專利名稱：：啤酒花遺傳變種的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鑒定啤酒花變種的方法，具體來說，涉及一種利用遺傳工程技術(shù)的鑒定方法。發(fā)明背景啤酒花使啤酒具有獨特的芳香和苦味，并且還有助于沉淀過量的蛋白質(zhì)，抑制細(xì)菌的增殖。但是，因為啤酒花以此種方式起作用的程度主要隨其變種而改變，因此為了制造質(zhì)量穩(wěn)定的啤酒和開發(fā)新型啤酒有必要鑒定啤酒花的變種。啤酒花鑒定的傳統(tǒng)方法基于其組成成分，例如，苦味成分(α酸/β酸共葎草酮/葎草酮，共葎果酮/葎果酮)和香精油成分(法呢烯，丁子香烯)。但是，這種以苦味和精油為基礎(chǔ)的鑒定方法除了需要大量精力測量所有的成分外，它還不能精確測定變種，因為即使是同種變種，根據(jù)收獲的地點和時間的不同這些成分變化很大。由于遺傳工程的最新進(jìn)展，人們進(jìn)行了各種各樣的努力試圖闡明植物物種的染色體的序列，并以所發(fā)現(xiàn)的堿基序列為基礎(chǔ)，根據(jù)不同植物或同一植物的不同變種之間的遺傳信息的差異，即DNA序列的多態(tài)性，來鑒定品種。這種以多態(tài)性為基礎(chǔ)的植物變種的鑒定是可靠的，因為DNA序列本身不易受環(huán)境的影響，并因此是穩(wěn)定的。考慮到這些原因，本發(fā)明提供一種利用上述的遺傳技術(shù)鑒定啤酒花的可靠而簡單的方法。發(fā)明描述本發(fā)明的鑒定啤酒花變種的方法是檢測以變種之間DNA序列差異為基礎(chǔ)的這種多態(tài)性。具體來說，使用一個鑒定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(此后用PCR表示)擴(kuò)增顯示多態(tài)性的啤酒花DNA序列，然后通過分析這種擴(kuò)增的DNA來鑒定變種。為了使用上述方法，有必要理解啤酒花變種之間DNA的多態(tài)性。術(shù)語多態(tài)性具體包括因插入，缺失或取代引起的遺傳序列的不同。所涉及的序列長度可能是1bp，或幾十個bp或更多，但優(yōu)選是從幾個bp到幾十個bp。這種變種之間的序列多態(tài)性可以通過測定與每個變種的染色體DNA相對應(yīng)的序列，然后進(jìn)行序列的比較分析來檢測。但是更簡單的方法是使用Williams等(NucleicAcidsResearch，Vol.19，0.6531，1990)改進(jìn)的RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)。這種RAPD技術(shù)使用PCR方法檢測未知DNA序列之間的多態(tài)性。具體來說，將包括一個約10個堿基的相對較短的合成寡聚核苷酸的低特異性引物與多種DNA類型混合，然后進(jìn)行PCR。當(dāng)啤酒花的DNA序列包括一個與引物完全或部分互補(bǔ)的序列時，此引物與此完全或部分互補(bǔ)的序列退火，引物之間界定的部分就被合成并擴(kuò)增。當(dāng)引物之間界定的部分的DNA中存在諸如插入或缺失的序列差異時，即獲得了依賴于變種的不同大小的PCR擴(kuò)增片段。另外，當(dāng)一個變種包含與引物退火的序列而另一個變種不含與引物退火的序列時，只有第一個變種可以獲得PCR擴(kuò)增片段。然后可以通過分離，如通過電泳，來檢測此多態(tài)性。RAPD方法不僅可以用于檢測上面描述的本發(fā)明的多態(tài)性，還可以用于選擇可以通過PCR方法檢測多態(tài)性的引物，即作為一種引物設(shè)計方法。本發(fā)明的方法使用了所有通過RAPD方法檢測的啤酒花變種DNA中的多態(tài)性區(qū)域。另外，根據(jù)本發(fā)明，所有可以擴(kuò)增由RAPD方法檢測出的多態(tài)性區(qū)域的引物都可以用作鑒定引物。通過上述方法產(chǎn)生的本發(fā)明的鑒定引物可以是一種類型的合成寡聚核苷酸，或兩種或多種類型的合成寡聚核苷酸。這種合成寡聚核苷酸的長度范圍是6-40，優(yōu)選是10-21。具體來說，使用包括序列表的SEQ.IDNo.1-14所示的堿基序列的寡聚核苷酸是很方便的。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)計鑒定引物的第二種方法包括下列步驟。這種方法首先測定使用一個鑒定引物(如可以擴(kuò)增通過上述RAPD方法檢測的多態(tài)性區(qū)域的一個引物，此后表示為原始引物(primaryprimer))通過聚合酶鏈?zhǔn)椒椒ǐ@得的擴(kuò)增片段的堿基序列。最后，合成兩個相應(yīng)地互補(bǔ)于上面的多態(tài)性序列片段的預(yù)定間隔的位置的鑒定引物，以高效且簡單地產(chǎn)生一個可以使多態(tài)性序列被原始引物鑒定的擴(kuò)增片段。換而言之，根據(jù)上面的方法，可以以多態(tài)性序列和周圍序列為基礎(chǔ)選擇性地設(shè)計鑒定引物。上述的原始引物可以是一個包括序列表的SEQ.IDNos1-14中描述的堿基序列的寡聚核苷酸。例如，可以如此設(shè)計第一種鑒定引物的序列，以便使一個引物或兩個引物均包括上述多態(tài)性序列的全部或部分。當(dāng)通過上述的引物進(jìn)行品種鑒定并使用一個包括所選的多態(tài)性序列的品種時，因為此品種包含互補(bǔ)序列，所以DNA擴(kuò)增因PCR而發(fā)生，并獲得特異性擴(kuò)增DNA。另一方面，當(dāng)使用不含多態(tài)性序列的品種時，因為此品種不含互補(bǔ)序列，所以即使進(jìn)行PCR也不能產(chǎn)生擴(kuò)增的DNA。因此在這種情況下，有可能根據(jù)此擴(kuò)增片段的存在與否來鑒定品種?？梢匀绱嗽O(shè)計第二種鑒定引物的序列以使兩種類型的引物相應(yīng)地位于多態(tài)性序列的上游和下游。當(dāng)使用上面的鑒定引物進(jìn)行品種鑒定時，通過PCR可以產(chǎn)生根據(jù)品種不同而具有不同的內(nèi)部堿基序列并有時是不同大小的擴(kuò)增DNA。然后通過使用電泳，如果必要在用限制酶消化后進(jìn)行電泳，變性梯度凝膠電泳或溫度梯度凝膠電泳分離擴(kuò)增的DNA，根據(jù)遷移帶型來鑒定品種。可以如此設(shè)計第三種鑒定引物的序列以在其5’端包括一個原始引物的序列，以及與這一序列相連的包括相互連接的5-20個堿基的多態(tài)性區(qū)域的堿基序列。當(dāng)例如在與原始引物互補(bǔ)的位置存在一個多態(tài)性序列時，使用這種鑒定引物進(jìn)行品種鑒定是很有用的。換而言之，在原始引物上接上5-20堿基的序列比單獨使用原始引物檢測多態(tài)性序列有更高的特異性。另外，任何不包括這種類型序列的鑒定引物也可以方便地用作啤酒花鑒定引物，條件是其根據(jù)上面的方法設(shè)計。具體來說，根據(jù)上面的方法設(shè)計的鑒定引物可以是一個包括序列表的SEQ.IDNos.15-40中描述的堿基序列的合成寡聚核苷酸，或者如果需要，兩個合成寡聚核苷酸的適當(dāng)組合(每個包括這種堿基序列的一部分)。另外，鑒定引物可以是包括基因組DNA堿基序列的一部分的合成寡聚核苷酸，此基因組DNA堿基序列的一部分位于SEQ.IDNo15(17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39)的堿基序列與基因組DNA退火的位置和SEQ.IDNo16(18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40)的堿基序列與基因組DNA退火的位置之間。根據(jù)這種設(shè)計第二鑒定引物的方法(即以這種組成)，有可能測定顯示多態(tài)性的一個區(qū)域的堿基序列，并因此本方法提供了一個可以更加可靠地鑒定品種的引物。以這種方式，根據(jù)本發(fā)明的品種鑒定方法在遺傳技術(shù)的基礎(chǔ)上通過進(jìn)行品種間DNA的比較分析，可以可靠地鑒定啤酒花品種而不受收獲環(huán)境的任何影響。現(xiàn)在，將以具體的實施例為參考對本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的描述，但是應(yīng)該明白本發(fā)明絕不僅限于這些實施例。附圖簡述圖1是顯示當(dāng)根據(jù)第二種鑒定引物設(shè)計方法使用一個原始引物(引物的一種B72)分別擴(kuò)增HallertauerTradition(HT)和ShinshuWase(SW)的DNA的一部分并將擴(kuò)增的片段進(jìn)行電泳獲得的遷移帶型的照片。圖2是顯示圖1中用箭頭指示的進(jìn)行電泳的約600bp的擴(kuò)增片段的堿基序列的圖解；上面一組顯示HT的堿基序列，下面一組顯示SW的堿基序列。與上面一組中的HT相對應(yīng)的位置上相同的堿基用一個黑點(·)表示，在HT和SW相對應(yīng)的位置上存在堿基取代的位置，顯示了堿基。在兩種類型相對應(yīng)的位置無堿基的位置，即缺失位置，用減號(-)指示。標(biāo)記為B72WF2的封閉框架含選作鑒定引物的如序列表的SEQ.IDNo27中描述的堿基序列。標(biāo)記為B72WR2的封閉框架含序列表的SEQ.IDNo28中描述的堿基序列，其為鑒定引物的互補(bǔ)序列。圖3是顯示當(dāng)使用一個包括圖2所示的B72WF2(SEQ.IDNo27)和B72WR2(SEQ.IDNo28)的互補(bǔ)序列的鑒定引物進(jìn)行PCR時分離擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果的照片。圖4是顯示另一個多態(tài)性擴(kuò)增片段(RAPD標(biāo)記)的堿基序列的圖示。圖5是顯示又一個多態(tài)性擴(kuò)增片段(RAPD標(biāo)記)的堿基序列的圖示。實施方案的詳細(xì)描述在本發(fā)明的啤酒花品種鑒定方法中，通過PCR方法使用鑒定引物擴(kuò)增多態(tài)性區(qū)域，即在不同啤酒花變種中DNA序列不同的DNA部分，通過分析擴(kuò)增片段之間的不同來鑒定品種。啤酒花DNA的收集研究用的啤酒花DNA可以從少量的啤酒花葉，球果和餅中收集。可以通過通常用于從植物樣品中回收DNA的任何方法收集啤酒花DNA，例如NucleicAcidsRes.，8，4321(1980)中提供的典型的DNA抽提方法，或使用商品BLOODANDCELLCULTUREDNAKIT(QIAGENInc.)更為簡單地進(jìn)行抽提。當(dāng)使用試劑盒時，將DNA吸收于一個陰離子交換樹脂柱上并回收，所以可以解決由可能影響反應(yīng)的物質(zhì)的摻入引起的問題?，F(xiàn)在將要描述本發(fā)明可以使用的設(shè)計鑒定引物的一些方法。第一種鑒定引物設(shè)計方法為了設(shè)計引物，可以使用任何尋找通過PCR檢測不同變種中的多態(tài)性區(qū)域或序列的寡聚核苷酸的方法，但RAPD方法尤為方便。為了進(jìn)行RAPD方法，首先制備一組包括多種引物的引物組。使用例如磷酰胺技術(shù)用DNA自動合成試劑盒可以獲得普通RAPD方法中使用的引物。它們具有隨機(jī)序列，其長度為6-40聚體或優(yōu)選為10-21聚體。還可以使用Williams等(NucleicAcidsResearch，Vol.18，p.6531，1990)披露的堿基序列，Beck's通用引物或OPERON公司制造的Operon10-merKits中的商品寡聚核苷酸。然后，在與下面描述的“PCR反應(yīng)”相同的條件下，使用上面制備的引物組中的一個或多個引物對不同類型的啤酒花DNA進(jìn)行PCR。接下來，由PCR擴(kuò)增的片段在適當(dāng)?shù)碾娪灸z上進(jìn)行分離，比較品種間的擴(kuò)增片段的遷移程度。作為上述比較的結(jié)果，將發(fā)現(xiàn)在品種間不同或大小不同的擴(kuò)增片段作為多態(tài)性擴(kuò)增片段(RAPD標(biāo)記)，從上面引物組中選出產(chǎn)生這些片段的一個或多個引物用作鑒定引物。以這種方式選擇的鑒定引物的例子是包括序列表的SEQ.IDNos1-14中描述的堿基序列的合成寡聚核苷酸，當(dāng)然這些序列也可以用作互補(bǔ)序列。包括序列表SEQ.IDNos1-14顯示的堿基序列的一部分的任何寡聚核苷酸可以用作PCR反應(yīng)中的鑒定引物，條件是它可以擴(kuò)增任何所需的啤酒花DNA多態(tài)性序列。另外，根據(jù)PCR的反應(yīng)條件，任何包括與上述合成寡聚核苷酸相似的堿基序列的核苷酸也可以使用。這種第一設(shè)計方法使設(shè)計可以檢測含有未知序列的啤酒花中的多態(tài)性的鑒定引物變得更加容易。還有，正如在下面實施例中所顯示的，通過這種方法設(shè)計的鑒定引物很好地發(fā)揮了其作用。第二種鑒定引物設(shè)計方法第二種鑒定引物設(shè)計方法測定在第一種鑒定引物設(shè)計方法中檢測的多態(tài)性擴(kuò)增片段(RAPD標(biāo)記)的堿基序列并檢測多態(tài)性序列。從此處測定的多態(tài)性擴(kuò)增片段序列中選擇可以產(chǎn)生包含多態(tài)性序列的擴(kuò)增片段的序列作為鑒定引物。可以設(shè)計在PCR中經(jīng)常引用的”PCRtechnology”，ed.HenryA.Erlich，TakaraShuzoCo.，Ltd.中列出的引物。具體來說，當(dāng)從DNA擴(kuò)增片段中選擇引物序列顯示與RAPD標(biāo)記一樣的大小變化時，選擇包括位于RAPD標(biāo)記堿基序列中插入或缺失的兩側(cè)的序列的寡聚核苷酸。這種鑒定引物的一個例子是包括序列表的SEQ.IDNos.27，28中描述的堿基序列的寡聚核苷酸的組合。RAPD標(biāo)記的大小變化是從1bp到幾百個bp，但10bp到幾十個bp的范圍對鑒定更為方便。即使沒有大小變化也存在可以被限制酶等鑒定的堿基取代?？梢匀菀椎乇浑娪緟^(qū)分的大小變化依賴于所用凝膠的類型和濃度，但是總的說來，它可以是全長的1/10或更多。例如，設(shè)計引物以使當(dāng)插入序列為20bp時，擴(kuò)增產(chǎn)物的全長為200bp或更少。因此通過用這種類型的鑒定引物進(jìn)行PCR，獲得使因多態(tài)性引起的大小變化容易區(qū)分的擴(kuò)增片段。或者，當(dāng)擴(kuò)增片段在品種間顯示大小變化時，可以選擇包括插入位點的內(nèi)部序列和在跨接缺失位點位置的序列的寡聚核苷酸。因此，通過用這種類型的鑒定引物進(jìn)行PCR，獲得具有插入和/或缺失的變種的擴(kuò)增片段。當(dāng)RAPD標(biāo)記可以鑒定依賴于品種的特定DNA擴(kuò)增片段是否存在時，從RAPD標(biāo)記的內(nèi)部堿基序列中選擇包括對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)最適的序列的寡聚核苷酸作為引物。這樣一種引物的例子是包括序列表的SEQ.IDNos35，36中描述的堿基序列的寡聚核苷酸。另外，當(dāng)只是在原始引物退火的位置存在多態(tài)性時，可以選擇在5’末端包括原始引物序列和包括5-20個堿基長的RAPD標(biāo)記堿基序列的合成寡聚核苷酸。例如，當(dāng)使用一個包括RAPD標(biāo)記的內(nèi)部堿基序列的引物并且所有的變種產(chǎn)生同樣大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時，通過這種方式設(shè)計引物可以增強(qiáng)特異性。作為一個具體的例子，包括序列表的SEQ.IDNos15和16中描述的堿基序列的引物還可以在5’末端包括連接其上的序列表的SEQ.IDNo12中描述的堿基序列(圖5)。但是，當(dāng)被連接的RAPD標(biāo)記中的堿基序列太短時，PCR中非特異性擴(kuò)增條帶增加，使得多態(tài)性的檢測不可能進(jìn)行。另一方面，當(dāng)它太長時，不管多態(tài)性存在與否，引物與每個品種退火并產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，多態(tài)性的檢測同樣不可能進(jìn)行。當(dāng)在RAPD標(biāo)記堿基序列中存在可以用于變種鑒定的限制酶識別位點時，可以如此設(shè)計引物以獲得保留這些酶識別位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。這種引物的例子是包括序列表的SEQ.IDNos33，34中描述的堿基序列的寡聚核苷酸。當(dāng)以這種方式設(shè)計引物時，可以調(diào)整進(jìn)行PCR的退火溫度以便只擴(kuò)增目標(biāo)片段(RAPD標(biāo)記)。因此DNA擴(kuò)增條帶的鑒定就更容易，并可獲得高可靠性的結(jié)果。合成寡聚核苷酸提供了一種獲得以上述方式設(shè)計的引物的簡單方法。本發(fā)明中使用的合成寡聚核苷酸可以用例如磷酰胺方法，使用商品DNA自動合成儀獲得。這種寡聚核苷酸的鏈長為15-40，但優(yōu)選為20-30。可以方便地使用包括序列表的SEQ.IDNos1-40中描述的任一堿基序列的寡聚核苷酸。除了上述外，在互補(bǔ)于包括序列表的SEQ.IDNos15-40所述的堿基序列中的兩種堿基序列(如15和16，17和18，…35和36等等)的其他合成寡聚核苷酸的位置之間包括啤酒花DNA堿基序列的一部分的合成寡聚核苷酸也可以使用。根據(jù)上述的第二引物設(shè)計方法的鑒定引物擴(kuò)增多態(tài)性區(qū)域以進(jìn)行基于多態(tài)性擴(kuò)增片段即多態(tài)性序列周圍的序列的合適的鑒定，并且根據(jù)第二引物設(shè)計方法的鑒定引物還包括適于PCR的序列。因此使用這些引物可以進(jìn)行精確的品種鑒定。PCR反應(yīng)接下來，使用根據(jù)上面的第一和第二設(shè)計方法設(shè)計的鑒定引物通過PCR擴(kuò)增啤酒花DNA中的多態(tài)性區(qū)域。PCR反應(yīng)由，例如，Saikiet.al，Science，vol.230，p.1350-1354披露。具體來說，反應(yīng)包括下列步驟變性模板DNA步驟，引物與模板DNA退火步驟和進(jìn)行DNA復(fù)制循環(huán)步驟，其包括以引物為起點通過DNA聚合酶的延伸步驟。通過在一個分離的反應(yīng)小管中處理每個品種進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過加入一種或兩種合成寡聚核苷酸，DNA聚合酶，4種脫氧核糖核苷酸(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，作為模板DNA的每種啤酒花變種的DNA，和擴(kuò)增緩沖溶液(包括約1.0μM到約4.0μM但優(yōu)選約1.5μM到約3.0μM的氯化鎂，氯化鉀，明膠，牛血清白蛋白，一種表面活性劑(如Tween20，NP-40，TritonX-100(均為商品名))，和二甲亞砜)來制備反應(yīng)溶液。含有此反應(yīng)溶液的反應(yīng)管安裝在熱循環(huán)儀上，進(jìn)行適當(dāng)數(shù)量的上述DNA復(fù)制循環(huán)，如約20個循環(huán)到約50個循環(huán)但優(yōu)選是約25個循環(huán)到約40個循環(huán)。可以在，例如，下列條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)步驟。通常，變性步驟通過90℃-95℃但優(yōu)選是94℃-95℃加熱約1分鐘到約3分鐘但優(yōu)選是約1分鐘到2分鐘來進(jìn)行。引物退火步驟通常通過與引物在30℃-50℃但優(yōu)選35℃-42℃溫育1-3分鐘但優(yōu)選1-2分鐘來進(jìn)行，根據(jù)需要，鑒定引物可以是一種，或兩種或更多種的組合。DNA聚合酶延伸步驟是在存在耐熱DNA聚合酶時在約70℃到約73℃但優(yōu)選是約72℃到73℃溫育約1分鐘到約4分鐘但優(yōu)選是約2分鐘到約3分鐘來進(jìn)行。這種耐熱DNA聚合酶可以是由PERKINELMERLtd.制造的商品耐熱DNA聚合酶。通過重復(fù)上面的步驟可以獲得所需的擴(kuò)增DNA。擴(kuò)增片段的分析使用上述的鑒定引物通過PCR反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增DNA通過電泳分離，電泳是分離DNA的常用方法。然后在所獲得的遷移帶型的基礎(chǔ)上就可以鑒定品種。在電泳中，對1000個脫氧核糖核苷酸堿基對或更小的DNA片段用約3％到約20％的聚丙烯酰胺凝膠，對更長的DNA片段使用約0.2％到約2％的瓊脂糖凝膠可獲得適當(dāng)?shù)倪w移帶型。電泳中使用的緩沖溶液可以是Tris-磷酸系統(tǒng)(pH7.5-8.0)，Tris-乙酸系統(tǒng)(pH7.5-8.0)或Tris-硼酸系統(tǒng)(pH7.5-8.3)，但優(yōu)選是Tris-磷酸系統(tǒng)。如果必要可以加入EDTA。電泳條件根據(jù)電泳裝置的不同而不同，但電泳條件可以是，例如，50-300V電泳10-200分鐘，優(yōu)選是150V電泳30分鐘。因為電泳的同時要加上大小標(biāo)記物作為比較，所以可以使用諸如100Base-PairLadder(PharmaciaInc.)的商品標(biāo)記物。用諸如與核酸相互作用的菲啶染料的物質(zhì)，如溴乙錠染色來檢測擴(kuò)增DNA。染色技術(shù)可以是首先加入終濃度約0.5mg/ml的諸如溴乙錠的物質(zhì)，或者將電泳后的凝膠浸入含有約0.5mg/ml的溴乙錠水溶液中約10到60分鐘。當(dāng)在暗室中用254nm或366nm的紫外線照射染好的凝膠時，遷移帶型被檢測呈紅色條帶，其中DNA與溴乙錠相互作用。將染色溶液加到電泳裝置上更為合適，這樣甚至在電泳過程中也可以觀察遷移帶型。除了這種電泳方法外，可以通過能夠檢測DNA存在與否或DNA大小的其他任何方法來分析擴(kuò)增的DNA。品種鑒定通過按上述獲得的遷移帶型的比較分析鑒定品種。可以根據(jù)例如，變種中預(yù)先測定的擴(kuò)增DNA的存在與否的差異或擴(kuò)增DNA的大小差異來進(jìn)行比較分析。特定變種中擴(kuò)增DNA的存在與否顯示用于PCR的引物是否包括退火的序列(即互補(bǔ)序列)，擴(kuò)增DNA的大小差異顯示依賴于變種的由PCR擴(kuò)增的區(qū)域中存在諸如缺失或插入的多態(tài)性序列。為了進(jìn)行更為精確的品種鑒定，優(yōu)選不只依賴于一個PCR的結(jié)果，而是比較當(dāng)使用一個或兩個不同的寡聚核苷酸作鑒定引物時擴(kuò)增片段的遷移帶型。還有，變種能夠被鑒定的精度和區(qū)分變種的能力可以通過觀察當(dāng)PCR的反應(yīng)條件如退火溫度，反應(yīng)緩沖溶液中鎂的濃度等等改變時獲得的結(jié)果來改進(jìn)。通過上面的順序操作，本發(fā)明的啤酒花變種鑒定方法可以清楚地區(qū)分不同的變種。應(yīng)用本發(fā)明的變種鑒定方法可以用于證實用于啤酒花產(chǎn)品如啤酒花餅的啤酒花變種的純度。例如，研究從標(biāo)準(zhǔn)啤酒花獲得的擴(kuò)增DNA和從啤酒花餅獲得的擴(kuò)增DNA的不同。如果檢測從啤酒花餅獲得的擴(kuò)增DNA不同于從標(biāo)準(zhǔn)啤酒花獲得的擴(kuò)增DNA，就可以確定啤酒花餅中的標(biāo)準(zhǔn)啤酒花中摻入了其它變種或物種。當(dāng)發(fā)現(xiàn)其它變種或物種存在時，可以通過觀察，例如，上述的溴乙錠的染色深度來測量擴(kuò)增DNA的量，這些其它變種或物種存在的程度，即純度。也是在這種情況下，純度檢測的精度可以通過聯(lián)合使用兩種或更多種本發(fā)明的合成寡聚核苷酸來增強(qiáng)?？梢灶A(yù)料本發(fā)明的寡聚核苷酸可以用于除啤酒花之外的其它植物品種(如桑樹，草莓，櫻桃等等)的鑒定。近緣物種中脫氧核糖核苷酸序列不同的位置是DNA突變?nèi)菀装l(fā)生的位置，因此它們是有限的。例如，據(jù)報道編碼rDNA的位置可以用于鑒定細(xì)菌菌種(大腸桿菌，乳酸菌)或植物物種(水稻實生苗，柑橘)。因此，根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)近緣物種之間有差異的位置還可能用于鑒定其它植物的品種。本發(fā)明的變種鑒定方法是在變種間的序列多態(tài)性的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，因此能夠精確區(qū)分啤酒花變種而不受環(huán)境因素的影響。另外，本發(fā)明的變種鑒定方法不僅可以用于鑒定變種，還可以用于測量啤酒花產(chǎn)品中不同啤酒花變種的純度。實施方案實施例1-12顯示使用由第一種鑒定引物設(shè)計方法設(shè)計的鑒定引物對啤酒花品種的鑒定。實施例1基因組DNA的提取所用的啤酒花為Brewer'sGold(此后用1號品種表示)，NorthernBrewer(此后用2號品種表示)，Tettnanger(此后用3號品種表示)，Saazer(此后用4號品種表示)，Hersbruckerspaet(此后用5號品種表示)，Spalterselect(此后用6號品種表示)，Hallertauertradition(此后用7號品種表示)，ShinshuWase(此后用8號品種表示)，和FuranoAce(此后用9號品種表示)。從上面的變種上仔細(xì)剪下綠葉組織(重約1g)，將組織片段浸入液氮中冰凍。使用一個Polytron在液氮中將冰凍物質(zhì)搗成粉末，使用BLOODANDCELLCULTUREDNAKIT(QIAGENInc.)從50mg的粉末中提取基因組DNA。每個變種最后獲得10-20mg的基因組DNA。實施例2用SEQ.IDNos1和2中描述的寡聚核苷酸作引物通過PCR進(jìn)行啤酒花變種的分類。在一個含50μMKCI，1.5μMMgCl2和含0.1％TritonX-100的10μMTris-HCl緩沖溶液(pH8.8)的小管中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在小管中加入一個單位的耐熱DNA聚合酶(WakoPureChemicals)，20mol的四種堿基(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)和0.1mg的例1中制備的每種啤酒花變種基因組DNA，33pmol的SEQ.IDNos1和2中描述的寡聚核苷酸作為引物。最終反應(yīng)溶液的體積為30μl，在小管中加入20μl的礦物油以防止反應(yīng)溶液的蒸發(fā)。上面的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在下列條件下進(jìn)行。首先，在94℃溫育3分鐘后，在94℃加熱1分鐘進(jìn)行變性步驟，在35℃溫育1分鐘進(jìn)行引物退火步驟。在72℃用耐熱DNA聚合酶完成35個循環(huán)，每個循環(huán)2分鐘，并在72℃保溫10分鐘進(jìn)行DNA聚合酶延伸步驟。將產(chǎn)物貯存于4℃。通過上面的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的擴(kuò)增DNA通過在5％聚丙烯酰胺凝膠上150V電泳30分鐘來分離，電泳緩沖溶液為含2μMEDTA的100μMTris-硼酸(pH8.0)。使用100Base-PairLadder(PharmaciaInc.)作大小標(biāo)記物。電泳結(jié)束后，將凝膠浸入0.5mg/ml的溴乙錠水溶液中10分鐘，在暗室中用254nm紫外線照射。檢測出與DNA和溴乙錠的化合物相對應(yīng)的紅色條帶。所獲得的結(jié)果顯示于表1。表中清楚地顯示，當(dāng)使用包括SEQ.IDNos1和2中描述的脫氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物時，在約520bp和約530bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，9個啤酒花變種被分成兩組。</tables>實施例3除了使用SEQ.IDNos3和4中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在40℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表1。當(dāng)使用SEQ.IDNos3和4中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約750bp和約850bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，9個啤酒花變種被分成四組。實施例4除了使用SEQ.IDNos5和6中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在40℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表1。當(dāng)使用SEQ.IDNos5和6中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約270bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，9個啤酒花變種被分成兩組。實施例5除了使用SEQ.IDNos7和8中描述的合成寡聚核苷酸作為引物外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表1。當(dāng)使用SEQ.IDNos7和8中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約370bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，9個啤酒花變種被分成兩組。實施例6除了使用SEQ.IDNos9中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在40℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表1。當(dāng)使用SEQ.IDNos9中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約950bp和約1200bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，9個啤酒花變種被分成三組。實施例7除了使用SEQ.IDNos10中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在38℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表2。當(dāng)使用SEQ.IDNos10中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約650bp，約700bp和約1200bp處檢測出了三條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，9個啤酒花變種被分成四組。表2實施例8除了使用SEQ.IDNos11中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在38℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表2。當(dāng)使用SEQ.IDNos11中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約1400bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，9個啤酒花變種被分成兩組。實施例9除了使用SEQ.IDNos12中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在38℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表2。當(dāng)使用SEQ.IDNos12中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約550bp和約800bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，9個啤酒花變種被分成四組。實施例10除了使用SEQ.IDNos13中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在38℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表3。當(dāng)使用SEQ.IDNos13中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約550bp，640bp，650bp和1400bp處檢測出了四條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，9個啤酒花變種被分成五組。表3實施例11除了使用SEQ.IDNos14中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物退火步驟是在38℃進(jìn)行外，方法與實施例2的相同。結(jié)果顯示于表3。當(dāng)使用SEQ.IDNos14中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約540bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，9個啤酒花變種被分成兩組。實施例12將作為8號品種出售的啤酒花餅(經(jīng)SapporoBreweriesLtd.許可由NortherrnHopAgriculturalCooperative，1wate-ken制造)在研缽中搗成粉末，使用BLOODANDCELLCULTUREDNAKIT(QIAGENInc.)從20mg的粉末中提取了約5mg的基因組DNA。使用包括SEQ.IDNos.1和2中描述的脫氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物，用與實施例2相同的程序處理此DNA。檢查此擴(kuò)增基因組DNA與從8號品種的標(biāo)準(zhǔn)啤酒花獲得的擴(kuò)增基因組DNA之間的不同以證實純度。接下來，使用由第二種鑒定引物設(shè)計方法設(shè)計的鑒定引物進(jìn)行的啤酒花品種的鑒定將在實施例13-30中描述。實施例13基因組DNA的提取從上述的變種上仔細(xì)剪下綠葉組織(重約1g)，將組織片段浸入液氮中冰凍。使用一個Polytron在液氮中將冰凍物質(zhì)搗成粉末，使用BLOODANDCELLCULTUREDNAKIT(QIAGENInc.)從50mg的粉末中提取基因組DNA。每個變種最后獲得10-20mg的基因組DNA。實施例14RAPD標(biāo)記的選擇為了獲得RAPD標(biāo)記，使用0.34μM的引物B72(圖2)作引物進(jìn)行PCR。在一個含50μMKCl，1.5μMMgCl2和含0.1％TritonX-100的10μMTris-HCl緩沖溶液(pH8.8)中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在小管中加入0.25個單位的TaqDNA聚合酶(NipponGeneK.K.)，200μM的四種堿基(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)和17.5μg的例13中制備的每種啤酒花變種基因組DNA。最終反應(yīng)溶液的體積為10μl。上面的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在下列條件下進(jìn)行。首先，在94℃溫育1分鐘后，在94℃加熱30秒進(jìn)行變性步驟，在33℃溫育1分鐘進(jìn)行引物退火步驟。在72℃用耐熱DNA聚合酶完成35個循環(huán)，每個循環(huán)30秒，在72℃保溫1分鐘進(jìn)行DNA聚合酶延伸步驟。通過上面的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的擴(kuò)增DNA通過在5％聚丙烯酰胺凝膠上150V電泳30分鐘來分離，電泳緩沖溶液為含2μMEDTA的100μMTris-硼酸(pH8.0)。使用Marker9(NipponGene)作大小標(biāo)記物。電泳結(jié)束后，將凝膠浸入0.5mg/ml的溴乙錠水溶液中10分鐘，在暗室中用254nm紫外線照射。檢測出與DNA和溴乙錠的化合物相對應(yīng)的紅色條帶。所獲得的結(jié)果顯示于圖1。從圖1可以看出用箭頭指示的位置的條帶的大小對HT和SW來說是不同的。用箭頭指示的條帶的位置相應(yīng)于RAPD標(biāo)記。實施例15從電泳凝膠上切下例14中制備的RAPD標(biāo)記，將其置于一個透析管中，加電壓從凝膠上洗下RAPD標(biāo)記。根據(jù)“PCRTechnology”(ed.HenryA.Erlich，pub.TakaraShuzoCo.，Ltd.)中描述的方法在獲得的RAPD標(biāo)記上加上限制酶BglII或PstI的識別序列。使用限制酶識別序列用pUC質(zhì)粒進(jìn)行亞克隆后，通過雙脫氧法測定其脫氧核糖核苷酸序列，結(jié)果顯示于圖2。圖中黑點(·)指示與上一行相同的脫氧核糖核苷酸，杠(-)指示堿基缺失。有下劃線的部分是引物B72的脫氧核糖核苷酸序列，用長方形封閉的脫氧核糖核苷酸序列是后面的實施例16中作為參考的脫氧核糖核苷酸序列。當(dāng)對每條帶進(jìn)行序列測定時，如圖2所示，SW中觀察到了一個32bp脫氧核糖核苷酸序列的插入。實施例16由實施例15中獲得的RAPD標(biāo)記，設(shè)計以圖2所示的由長方形封閉的脫氧核糖核苷酸序列B72WF2為參考獲得的序列表的SEQ.ID27所述的合成寡聚核苷酸，和從互補(bǔ)序列B72WR2獲得的SEQ.ID28所述的脫氧核糖核苷酸序列(分許可SawaddyTechnology生產(chǎn))。在下列的PCR反應(yīng)中，這些合成的寡聚核苷酸被用作一個引物組。在一個10μl的含50μMMgCl2和含0.1％TritonX-100的10μMTris-HCl緩沖溶液(pH8.8)中進(jìn)行PCR，加入0.25個單位的TaqDNA聚合酶(NipponGeneInc.)，200μM的四種堿基(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，17.5μg的例13中制備的啤酒花變種基因組DNA和0.34μM的合成寡聚核苷酸。上面的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在下列條件下進(jìn)行。首先，在94℃溫育1分鐘后，在94℃加熱1分鐘進(jìn)行變性步驟，在60℃溫育1分鐘進(jìn)行引物退火步驟。在72℃用耐熱DNA聚合酶完成35個循環(huán)進(jìn)行DNA聚合酶延伸步驟，每個循環(huán)30秒。上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的擴(kuò)增DNA通過在5％聚丙烯酰胺凝膠上150V電泳30分鐘來分離，電泳緩沖溶液為含2μMEDTA的100μMTris-硼酸(pH8.0)。使用Marker9(NipponGene)作大小標(biāo)記物。電泳結(jié)束后，將凝膠浸入0.5mg/ml的溴乙錠水溶液中10分鐘，在暗室中用254nm紫外線照射。檢測出與DNA和溴乙錠的化合物相對應(yīng)的紅色條帶。所獲得的結(jié)果顯示于圖3。對其它的變種進(jìn)行相同的程序，結(jié)果顯示于圖3。所用的其它品種為Fuggle(FU)，Cascade(CC)，Brewer'sGold(BG)，NorthernBrewer(NB)，Tettnanger(TE)，Saazer(SA)，Hersbruckerspaet(HE)，Perle(PE)，Spatterselect(SS)和FuranoAce(FA)。正如從圖中看出的，在BG，NB，TE，SW和FA中觀察到了包括插入位置的一個329bp片段(箭頭)的擴(kuò)增。在所有的品種中觀察到了不包括插入位置的一個299bp片段。還觀察到了品種特異性的片段600bp，700bp，710bp。這些片段易于鑒定且重復(fù)性高。實施例17除了使用SEQ.IDNos15和16中描述的合成寡聚核苷酸作為引物外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。從表中看出，當(dāng)使用SEQ.IDNos15和16中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約500bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例18除了使用SEQ.IDNos17和18中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和PCR中的引物退火步驟是在62℃進(jìn)行外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos17和18中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約260bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例19除了使用SEQ.IDNos19和20中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和PCR中的引物退火步驟是在65℃進(jìn)行外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos19和20中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約500bp和約550bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例20除了使用SEQ.IDNos21和22中描述的合成寡聚核苷酸作為引物外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos21和22中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約710bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例21除了使用SEQ.IDNos23和24中描述的合成寡聚核苷酸作為引物外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos23和24中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約330bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例22除了使用SEQ.IDNos25和26中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和進(jìn)行PCR后，使用1μl的反應(yīng)溶液作模板DNA在與前述相同的PCR條件下進(jìn)行20個PCR循環(huán)外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos25和26中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約160bp和約200bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例23除了使用SEQ.IDNos29和30中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和PCR中的引物退火步驟是在57℃進(jìn)行外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos29和30中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約350bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例24除了使用包括SEQ.IDNos3l和32中描述的脫氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作為引物，PCR進(jìn)行兩次，和反應(yīng)溶液用限制酶NlaIII(DaiichiPureChimicals)處理外，方法與實施例22的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用包括SEQ.IDNos31和32中描述的脫氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物時，在約220bp和約360bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，12個啤酒花變種被分成四組。實施例25除了使用SEQ.IDNos33和34中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，PCR中的引物退火步驟是在67℃進(jìn)行，和反應(yīng)溶液用限制酶TaqI(BoehringerMannheim)處理外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos33和34中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約220bp和約270bp處檢測出了兩條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)這些條帶的有無，12個啤酒花變種被分成三組。實施例26除了使用SEQ.IDNos35和36中描述的合成寡聚核苷酸作為引物，和PCR中的引物退火步驟是在58℃進(jìn)行外，方法與實施例16的相同。結(jié)果顯示于表4。當(dāng)使用SEQ.IDNos35和36中描述的合成寡聚核苷酸作引物時，在約400bp處檢測出了一條擴(kuò)增的基因組條帶。根據(jù)此條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例27使用33pmol的Beck's通用引物(A25；5'-GGTCAGGCACCA-3’)以與實施例14相同的方式進(jìn)行PCR和電泳。結(jié)果觀察到了超過10個約200-2000bp的擴(kuò)增基因組條帶，使用存在與否依賴于品種的約500bp處的條帶作為RAPD標(biāo)記。當(dāng)檢查此標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸序列時，獲得了圖4顯示的結(jié)果。在圖4中SEQ.IDNos19和20所述的合成寡聚核苷酸是以A和B標(biāo)出的長方形封閉的序列。圖4中SEQ.IDNos37和38所述的寡聚核苷酸是以C和D標(biāo)出的有下劃線的序列。SEQ.IDNos37和38中描述的這些寡聚核苷酸包括此RAPD標(biāo)記的一部分。SEQ.IDNos19和20中描述的這些寡聚核苷酸在5’端含有原始引物序列。除了使用SEQ.IDNos19和20作為引物在65℃進(jìn)行35個退火步驟循環(huán)，和使用SEQ.IDNos37和38作為引物在60℃進(jìn)行30個退火步驟循環(huán)外，程序與實施例16的相同。結(jié)果是當(dāng)使用SEQ.IDNos19和20作引物時，觀察到的500bp和550bp條帶如表4所示，當(dāng)使用SEQ.IDNos37和38作引物時，觀察到了一個459bp的條帶。根據(jù)這些條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例28使用33pmol的Beck's通用引物(A25；5'-GGTCAGGCACCA-3’)以與實施例14相同的方式進(jìn)行PCR和電泳。結(jié)果觀察到了超過10個約200-2000bp的擴(kuò)增基因組條帶，使用存在與否依賴于品種的約500bp處的條帶作為RAPD標(biāo)記。當(dāng)檢查此標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸序列時，獲得了圖5顯示的結(jié)果。在圖5中SEQ.IDNos15和16所述的合成寡聚核苷酸是以用A和B標(biāo)出的長方形封閉的序列為基礎(chǔ)的。圖5中SEQ.IDNos39和40所述的寡聚核苷酸是以用C和D標(biāo)出的有下劃線的序列為基礎(chǔ)的。使用SEQ.IDNos39和40作為引物，在60℃進(jìn)行30個退火步驟循環(huán)。所有的變種都觀察到了在500bp處的擴(kuò)增基因組條帶，但這些變種不能夠被鑒定。另一方面，當(dāng)使用SEQIDNos15和16進(jìn)行相同的程序時，獲得了表4所示的擴(kuò)增基因組條帶，這些根據(jù)這些條帶的有無，12個啤酒花變種被分成兩組。實施例29從綜合實施例16-28的類型的表4可以看出有可能區(qū)分12個啤酒花變種。列出片段大小的例子被作為變種鑒定的參考，用限制酶進(jìn)行處理的例子用括號()表示。表4</tables>實施例30在研缽中將ShinshuWase啤酒花餅(經(jīng)SapporoK.K.許可由NorthemHopAgriculturalCooperative，Iwate-ken制造)搗碎，使用BLOODANDCELLCULTUREDNAKIT(QIAGENInc.)從20mg的粉末中提取到了約5mg的基因組DNA。使用包括SEQ.IDNos.15-40中描述的脫氧核糖核苷酸序列的合成寡聚核苷酸作引物，用與實施例29相同的程序檢查所獲得的DNA的純度。出現(xiàn)了很少幾條非特異性的擴(kuò)增條帶，很容易證實所需的標(biāo)記。在重復(fù)純度測試中也獲得了高重復(fù)性的結(jié)果。應(yīng)用的領(lǐng)域根據(jù)本發(fā)明的遺傳鑒定方法，可以進(jìn)行不受環(huán)境或其它情況影響的精確而簡單的啤酒花變種的鑒定。本發(fā)明的遺傳鑒定方法對檢查以啤酒花為原料的產(chǎn)品的純度也是有效的。因此，通過鑒定啤酒花變種，本發(fā)明的遺傳鑒定方法可以用于保持含有穩(wěn)定水平啤酒花的產(chǎn)品的質(zhì)量，或用于提高其質(zhì)量。序列表SEQ.IDNo.1序列長度19序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CTATTCTGGCTAGTTCTGCSEQ.IDNo.2序列長度19序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CTATTTTGGCCAGTTTTGTSEQ.IDNo.3序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述AGCTGAGCAAGCTTCTTTGGSEQ.IDNo.4序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CCCTTTATATACACTGCCGASEQ.IDNo.5序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述TAGCATCGGTAATCTCTCGCSEQ.IDNo.6序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述AACATGCTGGGCAACTCCCASEQ.IDNo.7序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GGAGACATCATCGAATCAGASEQ.IDNo.8序列長度21序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述AACCAGAGCAGCCATGTTAGTSEQ.IDNo.9序列長度10序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CAATCGCCGTSEQ.IDNo.10序列長度12序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GCCAGCTGTACGSEQ.IDNo.11序列長度12序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述AGGTACGCCCGASEQ.IDNo.12序列長度12序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CGCCCTGCAGTASEQ.IDNo.13序列長度12序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CCATCCGCACGASEQ.IDNo.14序列長度12序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GGTCAGGCACCASEQ.IDNo.15序列長度24序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CGCCCTGCAGTACCTTCCTGTAAGSEQ.IDNo.16序列長度24序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CGCCCTGCAGTAGAGCACTTCTATSEQ.IDNo.17序列長度22序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CAATCGCCGTCTTGGTAGCGTASEQ.IDNo.18序列長度25序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CAATCGCCGTTGAGAAAGTTAAGTASEQ.IDNo.19序列長度25序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GGTCAGGCACCATGTACTAGCTGGCSEQ.IDNo.20序列長度25序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GGTCAGGCACCAAGGCCACCATCTGSEQ.IDNo.21序列長度26序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GCCAGCTGTACGATGCCATGACCTTASEQ.IDNo.22序列長度24序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GCCAGCTGTACGCCCCGGAAGGAASEQ.IDNo.23序列長度23序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述ACTCACCACGCAGAAACCCAGGCSEQ.IDNo.24序列長度23序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CCTCGACAAGTGAGATGTTGACCSEQ.IDNo.25序列長度23序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GCCACATTATCAAGGCAATACACSEQ.IDNo.26序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GGCATGACTCATGCCAGCTGSEQ.IDNo.27序列長度22序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GTCCCTCCTAGACACCTACATASEQ.IDNo.28序列長度21序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GCTCCTGACAGCAAGGTAAGCSEQ.IDNo.29序列長度22序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GAATACTGAGATTTTTATGAGGSEQ.IDNo.30序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CAGGTCATGACTCATGCTAASEQ.IDNo.31序列長度28序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述AAGGTGTTGCGGCCCTTAACAACTTCTTSEQ.IDNo.32序列長度28序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述AAGGTGTTGCGGAGAGTGTTCTAGAACASEQ.IDNo.33序列長度23序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述ATCGAGCGAACGTATCAGCTGCGSEQ.IDNo.34序列長度24序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CCTTTCCGACGTCACTAATCGTGGSEQ.IDNo.35序列長度24序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述TTAAATGACATGATCACCTCTCCCSEQ.IDNo.36序列長度24序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述TAACACAGAGGTACCTCACTGTCTSEQ.IDNo.37序列長度21序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CTCCCACTGCACACCTATTTCSEQ.IDNo.38序列長度21序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CACCATCTGAAGGAGGTCAAGSEQ.IDNo.39序列長度20序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述CCTTCCTGTAAGGGTTTACASEQ.IDNo.40序列長度21序列形式核酸鏈數(shù)1拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性序列類型合成DNA序列描述GAGCACTTCTATCATTTTTCG權(quán)利要求1.一種用于鑒定啤酒花品種的遺傳變種鑒定方法，包括分析用一個鑒定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA，此鑒定引物被設(shè)計用來擴(kuò)增在不同變種的啤酒花DNA的脫氧核糖核苷酸序列中包括多態(tài)性的區(qū)域。2.如權(quán)利要求1所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的鑒定引物包括一個，兩個或更多個合成的寡聚核苷酸。3.如權(quán)利要求1所述的遺傳變種鑒定方法，其中多態(tài)性是因一個或多個堿基的插入，缺失或取代造成的脫氧核糖核苷酸序列的排列不同而引起的。4.如權(quán)利要求1所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的分析是基于在變種之間比較擴(kuò)增DNA的存在與否、長度、以及預(yù)定的限制酶片段的長度中的至少一種。5.如權(quán)利要求1所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的鑒定引物是通過從多種合成寡聚核苷酸中選擇能夠在所說的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增包含變種之間的多態(tài)性區(qū)域的合成寡聚核苷酸來設(shè)計。6.如權(quán)利要求5所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的鑒定引物包括序列表的SEQ.IDNos.1-14所述的脫氧核糖核苷酸序列的任何一種或兩種以及每個序列的互補(bǔ)序列。7.如權(quán)利要求1所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說引物的設(shè)計包括(a)使用任何所需的原始引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多種啤酒花品種DNA的DNA擴(kuò)增步驟，(b)選擇顯示擴(kuò)增DNA的品種間多態(tài)性的多態(tài)性擴(kuò)增片段的多態(tài)性擴(kuò)增片段選擇步驟，(c)測定所說多態(tài)性擴(kuò)增片段中的多態(tài)性序列的多態(tài)性序列測定步驟，和(d)合成兩個鑒定引物的鑒定引物合成步驟，所述的兩個鑒定引物分別在啤酒花DNA序列的預(yù)定的間隔區(qū)的位置與其互補(bǔ)以產(chǎn)生一個包括所說多態(tài)性序列并具有可以被分析長度的擴(kuò)增片段。8.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的兩種鑒定引物包括所說多態(tài)性擴(kuò)增片段的一部分。9.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的兩種鑒定引物跨接所說的多態(tài)性序列。10.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的兩種鑒定引物中的至少一個包括所說多態(tài)性擴(kuò)增片段的一部分或全部。11.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的鑒定引物包括用于PCR的最佳序列。12.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的鑒定引物中的至少一個在5’末端包括一個原始引物序列。13.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的原始引物可以是一個，兩個或多個包括SEQ.IDNos.1-14所述的脫氧核糖核苷酸序列的引物。14.如權(quán)利要求7所述的遺傳變種鑒定方法，其中所說的鑒定引物對包括含有序列表的SEQ.IDNos.15-40所述的堿基序列的一個引物和含有互補(bǔ)序列的一個引物的任意組合。全文摘要本發(fā)明描述了一種以啤酒花變種遺傳序列中的多態(tài)性為基礎(chǔ)的鑒定啤酒花變種的方法。具體來說，使用設(shè)計的鑒定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴(kuò)增啤酒花DNA的多態(tài)性區(qū)域，并分析擴(kuò)增的DNA片段，其中所述的鑒定引物設(shè)計能夠擴(kuò)增包含在不同變種的堿基序列中的多態(tài)性區(qū)域。以這種方式，可以簡單而準(zhǔn)確地鑒定啤酒花變種。文檔編號C12Q1/68GK1159212SQ96190828公開日1997年9月10日申請日期1996年7月26日優(yōu)先權(quán)日1995年7月28日發(fā)明者荒木茂樹,土屋陽一申請人:薩波羅啤酒株式會社