專利名稱：一種醛脫氫酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醛脫氫酶，尤其是涉及來源于深海的太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica) H2的新型醒脫氫酶基因,及其重組表達(dá)所得到的醒脫氫酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
醒脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase) (ECL 21.3)是能夠催化內(nèi)源和外源醒氧化的NAD(P)+依賴型的酶超家族。迄今為止，已經(jīng)從人類發(fā)現(xiàn)了 19種醛脫氫酶基因，這些基因參與內(nèi)生和外生乙醒的代謝(Crabb, Matsumoto, Chang, &You, 2004)。研究者發(fā)現(xiàn)，醛脫氫酶在植物及微生物抗環(huán)境壓力(干旱，高鹽)方面也具有重要的作用(Huang et al.,2008; Li, Gao, Yu, Wang, Mn, 2003), Yang 等(Yang, Zhang, Wang, Wood, &Zhang, 2012)將齒肋赤蘚中的醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化菌得到重組菌也具有抗干旱和高鹽的倉泛力。Tomohisa kato 等(Kato, Miyanaga, Kanaya, &Morikawa, 2010)從 Geobacillusthermoleovorans B23得到了能夠降解長鏈鏈燒的醒脫氫酶基因,Jyumpei Kokayashi等從Rhodobacter sphaeroides可以在低濃度醋酸鹽中提高氫產(chǎn)量的醒脫氫酶。在專利方面,不同來源的醛脫氫酶基因已經(jīng)被克隆、測序和表達(dá)，主要應(yīng)用于利用L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C或2-KGA，解酒的保健品等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種新型醛脫氫酶基因fwaldh。本發(fā)明的第二目的是提供一種由所述醛脫氫酶基因fwaldh編碼的醛脫氫酶Fwaldh。

本發(fā)明的第三目的是提供醛脫氫酶Fwaldh的制備方法。所述醒脫氫酶Fwaldh的生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌(Flammeovirga Pacifica)H2，該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCCN0:M2012229，地址為武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。所述新型醛脫氫酶基因fwaldh的序列(SEQ ID N0.1)如下:
atggaaaatg taattattac ttctgatcag ascgttcaaa atattgaaga tatattcatt60
權(quán)利要求
1.醒脫氫酶Fwaldh的生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌(FlammeovirgaPacifica)H2,該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCC NO:M2012229。
2.醛脫氫酶基因fwaldh的序列(SEQID N0.1)如下:
3.醛脫氫酶基因fwaldh編碼的醛脫氫酶Fwaldh的氨基酸序列(SEQID N0.2)如下:
4.醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)克隆所述醛脫氫酶基因fwaldh； 2)將所述醛脫氫酶基因fwaldh插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶所述醛脫氫酶基因fwaldh的重組表達(dá)載體； 3)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中； 4)選取轉(zhuǎn)化后E.coli BL21中的陽性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； 5)離心收集發(fā)酵后的E.coli BL21細(xì)胞，重懸所述E.coli BL21細(xì)胞于裂解緩沖液中進(jìn)行裂解； 6)將步驟5)中裂解后的懸液進(jìn)行離心，收集上清液； 7)將上清液與N1-NTAAgarose混勻，按照純化試劑盒說明書進(jìn)行純化，即得所述醛脫氫酶 Fwaldh0
5.如權(quán)利要求4所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述表達(dá)載體為PET-His載體。
6.如權(quán)利要求4所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述培養(yǎng)基為含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求6所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基，當(dāng)誘導(dǎo)時補(bǔ)加100 μ g/mL氨芐青霉素。
8.如權(quán)利要求4所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述發(fā)酵條件為:37°C下振蕩培養(yǎng)至4_ = 0.6，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度為.50 μ g/mL,并添加0.2%葡萄糖,而后于28°C誘導(dǎo)至A6tltl = 0.8,再改至在16°C誘導(dǎo)至A6tltl =.1.2。
9.如權(quán)利要求4所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述裂解緩沖液配方為:0.3mol/L NaCl，IOmmoI/L 咪唑，50mmol/L NaH2PO4, pH 8.0。
10.如權(quán)利要求4所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述離心的條件為18000g,離心20min。
全文摘要
一種醛脫氫酶及其制備方法，涉及一種醛脫氫酶。所述醛脫氫酶Fwaldh的生產(chǎn)菌株為太平洋火色桿菌H2。克隆所述醛脫氫酶基因fwaldh；將所述醛脫氫酶基因fwaldh插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶所述醛脫氫酶基因fwaldh的重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中；選取轉(zhuǎn)化后E.coli BL21中的陽性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；離心收集發(fā)酵后的E.coli BL21細(xì)胞，重懸所述E.coli BL21細(xì)胞于裂解緩沖液中進(jìn)行裂解；將裂解后的懸液進(jìn)行離心，收集上清液；將上清液與Ni-NTA Agarose混勻，按照純化試劑盒說明書進(jìn)行純化，得所述醛脫氫酶Fwaldh。
文檔編號C12R1/01GK103114056SQ201310026030
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者曾潤穎, 劉洋, 丁志新 申請人:國家海洋局第三海洋研究所