專(zhuān)利名稱(chēng)：控制甜菜堿合成的膽堿單氧化酶，甜菜堿醛脫氫酶雙基因表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建植物雙基因載體，并期望利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將載體轉(zhuǎn)入植物中，提高植物的抗旱、耐鹽能力。
背景技術(shù)：
自然界中廣泛存在著一類(lèi)被稱(chēng)為滲透保護(hù)劑或滲透調(diào)節(jié)劑的無(wú)毒小分子化合物，當(dāng)外界環(huán)境存在不利因素時(shí)，例如干旱、鹽害、冷熱時(shí)，許多生物體內(nèi)便會(huì)積累一定濃度的滲透保護(hù)劑，起著調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓，保護(hù)胞內(nèi)酶活性的作用。甜菜堿是一種比較重要的滲透保護(hù)劑，它的積累使得許多代謝中的重要酶類(lèi)在滲透脅迫下能保持活性。在研究過(guò)的150多種代謝物中，甜菜堿是最好的滲透調(diào)節(jié)劑，甜菜堿合成途徑簡(jiǎn)單，進(jìn)行遺傳操作方便，甜菜堿合成酶基因是最重要和最有希望的脅追抗性基因之一。甜菜堿由膽堿經(jīng)由兩步氧化反應(yīng)合成膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿，其中由膽堿單氧化物酶(CMO)催化的第一步氧化反應(yīng)，甜菜堿醛脫氫酶(BADH)催化第二步氧化反應(yīng)，因此CMO和BADH是控制甜菜堿合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因。使用CMO和BADH單基因載體的轉(zhuǎn)基因植株都提高了一定的抗旱性。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力，我們研究將CMO和BADH兩個(gè)基因整合在同一個(gè)表達(dá)載體中的可能性，并在載體構(gòu)建成功后研究雙基因載體轉(zhuǎn)化植株的可能性，同時(shí)將觀察轉(zhuǎn)基因植株的抗性變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明不僅考慮了雙基因載體在單子葉植物方面的轉(zhuǎn)化，而且還考慮了在雙基因植物方面的轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了兩種含有不同啟動(dòng)子的載體，使雙基因載體可以在單、雙子葉植物中都可轉(zhuǎn)化，具體包括1、分別從本實(shí)驗(yàn)室已有的pBI-CMO，pBI-BADH質(zhì)粒上得到CMO和BADH基因；2、用上述1中得到的基因和實(shí)驗(yàn)室所擁有的載體，分別構(gòu)建帶有不同啟動(dòng)子的CMO單基因載體和BADH單基因載體(有帶Ubi和35S啟動(dòng)子的兩種CMO單基因載體，BADH單基因載體帶35S啟動(dòng)子)；3、用2中得到的帶有不同啟動(dòng)子的單基因載體，進(jìn)行酶切，將帶有啟動(dòng)子和BADH的基因片段連到CMO單基因載體上，得到兩種不同啟動(dòng)子的雙基因植物表達(dá)載體；4、用得到的雙基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌，為將來(lái)單子葉植株和雙子葉植株基因轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。
其中CMO的基因是通過(guò)酶切回收得到的，BADH的基因通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到，其中BADH的引物加入了BamH I酶切位點(diǎn)序列。
實(shí)驗(yàn)的其他步驟如植物表達(dá)載體的構(gòu)建、植株的轉(zhuǎn)化，抗性苗的篩選均是按已知方法進(jìn)行的。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示帶有Ubi啟動(dòng)子的CMO和帶有35S啟動(dòng)子的BADH雙基因載體質(zhì)粒圖(pCUC35SB是對(duì)這個(gè)載體的命名，其他的酶切位點(diǎn)是構(gòu)建過(guò)程中所利用的)；圖2表示將圖1構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌后，對(duì)經(jīng)過(guò)抗性板篩選長(zhǎng)出的菌斑進(jìn)行PCR鑒定(從左往右，泳道1至12用的是CMO的引物，其他泳道用的是BADH的引物)；圖3表示對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行酶切鑒定，用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I對(duì)載體進(jìn)行酶切，并跑電泳，得到如圖所示的酶切電泳圖像；圖4表示兩個(gè)啟動(dòng)子都是35S的CMO-BADH雙基因載體質(zhì)粒圖(pC35SC35SB是對(duì)這個(gè)載體的命名，其他的酶切位點(diǎn)是構(gòu)建過(guò)程中所利用的)；圖5泳道1到4表示將圖4構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌后，對(duì)經(jīng)過(guò)抗性板篩選長(zhǎng)出的菌斑進(jìn)行PCR檢測(cè)(1和3用的是BADH的引物，2和4用的是CMO的引物)；泳道5、6表示對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行酶切鑒定，用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I對(duì)載體進(jìn)行酶切，并跑電泳，得到如圖所示的酶切電泳圖像；實(shí)施例實(shí)施例一1、CMO-BADH雙基因雙子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建(一)植物表達(dá)中間載體pCUC1303的構(gòu)建用Sma I和Sac I雙酶切質(zhì)粒pBI-CMO，回收1.2kb CMO基因片段，與經(jīng)Sma I和Sac I雙酶切，回收的pCU1303質(zhì)粒大片段連接，獲得重組質(zhì)粒pCUC1303。
(二)植物表達(dá)中間載體pC35S B1391的構(gòu)建設(shè)計(jì)帶有BamH I酶切位點(diǎn)序列的PCR引物，用pfu聚合酶對(duì)pBI-BADH進(jìn)行BDAH高保真PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，與PMD-18T體載體進(jìn)行了連接，送交公司進(jìn)行測(cè)序，然后用BamH I和BstE II雙酶切PMD-18T-BADH，回收BADH基因片段，將此基因片段與經(jīng)BamH I和BstE II雙酶切，回收的pC35S1391大片段連接，獲得重組質(zhì)粒pC35S B1391。
(三)植物表達(dá)載體pCUC35SB的構(gòu)建用BstE II和HindIII雙酶切中間載體pC35S B1391，回收2.4kb的帶35S啟動(dòng)子和BADH基因片段，與經(jīng)BstE II和HindIII雙酶切，回收的中間載體pCUC1303大片段連接，獲得植物雙基因表達(dá)載體pCUC35SB。
2、CMO-BADH雙基因單子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建(一)植物表達(dá)中間載體pC35S B1391的構(gòu)建與構(gòu)建雙子葉植物表達(dá)載體相同(二)植物表達(dá)中間載體pC35SC1303的構(gòu)建用BamH I和HindIII雙酶切pC35S B1391和pCU1303，電泳，分別回收小片段和大片段，連接，檢測(cè)獲得表達(dá)中間載體pC35SC1303。
(三)植物表達(dá)載體pC35S C35SB的構(gòu)建用BstE II和HindIII雙酶切中間載體pC35S B1391，回收2.4kb的帶35S啟動(dòng)子和BADH基因片段，與經(jīng)BstE II和HindIII雙酶切，回收的中間載體pC35SC1303大片段連接，獲得植物雙基因表達(dá)載體pC35SC35SB。
實(shí)施例二1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草植株(一)煙草葉片的無(wú)菌處理及切片取溫室生長(zhǎng)的煙草葉片，洗去表面雜物，分別用70％乙醇和2.5％次氯酸鈉進(jìn)行滅菌處理，最后用無(wú)菌水洗滌；無(wú)菌的煙草葉片切去邊緣和主要葉脈，切成指甲蓋大小。
(二)農(nóng)桿菌侵染及培養(yǎng)切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，用無(wú)菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)。三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
2、基因槍轉(zhuǎn)化草坪草(一)建立草坪草高頻再生體系采用草坪草成熟種子、胚和胚軸等作為外植體，誘導(dǎo)草坪草的胚性愈傷組織，建立草坪草高頻再生體系。
(二)金粉處理與DNA包被采用美國(guó)Bio-Rad公司PDS-1000/He型基因槍?zhuān)凑掌湔f(shuō)明書(shū)上的方法處理金粉和包被外源DNA。
(三)基因槍轉(zhuǎn)化把誘導(dǎo)2-5個(gè)月的胚性愈傷組織作為基因槍轉(zhuǎn)化的靶材料，按照說(shuō)明書(shū)的方法對(duì)愈傷組織進(jìn)行轟擊。轟擊后的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基，后轉(zhuǎn)入含有抗生素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選，最后在含有抗生素的分化培養(yǎng)基中最后篩選抗性植株。
(四)轉(zhuǎn)基因植株的獲得對(duì)得到的抗性植株進(jìn)行PCR和Southern雜交分析，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株。
權(quán)利要求
1.一種提高植物抗旱耐鹽能力的植物轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，包括a、雙子葉植物的雙基因表達(dá)載體構(gòu)建；b、單子葉植物的雙基因表達(dá)載體構(gòu)建；c、單、雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因育種。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物表達(dá)載體為pCAMBIA1303。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建中，雙基因分別為Ubi啟動(dòng)子-膽堿單氧化酶編碼基因(CMO)和35S啟動(dòng)子-甜菜堿醛脫氫酶編碼基因(BADH)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的雙子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建中，雙基因分別為35S啟動(dòng)子-膽堿單氧化酶編碼基因(CMO)和35S啟動(dòng)子-甜菜堿醛脫氫酶編碼基因(BADH)。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單子葉植物的轉(zhuǎn)基因育種包括一年生黑麥草、多年生黑麥草、草地早熟禾、日本結(jié)縷草。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因育種包括煙草、胡枝子、草木犀、苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建出植物雙基因載體，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)將載體轉(zhuǎn)入草坪草中，實(shí)現(xiàn)提高草坪草的抗性能力。在構(gòu)建過(guò)程中，不僅考慮了雙基因載體在單子葉植物方面的轉(zhuǎn)化，而且還考慮了在雙基因植物方面的轉(zhuǎn)化，因此構(gòu)建了兩種含有不同啟動(dòng)子的載體，使雙基因載體可以在單、雙子葉植物中都可轉(zhuǎn)化。主要通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的1.從本實(shí)驗(yàn)室已有質(zhì)粒上獲得CMO和BADH基因；2.運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室已有的載體和獲得的兩個(gè)基因，構(gòu)建出帶有不同啟動(dòng)子的單基因載體；3.經(jīng)過(guò)多次不同的酶切和連接，得到兩種含不同啟動(dòng)子的雙基因植物表達(dá)載體；4.用得到的雙基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌，為將來(lái)單子葉植株和雙子葉植株基因轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1597968SQ20041005727
公開(kāi)日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月30日
發(fā)明者韓烈保, 劉君, 何宇鋒, 陳其軍, 信金娜 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué), 韓烈保, 曾會(huì)明