鐘，72℃,1.5分鐘的30圈循環(huán)過程，之后再于72℃保溫10分鐘，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后將所需條帶切出，用Gene Clean Kit回收，回收后的DNA插入質(zhì)粒pUC19，轉(zhuǎn)化E.clli JM83，所有克隆的PCR產(chǎn)物均經(jīng)再次PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。
4．序列分析所有的序列分析均以雙鏈質(zhì)粒為模板，用Sanger(1977)經(jīng)雙鏈全測(cè)序方法完成。
以山菠菜cDNA為模板，運(yùn)用引物1和2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得約1.5kb的單一條帶(圖1)，序列分析表明該片段為BADH的cDNA全長(zhǎng)基因，其長(zhǎng)度為1509bp，有一編碼603個(gè)氨基酸的開放讀碼框架(圖2，位于773～811密碼子所相應(yīng)十肽Val-Thr-Leu-Geu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro以及與酶功能有關(guān)的868～870位編碼的Cys(圖3)為醛脫氫酶高度保守的序列，同源性分析表明，山菠菜BADH基因與已發(fā)表的菠菜BADH cDNA 87.5％的同源性，與甜菜BADH cDNA88.1％同源性(Dnasis Computer Program,Hitachi)(圖3)，由它們的核苷酸推測(cè)的氨基酸序列的同源性分別為90.1％及87.8％。
5.BADH結(jié)構(gòu)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建所用大腸桿菌表達(dá)載體為pKK233-3。
6．山菠菜BADH基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)將山菠菜BADH編碼基因插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒KK223-3中，轉(zhuǎn)化E.coli JM83，得到一批轉(zhuǎn)化子，選取26個(gè)單克隆，提取質(zhì)粒DNA，以其為模板用引物1和3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取得到單一1.5kb擴(kuò)增帶質(zhì)粒DNA，再以BADH1.5kb結(jié)構(gòu)基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交分析，得到12個(gè)陽性克隆，隨機(jī)選取11個(gè)，以含有KK223-3質(zhì)粒的E.coli JM83為對(duì)照，測(cè)定BADH同工酶活力，含BADH結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)化菌，活力為8.04U/mg蛋白，而對(duì)照酶活性很低，僅為0.6U/mg蛋白，轉(zhuǎn)BADH基因菌比對(duì)照活性高13倍。
二．山菠菜BADH結(jié)構(gòu)基因在真核細(xì)胞中表達(dá)l．DNA提取質(zhì)粒DNA提取和純化按Sambrook方法進(jìn)行，植物總DNA提取按前述方法進(jìn)行。
2．植物表達(dá)載體的構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化BADH cDNA植物表達(dá)載體的構(gòu)建按常規(guī)方法進(jìn)行(圖5)，雙元表達(dá)載體pBin438(圖4)含雙重35S啟動(dòng)子和翻譯增強(qiáng)子TMV的“Ω”片段，用BamHI和KpnI將BADH cDNA片段從克隆質(zhì)粒中切出來后插入pBin438中，所得到的表達(dá)質(zhì)粒再經(jīng)基因槍法AGL1。
運(yùn)用35S啟動(dòng)子、Acfui啟動(dòng)子，經(jīng)基因槍法導(dǎo)入植物。
3．植物的轉(zhuǎn)化、再生和篩選。
轉(zhuǎn)化用宿主為雙子葉或單子葉植物如草莓(Fragaria chiloensisi)，煙草(Nicotiana tabacum)水稻、玉米、苜蓿和草坪草等。下以草莓和煙草為例。
將無菌草莓分生組織塊和約5mm大小的無菌煙草葉片分別浸入稀釋5倍的AGL1農(nóng)桿菌液中，約30分鐘后取出放在無菌濾紙上，吸去菌液。草莓接種在MS1培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+10mg/L 6-BA+0.5mg/L2,4-D)，煙草接種在MS2培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA)中共培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(草莓MS1+20mg/L卡那霉素+600mg/L頭孢霉素；煙草MS2+100mg/L卡那霉素+600mg/L頭孢霉素)。對(duì)照除不用農(nóng)桿菌侵染外其它各步驟相同。再生苗平均25天在相同的篩選培養(yǎng)基上重復(fù)篩選4～5次后，抗卡那霉素植株進(jìn)行農(nóng)桿菌檢菌和耐鹽性鑒定。
4．轉(zhuǎn)基因植株的篩選共培養(yǎng)后的草莓分生組織塊在添加6BA 10mg/L、2,4-D 0.5mg/L、卡那霉素20mg/L、600mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20天后再生小芽，這些小芽在附加30mg/L卡那霉素的無激素的MS培養(yǎng)基(MS0)中10天后部分形成小植株，在含50mg/L卡那霉素MS培養(yǎng)基中篩選3代后，共得到17株卡那抗性植株，共轉(zhuǎn)化的煙草葉片在附加0.1mg/L LAA,1mg/L 6-BAr MS培養(yǎng)基中30天后再生成小植株。在100mg/L卡那霉素濃度上共得12株煙草抗性植株。
5．BADH活性分析2g植物組織在液氮中研磨后，室溫下加入蛋白提取液(50mmol/LHepes/KOH pH8.0,1mmol/L EDTA,5mmol/L DTT)抽提，4℃下1400rpm離心10分鐘，蛋白濃度用紫外分光光度計(jì)280nm比色測(cè)定。
酶活性測(cè)定反應(yīng)體系為50mmol/L Hepes/KOH(pH8.0),5mmol/L DTT,1mmol/L EDTA,1mmol/L甜菜堿醛，1mmol/L NAD及酶提取液1.0mg蛋白，總體積1.0ml,37℃反應(yīng)10分鐘，紫外分光光度計(jì)340nm比色測(cè)定。上述反應(yīng)體系下每分鐘消耗1nmol的NAD定義為1個(gè)酶活力單位。
6．轉(zhuǎn)基因植株的BADH活性測(cè)定選耐鹽性檢測(cè)中表現(xiàn)較好的轉(zhuǎn)基因煙草和草莓各5株進(jìn)行BADH活性測(cè)定，其活性單位為在給出的反應(yīng)體系下，每10分鐘產(chǎn)生1nmNADH定義為1個(gè)酶活力單位。測(cè)定結(jié)果示于表1。由表1可見，對(duì)照未能測(cè)出BADH活性，轉(zhuǎn)基因株中均能測(cè)出BADH活性，但有較大的個(gè)體差異。
表1轉(zhuǎn)基因草莓、煙草BADH活性測(cè)定
7．卡那霉素抗性植株的耐鹽性鑒定轉(zhuǎn)化植株均表現(xiàn)出一定的耐鹽性，其中草莓對(duì)照在0.4％ NaCl培養(yǎng)基中20天后全部死亡，而12株轉(zhuǎn)基因草莓生長(zhǎng)基本正常(圖6-1)。其中7株在0.7％NaCl培養(yǎng)基中仍可緩慢生長(zhǎng)(圖6-2)。轉(zhuǎn)基因煙草在1％NaCl水平上和對(duì)照有明顯差異；在2％NaCl水平上，轉(zhuǎn)基因植株可在MS0培養(yǎng)基中生根，對(duì)照植株不能(圖6-3、4)。
8．轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)、Southerm雜交、Northem雜交均按常規(guī)方法進(jìn)行。
a．轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)，用山菠菜BADH cDNA擴(kuò)增引物對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行的PCR檢測(cè)說明，17株抗卡那霉素草莓和12株抗卡那霉素?zé)煵菥屑s1.0kb的擴(kuò)增條帶而對(duì)照植株沒有(圖6-5)。
b．轉(zhuǎn)基因植株Northern雜交分析，對(duì)檢測(cè)到BADH活性的轉(zhuǎn)基因煙草和草莓進(jìn)行Northern雜交分析，其中煙草和草莓各有2株酶活較高的植株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄體(圖6-6)。
9．植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定，稱取0.5g新鮮葉片，加5ml超純水，分成兩等份，一份于25℃、40rpm振蕩4h，另一份于沸水浴中加熱5分鐘，分別用DDB-6200型數(shù)字電導(dǎo)儀測(cè)定溶液電導(dǎo)率，前者為Rc′，后者為Rc，相對(duì)電導(dǎo)率為Rc/Rc′×100％。
10．植物大分子滲漏值的測(cè)定，根據(jù)Leopeld方法略加修改進(jìn)行，用打孔器自新鮮葉片鉆取5個(gè)圓片(0.5cm)，加入超純水2ml，室溫下40rpm振蕩4h后紫外比色測(cè)定OD254吸收，得到的是總滲漏值。
11．轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)電導(dǎo)率和大分子滲漏值的測(cè)定取上述轉(zhuǎn)基因草莓、煙草各5株進(jìn)行鹽脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率和大分子泄漏值測(cè)定(表2)。轉(zhuǎn)基因植株的電導(dǎo)率和大分子滲漏值低于對(duì)照，表明轉(zhuǎn)基因植株受鹽害程度低于對(duì)照。
表2轉(zhuǎn)基因草莓、煙草的相對(duì)電導(dǎo)率和大分子滲漏值


圖1是以山菠菜cDNA為模板經(jīng)引物1,2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析圖。
圖2是BADH cDNA序列圖。
圖3是BADH和其它的醛脫氫酶在相似位置上都含有10個(gè)保守氨基酸序列和脫氨酸殘基圖。
圖4是pBin 438的結(jié)構(gòu)圖。
圖5是雙元載體構(gòu)建圖。
圖6是轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株的耐鹽性圖。
實(shí)施例1山菠菜RNA的提取和CDNA合成參照分子克隆一書，將抽提RNA組織(山菠菜3克)在液氮中碾磨，直到粉沫狀；加入2ml提取緩沖液(4M guanidini thiocyanate,25mM sodiumcitrate 0.5％ sarcosyl,100μLB-mercaptoethanoL)振蕩混合，加1.5ml 3MNaAc(pH5.2)和8ml酸酚，冰浴中至少保溫20分鐘，4℃6000轉(zhuǎn)離心20分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移入新的10ml管中，棄去沉淀，加等體積4MLiCL，靜止沉淀RNA,6500轉(zhuǎn)離心20分鐘，棄上清，將沉淀沉降在300μl無菌的DEP水中。DEP水是一種抑制核酸酶的生物化學(xué)試劑，商業(yè)DEP是未經(jīng)稀釋過的，使用時(shí)需1∶1000份水稀釋后才能使用，因此稀釋后的DEP稱DEP水。DEP可查文獻(xiàn)在《美國(guó)科學(xué)院報(bào)》1970年67卷93頁(yè)中，是NJ.等人發(fā)表的，DEP的英文全稱是DIETMYLPYROCARBONAFE，化學(xué)分子式為COH1005，分子量162,1，可以從美國(guó)Sigma公司委托的中方代理如北京的華美公司、東方公司等，都可以買到，編號(hào)D5758(Sigma產(chǎn)品目錄)。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,lμl 0.5μg/μloligo(dT)primer 20μl(4.7μg)totol RNA 7.5μl H2O65℃5分鐘，然后放冰浴，加最終濃度5mM Mgcl2,2μl10x反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1.5單位的逆轉(zhuǎn)錄酶，2.5單位的rRNasin(promega)，總體積20ml，42℃1小時(shí)，95℃5分鐘。
實(shí)施例2山菠菜BADH基因的PCR擴(kuò)增；取上述合成的第一鏈CDNA2μl，作PCR擴(kuò)增摸板。于50μl反應(yīng)體系中，加入TaQ酶0.5μl(su/μl),4種dNTP(每種dNTP終濃度為200μmol/L)Mg2+(終濃度為1.5mMol/L,10×反應(yīng)緩沖液5μl，雙端引物(5’端為5’AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC3’,3’端為5’TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA3’)各2μl，其余加雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10分鐘，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘以補(bǔ)齊末端。取少量擴(kuò)增產(chǎn)物于2％的瓊脂糖(購(gòu)自Promega公司)凝膠中電泳鑒定。
實(shí)施例3BADH基因的克隆和序列分析將PCR擴(kuò)增的大小約1.5bp的BADH基因產(chǎn)物用內(nèi)切酶BamH1和KPn1在370°消化2小時(shí)，然后75℃反應(yīng)10分鐘以失活內(nèi)切酶；連接到經(jīng)同樣酶處理的puc19載體，16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM83，這樣BADH定向插入到puc19的BamH1和KPnⅠ位點(diǎn)；在含有100μg/μl氨青霉素及X-g al和IPTG各800μg的LB(1升LB含10g蛋白膠、10g氯化鈉、5g酵母提取粉、PH7.0)平板上經(jīng)藍(lán)白色斑系統(tǒng)篩選出陽性克隆。序列分析表明，克隆的CDNA片斷。其長(zhǎng)度為1.509bp，有一編碼503個(gè)氨基酸的開放續(xù)碼框架為醛脫氫酶高度保守的序列。同源性分析，山菠菜BADH基因與已發(fā)表的菠菜的BADHCDNA有87.5％的同源性，3′端片段特性分析表明以菠菜及山菠菜總DNA為模板，2個(gè)不同來源BADH基因的編碼序列有極高的同源性。而它們的內(nèi)含子區(qū)卻存在著很大差異，山菠菜的內(nèi)含子為105bp。菠菜為479bp，它們之間無明顯同源性。
實(shí)施例4BADH基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamH1和KpnⅠ雙酶切消化已插入大小約1.5Kp BADH基因的pUC19載體，連接到同樣酶處理的植物表達(dá)載體PBin438上，16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH52，這樣BADH基因定向插入到PB438質(zhì)粒BamH1和Kpnl位點(diǎn)處。其5’端有植物中高效表達(dá)的caMV35s啟動(dòng)子，3’端有增強(qiáng)表達(dá)的nos終止子，以保證BADH基因在植物中高效表達(dá)。PBin438上的卡那霉素抗性基因作為轉(zhuǎn)化植株的篩選標(biāo)記；然后用BamH1,KPnⅠ雙酶切鑒定BADH基因的插入，并用沒有插入BADH的PB438載體作對(duì)照，構(gòu)建的載體切出了1.509Kb的BADH基因，說明BADH已經(jīng)正確插入到PB438的質(zhì)粒BADH和KPnⅠ位點(diǎn)處，這樣BADH基因的植物表達(dá)載體已構(gòu)建成功，可以用農(nóng)桿菌、基因槍、激光、聚乙二醇等轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入植物中。

圖1以山菠菜cDNA為模板經(jīng)引物1,2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和瓊脂糖電泳分析，1為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2為山菠菜cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖5雙元載體構(gòu)建圖。
圖5中NPTII卡那霉素抗性基因RB序列右LB序列左35S花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子nos終止子Apr氨芐青霉素抗性基因Ω增強(qiáng)子基因32S山菠菜啟動(dòng)子圖6中1．轉(zhuǎn)基因草莓及其對(duì)照在0.4％NaCl培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，左1及右1為對(duì)照，中間為轉(zhuǎn)基因植株；2．轉(zhuǎn)基因草莓和對(duì)照及其在0.7％NaCl培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況；3．轉(zhuǎn)基因煙草及對(duì)照在2.0％NaCl培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，左邊為轉(zhuǎn)基因植株，右邊為對(duì)照；4．轉(zhuǎn)基因煙草及對(duì)照在2.0％NaCl培養(yǎng)基上的生根情況，右邊為轉(zhuǎn)基因植株，左邊為對(duì)照；5．轉(zhuǎn)基因草莓，煙草PCP檢測(cè)1-4為煙草，1為對(duì)照，5-10為草莓，5為對(duì)照；6．轉(zhuǎn)基因草莓、煙草Northern檢測(cè)1-4為草莓，1為對(duì)照，5-7為煙草，5為對(duì)照。
權(quán)利要求
1．具有圖2所示DNA堿基序列的山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因。
2．提高植物耐鹽性的方法，其特征在于將權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成小植株。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中植物為雙子葉及單子葉植物。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中轉(zhuǎn)化過程是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍法。
5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述基因由植物表達(dá)載體攜帶轉(zhuǎn)化植物組織或細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因及其DNA序列,提供了將該基因轉(zhuǎn)化到宿主植物并使之在其中表達(dá)的載體,還提供了轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因的植物以及使植物具有高耐鹽性的方法。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1221034SQ97125830
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月25日
發(fā)明者陳受宜, 肖崗, 張耕耘, 劉鳳華, 王軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室