專利名稱：溶膠－凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于溶膠-凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法。
溶膠-凝膠包埋法是一種最新發(fā)展起來(lái)的固定化酶方法，它能在室溫下實(shí)現(xiàn)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變并同時(shí)包埋酶，從而有效地防止了酶和抗體等生物大分子的熱失活，且制得的含酶膠膜具有物理剛性，化學(xué)惰性和抗微生物污染等優(yōu)點(diǎn)。Bakul C.Dave et al.,Anal.chem.1994,66,1120公開(kāi)了一種用溶膠-凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法，指出其主要優(yōu)點(diǎn)是制備方法簡(jiǎn)單，酶活損失少且制得的含酶膠膜具有光透性，但此法制得的含酶膠膜很容易開(kāi)裂，影響了生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。S.Sampath,O.Lev在Electroanalysis,1996,8,1112中將溶膠-凝膠固定化酶和碳糊電極的使用結(jié)合起來(lái)制備生物傳感器，能夠防止溶膠-凝膠的開(kāi)裂，但此法所需的酶量很大，且每次使用前均需要重新拋光也不利于其實(shí)際應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供一種溶膠-凝膠包埋酶制備生物傳感器的新方法，即將含酶的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶水溶液加入硅烷水解制得的溶膠中，混勻后直接滴涂于電極表面，室溫放置一段時(shí)間，得到含酶膠膜不開(kāi)裂且牢固粘附于電極表面的生物傳感器，這樣制備出的生物傳感器響應(yīng)快，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)而所需的酶量少。
本發(fā)明將接枝度為5-30％的聚乙烯醇接枝4-7烯基吡啶配成濃度為2-5％的水溶液，再將0.5-3.0毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶中的一種，加入300μl上述水溶液中，混勻，得溶液A；另取110-330μl 4-乙氧基硅烷，430-210μl水，即保證4-乙氧基硅烷和水的總體積為540μl，再加入20μl 0.1mol L-1鹽酸，60μl乙醇，混勻，超聲振蕩1小時(shí)后靜置3-5小時(shí)，得溶膠B；然后將溶液A與溶膠B按3∶1-1∶3的比例混勻，用微量注射器移取5-10μl該混合液滴涂到基底電極表面，室溫放置24小時(shí)，即制得所需的生物傳感器。
本發(fā)明所述生物傳感器的制備方法，在傳統(tǒng)的溶膠-凝膠體系中加入了一種有機(jī)高分子-聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶，因而具有以下優(yōu)點(diǎn)1．聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶能自身物理交聯(lián)成膠，又能通過(guò)聚乙烯醇支鏈上的羥基與溶膠-凝膠網(wǎng)絡(luò)中的硅共價(jià)連接，從而防止了含酶膠膜的開(kāi)裂，保證了生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性；2．聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶可以通過(guò)氫鍵等相互作用穩(wěn)定酶，減少了酶在溶膠-凝膠過(guò)程中的活力損失，有利于提高生物傳感器的靈敏度；3,4-乙烯基吡啶支鏈在多種電極表面均有較強(qiáng)的吸附作用，能增強(qiáng)含酶膠膜在電極表面的粘附力；4．有機(jī)高分子的摻入改善了溶膠-凝膠膜的擴(kuò)散性質(zhì)，有利于含酶膠膜對(duì)底物的快速響應(yīng)；5．本方法制得的含酶膠膜仍保留了傳統(tǒng)溶膠-凝膠體系所具有的物理剛性、化學(xué)惰性和抗微生物污染等優(yōu)點(diǎn)．本發(fā)明提供的實(shí)施例如下實(shí)施例1．葡萄糖氧化酶電極。將接枝度為17.5％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成濃度為2％的水溶液(聚乙烯醇為PVA-124，分子量84000)，向300μl此溶液中加入3毫克葡萄糖氧化酶，混勻，得溶液A；另取110μl 4-乙氧基硅烷，加入20μl 0.1 mol L-1鹽酸，60μl乙醇，430μl水，混勻，超聲振蕩1小時(shí)后靜置3小時(shí)，得溶膠B；再將100μl溶液A與100μl溶膠B混勻，用微量注射器移取10μl該混合液滴涂到玻碳電極表面，室溫放置24小時(shí)，即制得葡萄糖氧化酶電極。該電極可用于水相中檢測(cè)葡萄糖。電極平衡時(shí)間，5分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間，10-12秒；線性范圍，5×10-6-1.5×10-2mol L-1；穩(wěn)定性，4個(gè)月以上。
實(shí)施例2辣根過(guò)氧化物酶電極。將接枝度為5％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成濃度為5％的水溶液，向300μl此溶液中加入0.5毫克辣根過(guò)氧化物酶，得溶液A；另取220μl 4-乙氧基硅烷，加入20μl0.1molL-1鹽酸，60μl乙醇，320μl水，混勻，超聲振蕩1小時(shí)后靜置4小時(shí)，得溶膠B；再將50μl溶液A與150μl溶膠B混勻，用微量注射器移取5μl該混合液滴涂于石墨電極表面，室溫放置24小時(shí)，即制得辣根過(guò)氧化物酶電極。該電極可用于水相中檢測(cè)過(guò)氧化氫，酚，胺等物質(zhì)。電極平衡時(shí)間，5分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間，8-12秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
實(shí)施例3多酚氧化酶電極。將接枝度為30％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成濃度為3％的水溶液，向300μl此溶液中加入1毫克多酚氧化酶，得溶液A；另取330μl 4-乙氧基硅烷，加入20μl 0.1molL-1鹽酸，60μl乙醇，210μl水，混勻，超聲振蕩1小時(shí)后靜置5小時(shí)，得溶膠B；再將300μl溶液A與100μl溶膠B混勻，用微量注射器移取8μl該混合液滴涂于玻碳電極表面，室溫放置24小時(shí)，即制得多酚氧化酶電極。該電極可用于水相中測(cè)定苯酚，兒茶酚等物質(zhì)。電極平衡時(shí)間，5分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間，10-15秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1．一種溶膠-凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法，其特征在于將接枝度為5-30％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成濃度為2-5％的水溶液，再將0.5-3.0毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶中的一種，加入300μl上述水溶液中，混勻，得溶液A；另取110-330μl 4-乙氧基硅烷，430-210μl水，即保證4-乙氧基硅烷和水的總體積為540μl，再加入20μl 0.1mol L-1鹽酸，60μl乙醇，混勻，超聲振蕩1小時(shí)后靜置3-5小時(shí)，得溶膠B；然后將溶液A與溶膠B按3∶1-1∶3的比例混勻，用微量注射器移取5-10μl該混合液滴涂到基底電極表面，室溫放置24小時(shí)，即制得所需的生物傳感器。
全文摘要
本發(fā)明屬于溶膠－凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法。本發(fā)明的目的是提供一種溶膠－凝膠包埋酶制備生物傳感器的新方法,即將含酶的聚乙烯醇接枝4－乙烯基吡啶水溶液加入硅烷水解制得的溶膠中,混勻后直接滴涂于電極表面,室溫放置一段時(shí)間,得到含酶膠膜不開(kāi)裂且牢固粘附于電極表面的生物傳感器,這樣制備出的生物傳感器響應(yīng)快,重現(xiàn)性好,使用壽命長(zhǎng)而所需的酶量少。
文檔編號(hào)C12N11/04GK1211620SQ9711726
公開(kāi)日1999年3月24日 申請(qǐng)日期1997年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月15日
發(fā)明者董紹俊, 李彬, 王炳全 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所