專利名稱：細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(酸性磷酸酶法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利為一種非放射性的檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性的方法，也是一種間接的活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，適應(yīng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)的貼壁和懸浮細(xì)胞的檢測(cè)。
細(xì)胞增殖的檢測(cè)一般包括①光鏡下直接作細(xì)胞計(jì)數(shù)；②電子顆粒計(jì)數(shù)；③測(cè)定細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的含量，包括用同位素35S-甲硫氨酸和3H-TdR及非同位素BrdU進(jìn)行標(biāo)記；④細(xì)胞壓積判斷細(xì)胞容量；⑤細(xì)胞攝取染料顆粒；⑥細(xì)胞內(nèi)酶檢測(cè)方法，以及⑦流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)等。其中細(xì)胞攝取染料顆粒和細(xì)胞壓積判斷細(xì)胞容量等方法目前已較少采用。在常用的幾種方法中，細(xì)胞直接計(jì)數(shù)和電子顆粒計(jì)數(shù)方法，由于存在主觀性，或上樣等原因，樣品間差異較大。而細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)測(cè)定，屬于從另一個(gè)側(cè)面反應(yīng)細(xì)胞增殖，不是一種間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)的方法。將流式細(xì)胞儀用于細(xì)胞增殖測(cè)定，準(zhǔn)確性較高，而且信息量大。但其需要較高的條件，操作復(fù)雜，費(fèi)用高，不適用一般研究工作。
細(xì)胞內(nèi)酶檢測(cè)方法用于細(xì)胞增殖，最常用的為四甲基偶氮唑鹽比色法，即MTT法。其原理是活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能催化MTT形成藍(lán)色甲肷，形成的量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。MTT法的缺陷是靈敏性較差，重復(fù)性不佳(姜泊，張亞歷，周殿元主編分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.人民軍醫(yī)出版社第一版.1996101)。但在作了一些改進(jìn)后已由Promega公司(1992)和Boehringer Mannheim公司推出，作為無同位素的細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒。其它細(xì)胞酶內(nèi)方法還包括酸性磷酸酶和堿性磷酸酶方法等，后者用于體外含豐富堿性磷酸酶的骨母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的測(cè)定[Bone miner 1994；Oct 27(1)57]。我們?cè)鴮A性磷酸酶方法用于其它類型細(xì)胞的檢測(cè)，結(jié)果不佳。
利用細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法，最早出現(xiàn)在1986年，由Connolly等人用于測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(Analytical Biochemistry 1986；152136)，其靈敏度可達(dá)100細(xì)胞/孔。其原理是活細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞數(shù)。在一定條件下，用去垢劑使細(xì)胞膜破裂釋放出酸性磷酸酶，使其與磷酸酶底物作用，這一呈色反應(yīng)可用酶標(biāo)儀檢測(cè)，所測(cè)的吸光度即可代表酸性磷酸酶的活性，也間接反映了活細(xì)胞數(shù)。國內(nèi)沈敏等也用于內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)其方法也得到很好的結(jié)果[上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)1989；9(2)149]。我們將這一方法用于上皮細(xì)胞的計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶也能較好地反應(yīng)上皮細(xì)胞的增殖情況[中華消化雜志1994；14(S)42，胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志1994；3(4)279]。近來，我們將其用于中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和骨細(xì)胞等計(jì)數(shù)，也取得了很好的結(jié)果。細(xì)胞數(shù)與所測(cè)定得的吸光度(細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶底物呈色反應(yīng)405nm處測(cè)定結(jié)果)的相關(guān)系數(shù)均大于0.96，大部分在0.99左右，重復(fù)性好。因此，在較廣義的范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性可以準(zhǔn)確地反映檢測(cè)的活細(xì)胞數(shù)，可以用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖和活性。
一種好的細(xì)胞增殖檢測(cè)方法應(yīng)該有以下特點(diǎn)能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖和活性，即能真實(shí)地反映細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)的含量；操作簡便，無污染；重復(fù)性好；成本低。將酸性磷酸酶方法用于細(xì)胞增殖檢測(cè)，雖然有準(zhǔn)確、重復(fù)性好和無污染等特點(diǎn)，但工作濃度的磷酸酶底物難于保存，應(yīng)用時(shí)配制較繁瑣，限制了其推廣應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)，將磷酸酶底物配制成儲(chǔ)存液(5--10×)，避光保存于-10℃以下，應(yīng)用時(shí)將其稀釋成工作液，在一定時(shí)間內(nèi)(--1年)將對(duì)檢測(cè)結(jié)果無明顯影響。出于大家熟知的原因，將磷酸酶底物以固態(tài)形成保存結(jié)果將更好。因此，如果將本方法的其它試劑也配成儲(chǔ)存濃度，將可使方法簡便化?；诖朔N設(shè)想，本專利設(shè)計(jì)了一種利用細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性檢測(cè)細(xì)胞增殖的試劑盒。
本發(fā)明的目的是利用細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性可以準(zhǔn)確地反映檢測(cè)的活細(xì)胞數(shù)的原理，設(shè)計(jì)應(yīng)用簡單方便，無污染和成本低的檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性的試劑盒。本方法主要用于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的測(cè)定。應(yīng)用范圍可包括①測(cè)定細(xì)胞對(duì)生長因子、細(xì)胞因子、促分裂因子和營養(yǎng)因子刺激的增殖反應(yīng)；②分析抗腫瘤藥物及其它化學(xué)藥物的細(xì)胞毒和細(xì)胞抑制作用；③評(píng)價(jià)生長抑制抗體和生理調(diào)節(jié)因子的作用等本試劑盒由磷酸酶底物緩沖液、磷酸酶底物、反應(yīng)中止液和/或磷酸酶底物稀釋瓶組成。所說的磷酸酶底物緩沖液為含去垢劑的酸性緩沖液，磷酸酶底物為硝基苯磷酸鹽(4-Nitrophenyl phosphate，p-Nitrophenyl phosphate)，或磷酸酶底物緩沖液和硝基苯磷酸鹽充分混合后無沉淀的混合物。反應(yīng)中止液為堿性的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。
本設(shè)計(jì)中，磷酸酶底物緩沖液中的去垢劑可以是TritonX-100或Tween-20，其中TritonX-100的工作濃度為0.1-0.5％，Tween-20的工作濃度為0.05-0.2％；磷酸酶底物緩沖液中的酸性緩沖液的pH為5.0--6.0之間，可以為乙酸鈉緩沖液和磷酸鹽緩沖液中的一種，乙酸鈉緩沖液的工作濃度可以為0.05--0.5M，磷酸鹽緩沖液的工作濃度可以為0.01--0.1M；磷酸酶底物其工作濃度時(shí)，硝基苯磷酸鹽的濃度可以為5--20mM；反應(yīng)中止液氫氧化鈉或氫氧化鉀的工作濃度可以為0.05--0.5M。
為體現(xiàn)試劑盒使用簡便的特點(diǎn)，本設(shè)計(jì)中磷酸酶底物和磷酸酶底物緩沖液以儲(chǔ)存液的形式存在，其濃度均為工作濃度的5--10倍。使用者只要簡單地用蒸餾水將磷酸酶底物緩沖液稀釋5--10倍，再用稀釋后的磷酸酶底物緩沖液將磷酸酶底物稀釋5--10倍，即可配成磷酸酶底物的工作液。另外，為更有效地保存磷酸酶底物中硝基苯磷酸鹽，本設(shè)計(jì)中還采用了另一種方法，即先將硝基苯磷酸鹽以固體的形式粉劑、顆粒狀和片劑中的一種形式保存。在使用前，操作者只需簡單地將硝基苯磷酸鹽中加入試劑盒提供的磷酸酶底物緩沖液原液，充分?jǐn)嚢柚翢o沉淀即可形成儲(chǔ)存液形式，這時(shí)磷酸酶底物中硝基苯磷酸鹽的濃度應(yīng)為工作濃度的5--10倍。
更具體地解釋本試劑盒的組成，以其中的一種組合為例說明(磷酸酶底物和磷酸酶底物緩沖液以10×儲(chǔ)存液濃度配制)。本例中，試劑盒在使用時(shí)，去垢劑為Triton X-100(工作濃度為0.1％)，酸性緩沖液為pH 5.5的乙酸鈉緩沖液(工作濃度為0.1M)，硝基苯磷酸鹽為p-Nitrophenyl phosphate，disodium，hexahydrate(工作濃度為10mM)，反應(yīng)中止液為氫氧化鈉(工作濃度為0.1M)。為確切地描述試劑盒的組成，將一個(gè)試劑盒所測(cè)定的樣本定為1000份，即可檢測(cè)10個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。該試劑盒組成如下1)磷酸酶底物緩沖液1M乙酸鈉緩沖液(pH5.5，含1％的Triton X-100)10.0ml；2)磷酸酶底物100mM硝基苯磷酸鹽10.0ml，用含0.1％Triton X-100的0.1M乙酸鈉配制，pH 5.5；3)反應(yīng)中止液0.1M氫氧化鈉10.0ml；4)10ml的磷酸酶底物稀釋瓶一個(gè)。
由于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板一次可以檢測(cè)96孔，而加入的磷酸酶底物為100μl/孔，因而檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板需9600μl，約為10.0ml。以檢測(cè)一個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用程序如下1)取磷酸酶底物緩沖液1.0ml，加入9.0ml蒸餾水，搖勻后取9.0ml加入磷酸酶底物稀釋瓶中；2)取磷酸酶底物1.0ml加入稀釋瓶中，充分搖勻；3)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)細(xì)胞，用細(xì)胞洗滌液(0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.0，含0.85％的氯化鈉)洗滌1次(如為懸浮細(xì)胞則用離心洗滌)，去洗滌液后加入上述稀釋后的磷酸酶底物100μl/孔；4)37℃，孵育1-4小時(shí)(細(xì)胞數(shù)每孔約＞105，則控制在2小時(shí)以內(nèi)；5)加入0.1M氫氧化鈉100μl/孔；6)在多孔酶標(biāo)儀上405nm處測(cè)光吸收度，將細(xì)胞培養(yǎng)板其中不含細(xì)胞，同樣處理過的一孔作為空白對(duì)照，所測(cè)的每孔光吸收度可間接反映每孔中的細(xì)胞數(shù)。如在同樣條件下作一細(xì)胞數(shù)的系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，以細(xì)胞數(shù)為X軸，光吸收度為Y軸，可作直線回歸，可推算出每孔中的細(xì)胞數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種非放射性用于細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，適用于檢測(cè)培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的貼壁和懸浮細(xì)胞，是由磷酸酶底物緩沖液、磷酸酶底物、反應(yīng)中止液和/或磷酸酶底物稀釋瓶組成。所說的磷酸酶底物緩沖液為含去垢劑的酸性緩沖液。所說的磷酸酶底物為硝基苯磷酸鹽(4-Nitrophenyl phosphate，p-Nitrophenyl phosphate)，或磷酸酶底物緩沖液和硝基苯磷酸鹽充分混合后無沉淀的混合物。所說的反應(yīng)中止液為堿性的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的磷酸酶底物緩沖液，其特征是所說的酸性緩沖液的pH值為5.0-6.0，是磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液中的一種，所說的去垢劑是Triton X-100或Tween-20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2，所說的磷酸酶底物緩沖液，其特征是，酸性緩沖液和去垢劑的濃度是儲(chǔ)存濃度，為工作濃度的5--10倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的磷酸酶底物，其特征是，磷酸酶底物可以是粉末狀、顆粒狀、片劑、液體(0℃下為固體形態(tài))中形態(tài)的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求4所說的磷酸酶底物的液體形態(tài)(0℃下為固體形態(tài))，其特征是，由硝基苯磷酸鹽和磷酸酶底物緩沖液充分混合后無沉淀的混合物，其硝基苯磷酸鹽的濃度為工作濃度的5--10倍。
全文摘要
本發(fā)明為一種非放射性檢測(cè)細(xì)胞增殖和活性的試劑盒,其利用活細(xì)胞酸性磷酸酶的活性與細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)關(guān)系的原理。本試劑盒由磷酸酶底物緩沖液、磷酸酶底物、反應(yīng)中止液和/或磷酸酶底物稀釋瓶組成。主要用于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁和懸浮細(xì)胞的測(cè)定。應(yīng)用范圍:①測(cè)定細(xì)胞對(duì)生長因子、細(xì)胞因子、促分裂因子和營養(yǎng)因子刺激的增殖反應(yīng);②分析抗腫瘤藥物及其它化學(xué)藥物的細(xì)胞毒和細(xì)胞抑制作用;③評(píng)價(jià)生長抑制抗體和生理調(diào)節(jié)因子的作用等。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1180108SQ9711697
公開日1998年4月29日 申請(qǐng)日期1997年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月8日
發(fā)明者陳學(xué)清, 潘國宗 申請(qǐng)人:陳學(xué)清, 潘國宗