專利名稱：：對(duì)甲基苯丙胺具有特異性之單克隆抗體,產(chǎn)生該抗體之雜交瘤,含此單克隆抗體之試劑盒...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種特異于甲基苯丙胺(methamphetamine，甲基安非他命)的單克隆抗體，產(chǎn)生該抗體的雜交瘤，含此單克隆抗體之試劑盒，以及利用此抗體、雜交瘤(hybridoma)及試劑盒檢測(cè)甲基苯丙胺濫用之用途。苯丙胺(安非他命)藥物是一群合成的麻黃素類衍生物之總稱。由于其構(gòu)造上與神經(jīng)傳送物質(zhì)(如多巴胺及腎上腺素等)非常類似，屬中樞神經(jīng)興奮劑，可刺激中樞及周邊交感神經(jīng)之α及β受體，表現(xiàn)出神經(jīng)及心臟血管系統(tǒng)之亢奮作用。其中最常見的為(+)-及(-)-苯丙胺，及(+)-及(-)-甲基苯丙胺。在美國(-)-甲基苯丙胺(VicksInhaler)即用于鼻充血、鼻塞之吸入治療劑(J.Anal.Tox.17284，1993)，并應(yīng)用于治療昏睡癥病人、過動(dòng)孩童及減肥用藥。因此藥具有提神、減低食欲、產(chǎn)生欣快感等作用，故濫用情形日漸嚴(yán)重。久用此藥后，會(huì)造成此藥物之成癮性及耐藥性。長期濫用會(huì)影響情緒、思考，中毒深者導(dǎo)致苯丙胺分裂癥，產(chǎn)生暴力行為，危及社會(huì)治安。依據(jù)本地衛(wèi)生署及法務(wù)部調(diào)查局調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，自1990年以來臺(tái)灣地區(qū)查獲及送檢的毒品數(shù)量已暴增40至50倍。毒品迅速蔓延及吸毒人口的迅速增加已成為當(dāng)前社會(huì)治安的最大隱患，而本地吸食者又以苯丙胺類之甲基苯丙胺(中華醫(yī)志48305-9，1991)及海洛因占最大部分(94％)(藥物食品簡訊158期1993年10月20日)。甲基苯丙胺，在正常情況下，有43％以原形在24小時(shí)內(nèi)由尿中排出，僅有4-7％以苯丙胺形態(tài)排出，而約有15％以對(duì)-羥甲基苯丙胺及其他形態(tài)排出。因此，檢驗(yàn)?zāi)蛞褐屑谆奖芳按x物之含量，便可反應(yīng)有無吸收甲基苯丙胺。有鑒于日漸增加之藥物濫用問題，故有擴(kuò)大施行全面濫用藥物篩檢的必要。濫用藥物檢查主要包括兩大步驟初步的篩檢及進(jìn)一步的確認(rèn)(DrugsofAbuseTestingMarket，ThetaCorp.1991)。初步篩檢需具有高敏感度，使用方便，并適合處理大量樣品的特性。經(jīng)篩選測(cè)試呈陽性樣品，再經(jīng)具有高特異性及精確性的方法，如氣相層析/質(zhì)譜儀(J.Anal.Tox.16109，1992)或氣相層析/付立葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜儀(J.Anal.Tox.17359，1993)，加以確認(rèn)。目前市售用來篩檢苯丙胺藥物濫用的分析方法包括薄層層析(TLC)，高壓液相層析(HPLC)及免疫分析(Immunoassay)。其中又以利用多株或單克隆抗體發(fā)展出的免疫試劑較佳，除具高特異及敏感度外，使用方便，反應(yīng)快速，且樣品不需前處理，非常便于進(jìn)行大量檢體的篩選之用。惟目前所使用的免疫試劑盒皆采整組進(jìn)口，成本昂貴，同時(shí)品質(zhì)上常會(huì)受到麻黃素及苯基丙醇胺(phenylpropanolamine)干擾，而產(chǎn)生偽陽性(藥物食品簡訊158期1993年10月)。為了要降低檢驗(yàn)成本及提升試劑品質(zhì)，發(fā)明人乃自行開發(fā)對(duì)(+)-甲基苯丙胺具高特異性及敏感性之單克隆抗體，并自行配組完成檢驗(yàn)試劑。本發(fā)明之一目的為提供一種對(duì)甲基苯丙胺具特異性之單克隆抗體。本發(fā)明之另一目的為提供一種分泌該單克隆抗體之雜交瘤。本發(fā)明尚有另一目的為提供一種包括該單克隆抗體以檢測(cè)甲基苯丙胺濫用之試劑盒。本發(fā)明更有另一目的為提供一種利用該單克隆抗體、雜交瘤及試劑盒以檢測(cè)甲基苯丙胺濫用之用途。本發(fā)明之目的、優(yōu)點(diǎn)及特征可由下列之說明而更為明了。附圖之簡單說明如下圖1為甲基苯丙胺直接競爭型ELISA之標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。圖2為甲基苯丙胺簡易層析免疫測(cè)試片于不同濃度甲基苯丙胺之測(cè)試結(jié)果。本發(fā)明包括對(duì)甲基苯丙胺具特異性之雜交瘤細(xì)胞株，及其產(chǎn)生的抗體與抗體片段。本發(fā)明亦包括應(yīng)用此抗體配制出之試劑盒，直接競爭型酵素免疫分析試劑盒及簡易層析式免疫分析試劑盒。本發(fā)明另包括利用此抗體及試劑盒檢測(cè)甲基苯丙胺濫用之方法。本發(fā)明是利用已知技術(shù)，以B細(xì)胞融合方式制得對(duì)甲基苯丙胺具特異性的B細(xì)胞雜交瘤。其方法為利用已知之細(xì)胞融合劑，如聚乙二醇(PEG)，將鼠源骨髓瘤細(xì)胞株與產(chǎn)生對(duì)抗甲基苯丙胺抗體的B淋巴細(xì)胞融合，以HAT篩選雜交瘤細(xì)胞株，再用間接酵素結(jié)合免疫吸附分析法(ELISA)及競爭型ELISA分析雜交瘤培養(yǎng)基液中抗體之專一性，再選取對(duì)甲基苯丙胺具特異性之單克隆雜交瘤細(xì)胞株。然后將該雜交瘤細(xì)胞株注入小白鼠腹腔中以產(chǎn)生腹水，利用蛋白質(zhì)純化技術(shù)將單克隆抗體由腹水中回收。然后利用該單克隆抗體配制發(fā)展出直接競爭型酵素免疫分析試劑盒(DirectCompetativeELISAKit)及簡易層析式免疫分析檢驗(yàn)片(OneStepChromatographicDipStick)，以檢測(cè)尿甲基苯丙胺。免疫分析的特異性及敏感性取決于抗體的特性，而是否能產(chǎn)生特異性抗體，免疫原的設(shè)計(jì)及制備關(guān)鍵至極。尤其是分子量小于1000道耳頓的藥物如甲基苯丙胺，由于其分子量小，在免疫原上屬于半抗原，即單獨(dú)存在時(shí)不會(huì)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)上，為了要產(chǎn)生對(duì)抗小分子半抗原的免疫反應(yīng)，一般需將小分子半抗原物質(zhì)與大分子量具免疫原性的載體蛋白質(zhì)結(jié)合，借助載體的免疫原性協(xié)助半抗原產(chǎn)生免疫力。故小分子半抗原與載體結(jié)合物的設(shè)計(jì)、結(jié)合及制備法等均會(huì)影響抗體的品質(zhì)及特異性。美國專利5,026,827使用N-(4-胺丁基)苯丙胺與蛋白質(zhì)之結(jié)合物產(chǎn)生能與甲基苯丙胺結(jié)合的抗體。美國專利5,135,863應(yīng)用烷氧基硫醇烷酰胺-苯丙胺/甲基苯丙胺制作抗體及酵素結(jié)合物以檢測(cè)苯丙胺及甲基苯丙胺之存在。Kuroiwa等利用對(duì)-及鄰-胺基甲基苯丙胺-BSA當(dāng)作免疫原以制備抗甲基苯丙胺的單克隆抗體(ForensicScienceInternational44245-255,1990；J.ofImmunoassay12(2)277-292.(1991))。由于所應(yīng)用的甲基苯丙胺衍生物具差異性，故所產(chǎn)生抗體的特異性均不相同。本發(fā)明利用甲基苯丙胺衍生物與載體蛋白質(zhì)之結(jié)合物當(dāng)作免疫原以制備抗甲基苯丙胺之單克隆抗體。甲基苯丙胺衍生物具有下通式其中n為1-4；R1為C1-4烷基，未經(jīng)取代或經(jīng)鹵素取代；C1-4烷氧基；-OCH2Ph；或-OC(C1-4烷基)3；R2為＝O，＝S或-H；R3及R4各自為-H，C1-4烷基或二(C1-4烷基)；R5及R6各自為-H，或R5及R6一起表-(CH2)4-；舉例而言，R1可為-CF3，-CCl3，-CH3，-OCH3，-OC2H5，-OCH2Ph或-OC(CH3)3；R3及R4可為-H，-CH3或-(CH3)2。載體蛋白質(zhì)可使用例如白蛋白、球蛋白、血藍(lán)質(zhì)、鐵蛋白質(zhì)等等。在本發(fā)明之一具體實(shí)施例中，是應(yīng)用N-三氟-甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-N-羥基琥珀酸二酰亞胺酯與牛血清白蛋白之結(jié)合物當(dāng)作免疫原，所產(chǎn)生單克隆抗體的特異性詳如下列實(shí)例所述。利用本發(fā)明抗體研制出的ELISA試劑盒與GC/MS的相關(guān)性較市售MicrozymeTM(ImmunotechCorp，U.S.A)佳，表示本發(fā)明之抗體較先前技術(shù)已有的抗甲基苯丙胺的抗體具顯著的進(jìn)步性。直接競爭型免疫分析法是將抗甲基苯丙胺的單克隆抗體粘附在固相支持物之表面。測(cè)試時(shí)，不同標(biāo)準(zhǔn)濃度之甲基苯丙胺或待測(cè)樣品，與已連接有訊號(hào)(如酶，螢光劑，放射元素等)的甲基苯丙胺復(fù)合物，一起置入反應(yīng)。由于甲基苯丙胺會(huì)與甲基苯丙胺-訊號(hào)復(fù)合物相互競爭有限的抗甲基苯丙胺抗體，故藉已知標(biāo)準(zhǔn)濃度的甲基苯丙胺所產(chǎn)生訊號(hào)強(qiáng)弱所建立之一條甲基苯丙胺抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可檢測(cè)待測(cè)尿液樣品中的甲基苯丙胺是否存在及其含量。直接競爭型免疫分析試劑盒包括(1)固相支持物，(2)抗甲基苯丙胺單克隆抗體，(3)甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)品，(4)甲基苯丙胺-訊號(hào)復(fù)合物，及(5)呈色物質(zhì)。固相支持物可為微滴盤(microtiterplate)、微球體(beads)及紙(paper)，是由適宜蛋白質(zhì)固定的材料構(gòu)成，適用之材料可為例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、硝化纖維、耐龍等。訊號(hào)可使用例如螢光物，如鑭系螢光物；冷光標(biāo)記物(luminescents)，如生物冷光標(biāo)記物及化學(xué)冷光標(biāo)記物；放射性元素；及酵素，如過氧化氫酶、堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶等。該分析方法及反應(yīng)條件是利用已知技術(shù)(AntibodyALaboratoryManual，Ed.Harlow&DayidLane，1988)。簡易層析式免疫檢驗(yàn)法是利用抗原與抗體之特異性結(jié)合并配合色層分析法所發(fā)展出來的一種簡便、快速、肉眼即可判讀結(jié)果之免疫檢驗(yàn)法，適用于個(gè)人，不需特殊經(jīng)驗(yàn)即可操作使用。簡易層析式免疫分析檢驗(yàn)片包括(1)樣品接觸區(qū)，(2)抗甲基苯丙胺-指示劑區(qū)，(3)反應(yīng)測(cè)試區(qū)，及(4)液體回收區(qū)。該檢驗(yàn)片是由可提供毛細(xì)現(xiàn)象并吸附液體之材質(zhì)之多孔性載體物質(zhì)所構(gòu)成，例如濾紙、硝化纖維膜、耐龍膜、玻璃纖維膜等。指示劑可使用例如有顏色乳膠顆粒(coloredlatexparticles)，例如聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯甲苯(polyvinyltoluene)、聚苯乙烯-丙烯酸(polystyrene-acrylicacid)及聚丙烯醛(polyacrolein)等材料的聚合物；金屬膠質(zhì)溶液(metalliccolloidalsol)，例如金膠質(zhì)溶液(goldsol)；非金屬膠溶液(nonmetallicsol)，例如硅膠溶液(colloidalsilicaparticles)，及染料膠質(zhì)溶液(dyesol)，該等原料皆是商業(yè)化之產(chǎn)品。樣品接觸區(qū)位于檢驗(yàn)片之一端，與待測(cè)樣品相接觸，將吸附之樣品依毛細(xì)現(xiàn)象向另一端移動(dòng)，以致濕透整個(gè)檢驗(yàn)片。指示劑區(qū)接近樣品接觸區(qū)，該區(qū)以干燥形式聚集有抗甲基苯丙胺的單克隆抗體與具高穩(wěn)定性、不需特殊儀器、用肉眼即可判讀的指示劑的結(jié)合物。測(cè)試區(qū)位于指示劑區(qū)之上方，該區(qū)固定有顏色反應(yīng)物，如甲基苯丙胺-載體抗原結(jié)合物，可與抗甲基苯丙胺抗體-指示劑發(fā)生反應(yīng)，而顯現(xiàn)出一肉眼判讀之訊號(hào)變化。該載體抗原可為例如白蛋白、球蛋白、血藍(lán)質(zhì)、鐵蛋白質(zhì)等。反應(yīng)測(cè)試時(shí)，將檢驗(yàn)片之樣品接觸區(qū)端與已知標(biāo)準(zhǔn)濃度之甲基苯丙胺尿液及待測(cè)樣品相接觸。尿液依毛細(xì)現(xiàn)象向上浸濕，并回溶抗體-指示劑結(jié)合物。若尿液中含有甲基苯丙胺，則會(huì)與測(cè)試區(qū)上的甲基苯丙胺-載體抗原相互競爭有限的抗甲基苯丙胺-指示劑結(jié)合物，故樣品中甲基苯丙胺含量愈高，測(cè)試區(qū)陽性訊號(hào)愈弱。由測(cè)試區(qū)反應(yīng)之有無及強(qiáng)弱，可判定尿液中是否含有甲基苯丙胺及其含量。為了使本發(fā)明的目的、方法、特征及原理更清楚明了，茲以下列實(shí)例配合附圖作詳細(xì)敘述，但此等實(shí)便并不對(duì)本發(fā)明范圍作任何局限。本說明書中之英文簡寫名詞系如下定義HAT次黃嘌呤(Hypoxanthine)/胺基蝶呤(Aminopterin)/胸腺核苷Tg牛甲狀腺球蛋白FCS胎牛血清DMSO二甲亞砜PBS磷酸鹽緩沖溶液TMB四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzydine)BSA牛血清白蛋白實(shí)施例1雜交瘤(2602-16.2)的制備(+)-甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-牛血清白蛋白之制備方法取14mgN-三氟-甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-N-羥基琥珀酸二酰亞胺酯溶于2.8mlDMSO中。取2.55ml溶液加入20ml牛血清白蛋白(100mg/0.5M碳酸鈉溶液)中，于冰浴中攪拌反應(yīng)。隔夜后，反應(yīng)物用0.1MpH11的碳酸鈉溶液充分透析后，再置換于pH7.4的磷酸緩沖液中，凍晶保存。取(+)-甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-牛血清白蛋白之結(jié)合物(MA-BSA)(MA/BBSA之摩爾比為2.6)與Freunds佐劑(第一次免疫用完全佐劑，之后用不完全佐劑)之1∶1(v/v)乳化液經(jīng)皮下注射入BALB/C小鼠(每只使用125μgBSA)，一周一次，連續(xù)4次。然后再每四周補(bǔ)強(qiáng)一次(每只40μg)，共進(jìn)行5次。進(jìn)行細(xì)胞融合的前三天，再用靜脈注射(不含佐劑)追加一次。三天后，將脾臟細(xì)胞與鼠源骨髓瘤細(xì)胞FO細(xì)胞株(ATCCCRL1646)，用50％之聚乙二醇-400(PEG400)，以1∶3比例，進(jìn)行融合。融合后，將細(xì)胞懸浮于RPMI培養(yǎng)基(HAT，20％FCS)中，稀釋成1×105FO細(xì)胞，種入96孔培養(yǎng)基中(0.2ml/孔)。10天后，以吸附有(+)-MA-牛甲狀腺蛋白結(jié)合物(MA-Tg)(MA/Tg之摩爾比為5.8)之ELISA盤測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)上清液。選取與(+)-甲基苯丙胺(MA)具特異性的雜交瘤，以限制稀釋法予以單克隆化。用此方法選出單克隆細(xì)胞之雜交瘤2602-16.2，測(cè)其分泌的單克隆抗體，知其為IgG2m，Kappa輕鍵，其等電點(diǎn)為6.7-7.0。此株雜交瘤(于含10％DMSO及90％FCS中)可以儲(chǔ)存于-70℃及液態(tài)氮中，及使用標(biāo)準(zhǔn)之哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(含10％胎牛血清之RPMI1640補(bǔ)充以200mM谷胺酰胺及5μM2-琉基乙醇)予以培養(yǎng)。此株雜交瘤已于1994年7月13日寄存于食品工藝發(fā)展研究所之菌種保存及研究中心，經(jīng)編號(hào)為960003。實(shí)施例2檢測(cè)甲基苯丙胺濫用的直接競爭ELISA法抗體附著盤的制作方法將2602-16.2單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液(pH＝9.6)稀釋成2.5μg/ml。取200微升，附著于96孔聚苯乙烯微孔盤之每孔表面上，于4℃過夜培養(yǎng)。用0.05％Tween20-PBS沖洗4次，然后拍干。每一微孔中加250μl的0.1％脫脂奶粉-PBS，于37℃阻斷30分鐘。用0.05％Tween20-PBS洗三次，拍干后備用。甲基苯丙胺-過氧化氫酵素結(jié)合物之制備方法先將過氧化氫酵素(5mg/ml)于pH＝4.5，50mM醋酸鈉中，用10mM之過碘酸鈉于室溫下氧化30分鐘。然后用50mM醋酸鈉溶液透析除去過碘酸鈉。然后加入15μl的N-三氟甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-聯(lián)氨。于室溫反應(yīng)1小時(shí)后，再用pH11.5之0.5M碳酸鈉溶液調(diào)反應(yīng)物之pH至9.5。然后再加入20mM硼氫化鈉，于4℃過夜還原。將反應(yīng)物用0.1M碳酸鈉(pH＝11)透析2小時(shí)。再將緩沖液置換成0.1MpH＝8.0的醋酸鈉，分裝儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆谩y(cè)試時(shí)，分別取50μl配制于陰性尿液中的(+)-甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)品(0，50，100，200，300，500，750及1000ng/ml)及表二及表三所列藥物(濃度詳見表二及表三)，加入附著有抗體2602-16.2的微孔中，再加入150μl甲基苯丙胺-過氧化氫酵素結(jié)合體(稀釋4200倍)。混合后，置于室溫下反應(yīng)10分鐘。然后將反應(yīng)液丟棄，以0.05％Tween20-PBS充滿，然后丟棄。重復(fù)洗5次后，加入100μl過氧化氫酵素受質(zhì)TMB，于室溫下反應(yīng)10分鐘后，加入50μl的2NHCl以中止反應(yīng)。測(cè)定OD450/650值。表一為(+)-甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光值，及6個(gè)重復(fù)測(cè)試的變異系數(shù)(coefficientofvariation，cv)及抑制百分比。可知每一濃度的cv均小于10％。抑制百分比代表抗體對(duì)特定物質(zhì)的相對(duì)敏感度，其計(jì)算方法為(1-OD測(cè)試/ODOMA)，其中ODOMA為不含MA的陰性控制液的OD，而OD測(cè)試為含有不同濃度的MA或其他非MA藥物(詳見表二及表三)的OD。圖1為使用本發(fā)明直接競爭ELISA，(+)-MA所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(γ＝0.993)。如用不含MA陰性對(duì)照組變異系數(shù)10％的2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差＞20％代表明顯差異的話，則MA直接競爭免疫試劑盒的敏感度可達(dá)50ng/ml。表二所列的94種非(+)-甲基苯丙胺的藥物，于100μg/ml測(cè)試時(shí)均不會(huì)產(chǎn)生＞20％抑制。添加不同濃度表三所列藥物時(shí)，由所測(cè)得的濃度計(jì)算交叉反應(yīng)百分比，發(fā)現(xiàn)除(+)甲基苯丙胺外，2602-16.2單克隆抗體亦可檢測(cè)到甲基安非的代謝物對(duì)-羥甲基苯丙胺及會(huì)產(chǎn)生幻覺的苯丙胺類似物3，4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺(J.Anal.Tox.14146-150，1990)。(+)-偽麻黃素會(huì)產(chǎn)生平均36％的交叉反應(yīng)性。對(duì)二苯安明、苯乙肼(phenelzine)及糠硝烯二胺(Ranitidine)的交叉反應(yīng)率均小于1％。由于過碘酸鈉會(huì)將氫胺類(hydroamine)藥(如麻黃素及偽麻黃素)分解成小片斷(J.Anal.Tox.17125-126，1993)，故本發(fā)明乃設(shè)計(jì)將過碘酸鈉(125mM)附著于96微孔盤中干燥，然后做疑含(+)偽麻黃素引起陽性尿液的前處理用。表四為尿液中含有不同濃度的(+)偽麻黃素或(+)甲基苯丙胺于室溫下反應(yīng)10分鐘后的效果。此處理可有效降低(+)偽麻黃素的干擾，將交叉反應(yīng)性由原36％降至平均5％。同時(shí)，此處理不影響(+)-甲基苯丙胺抑制曲線。利用本發(fā)明的直接競爭ELISA試劑盒測(cè)試213個(gè)樣品，其中80個(gè)氣相層析/質(zhì)譜儀確認(rèn)為陽性，3個(gè)確認(rèn)為陰性，及130個(gè)為一般尿液。若ELISA用≥300ng/ml判為陽性，則本試劑與氣相層析/質(zhì)譜儀所得結(jié)果的符合率、敏感性及特異性均高，其結(jié)果詳見表五。為了證明本發(fā)明的進(jìn)步性，利用市售MicrozymeTM甲基苯丙胺/苯丙胺酵素免疫分析(ImmunotechCorp.，U.S.A)。測(cè)試106個(gè)樣品，其中52個(gè)氣相層析/質(zhì)譜儀確認(rèn)為陽性，3個(gè)確認(rèn)為陽性，及51個(gè)為一般尿液。若依試劑規(guī)定≥300ng/ml判為陽性，則此市售ELISA試劑與氣相層析/質(zhì)議依所得結(jié)果如表六所示。結(jié)果可知，利用本發(fā)明的單克隆抗體研制出的連接酶檢驗(yàn)試劑的符合率，Kappa及特異性均有顯著的進(jìn)步性。表一、甲基苯丙胺各種濃度標(biāo)準(zhǔn)品之吸光值及六次重復(fù)測(cè)試之變異系數(shù)及抑制百分比</tables>表二、抑制百分比小于20％之藥物(100μg/ml)</tables></tables>表三、具交叉反應(yīng)性之非(+)甲基苯丙胺藥物</tables></tables>表四、過碘酸鈉對(duì)(+)甲基苯丙胺及(+)偽麻黃素之影響</tables></tables>表五、(+)甲基苯丙胺直接競爭ELISA與氣相層析/質(zhì)譜樣品比對(duì)結(jié)果。無NaIO4有NaIO4GC/MS(+)7980ELISA(+)GC/MS(-)129131ELISA(-)GC/MS(+)**10ELISA(-)GC/MS(-)***42ELISA(+)總共213213符合率0.9760.99Kappa0.950.98敏感性0.991.00特異性0.970.985*ELICA(+)＞300ng/ml(+)甲基苯丙胺GC/MS(+)＞50ng/ml甲基苯丙胺及苯丙胺**使用ELISA之三個(gè)個(gè)別實(shí)驗(yàn)之平均(+)苯丙胺之濃度為277ng/ml***4個(gè)樣品中有1個(gè)樣品經(jīng)GC/MS證實(shí)為陰性。Kappa機(jī)率校正的比例符合率(Chance-correctedProportionalAgreement)(PracticalStatisticsforMedicalResarch，DouglasG.，Altman&Chapman&Hall.1991，p.403)敏感性(能正確判定為陽性的百分比)特異性(能正確判定為陰性的百分比)真正的陰性數(shù)+假陽性數(shù)表六、市售MicrozymeTM酵素免疫分析法與氣相層析/質(zhì)譜樣品對(duì)比結(jié)果*GC/MS(+)52ELISA(+)GC/MS(-)48ELISA(-)GC/MS(+)0ELISA(-)GC/MS(-)**6ELISA(+)總共106符合率0.943Kappa0.886敏感性1.0特異性0.889*ELISA(+)＞300ng/ml(+)甲基苯丙胺及苯丙胺GC/MS(+)＞50ng/ml甲基苯丙胺及苯丙胺**6個(gè)樣品中有3個(gè)樣品經(jīng)GC/MS證實(shí)為陰性。實(shí)施例3檢測(cè)甲基苯丙胺濫用的簡易層析式免疫分析法抗甲基苯丙胺(2602-16.2)-藍(lán)色乳膠結(jié)合體的制備方法于1.5ml的小離心管中，逐步加入200μg混合均勻的藍(lán)色乳膠(羧基修飾的聚苯乙烯，10％solid，0.284μM，Seradyn，U.S.A)，650μl硼酸鹽緩液(50mM，pH＝8.5)，1mg2602-16.2抗體，再加水至1ml?；旌暇鶆蚝?，放在回轉(zhuǎn)式振蕩器上，于室溫下反應(yīng)18小時(shí)。然后使用12,000xg于4℃下離心15分鐘，將上清液除去。將沉淀顆粒(pellet)用1ml之50mM硼酸鹽緩沖液(pH8.5)再懸浮。然后以12,000xg離心，將上清液除去。如此重復(fù)清洗3次后，將抗體-乳膠顆粒(pellet)懸浮于1ml的10％BSA-硼酸鹽緩沖液(50mM，pH＝8.5)，置于回轉(zhuǎn)式振蕩器中于室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后用1,200xg離心15分鐘。最后將抗體-乳膠顆粒懸浮于1ml的含有15％Trehalose，0.01％NaN3的硼酸鹽緩沖液(50mMpH＝8.5)中，置于4℃保存。簡易層析式免疫檢驗(yàn)測(cè)試片的制備。將孔隙5μm的硝化纖維膜(Schleider&Schnell)剪成長寬為10公分×2.0公分的薄片(相當(dāng)于20個(gè)0.5公分×2.0公分的測(cè)試片)。在距寬邊(2.0公分)的頂端約0.6公分(控制區(qū)處)及1.2公分(測(cè)試區(qū)處)，分別用噴槍(2kg/cm2的壓力)將兔子抗老鼠IgG的抗體(1mg/ml及甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-牛甲狀腺球蛋白(0.8mg/ml)噴于該二處，使成約1.5毫米寬度的線狀。置于室溫下風(fēng)干30分鐘后，再將其置于含有阻斷緩沖液(0.25％酪素，0.01TritonX-100，3％Trehalose-PBS(20mM))中。于室溫阻斷30分鐘后，取出置于20℃，30％濕度恒溫濕室中干燥30分鐘。剪取一長寬為10公分×7公分，單面有膠的塑膠背板。在距寬邊(7公分)頂端的3公分至5公分處，附著上述已制備好的硝化纖維膜。由頂端至3公分處，粘附10公分×3公分的濾紙(Whatman)。于下方樣品接觸區(qū)，粘附一張10公分×2公分的玻璃纖維膜。在玻璃纖維膜距硝化纖維膜底端1.5公分處，噴上總共8μl的抗甲基苯丙胺-藍(lán)色乳膠結(jié)合物。于恒溫(20℃)恒濕(30％)室過夜干燥后，切成0.5公分×7公分的小薄片。測(cè)試時(shí)，使其下端的樣品接觸區(qū)浸泡于約200μl含有(+)-甲基苯丙胺濃度分別為1000，500，300，100ng/ml的尿液中，另有一不含MA的尿液作為對(duì)照組。5-10分鐘后，若控制區(qū)及測(cè)試區(qū)均出現(xiàn)藍(lán)色訊號(hào)，則反應(yīng)為陰性，表示樣品中不含所欲偵測(cè)的MA；若只有控制區(qū)顯現(xiàn)藍(lán)色訊號(hào)，而測(cè)試區(qū)未顯現(xiàn)藍(lán)色訊號(hào)或顯現(xiàn)極弱的藍(lán)色訊號(hào)，則反應(yīng)為陽性，表示樣品中含有欲檢測(cè)的MA。測(cè)試結(jié)果如圖2，顯示此測(cè)試片的敏感度為300ng/ml。此外，于樣品接觸區(qū)的玻璃纖維膜上吸附過碘酸鈉，可有效解決(+)偽麻黃素所引的交叉反應(yīng)。本發(fā)明可容許各種修改及變化形式，其特定具體實(shí)施例已藉實(shí)施例的方式例示并詳細(xì)說明。然而，應(yīng)了解，其并非用以限制本發(fā)明于所揭示的特定形式，而用以涵蓋所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神及范圍內(nèi)的所有的修飾、類似及改變。權(quán)利要求1.一種雜交瘤，其是骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生抗甲基苯丙胺抗體的B細(xì)胞融合的細(xì)胞株，產(chǎn)生對(duì)甲基苯丙胺具特異性的單克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤，其中B細(xì)胞是得自以甲基苯丙胺衍生物與載體蛋白質(zhì)結(jié)合物免疫的動(dòng)物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交瘤，其中甲基苯丙胺衍生物具有下通式其中n為1-4；R1為C1-4烷基，未經(jīng)取代或經(jīng)鹵素取代；C1-4烷氧基；-OCH2Ph；或-OC(C1-4烷基)3-；R2為＝O，＝S或-H；R3及R4各自為-H，C1-4烷基或二(C1-4烷基)；R5及R6各自為-H，或R5及R6一起表-(CH2)4-。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述之雜交瘤，其中甲基苯丙胺衍生物是甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交瘤，其中載體蛋白質(zhì)是白蛋白、球蛋白、血藍(lán)質(zhì)、鐵蛋白質(zhì)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤，其中骨髓瘤細(xì)胞為鼠源骨髓瘤細(xì)胞F0細(xì)胞株，B細(xì)胞是得自以甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-牛血清白蛋白免疫的鼠。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交瘤，其為鼠源B細(xì)胞雜交瘤2602-16.2。8.一種單克隆抗體，其是對(duì)甲基苯丙胺具特異性的，是由權(quán)利要求1的雜交瘤所產(chǎn)生的。9.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1的雜交瘤的方法，其包括以B細(xì)胞融合方法融合骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生抗甲基苯丙胺抗體的B細(xì)胞，及選取對(duì)甲基苯丙胺具特異性的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中B細(xì)胞是得自以甲基苯丙胺衍生物與載體蛋白質(zhì)結(jié)合物免疫的動(dòng)物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中甲基苯丙胺衍生物具有下通式其中n為1-4；R1為C1-4烷基，未經(jīng)取代或經(jīng)鹵素取代；C1-4烷氧基；-OCH2Ph；或-OC(C1-4烷基)3；R2為＝O，＝S或-H；R3及R4各自為-H，C1-4烷基或二(C1-4烷基)；R5及R6各自為-H，或R5及R6一起表-(CH2)4-。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中甲基苯丙胺衍生物是甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸。13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中載體蛋白質(zhì)是白蛋白、球蛋白、血藍(lán)質(zhì)、鐵蛋白質(zhì)。14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中骨髓瘤細(xì)胞為鼠源骨髓瘤細(xì)胞FO細(xì)胞株，B細(xì)胞是得自以甲基苯丙胺-對(duì)-丁酸-牛血清白蛋白免疫的鼠。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中使用聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合。16.一種試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求8的單克隆抗體。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其為直接競爭型ELISA試劑盒。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其包括(1)固相支持物，(2)根據(jù)權(quán)利要求8所述的單克隆抗體，(3)甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)品，(4)甲基苯丙胺-訊號(hào)復(fù)合物，及(5)呈色物質(zhì)。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中固相支持物為微滴盤、微球體或紙。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中訊號(hào)選自螢光物、冷光標(biāo)記物、放射性元素及酵素。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中酵素選自過氧化氫酶、堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶。22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其為層析式免疫檢驗(yàn)片。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其包括(1)樣品接觸區(qū)，(2)根據(jù)權(quán)利要求8的單克隆抗體-指示劑區(qū)，(3)反應(yīng)測(cè)試區(qū)，及(4)液體回收區(qū)。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中該檢驗(yàn)片由可提供毛細(xì)胞現(xiàn)象并吸附液體的材質(zhì)的多孔性載體物質(zhì)所構(gòu)成。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中該檢驗(yàn)片選自濾紙、硝化纖維膜、耐龍膜、玻璃纖維膜。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中該指示劑選自有顏色乳膠顆粒，如聚苯乙烯、聚乙烯甲苯、聚苯乙烯-丙烯酸及聚丙烯醛的聚合物；金屬膠質(zhì)溶液，如金屬質(zhì)溶液；非金屬膠溶液，如硅膠溶液，及染料膠質(zhì)溶液。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中反應(yīng)測(cè)試區(qū)含有甲基苯丙胺-載體抗原結(jié)合物。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中載體抗原為白蛋白、球蛋白、血藍(lán)質(zhì)、鐵蛋白質(zhì)。29.一種偵測(cè)尿液中甲基苯丙胺的方法，該方法是利用根據(jù)權(quán)利要求8的單克隆抗體或根據(jù)權(quán)利要求16-28中任一項(xiàng)的試劑盒檢測(cè)尿液。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于一種對(duì)甲基苯丙胺(Ma,methamphe-tamine)具有特異性之單克隆抗體,產(chǎn)生該抗體之雜交瘤,含此單克隆抗體之試劑盒,及利用此單克隆抗體、雜交瘤及試劑盒偵測(cè)甲基苯丙胺濫用之用途。文檔編號(hào)C12N5/20GK1179469SQ9612032公開日1998年4月22日申請(qǐng)日期1996年10月11日優(yōu)先權(quán)日1996年10月11日發(fā)明者劉涓,楊玫君,蔡宜芬,黃詠玲,史惟馨,張東玄申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人生物技術(shù)開發(fā)中心