專利名稱：：Dna片斷和含有該dna片斷的重組載體以及應(yīng)用其之后外源基因的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于對(duì)基因的表達(dá)起促進(jìn)作用的新DNA片斷和含有DNA片斷的重組載體，以及應(yīng)用其后外源基因的表達(dá)方法的。
背景技術(shù)：
：促進(jìn)外源基因表達(dá)的技術(shù)是將基因工程技術(shù)應(yīng)用于植物時(shí)最必要的技術(shù)之一。其方法之一就是利用具有能促進(jìn)基因表達(dá)的堿基序列的DNA。促進(jìn)外源基因表達(dá)的堿基序列，眾所周知有蓖麻的過氧化氫酶的內(nèi)含子等[特開平03-103182；Tanakaetal.NucleicAcidsRes.18，6767-6770(1990)]?？墒?，所要的的植物種類繁多，也有必要促進(jìn)生育階段或組織器官中的外源基因的表達(dá)；因此，期待著開發(fā)可利用的能促進(jìn)多種基因表達(dá)的DNA。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的就提供一種可促進(jìn)外源基因表達(dá)的新DNA，它與已知的能促進(jìn)外源基因表達(dá)的DNA序列不同。經(jīng)本專利的發(fā)明者們的精心研究，完成了本發(fā)明，其發(fā)明點(diǎn)是通過比較稻子的磷脂酶D(以下稱為“PLD”)的cDNA和稻子的染色體組DNA的堿基序列，發(fā)現(xiàn)了PLD的基因的內(nèi)含子，而且發(fā)現(xiàn)了其中一個(gè)內(nèi)含子對(duì)其下游基因的表達(dá)有明顯促進(jìn)作用。也就是說，本發(fā)現(xiàn)提供了具有序列表中序列號(hào)1所示的堿基序列的分離的DNA片斷以及在該堿基順序中增加、插入、缺失或置換一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸，并對(duì)其下游基因的表達(dá)有促進(jìn)作用的分離的DNA片斷。本發(fā)明還提供了含有上述本發(fā)明中的DNA片斷和與其下游功能性連接的待表達(dá)的外源基因的重組載體。本發(fā)明還提供了外源基因的表達(dá)方法，即將本發(fā)明中上述重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使上述外源基因表達(dá)出來。通過下面的實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)，本發(fā)明中的DNA片斷大大促進(jìn)了其下游基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明在利用基因工程技術(shù)來使外源基因表達(dá)方面做出了很大貢獻(xiàn)。附圖簡述圖1示在本發(fā)明實(shí)施例中插入了本發(fā)明的DNA片斷的pBI221的基因圖的關(guān)鍵部位。發(fā)明的最佳實(shí)施方案如上所述，本發(fā)明的DNA片斷具有序列表中序列號(hào)1的堿基序列。本發(fā)明的DNA片斷象下述實(shí)施例中所講的那樣，通過比較稻子PLD基因的cDNA和與其相應(yīng)的稻子的染色體組DNA的堿基序列來鑒定稻子PLD基因上游的(內(nèi)含子區(qū)，用PCR制備含有173bp內(nèi)含子序列的片斷(該內(nèi)含子位于上述內(nèi)含子的5′端)與非編碼區(qū)域相應(yīng)的位置上)，并組裝到載體中報(bào)告基因的上游。通過比較該報(bào)告基因的表達(dá)活性，確認(rèn)了對(duì)下游基因表達(dá)起了促進(jìn)作用的片斷。本發(fā)明的DNA片斷的堿基序列相當(dāng)于序列表中序列號(hào)3所表示的稻子基因組PLD基因堿基序列的第1661～1843堿基。還將位于稻子PLD基因上游的上述173bp內(nèi)含子區(qū)序列的堿基序列以序列表的序列號(hào)4表示。序列號(hào)4所表示的序列對(duì)下游基因的表達(dá)當(dāng)然具有促進(jìn)作用。序列號(hào)4所表示的堿基序列相當(dāng)于序列表中序列號(hào)3所表示的稻子基因組PLD基因堿基序列的第1666～第1838堿基。本發(fā)明的DNA片斷是位于稻子PLD基因上游的內(nèi)含子區(qū)，通過本發(fā)明明確了其堿基序列；所以，可以采用把稻子的染色體組DNA為模板的PCR法，很容易制備出本發(fā)明的DNA片斷。PCR法是基因工程領(lǐng)域中經(jīng)常采用的方法，采用此方法要用的成套儀器市場上均可買到；因此，專業(yè)人員很容易實(shí)施此方法。在下述實(shí)施例中，詳細(xì)敘述一具體實(shí)施例。一般在具有生理作用的DNA序列中，即使增加、插入、缺失或置換一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸，也可以維持其生理活性的觀點(diǎn)，在專業(yè)人員當(dāng)中正在得到廣泛的承認(rèn)。本發(fā)明也進(jìn)行了這種修飾，而且包含對(duì)下游基因的表達(dá)有促進(jìn)作用的DNA片斷。也就是說，在序列表中序列號(hào)1所示的堿基序列中，增加、缺失或置換一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸，而且對(duì)其下游基因的表達(dá)有促進(jìn)作用的DNA片斷也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。特別是序列號(hào)1所示的堿基序列中5′末端的5堿基及3′末端的6堿基是外顯子部分，所以缺失這些序列的DNA片斷對(duì)基因的發(fā)現(xiàn)也有促進(jìn)作用，這些片斷也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核苷酸的擴(kuò)增、插入、缺失或置換可以采用眾所周知的定點(diǎn)突變法(例如核酸研究，Vol.10，No.20，P6487-6500，1982)技術(shù)就可以做到；本說明書中講的“一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸”的意思就是采用定點(diǎn)突變法，可以增加、插入、缺失或置換的核苷酸的數(shù)量。除了所要求的變異不一致之外，可以按下述方法用互補(bǔ)合成的寡核苷酸引物對(duì)應(yīng)接受變異的主鏈?zhǔn)删wDNA進(jìn)行定點(diǎn)突變。即以上述合成的寡核苷酸為引物給噬菌體合成互補(bǔ)鏈，用所得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化成含噬菌體的宿主細(xì)菌。將轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌培養(yǎng)物做成瓊脂培養(yǎng)基，使其從含有噬菌體的單一細(xì)胞形成噬菌斑。這樣，理論上講50％的新集落含有單鏈變異的噬菌體，剩余的50％具有原來的序列。使所得到的噬菌斑與其具有上述所要求的變異的DNA完全相同的DNA形成混合物，在與具有原來鏈的不相同的DNA不形成混合物的溫度下，使其與激子酶處理過的合成探針形成混合物。然后，挑選出與該探針形成混合物的噬菌斑，進(jìn)行培養(yǎng)，回收DNA。另外，在堿基序列中，做為對(duì)下游基因的表達(dá)不喪失促進(jìn)作用的置換、缺失、擴(kuò)增或插入一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的方法，除了上述定點(diǎn)突變之外，還有用變異原處理基因的方法以及選擇性地分裂基因，然后把選擇出來的核苷酸除去、增加、插入或置換，并進(jìn)行連接的方法。本發(fā)明中的DNA片斷對(duì)其下游基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。因此，通過把本發(fā)明中的DNA片斷插到的外源基因的轉(zhuǎn)錄部位的5′末端，就可以促進(jìn)該外源基因的表達(dá)。外源基因的表達(dá)方法在基因工程領(lǐng)域中已被確立。這種方法是把所希望得到的外源基因插到表達(dá)載體的克隆部位，并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞，即可使外源基因表達(dá)。而且，本發(fā)明是按著這種常規(guī)方法來使外源基因表達(dá)的，方法是將上述本發(fā)明中的DNA片斷，在與該外源基因功能性連接的狀態(tài)下，插到該外源基因的上游，這樣來使該外源基因表達(dá)。這里所謂的本發(fā)明的片斷與其應(yīng)找出的下游基因“功能性連接”的意思是指插入本發(fā)明的DNA片斷，與不插入該DNA片斷相比，上述外源基因的表達(dá)水平增加了，并可以檢測出來。本發(fā)明中的DNA即可插到待促進(jìn)表達(dá)的外源基因的緊上游，也可以在本發(fā)明中的DNA與該外源基因之間夾雜其它序列。此序列的長度沒有特別限定，但通常為0～1000bp左右。本發(fā)明中的DNA片斷的上游雖還有啟動(dòng)子序列，但本發(fā)明的DNA片斷即可以插到啟動(dòng)子的緊下游，也可以在啟動(dòng)子和本發(fā)明的DNA之間夾雜其它序列。該序列的長度沒有特別的限定，但通常為0～1000bp左右。關(guān)鍵是由于插入本發(fā)明的DNA片斷與未插入該DNA片斷相比，對(duì)于上述外來基因的表達(dá)水平增加了，并可以檢測出來，其重組載體均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因知道已有載體的克隆部位的堿基序列，所以使用適當(dāng)?shù)南拗泼负瓦B接程序(根據(jù)需要)即可很容易將本發(fā)明的DNA片斷插到載體中。眾所周知，在該領(lǐng)域中有多種這種被發(fā)現(xiàn)的載體，而且在市場上有銷售。這些被發(fā)現(xiàn)的載體至少要包含在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、給出用于插入外源基因的限制性酶切位點(diǎn)的克隆部位以及抗藥性基因等的選擇標(biāo)記，一般包含有穩(wěn)定結(jié)束復(fù)制的終止子和SD序列(宿主為細(xì)菌時(shí))。本發(fā)明方法采用這些眾所周知的被發(fā)現(xiàn)的任何一種載體均可。實(shí)施例下面，用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步具體說明。當(dāng)然，本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。1.米糖PLD的純化純化時(shí)，請(qǐng)參考米糠PLD的純化的有關(guān)文獻(xiàn)[高野等人，日本食品工業(yè)學(xué)會(huì)志34，8-13(198)]。酶活性是以磷脂酰膽堿為底物，用膽堿氧化酶法定量測定酶反應(yīng)生成的膽堿。[Imamuraeral.，J.Blochem.83，677-680(1978)]，但是，PLD的酶反應(yīng)是在95℃的條件下進(jìn)行5分鐘的熱處理后停止。也就是將1立升己烷加到100g“輿光”(コシヒカリ)稻(Oryza，SatiVa)的米糠中，攪拌一晝夜，脫脂后加入由10g波里古拉魯AT(ボリヮラ-ル)(商品名聚乙烯吡咯烷酮、GAFChemical公司制)、500ml的1mMCaCl2、5mM2-巰基乙醇組成的10mMTris-HCl緩中液(pH7)，攪拌1小時(shí)，將酶提取出來。把提取液用8層紗布過濾，然后用15,000×g離心20分鐘，將中層做為粗提取液。將粗提取液用硫銨處理(65％飽和)、用離心分離(15,000×g，20分鐘)方法，收集生成的沉淀，將沉淀溶解后，透析到上述緩沖液中。透析后，離心，除去沉淀做為硫銨試樣(畫分)。將此硫銨試樣用緩沖液A(10mMTris-HClpH7，1mMCaCl2，1mM2-巰基乙醇)注入老化過的DEAE-纖維素[瓦特曼(ヮシトマン)公司制]的色譜柱(2.0×10cm)中。用約100ml含有50mMNaCl的緩沖液A清洗，然后用120mlNaCl線性濃度梯度為50～350mM的緩沖液A洗脫。PLD用濃度約為0.2M的NaCl進(jìn)行洗脫?；厥沾鞵LD活性的級(jí)分，做為洗脫液(DEAE-纖維素)。在洗脫液(DEAE-纖維素)中加入3M的硫銨，配成1M的硫銨溶液，用含有1M的硫銨的緩沖液A注入老化過的Phenylsepharose色譜柱[法馬西亞(フマルマシァ)公司制，2.6×10cm]中。用240ml硫銨濃度梯度為1.0～0M的緩沖液A抽提。PLD用濃度約為0.1M的硫銨抽提?；厥沾砘钚缘募?jí)分，透析到緩沖液A中，做為洗脫液(Phenylsepharose)。將洗脫液(Phenylsepharose)用緩沖液A注入老化過的Phenylsepharose色譜柱(法馬西亞(フマルマシァ)公司制，2.6×10cm)中。用240ml硫銨濃度梯度為1.0～0M的緩沖液A抽提。PLD用濃度約為0.1的硫銨抽提?；厥沾砘钚缘募?jí)分，透析到緩沖液A中，做為洗脫液(Phenylsepharose)。將洗脫液(Phenylsepharose)用緩沖液A注入老化過的MonoQ色譜柱(法馬西亞(フマルマシァ)公司制的陰離子交換柱16×10cm)，用150ml濃度梯度為50～35mM的NaCl緩沖液A洗脫。PLD用濃度為210mM～235mM的NaCl洗脫。回收代表PLD活性的級(jí)分(分畫)，將此溶液透析到緩沖液A上，做為洗脫液(MonoQlse)。將洗脫液(MonoQlst)用離心超級(jí)過濾濃縮至0.5ml，用濃度為0.1M的NaCl緩沖液A注入老化過的Superose6色譜柱[法馬西亞(フマルマシァ)公司制1.0×30cm]，用同樣的緩沖液洗脫。推測PLD的分子量為78KDa?；厥沾鞵LD活性的級(jí)分，做為洗脫液(Superose6)。洗脫液(Superose6)中加入2.5ml40％的兩性載體(Pharmacia.pH4.0-6.0)和蒸餾水至50ml，用Rotofore[巴伊屋拉多(バィオラッド)公司制]做等電點(diǎn)電泳。在2℃、12W恒定功率的條件下，電泳4個(gè)小時(shí)。PLD活性約為pH4.9。回收代表PLD活性的級(jí)分，將此溶液透析到緩沖液A中，做為等電點(diǎn)電泳試樣。把等電點(diǎn)電泳試樣用緩沖液A注入老化過的MonoQ色譜柱[法馬西亞(フマルマシァ)公司制0.5×5cm]，用線性濃度梯度為50～35mM的NaCl緩沖液A洗脫。PLD用濃度約為210mM和235mM的NaCl洗脫?；厥沾鞵LD活性的2個(gè)級(jí)分，做為洗脫液(MonoQ2nd-I、II)。通過SDS-聚丙烯酰胺(用7.5％的丙烯酰胺制得的)電泳[laemmli(1970)]來檢驗(yàn)洗脫液(MonoQ2nd-I、II)的純度。電泳后用染料考馬斯亮蘭R250將凝膠染色。發(fā)現(xiàn)洗脫液在任何情況下主帶都在分子量為82KDa的位置上；洗脫液(MonoQ2nd-II)是單一帶。通過以上純化，洗脫液(MonoQ2nd-I、II)的純化倍率分別是粗洗脫液的380倍、760倍。對(duì)2個(gè)級(jí)分進(jìn)行酶的性狀分析。其結(jié)果示于表1。用于測定最適宜pH值的緩沖液有醋酸鈉(pH4-6)，MES-NaOH(pH5.5-7.0)，Tris-HCl(pH7-9)，均為100mM。pH值的穩(wěn)定性是在25℃，各種pH值的條件下，放置30分鐘后，測定其殘留活性，看不出活性下降。溫度的穩(wěn)定性，是在4℃、25℃、37℃及50℃的各種溫度條件下，放置30分鐘后，測定其殘留活性。在底物濃度為5mM的條件下測定底物的特異性，以酶對(duì)磷脂酰膽堿的作用為100的相對(duì)活性表示。表1</tables>2.證明純化蛋白質(zhì)是PLD與檢驗(yàn)純度一樣，分別用SDS-聚丙烯酰胺電泳來分離洗脫液(MonoQ2nd-I、II)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜[Millipore公司制]上，然后染色。切下82Kda蛋白質(zhì)帶，用氨基酸序列分析儀(島津制作所.PSQ-1)來測定N末端氨基酸序列。均可分析到10個(gè)殘基，序列也相同。其序列如下所述。ValGlyLysGlyAlaThrLysValTyrSer在兩個(gè)活性試樣中看到的82KDa蛋白質(zhì)的關(guān)系雖不明確，但至少氨基酸序列等級(jí)非常相似，在制備用來制作抗體的抗原時(shí)，使用兩試樣的混合液是沒問題的。用SDS-聚丙烯酰胺(用7.5％的丙烯酰胺制得的)電泳來分離洗脫液(MonoQ2nd-I、II)的混合液，用考馬斯亮蘭染料將凝膠染色。切下82KDa的蛋白質(zhì)帶，用電洗脫(25mMTris、192mM乙氨酸、0.025％SDS、100V、10小時(shí))回收。再用電透析(15mM碳酸氫銨、200V、5小時(shí))除去SDS后，冷凍干燥。電洗脫、電透析時(shí)使用BIOTRAP(Schleicher和Schuell公司制)。把用上述方法高度純化的82KDa蛋白質(zhì)每隔7天，每次50μg給兔子進(jìn)行免疫，用免疫前及免疫3次后的血清、進(jìn)行免疫滴定實(shí)驗(yàn)。在8.6×10-3單位的PLD溶液中加入0～50μl的免疫前或免疫3次后的血清，50μl的250mMTris-HCl(pH7.0)，5μl的50mMCaCl2，50μl的0.2％TritonX-100(商品名)和水，總量為250μl，在室溫下，放置2.5個(gè)小時(shí)。加入200μl的ProteinASepharose(Pharmacia)，在室溫下緩慢振動(dòng)2小時(shí)，然后離心(500×g、5分鐘)測定上清液的酶活性。以不加血清時(shí)的酶活性為100％，加入20μl、50μl免疫前的血清，其酶活性分別為95％、88％、而加入20μl、50μl免疫3次后的血清，其酶活性分別為75％、30％。其結(jié)果證明了82KDa蛋白質(zhì)為PLD。3.內(nèi)部氨基酸序列的測定PLD蛋白質(zhì)的片斷化采用了在凝膠中電泳分離的方法[Clevelandetal，J.Biol.Chem.，252，1102(1977)]。將含有PLD蛋白質(zhì)(用與2同樣的方法提出的)的凝膠插到用肽分離制備的15％丙烯酰胺凝膠的電泳槽中，將PLD蛋白質(zhì)量的1/10的金黃色葡萄球菌V8蛋白酶(和光純藥公司制)混合后，開始電泳。溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的中央時(shí)，暫停電泳，30分鐘后再開始電泳。電泳完以后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，染色。在分子量為20、14、13、11及10KDa的位置上可以看到清晰的帶型。切除分子量為20、14及13KDa的肽片斷的帶，用氨基酸序列分析儀測定氨基酸的序列。其序列如下所示20KdaAsnTyrPheHisGlVSerAspValAsn？ValLeu？ProArgAsnProAspAsp(Asp)？？lle14KdaThr？AsnValGlnLeuPheArgSerIleAspGlyGlyAlaAlaPheGlyPheProAspThrProGluGluAlaAlaLys？GlyLeuValSerGly13KdaIleAlaMetGlyGlyTyrGlnPheTyrHisLeuAlaThrArgGlnProAlaArgGlyGlnIleHisGlyPheArgMetAlaLeu？TyrGluHisLeuGlyMetLeu？AspValPhe(其中？-表示不能確定是氨基酸的殘基()-表示很可能是其它的氨基酸的殘基。)4.稻子未成熟的種子cDNA基因文庫的制備根據(jù)SDS苯酚法，從開花5天后的未成熟的種子中萃取出所有的RNA，并用氯化鋰沉淀進(jìn)行調(diào)制。Poly(A)+RNA的調(diào)制是用Oligotex-dT30(寶酒造公司制)按制造商的說明書來進(jìn)行的。把cDNA合成系統(tǒng)プラス[阿瑪霞目(ァマシャム)公司制]、cDNA克隆系統(tǒng)λgt10[阿瑪霞目(ァマシャム)公司制]用于cDNA克隆，但要把λZAPII載體[斯托拉塔金(ストラタジ-ン)公司制]做為克隆載體使用，把XLl-Blue做為宿主細(xì)胞使用。5.探針的制備利用DNA合成裝置[阿甫拉依多巴依奧(ァプラィドバィオシステムズ)系統(tǒng)公司制]合成與PLD的氨基酸序列相應(yīng)的寡核苷酸。其序列和與這些序列相應(yīng)的氨基酸序列如下所述。20KF5′AAYTAYTTYCAYGG3′20KR15′RTCRTCRTCNGGRTT3′(其中R表示嘌呤類A或G，Y表示嘧啶類T或C，N表示G、A、T及C中任何一種)20KF是32種寡核苷酸的混合物，它包括了對(duì)在分子量為20KDa的肽中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列AsnTyrPheHisGly進(jìn)行了編碼的DNA堿基序列；20KR1是128種寡核苷酸的混合物，它包括了對(duì)在分子量為20KDa的肽中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列AsnProAspAsp(Asp)進(jìn)行了編碼的DNA堿基序列的互補(bǔ)鏈。cDNA合成反應(yīng)液總體積為10μl，參與反應(yīng)的物質(zhì)有10ngpoly(A)+RNA，0.3μg的隨機(jī)六聚體dN6、10U的RNA酶抑制劑[RNAGuard、法馬西亞(Pharmacia)公司制]、1mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、1×PCR緩沖液(寶酒造公司制)、50mM的氯化鎂以及100U的逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLVRTase，BRL公司制)。在37℃下反應(yīng)30分鐘，然后在95℃下進(jìn)行5分鐘熱處理，保持在冰上。進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)時(shí)，以上述cDNA為模板，20KF和20KR1為引物。反應(yīng)液的總?cè)莘e為50μl，參與反應(yīng)的物質(zhì)有10μlcDNA合成反應(yīng)液，50pmol各種引物的混合物，200μM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、1×PCR緩沖液(寶酒造公司制)及2.5UAmliTaqDNA聚合酶(寶酒造公司制)。按下述溫度條件反應(yīng)，反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；在DNA的PCR儀[拍金愛爾馬·喜塔斯(パ一キンェルマ一シ一タス)公司制]中，94℃下，反應(yīng)1分鐘；40℃下，反應(yīng)1分鐘；72℃下，反應(yīng)2分30秒鐘。在2％的瓊脂凝膠上將PCR產(chǎn)物分離，用溴化乙錠染色法檢測幾個(gè)片斷。其中一個(gè)的長度為94bp，與預(yù)想的大小相同。從凝膠中提出PCR片斷，在pUC19質(zhì)粒中進(jìn)行亞克隆。根據(jù)雙脫氧法(該方法使用T7sequencing成套儀器)來決定做了亞克隆的PCR片斷的DNA序列。在二個(gè)引物之間發(fā)現(xiàn)了對(duì)預(yù)測到的氨基酸的堿基序列進(jìn)行了編碼的DNA堿基序列。引物之間的DNA堿基序列和其編了碼的氨基酸如下所述。CTCTGACGTGAACTGTGTTCTATGCCCTCGCSerAspValAsnCysValLeuCysProArg使用DNA5′末端標(biāo)記的成套儀器MEGALABEL(寶酒造公司)讓同位素32P[阿瑪霞目(ァマシャム)公司制]摻入上述寡核苷酸，制成放射性寡核苷酸探針。6.含有PLD基因的克隆的篩選以上述放射性寡核苷酸為探針來篩選cDNA基因文庫。雜交溶液是0.5M的磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，7％SDS，1mMEDTA，100μg/ml鮭魚精子，將探針加到雜交溶液中，在45℃下，雜交16個(gè)小時(shí)。清洗液為0.3MNaCl、30mM檸檬酸鈉，在45℃下，清洗2次，每次20分鐘。分離陽性噬菌斑，按λZAPII克隆載體制造商給出的方法，在體外(invivo)對(duì)pBluescript質(zhì)粒[斯托拉塔金(ストラタジ一ン)公司制]進(jìn)行克隆。用雙脫氧法決定堿基序列的部位，存在有對(duì)3.中測定的內(nèi)部氨基酸地堿基序列進(jìn)行編碼的區(qū)域。7.測定5′末端區(qū)域的堿基序列6.中所寫的方法不能分離包含全長的cDNA的克隆，所以用RACE法[Edwardsetal，NucleicAcidsRes.，19，5227-5232(1991)]來制備含有5′末端區(qū)的DNA片斷。按著所附的說明5′-AmpliFINDERRACEKit[固倫鐵固(クロ一ンテッケ)公司制]，以按6.測定的cDNA的堿基序列為基礎(chǔ)，合成低聚DNA，用4中所述的方法制成的mRNA為模板，進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物克隆在PCRII載體[因畢特羅金(ィンビトロジェン)公司制]上，用雙脫氧法測定堿基序列。將這樣決定了稻子PLD的cDNA的堿基序列及堿基序列編碼，由此推測出的氨基酸序列示于序列表的序列2。譯碼推測是從示于序列表2的第182號(hào)堿基開始。其根據(jù)是36堿基上游存在終止密碼子。8.與PLDcDNA克隆相應(yīng)的PLD染色體組克隆的分離及引物區(qū)域的鑒定為了分離負(fù)責(zé)PLD基因的調(diào)節(jié)序列的染色體組DNA的克隆，要建立一個(gè)“輿光”稻的染色體文庫；該P(yáng)LD基因與在pBluescript質(zhì)粒中進(jìn)行克隆的按6.測定的PLDcDNA相對(duì)應(yīng)。將“輿光”種子發(fā)芽長出來的葉DNA用MboI進(jìn)行部分消化，通過蔗糖梯度離心分離，純化出16～20kb的大的部分，使用λDASHII[斯托拉塔金(ストラタジ一ン)公司制]、GigapackIICold[斯托拉塔金(ストラタジ一ン)公司制]來建立基因文庫。把PLDcDNA克隆做為探針來篩選染色體組文庫。按6.所述內(nèi)容進(jìn)行篩選。但在65℃下，雜交16小時(shí)，用0.5×SSC、0.1％SDS的清洗液在65℃下清洗兩次，每次20分鐘。用雙脫氧法測定雜交過的染色體組克隆的堿基序列，存在有與按6測定的cDNA序列相同的范圍。復(fù)制開始的部位用7.所述的方法測定。在復(fù)制開始的位點(diǎn)旁邊發(fā)現(xiàn)了“TATA”共有序列序列框。ATG編碼開始的部位通過測定DNA序列來判斷，則定為克隆的譯碼閱讀框內(nèi)的最上游的ATG密碼子，還有在稻子中合成的mRNA的起始存在ATG密碼子。雜交在cDNA克隆的染色體組克隆的部分DNA序列示于序列號(hào)3。在染色體組DNA中以ATG譯碼開始的密碼子開始，鑒定了與其相應(yīng)的cDNA序列重合的閱讀框。啟動(dòng)子位于ATG編碼開始密碼子的上游，從緊靠其上游開始。9.內(nèi)含子的確定以及基因表達(dá)作用的分析通過cDNA(序列號(hào)2)和染色體組(序列號(hào)3)的比較，明確了PLD的基因上有3個(gè)內(nèi)含子。之后，調(diào)查了173bp內(nèi)含子對(duì)發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞內(nèi)的基因的影響。173bp內(nèi)含子區(qū)(即序列號(hào)3中所示的堿基序列的第1666～第1838號(hào)堿基，將該序列示于序列號(hào)4)位于與mRNA的5′末端非編碼區(qū)相應(yīng)的位置上。合成每5個(gè)基數(shù)含有一個(gè)外顯子部分的15聚體的引物(5′-ACCCGGTAAGCCCAG-3′，3′-CCCCCGCGTCCATCC-5′)，以染色體克隆為模板，采用“5.探針的制作”中所述的方法來進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物亞克隆到PCRII載體上，將從這里用EcoRI酶切提出來的片斷做平末端處理；然后裝到質(zhì)粒pBI221(東洋紡公司制)的SmaI位點(diǎn)(參照?qǐng)D1)。下面，根據(jù)已經(jīng)報(bào)導(dǎo)[Shimamotoetal.Nature，338，274-276(1989)]的方法，將上述重組質(zhì)粒導(dǎo)入稻子的培養(yǎng)細(xì)胞[Babaetal.PlantCellPhysiol。27，463-471(1986)]，測定β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性。如表2所示，發(fā)現(xiàn)由于內(nèi)含子的導(dǎo)入，GUS活性增大了。如表3有所示，還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子反向進(jìn)入時(shí)，GUS活性也增大。另外，利用內(nèi)含子序列中的BgIII部位和pBI221的BamHI部位，根據(jù)用雙酶提出的片斷的長度來決定內(nèi)含子的方向。表2原生質(zhì)體的GUS活性<p>表3原生質(zhì)體的GUS活性(pmolMU/min/mg蛋白)序列表序列號(hào)1序列長度183序列類型核酸序列種類基因組DNA起源生物名稻序列ACCCGGTAAGCCCAGTGTGCTTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCT60TCTCCGCTCAGATCTGCTTGCTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTG120TCGCTGCTTCGTCTTCCTTCCTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAGGT180AGG183序列號(hào)2序列長度3040序列類型核酸序列種類cDNA到mRNA起源生物名稻序列AGTCTCTCTTCTCCCGCAATTTTATAATCTCGATCGATCCAATCTGCTCCCCTTCTTCTT60CTACTCTCCCCATCTCGGCTCTCGCCATCGCCATCCTCCTCTCCCTTCCCGGAGAAGACG120CCTCCCTCCGCCGATCACCACCCGGTAGGGCGAGGAGGGAGCCAAATCCAAATCAGCAGC180CATGGCGCAGATGCTGCTCCATGGGACGCTGCACGCCACCATCTTCGAG229MetAlaGlnMetLeuLeuHisGlyThrLeuHisAlaThrIlePheGlu151015GCGGCGTCGCTCTCCAACCCGCACCGCGCCAGCGGAAGCGCCCCCAAG277AlaAlaSerLeuSerAsnProHisArgAlaSerGlySerAlaProLys202530TTCATCCGCAAGTTTGTGGAGGGGATTGAGGACACTGTGGGTGTCGGC325PheIleArgLysPheValGluGlyIleGluAspThrValGlyValGly354045AAAGGCGCCACCAAGGTGTATTCTACCATTGATCTGGAGAAAGCTCGT373LysGlyAlaThrLysValTyrSerThrIleAspLeuGluLysAlaArg505560GTAGGGCGAACTAGGATGATAACCAATGAGCCCATCAACCCTCGCTGG421ValGlyArgThrArgMetIleThrAsnGluProIleAsnProArgTrp65707580TATGAGTCGTTCCACATCTATTGCGCTCATATGGCTTCCAATGTGATC469TyrGluSerPheHisIleTyrCysAlaHisMetAlaSerAsnValIle859095TTCACTGTCAAGATTGATAACCCTATTGGGGCAACGAATATTGGGAGG517PheThrValLysIleAspAsnProIleGlyAlaThrAsnIleGlyArg100105110GCTTACCTGGCTGTCCAAGAGCTTCTCAATGGAGAGGAGATTGACAGA565AlaTyrLeuProValGlnGluLeuLeuAsnGlyGluGluIleAspArg115120125TGGCTCGATATCTGTGATAATAACCGCGAGTCTGTTGGTGAGAGCAAG613TrpLeuAspIleCysAspAsnAsnArgGluSerValGlyGluSerLys130135140ATCCATGTGAAGCTTCAGTACTTCGATGTTTCCAAGGATCGCAATTGG661IleHisValLysLeuGlnTyrPheAspValSerLysAspArgAsnTrp145150155160GCGAGGGGTGTCCGCAGTACCAAGTATCCAGGTGTTCCTTACACCTTC709AlaArgGlyValArgSerThrLysTyrProGlyValProTyrThrPhe165170175TTCTCTCAGAGGCAAGGGTGCAAAGTTACCTTGTACCAAGATGCTCAT757PheSerGlnArgGlnGlyCysLysValThrLeuTyrGlnAspAlaHis180185190GTCCCAGACAACTTCATTCCAAAGATTCCGCTTGCCGATGGCAAGAAT805ValProAspAsnPheIleProLysIleProLeuAlaAspGlyLysAsh195200205TATGAACCCCACAGATGCTGGGAGGATATCTTTGATGCTATAAGCAAT853TyrGluProHisArgCysTrpGluAspIlePheAspAlaIleSerAsn210215220GCTCAACATTTGATTTACATCACTGGCTGGTCTGTATACACTGAGATC901AlaGlnHisLeuIleTyrIleThrGlyTrpSerValTyrThrGlulle225230235240ACCTTGGTTAGGGACTCCAATCGTCCAAAACCTGGAGGGGATGTCACC949ThrLeuValArgAspSerAsnArgProLysProGlyGlyAspValThr245250255CTTGGGGAGTTGCTCAAGAAGAAGGCCAGTGAAGGTGTTCGGGTCCTC997LeuGlyGluLeuLeuLysLysLysAlaSerGluGlyValArgValLeu260265270ATGCTTGTGTGGGATGACAGGACTTCAGTTGGTTTGCTAAAGAGGGAT1045MetLeuValTrpAspAspArgThrSerValGlyLeuLeuLysArgAsp275280285GGCTTGATGGCAACACATGATGAGGAAACTGAAAATTACTTCCATGGC1093GlyLeuMetAlaThrHisAspGluGluThrGluAsnTyrPheHisGly290295300TCTGACGTGAACTGTGTTCTATGCCCTCGCAACCCTGATGACTCAGGC1141SerAspValAsnCysValLeuCysProArgAsnProAspAspSerGly305310315320AGCATTGTTCAGGATCTGTCGATCTCAACTATGTTTACACACCATCAG1189SerIleValGlnAspLeuSerIleSerThrMetPheThrHisHisGln325330335AAGATAGTAGTTGTTGACCATGAGTTGCCAAACCAGGGCTCCCAACAA1237LysIleValValValAspHisGluLeuProAsnGlnGlySerGlnGln340345350AGGAGGATAGTCAGTTTCGTTGGTGGCCTTGATCTCTGTGATGGAAGG1285ArgArgIleValSerPheValGlyGlyLeuAspLeuCysAspGlyArg355360365TATGACACTCAGTACCATTCTTTGTTTAGGACACTCGACAGTACCCAT1333TyrAspThrGlnTyrHisSerLeuPheArgThrLeuAspSerThrHis370375380CATGATGACTTCCACCAGCCAAACTTTGCCACTGCATCAATCAAAAAG1381HisAspAspPheHisGlnProAsnPheAlaThrAlaSerIleLysLys385390395400GGTGGACCTAGAGAGCCATGGCATGATATTCACTCACGGCTGGAAGGG1429GlyGlyProArgGluProTrpHisAspIleHisSerArgLeuGluGly405410415CCAATCGCATGGGATGTTCTTTACAATTTCGAGCAGAGATGGAGAAAG1477ProIleAlaTrpAspValLeuTyrAsnPheGluGlnArgTrpArgLys420425430CAGGGTGGTAAGGATCTCCTTCTGCAGCTCAGGGATCTGTCTGACACT1525GlnGlyGlyLysAspLeuLeuLeuGlnLeuArgAspLeuSerAspThr435440445ATTATTCCACCTTCTCCTGTTATGTTTCCAGAGGACAGAGAAACATGG1573IleIleProProSerProValMetPheProGluAspArgGluThrTrp450455460AATGTTCAGCTATTTAGATCCATTGATGGTGGTGCTGCTTTTGGGTTC1621AsnValGlnLeuPheArgSerIleAspGlyGlyAlaAlaPheGlyPhe465470475480CCTGATACCCCTGAGGAGGCTGCAAAAGCTGGGCTTGTAAGCGGAAAG1669ProAspThrProGluGluAlaAlaLysAlaGlyLeuValSerGlyLys485490495GATCAAATCATTGACAGGAGCATCCAGGATGCATACATACATGCCATC1717AspGlnIleIleAspArgSerIleGlnAspAlaTyrIleHisAlaIle500505510CGGAGGGCAAAGAACTTCATCTATATAGAGAACCAATACTTCCTTGGA1765ArgArgAlaLysAsnPheIleTyrIleGluAsnGlnTyrPheLeuGly515520525AGTTCCTATGCCTGGAAACCCGAGGGCATCAAGCCTGAAGACATTGGT1813SerSerTyrAlaTrpLysProGluGlyIleLysProGluAspIleGly530535540GCCCTGCATTTGATTCCTAAGGAGCTTGCACTGAAAGTTGTCAGTAAG1861AlaLeuHisLeuIleProLysGluLeuAlaLeuLysValValSerLys545550555560ATTGAAGCCGGGGAACGGTTCACTGTTTATGTTGTGGTGCCAATGTGG1909IleGluAlaGlyGluArgPheThrValTyrValValValProMetTrp565570575CCTGAGGGTGTTCCAGAGAGTGGATCTGTTCAGGCAATCCTGGACTGG1957ProGluGlyValProGluSerGlySerValGlnAlaIleLeuAspTrp580585590CAAAGGAGAACAATGGAGATGATGTACACTGACATTACAGAGGCTCTC2005GlnArgArgThrMetGluMetMetTyrThrAspIleThrGluAlaLeu595600605CAAGCCAAGGGAATTGAAGCGAACCCCAAGGACTACCTCACTTTCTTC2053GlnAlaLysGlyIleGluAlaAsnProLysAspTyrLeuThrPhePhe610615620TGCTTGGGTAACCGTGAGGTGAAGCAGGCTGGGGAATATCAGCCTGAA2101CysLeuGlyAsnArgGluValLysGlnAlaGlyGluTyrGlnProGlu625630635640GAACAACCAGAAGCTGACACTGATTACAGCCGAGCTCAGGAAGCTAGG2149GluGlnProGluAlaAspThrAspTyrSerArgAlaGlnGluAlaArg645650655AGGTTCATGATCTATGTCCACACCAAAATGATGATAGTTGACGATGAG2197ArgPheMetIleTyrValHisThrLysMetMetIleValAspAspGlu660665670TACATCATCATCGGTTCTGCAAACATCAACCAGAGGTCGATGGACGGC2245TyrIleIleIleGlySerAlaAsnIleAsnGlnArgSerMetAspGly675680685GCTAGGGACTCTGAGATCGCCATGGGCGGGTACCAGCCATACCATCTG2293AlaArgAspSerGluIleAlaMetGlyGlyTyrGlnProTyrHisLeu690695700GCGACCAGGCAACCAGCCCGTGGCCAGATCCATGGCTTCCGGATGGCG2341AlaThrArgGlnProAlaArgGlyGlnIleHisGlyPheArgMetAla705710715720CTGTGGTACGAGCACCTGGGAATGCTGGATGATGTGTTCCAGCGCCCC2389LeuTrpTyrGluHisLeuGlyMetLeuAspAspValPheGlnArgPro725730735GAGAGCCTGGAGTGTGTGCAGAAGGTGAACAGGATCGCGGAGAAGTAC2437GluSerLeuGluCysValGlnLysValAsnArgIleAlaGluLysTyr740745750TGGGACATGTACTCCAGCGACGACCTCCAGCAGGACCTCCCTGGCCAC2485TrpAspMetTyrSerSerAspAspLeuGlnGlnAspLeuProGlyHis755760765CTCCTCAGCTACCCCATTGGCGTCGCCAGCGATGGTGTGGTGACTGAG2533LeuLeuSerTyrProIleGlyValAlaSerAspGlyValValThrGlu770775780CTGCCCGGGATGGAGTACTTTCCTGACACACGGGCCCGCGTCCTCGGC2581LeuProGlyMetGluTyrPheProAspThrArgAlaArgValLeuGly785790795800GCCAAGTCGGATTACATGCCCCCCATCCTCACCTCATAGACGAGGAAGCACT2633AlaLysSerAspTyrMetProProIleLeuThrSer805810ACACTACAATCTGCTGGCTTCTCCTGTCAGTCCTTCTGTACTTCTTCAGTTTGGTGGCGA2693GATGGTATGGCCGTTGTTCAGAATTTCTTCAGAATAGCAGTTGTTACAGTTGTGAATCAT2753AAAGTAATAAGTGCAGTATCTGTGCATGGTTGAGTTGGGAAGAAGATCGGGGATGCAATG2813ATGCTTGTGAAGTTGTGATGCCGTTTGTAAGATGGGAAGTTGGGAACTACTAAGTAATTG2873GCATGATTGTACTTTGCACTACTGTTTAGCGTTGTTGATACTGGTTAACCGTGTGTTCAT2933CTGAACTTGATTCTTGATGCAGTTTGTGGCATTACCAGTTTATCATCGTTCTTCAGGAAA2993AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3040序列號(hào)3序列長度2799序列類型核酸序列種類基因組DNA起源生物名稻序列CAAGGGTGTACATAGATTTGTCTCGTAAAATAGTATTATAATATTATAAACTTATTACTC60TATCCGTTCTAAAATATAAGAACCTTATGACTGGATGGAACATTTCCTAGTACTACGAAT120CTGAACACATGTCTAGATTCATAGTACTAGGAAATGTCTCATCGCGGTACTAGGTTCTTA180TATTTTAGGATGGAGGGAGTTTAATATAAAACTAATGGTTAGAACTTTGAAAGTTTGATT240TTAAATGTCAAATATTTATGGCTGGAGGTAGTATAATATGTTTTTTTTGGGACGTAGACT300AGGTAGTATAATATGTTTGGTTGTGTTTAGATCCAATATTTGGATCCAAACTTCAGTCAT360TTTCCATCACATCAACTTGTCATATACACATAACTTTTCAGTCACATCATCCCCAATTTC420AACCAAAATCAAACTTTGCGCTGAACTAAACACAACCTTTGGGCCCGTTTAGTTCCCCAA480TTTTTTTCCCAAAAACATCACATCGAATCTTTGGACACATGCATGAAGCATTAAATATAG540ATAAAAAGAAAAACTAATTGCACAGTTATGGAGGAAATCGCGAGACGAATCTTTTAAGCC600TAATTAGTCCGTGATTAGCCATAAGTGCTACAGTAACCCAATTGTGCTAATGACGGCTTA660ATTAGTCTCCACAAGATTCGTCTCGCAGTTTCCAGGCGAGTTCTGAAATTAGTTTTTTCA720TTCGTGTCCGAAAACCCCTTCCGACATCCGGTCAAACGTTCGATATGACACCCACAAATT780TTCTTTTCCCCAACTAAACACACCCTTTATCTCTTACCCTCTGGCTCTTTCAGTAGGCAT840ATCCAAGACAGCTGGTAATGCAGGCTCGGACATAATTTGACAGTTACGTTCATGTGACCG900ACGGTTGATGCTAGTGCAACTGCAACATACTGTTCAGATGGATGTCCCAACGAGCTCAAA960ACAACTTAGGTGGCGCGTCGCGATTCATCAATAACTCAAATGGAAGCGCAAGTGCACGTA1020CGAAAATGACAGCGAGTGAGGTGGCGAGCCTCACCTTGGTGATCCCAACCGGATAAGCTA1080TGCATCAGCCAGTTTCGTGGGGCTGCACATTTCGTCGAACACCTGGAGTCCACGCCGCCG1140GCGACGTCGGCACAGCGCGCCCGCCCACCGCCCACGCACGCGCTTGACTCCACCCATGTT1200CTCCCTTCTCGACGCCCGCGAAGCCAGCGAACCGATCCGAGGAAGTCAAGCCCCCACCGC1260CACTTGGACCGACCTCGGGACGACGACGCCCCCGCGCTCTTCTAGACGCGCGGACGACGC1320GGGCGCTGGCTCCGCGACGCGACGTCGCGGTCATGGAGTAACCGCGACGGACAGATACTT1380CTACCCGTTTTTAACCTCGCCTCCTCCTCCTCCCGGCTCGAGATCCGTGGCCACGACGCG1440TGGTGGGAAACCGGGAACGACGTGCACGCACGCACACAGGGCAAGTTTCAGTAGAAAAAT1500CGCCGGCATCCAGATCGGGACAGTCTCTCTTCTCCCGCAATTTTATAATCTCGCTCGATC1560CAATCTGCTCCCCTTCTTCTTCTACTCTCCCCATCTCGGCTCTCGCCATCGCCATCCTCC1620TCTCCCTTCCCGGAGAAGACGCCTCCCTCCGCCGATCACCACCCGGTAAGCCCAGTGTGC1680TTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCTTCTCCGCTCAGATCTGCTTG1740CTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTGTCGCTGCTTCGTCTTCCTTC1800CTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAGGTAGGGCGAGGAGGGAGCCAAA1860TCCAAATCAGCAGCCATGGCGCAGATGCTGCTCCATGGGACGCTGCACGCC1911MetAlaGlnMetLeuLeuHisGlyThrLeuHisAla1510ACCATCTTCGAGGCGGCGTCGCTCTCCAACCCGCACCGCGCCAGCGGA1959ThrIlePheGluAlaAlaSerLeuSerAsnProHisArgAlaSerGly152025AGCGCCCCCAAGTTCATCCGCAAGGTTCGGACCCTTCTCCTTAATCTACTCGTC2013SerAlaProLysPheIleArgLys3035TTTGCTCTTGCTCTTTTTCTTTTGTGTCCCTTTCTTGTGTGTGCGTTTGCATGAGCCCGA2073ATTTGATCTGCTAGTGCACAGTACAGTCAGATACACTGAAACGATCTGGAAATTCTGGAT2133TATTAGGAAAAATAAAGAGGTAGTAGACAAGAATTGGAGATACTTTCTATCAAGATTGGT2193CTATTATGCTTGGCCATTTCTTGTTTGACCCAAGTACTTCTTTGAATCTAGAGTTTGCTG2253TGTGTGATGTGGTGTGTGTTTGTGTCACCAAAAATCTTCATTAGCTAAAACTGAAATTTT2313ATTTATTAACTGACCTACTAAAAATGTAGAGTTCTCTGTGTGTGATGTGTGCTTGTGTCA2373CCAAAAATCTTGATTTGATAGAGTTTTTATTTATTTATTAACTGACCTACTACAAATCTA2433TTGCTGTATGCTATGTGTGTCTGTATCACCTGAAATGCAATGTCTTCTTCTTTGTTGTTC2493TTGATCTAACACGTGAGCTCATGTCAACAGTTTGTGGAGGGGATTGAGGACACT2547PheValGluGlyIleGluAspThr40GTGGGTGTCGGCAAAGGCGCCACCAAGGTGTATTCTACCATTGATCTG2595ValGlyValGlyLysGlyAlaThrLysValTyrSerThrIleAspLeu45505560GAGAAAGCTCGTGTAGGGCGAACTAGGATGATAACCAATGAGCCCATC2643GluLysAlaArgValGlyArgThrArgMetIleThrAsnGluProIle657075AACCCTCGCTGGTATGAGTCGTTCCACATCTATTGCGCTCATATGGCT2691AsnProArgTrpTyrGluSerPheHisIleTyrCysAlaHisMetAla808590TCCAATGTGATCTTCACTGTCAAGATTGATAACCCTATTGGGGCAACG2739SerAsnValIlePheThrValLysIleAspAsnProIleGlyAlaThr95100105AATATTGGGAGGGCTTACCTGCCTGTCCAAGAGCTTCTCAATGGAGAG2787AsnIleGlyArgAlaTyrLeuProValGlnGluLeuLeuAsnGlyGlu110115120GAGATTGACAGA2799GluIleAspArg125序列號(hào)4序列長度173序列類型核酸序列種類基因組DNA起源生物名稻序列GTAAGCCCAGTGTGCTTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCTTCTCC60GCTCAGATCTGCTTGCTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTGTCGCT120GCTTCGTCTTCCTTCCTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAG17權(quán)利要求1.具有序列表中序列號(hào)1中所示的堿基序列的DNA片段以及對(duì)在該堿基序列中增加、插入、缺失或置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸后而且對(duì)其下游的基因的表達(dá)有促進(jìn)作用的分離的DNA片段。2.權(quán)利要求1所述的具有序列表中序列號(hào)1所示的堿基序列的DNA片段。3.權(quán)利要求1的具有序列表中序列號(hào)1所示的堿基序列的分離的DNA片段以及對(duì)該堿基序列增加、插入、缺失或置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸后并且對(duì)其下游的基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用的DNA片段。4.權(quán)利要求3中所述的具有序列表中序列號(hào)4所示的堿基序列的DNA片段。5.包含權(quán)利要求1中所述的DNA片段和在其下游功能性連結(jié)的待表達(dá)的外源基因的重組載體。6.權(quán)利要求5中所述的包含前述的具有序列表中序列號(hào)1中所示的堿基序列的DNA片段的重組載體。7.權(quán)利要求5中所述的包含前述的具有序列表中序列號(hào)4中所示的堿基序列的DNA片段的重組載體。8.將權(quán)利要求3中所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而表達(dá)上述外源基因的外源基因的表達(dá)方法。9.權(quán)利要求8的方法，其中包含前述的具有序列表中序列號(hào)1中所示的DNA片段。10.權(quán)利要求9的方法，其中之DNA為前述的具有序列表中1序列號(hào)4中所示的DNA片段。全文摘要本文公開了可大大促進(jìn)外源基因表達(dá)的新DNA，它與已知的可促進(jìn)外源基因表達(dá)的DNA序列不同。本發(fā)明提供了具有序列表中序列號(hào)1所示的堿基序列的分離出來的DNA片斷；而且在該DNA堿基序列中，擴(kuò)增、插入、缺失或置換一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸，都對(duì)其下游基因的表達(dá)有促進(jìn)作用。文檔編號(hào)C12N9/16GK1154141SQ96190520公開日1997年7月9日申請(qǐng)日期1996年3月28日優(yōu)先權(quán)日1995年3月29日發(fā)明者森岡真二,植木潤申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社