專利名稱：啤酒花潛伏病毒基因及該病毒的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及啤酒花潛伏病毒基因及該病毒的檢測(cè)方法。
啤酒花潛伏病毒(Hop Latent Virus，以下簡(jiǎn)稱HLV)被認(rèn)為廣泛地感染啤酒花栽培地區(qū)的啤酒花(Tresh & Ormerod，Rep.E.Malling Res.Stn for 196841(1969)，Probasco & Skotland，植物病理學(xué)68277(1978)，Adams & Barbara，應(yīng)用生物學(xué)年鑒101483(1982)，Inoue et al.，Ann.Phytopath Soc.Japan 39229(1973)。
這種HLV是屬于香石竹潛病毒組的絲狀體，關(guān)于其基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)等還不清楚。因此，在啤酒花中，當(dāng)制作無病毒菌落時(shí)，作為無病毒菌落的選別方法，采取使用抗HLV抗體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)。但是，在利用ELISA的HLV檢測(cè)診斷中，因試樣采集期的不同而產(chǎn)生檢定精度低和抗體制作費(fèi)事等種種問題。
鑒于上述狀況，本發(fā)明的目的是，通過開發(fā)HLV感染株的有效且可靠的基因檢測(cè)法來解決上述課題。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人首先對(duì)HLV基因進(jìn)行解析、研究，結(jié)果，率先鑒別了HLV的外殼蛋白基因，成功地解釋清楚其堿基序列，進(jìn)而也解釋清楚其蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。利用所得到的HLV外殼蛋白基因或其一部分或者基于這些堿基序列而合成的合成DNA，借助遺傳學(xué)的方法可以檢測(cè)HLV。作為該遺傳學(xué)的方法，例如可舉出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)和Southern雜交法等。例如，在PCR中使用具有該堿基序列的一部分或包含其互補(bǔ)序列的DNA為引物，通過特異于HLV感染植物的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)行HLV的檢測(cè)。進(jìn)而，在以HLV基因的互補(bǔ)鏈DNA作為探針進(jìn)行雜交的情況下，通過在HLV感染株上出現(xiàn)特異的陽性條帶，就能檢測(cè)HLV感染株。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是編碼啤酒花潛伏病毒的外殼蛋白具有序列表的序列號(hào)1的堿基序列的DNA。
在上述序列表的序列號(hào)1的堿基序列之中，第58-975位的堿基序列編碼306個(gè)氨基酸殘基。
在序列表的序列號(hào)1中記載的堿基序列之中，第981-1292位堿基序列編碼104個(gè)氨基酸殘基。
編碼上述HLV外殼蛋白基因(包括DNA、RNA)或其部分，都可以用于上述遺傳學(xué)檢測(cè)方法。在PCR和Southern雜交中，可以優(yōu)先使用序列表中的下述堿基序列作為探針，例如a)序列號(hào)2(相當(dāng)于序列號(hào)1中的第405-423位)；b)序列號(hào)3(相當(dāng)于序列號(hào)1中的第457-474位)；c)序列號(hào)4(相當(dāng)于序列號(hào)1中的第618-637位)；d)序列號(hào)5(相當(dāng)于序列號(hào)1中的第761-781位)。
這些DNA也可以從由HLV提取并純化的RNA得到，而且可以使用自動(dòng)DNA合成儀制得。尤其，在像序列號(hào)2-5那樣的短單鏈DNA的情況下，可以簡(jiǎn)便地通過合成而得到。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是啤酒花潛伏病毒的檢測(cè)方法，其特征是，以從啤酒花提取的核酸作為模板，通過使用上述序列號(hào)2-5的任一種合成DNA作為探針進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR以進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。
更詳細(xì)地說，使用序列號(hào)2的合成DNA和序列號(hào)4的合成DNA作為引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，在將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析時(shí)，根據(jù)有無233堿基對(duì)的特異DNA片段存在，可以檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
類似地，使用序列號(hào)3的合成DNA和序列號(hào)4的合成DNA作為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增，在將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析時(shí)，根據(jù)有無181堿基對(duì)的特異DNA片段存在，可以檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
使用序列號(hào)2的合成DNA和序列號(hào)5的合成DNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增，在將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析時(shí)，根據(jù)有無377堿基對(duì)的特異DNA片段存在，可以檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
使用序列號(hào)3的合成DNA和序列號(hào)5的合成DNA作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，在將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析時(shí)，根據(jù)有無325堿基對(duì)的特異DNA片段存在，可以檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
本發(fā)明另一個(gè)方面是啤酒花潛伏病毒的檢測(cè)方法，其特征是，將序列號(hào)4或5的合成DNA或者用該DNA作為引物延伸合成的互補(bǔ)鏈DNA作為探針，與從啤酒花提取的核酸進(jìn)行雜交。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是啤酒花潛伏病毒的檢測(cè)方法，其特征是，以序列號(hào)1的DNA的限制性內(nèi)切酶切片段作為探針與從啤酒花提取的核酸進(jìn)行雜交。
本發(fā)明的又一個(gè)方面是啤酒花潛伏病毒的外殼蛋白，該外殼蛋白是從序列表的序列號(hào)1的堿基序列中的第58-975位堿基序列翻譯來的，具有序列表的序列號(hào)6的306個(gè)氨基酸殘基序列。


圖1示出由蛋白質(zhì)序列分析儀分析得到的啤酒花潛伏病毒的外殼蛋白的氨基酸序列。
圖2示出用PCR對(duì)啤酒花潛伏病毒進(jìn)行基因診斷而得到的電泳圖。
按以下次序分析HLV的基因，鑒別HLV的外殼蛋白基因，弄清楚其堿基序列。
(1)HLV的分離按照常規(guī)方法可以從HLV感染的啤酒花中分離出HLV，例如可以利用聚乙二醇濃縮病毒、利用有機(jī)溶劑和熱處理使抽提物澄清化、分級(jí)離心分離、蔗糖密度梯度離心等來進(jìn)行。
(2)從HLV提取RNA從HLV中提取RNA，例如可以利用主要用于其他植物病毒的SDS-酚法等來實(shí)現(xiàn)。
(3)cDNA的克隆以從HLV顆粒中提取的RNA作為模板，利用Gubler-Hoffman法(Gubler & Hoffman.Gene，25，263(1983))，體外內(nèi)合成雙鏈cDNA。利用常規(guī)方法進(jìn)行連接，將合成的cDNA摻入到質(zhì)粒載體中。作為質(zhì)?？膳e出pUC119、pBluescriptII等。使用上述連接混合物進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，從所得到的轉(zhuǎn)化子中按常規(guī)方法選擇克隆cDNA的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行純化。
(4)來自HLV基因組的cDNA堿基序列的確定使用按上述方法得到的重組質(zhì)粒，采用Maxam-Gilbert法(Maxam & Gilbert，Proc，Natl.Acad.Sci.，74，560(1977))或者雙脫氧法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5463(1977))確定堿基序列。
由此確定含有編碼HLV外殼蛋白的基因(以下簡(jiǎn)稱HLV外殼蛋白基因)的DNA的堿基序列，在序列表的序列號(hào)1中記載了該序列。
(5)HLV外殼蛋白的部分氨基酸序列的確定利用蛋白酶將HLV外殼蛋白部分消化后，用高效液相色譜法進(jìn)行分離、純化，然后用蛋白質(zhì)測(cè)序儀(ABI社制造)來確定HLV外殼蛋白的部分氨基酸序列。在圖1中示出像這樣確定的HLV外殼蛋白的部分氨基酸序列。通過將這部分氨基酸序列與從序列表的HLV外殼蛋白基因的堿基序列預(yù)測(cè)的HLV外殼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較研究，就清楚外殼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)(參照?qǐng)D1)。
(6)HLV感染的啤酒花的病毒基因診斷①利用反轉(zhuǎn)錄PCR法的基因診斷利用常規(guī)方法合成具有由上述方法確定的HLV外殼蛋白基因堿基序列或該堿基序列的互補(bǔ)序列中的部分堿基序列的大約20個(gè)堿基的引物DNA，使用PCR法根據(jù)是否得到擴(kuò)增產(chǎn)物，可以診斷HLV感染的啤酒花的病毒基因。
引物可以使用具有序列表的序列號(hào)2-5的堿基序列的寡聚核苷酸。其中，序列表的序列號(hào)2的堿基序列與序列號(hào)1的堿基序列中的第405-423位堿基序列相同，以下簡(jiǎn)稱3P。序列表的序列號(hào)3的堿基序列與序列號(hào)1的堿基序列中的第457-474位堿基序列相同，以下簡(jiǎn)稱4P。另外，序列表的序列號(hào)4的堿基序列是序列號(hào)1的堿基序列中的第618-637位堿基序列的互補(bǔ)序列，以下簡(jiǎn)稱3M。序列表的序列號(hào)5的堿基序列是序列號(hào)1的堿基序列中的第761-781位堿基序列的互補(bǔ)序列，以下簡(jiǎn)稱4M。
另外，具有序列表的序列號(hào)2-5號(hào)所示堿基序列的一部分序列的合成寡聚核苷酸也可以作為引物使用。即，因?yàn)镻CR本來是將從許多堿基序列中得到的特定的基因信息擴(kuò)增的方法，所以如果是具有與本發(fā)明引物的堿基序列近似的堿基序列的寡聚核苷酸，則同樣可以作為引物使用。
在本發(fā)明的中使用的引物DNA，例如可以使用利用β-氰乙基磷酰胺酸法或硫代硫化物法的市售的自動(dòng)DNA合成儀得到。
在本發(fā)明中使用的啤酒花植物的核酸，可以用常規(guī)方法提取，如普通的核酸提取方法。
使用這樣得到的啤酒花核酸和上述的引物，通過病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄和PCR使來自HLV基因組的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR是反復(fù)進(jìn)行由變性過程、引物退火過程和利用DNA聚合酶產(chǎn)生的延伸過程組成的DNA復(fù)制循環(huán)，例如在Saiki等，Science第230卷，1350-1354頁等中所記載的普通方法。
作為在本發(fā)明中進(jìn)行的PCR，可以舉出以下方法，即在含有預(yù)先添加了合成寡聚核苷酸、DNA聚合酶、4種堿基(dATP、dTTP，dCTP、dGTP)和啤酒花DNA的約1.0mM-約4.0mM、最好約1.5mM-約3.0mM的氯化鎂、氯化鉀、明膠、牛血清白蛋白、表面活性劑(Tween20、NP-40、Triton X-100等(均是商品名))、二甲亞砜等的擴(kuò)增用緩沖液中，反復(fù)進(jìn)行約20次至約50次，最好約25次至約40次的DNA復(fù)制循環(huán)的方法。
再者，在PCR中的各過程，例如可以在下述條件下進(jìn)行。
變性過程通常是通過在90-95℃、最好約94-95℃加熱約1-3分鐘、最好約1-2分鐘來進(jìn)行。
引物退火過程通常是通過在30-50℃、最好約35-42℃進(jìn)行約1-3分鐘、最好約1-2分鐘的引物溫育來進(jìn)行。
由DNA聚合酶產(chǎn)生的延伸過程，通常是通過在約70-73℃、最好約72-73℃進(jìn)行約1-4分鐘、最好約2-3分鐘的耐熱性DNA聚合酶處理來進(jìn)行。耐熱性DNA聚合酶可以舉出PERKIN ELMER公司制造的耐熱性DNA聚合酶等市售品。
由上述PCR得到的擴(kuò)增DNA，采用在通常的DNA分離中使用的電泳法進(jìn)行分離。一般可以使用約0.2％至約2％的瓊脂糖凝膠。作為電泳中使用的緩沖液，可舉出三磷酸系(pH7.5-8.0)、三乙酸系(pH7.5-8.0)、三硼酸系(pH7.5-8.3)等，最好是三硼酸系。另外，根據(jù)需要可以添加EDTA等。
作為電泳條件，例如是50-300V、10-20分鐘，最好是150V、30分鐘，作為分子量大小標(biāo)記物，例如可以使用100Base-PairLadder(Pharmacia公司制造)等市售品。
例如可以使用溴化乙錠等物質(zhì)，在暗處對(duì)凝膠照射254nm或366nm的紫外線，即使在電泳過程中也能檢測(cè)DNA和溴化乙錠的結(jié)合體的紅色條帶。不過，通常是在電泳結(jié)束后，將凝膠在溴化乙錠等物質(zhì)溶液中浸漬約10分鐘至60分鐘，然后在暗處對(duì)凝膠照射254nm或366nm的紫外線，檢測(cè)DNA和溴化乙錠結(jié)合體的紅色條帶。
根據(jù)有無被檢測(cè)的擴(kuò)增DNA存在，能夠識(shí)別病毒感染。即，在使用同一引物進(jìn)行PCR時(shí)，來自病毒感染的啤酒花，檢測(cè)出特異的擴(kuò)增DNA，來自未感染的啤酒花，檢測(cè)不出特異的擴(kuò)增DNA。
例如，在權(quán)利要求9所述的方法中，根據(jù)有無233堿基對(duì)的特異DNA片段，在權(quán)利要求10所述的方法中，根據(jù)有無181堿基對(duì)的特異DNA片段，在權(quán)利要求11所述的方法中，根據(jù)有無377堿基對(duì)的特異DNA片段，另外在權(quán)利要求12所述的方法中，根據(jù)有無325堿基對(duì)的特異DNA片段，分別可以檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
②利用雜交的基因診斷利用化學(xué)合成或基因操作制備具有與HLV外殼蛋白基因互補(bǔ)的序列的寡聚核苷酸，用該寡聚核苷酸作為探針進(jìn)行雜交，可以進(jìn)行與以往的免疫學(xué)方法不同的診斷。
作為探針，通常使用鏈長(zhǎng)20至數(shù)千堿基，例如可舉出具有序列表的序列號(hào)6和7的堿基序列的那些，以及由HLV外殼蛋白基因克隆的質(zhì)粒制備的cDNA用限制酶消化的DNA片段，這些探針在用同位素、生物素?zé)晒馕镔|(zhì)等按照常規(guī)方法標(biāo)記后，用于雜交。
雜交中使用的啤酒花植物的核酸，可以利用常規(guī)方法提取，例如可以利用Murray & Thompson，Nucl.Acid Res.，8，4321-4325(1980)等中記載的普通核酸提取法進(jìn)行。所得到的核酸在變性處理后，點(diǎn)在過濾膜上。過濾膜可以使用硝酸纖維素濾膜、尼龍濾膜等，例如Hybond-N+(Amersham公司制造)是理想的。
將核酸在含有甲酰胺、甲醛、MOPS、乙酸鈉、EDTA等的變性溶液中，在69-70℃、最好65℃，進(jìn)行5-20分鐘、最好15分鐘的熱處理后急冷，進(jìn)行核酸的變性處理。變性處理后，添加20XSSC進(jìn)行混合，在過濾膜上進(jìn)行點(diǎn)樣。
使用這樣得到的過濾膜(點(diǎn)有啤酒花核酸)和上述探針在雜交溶液中，在42-65℃、最好46℃，進(jìn)行12-20小時(shí)、最好16小時(shí)的雜交。然后潤(rùn)濕過濾膜，進(jìn)行干燥，利用放射自顯影術(shù)等檢測(cè)手段觀察有關(guān)斑點(diǎn)的信號(hào)。
即，來自病毒感染的啤酒花的核酸，由于進(jìn)行了雜交，可以檢測(cè)出信號(hào)，而來自未感染的啤酒花的核酸，由于未雜交，所以沒有檢測(cè)出信號(hào)。
下面通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1HLV的分離將1kg的HLV感染的啤酒花的萌芽莖在3倍體積的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH8.0，含0.2％抗壞血酸、0.2％尼古丁、0.2％PVP)中磨碎，于室溫放置1小時(shí)后，用紗布過濾，得到粗提液。將該粗提液熱處理(55℃，8分鐘)后，立即在冰浴中進(jìn)行急冷，以3000×g進(jìn)行30分鐘離心，得到上清液。在上清液中添加5％聚乙二醇和0.15M氯化鈉，攪拌1小時(shí)后，以3000×g進(jìn)行30分鐘離心，將沉淀物懸浮在0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.4，含0.02MEDTA)中。
進(jìn)而以高速離心(15000×g，10分鐘)得到上清液后，將以超離心(100000×g，120分鐘)回收沉淀物的操作反復(fù)進(jìn)行二次，使病毒與夾雜物分離。
將所得到的沉淀物懸浮在2ml的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中后，進(jìn)行20-10％的蔗糖密度梯度離心(150000×g，120分鐘)，回收病毒組分。最后，進(jìn)行180000×g、150分鐘的離心，得到沉淀物病毒顆粒，再懸浮在0.01M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中，作為純化病毒樣品而保存。
另外，除非事先說明，上述操作都是在4℃條件下進(jìn)行。
實(shí)施例2從HLV中提取RNA從HLV顆粒中提取RNA，按照SDS-酚法(Proll et al.，Pota to Research 24，1-10(1981))進(jìn)行。
在84μl按照與實(shí)施例1相同的方法得到的HLV純化樣品(1μg/ml)中添加5μl的20％SDS、1μl的20xSSC、10μl(10mg/ml)蛋白酶(商品名蛋白酶K)，進(jìn)行混合，在37℃保溫30分鐘。
接著，添加50μl的0.5％膨潤(rùn)土懸浮液和150μl的TE飽和酚，進(jìn)行酚萃取。然后，用酚∶氯仿混合液(1∶1)再進(jìn)行酚萃取。用氯仿萃取水層后，向水層中添加10μl的3M乙酸鈉、250μl的冷乙醇，進(jìn)行混合，在-80℃靜置30分鐘。然后，以15000×g進(jìn)行5分鐘離心，得到沉淀物。接著用70％乙醇進(jìn)行離心清洗，干燥除去乙醇后，在沉淀物中添加50μl蒸餾水進(jìn)行溶解，向此溶液中添加50μl的4M氯化鋰，進(jìn)行混合后，在冰中靜置1夜。
然后，以15000×g進(jìn)行5分鐘離心，得到沉淀物，再用70％乙醇進(jìn)行離心清洗，干燥除去乙醇后，向沉淀物中添加8μl蒸餾水，進(jìn)行溶解，作為RNA樣品而保存。
實(shí)施例3cDNA的克隆使用cDNA合成試劑盒(Amersham公司制造)，按照廠商的建議和程序，從實(shí)施例2制備的RNA樣品合成cDNA，溶解在10μlTE緩沖液中。
接著，將質(zhì)粒pUC119(50ng/μl)用SmaI消化并去磷酸化，向2μl的去磷酸化處理的上述質(zhì)粒中添加1μl上述的合成cDNA、10mMATP、10x連接緩沖液(Boehringer公司制造)、T4DNA連接酶(5U/μl，Boehringer公司制造)、13μl蒸餾水，進(jìn)行混合后，在22℃保溫一夜，進(jìn)行連接反應(yīng)。
制備大腸桿菌MV1184的感受態(tài)細(xì)胞，將100μl該感受態(tài)細(xì)胞和上述連接反應(yīng)液混合，在冰上靜置30分鐘。
接著，在42℃保溫60秒后，立即在冰中進(jìn)行急冷，添加500μl的SOC培養(yǎng)基，在37℃保溫1小時(shí)。添加各為50μl的2％X-gal和100m MIPTG，在2個(gè)含50μg/ml氨芐青霉素的2x YT瓊脂板培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，在37℃培養(yǎng)一夜。
按照常規(guī)方法，從所得到的白色菌落大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA，選擇具有插入長(zhǎng)cDNA片段的質(zhì)粒的大腸桿菌，進(jìn)行保存。
隨后，為了確認(rèn)cDNA是來自HLV基因組，將已純化的HLV-RNA樣品進(jìn)行部分堿變性，使用以T4多核苷酸激酶[γ32P]ATP進(jìn)行5’末端標(biāo)記的探針，對(duì)選擇出的cDNA進(jìn)行Southern印跡雜交。
結(jié)果得到具有插入來自HLV基因組的0.7kb、1.2kb、1.35kb、3.5kb、5.0kb的cDNA片段的質(zhì)粒的大腸桿菌。
實(shí)施例4來自HLV基因組的cDNA的堿基序列的確定用2xYT培養(yǎng)基，在37℃下將實(shí)施例3得到的具有插入來自HLV基因組的cDNA片段的質(zhì)粒的大腸桿菌振動(dòng)培養(yǎng)一夜，按照常規(guī)方法純化質(zhì)粒。按照常規(guī)方法，由該質(zhì)粒制備來自HLV基因組的cDNA片段，將其作為模板使用，按照雙脫氧法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，74，5463(1977))，使用DNA測(cè)序儀(ABI公司制造)和測(cè)序試劑盒(USB公司制造，商品名SEQUENASE)，將堿基序列解碼，確定1375個(gè)堿基長(zhǎng)的序列。
其結(jié)果，在該堿基序列中鑒定出編碼，外殼蛋白基因(編碼306個(gè)氨基酸殘基，分子量約31.4KD)的翻譯區(qū)域(序列表的序列號(hào)1的第58-975位堿基序列)和編碼分子量約12.0KD蛋白質(zhì)(101個(gè)氨基酸殘基)的翻譯區(qū)域(序列表的序列號(hào)1的第981-1292位堿基序列)。
另外，在序列表的序列號(hào)6和7中示出了從各堿基序列翻譯的推測(cè)的氨基酸序列。而且，在這些氨基酸序列中，序列號(hào)6中所示的氨基酸序列，因?yàn)榘喈?dāng)于在后面詳述的圖1中所示的HLV外殼蛋白的部分氨基酸序列，因此已證明其存在。
通過轉(zhuǎn)化如此得到的編碼HLV外殼蛋白的基因，本發(fā)明預(yù)期可用于生產(chǎn)抗所述病毒的啤酒花。因此，用如此獲得的所述外殼蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化微生物如大腸桿菌等可以生產(chǎn)所述的蛋白。另外，基于所述蛋白的氨基酸序列，可以使用例如蛋白質(zhì)合成儀等獲得其任何片段。該外殼蛋白或其片段可用于生產(chǎn)HLV抗體以用于檢測(cè)HLV。
實(shí)施例5HLV外殼蛋白的部分氨基酸序列的確定將120μl的實(shí)施例1制備的HLV純化樣品(1μg/μl)用蛋白酶(Lysyl Endopeptidase，和光純藥公司制造)在常溫(25℃)、16小時(shí)的條件下進(jìn)行部分消化，將所得到的肽片段用逆相HPLC(RepRPC HR5/5柱，Pharmacia公司制造)分離純化后，使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀(ABI公司制造)分析肽片段的N末端氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)三個(gè)肽片段的N末端氨基酸序列與上述HLV外殼蛋白的推定氨基酸序列完全一致。在圖1中示出這三個(gè)肽片段的N末端氨基酸序列和其在HLV外殼蛋白的氨基酸序列中的位置。
實(shí)施例6利用HLV感染的啤酒花的反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行病毒基因診斷在1ml的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中將HLV感染的啤酒花葉(品種信州早生)和無病毒啤酒花葉(品種信州早生)各0.1g磨碎并用氯仿萃取，之后上清液進(jìn)行酚處理和三次醚處理后，用乙醇使核酸沉淀。接著，用70％乙醇將沉淀物離心清洗，干燥除去剩余的乙醇后，溶解在100μl的TE緩沖液中，其中的2μl供反轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)。
PCR用的4種引物，是根據(jù)該堿基序列，使用ABI公司制造的DNA合成儀(型號(hào)380B)按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)、合成的，具有序列表的序列號(hào)2-5的堿基序列(分別簡(jiǎn)稱3P、4P、3M、4M)。各引物以3P/3M、4P/3M、3P/4M、4P/4M的4種組合用于反轉(zhuǎn)錄PCR。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)添加25皮摩爾(pM)的互補(bǔ)鏈引物、5單位的反轉(zhuǎn)錄酶(ANV-RTase XL，寶酒造(株)社制造)和2μg的上述制備的啤酒花核酸，在含有75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM dNTP的50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)中，在55℃進(jìn)行30分鐘。
然后，在反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中添加0.5單位的耐熱性DNA聚合酶(Boehringer公司制造)和25pM的擴(kuò)增用引物，進(jìn)行PCR。反應(yīng)體積為10μ，為了防止反應(yīng)液蒸發(fā)，添加約20μl礦物油。
PCR的各步驟按下述條件進(jìn)行。
首先在94℃保持3分鐘后，進(jìn)行30次的下述循環(huán)變性過程在94℃進(jìn)行1分鐘，引物退火過程在55℃進(jìn)行1分鐘，DNA的延伸過程在72℃進(jìn)行2分鐘。反應(yīng)溶液在72℃保持5分鐘后，在4℃下保存。
用瓊脂糖凝膠電泳分析由上述聚合酶鏈反應(yīng)得以擴(kuò)增的基因組DNA。
使用2％的瓊脂糖凝膠，在含有2mM EDTA的Tris-硼酸鹽緩沖液(pH8.0)中進(jìn)行100V、30分鐘的電泳，實(shí)現(xiàn)DNA的分離。此時(shí)，作為分子量標(biāo)記使用以限制酶Hind III和EcoRI酶切的λDNA(Nippon Energy公司制造)。
電泳結(jié)束后，在0.5μg/ml的溴化乙錠水溶液中將凝膠浸漬10分鐘后，在暗處用254nm的紫外線照射凝膠，檢測(cè)DNA和溴化乙錠的結(jié)合體的紅色條帶。
由電泳分析(反復(fù)進(jìn)行2次)得到的結(jié)果示于圖2中。圖中的DW意指滅菌水。
瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果是，感染的啤酒花與所用引物相對(duì)應(yīng)得到特異的DNA擴(kuò)增片段，未感染的啤酒花沒有得到這樣的DNA擴(kuò)增片段，從而可以將兩者區(qū)別開。
另外，與引物相應(yīng)的特異DNA擴(kuò)增片段是3P/3M233堿基對(duì)、4P/3M181堿基對(duì)、3P/4M377堿基對(duì)、4P/4M325堿基對(duì)。
實(shí)施例7利用斑點(diǎn)印跡雜交的基因診斷在1ml的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中磨碎HLV感染的啤酒花葉(品種信州早生)和無病毒啤酒花葉(品種信州早生)各0.1g，并用氯仿萃取，之后將上清液進(jìn)行酚處理和3次醚處理，然后用乙酸使核酸沉淀。接著，用70％乙醇離心清洗該沉淀物，干燥除去剩余的乙醇后，溶解在100μl的TE緩沖液中。將其中的2μl添加到3倍體積的核酸變性溶液(65％甲酰胺、20％甲醛、1.54M MOPS、6.5mM乙醇鈉、1.3mMEDTA)中，在65℃保溫15分鐘后急冷。接著，添加8μl的20xSSC(0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸納，pH7.0)混合后，在過濾膜(Amersham公司制造，商品名Hybond-N+)上將其中10μl進(jìn)行點(diǎn)樣，供斑點(diǎn)印跡雜交試驗(yàn)。
探針是用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化實(shí)施例4制備的大腸桿菌的質(zhì)粒(含有來自HLV基因組的約1.35kb cDNA片段)后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離片段，在柱(寶酒造(株)社制造，商品名Suprec-01柱)上將來自HLV基因組的cDNA洗脫，進(jìn)行純化。接著，純化的cDNA利用隨機(jī)標(biāo)記試劑盒(寶酒造(株)社制)以[α32]dCTP進(jìn)行標(biāo)記后，在Sephadex G-50柱上純化后而使用。
在5xSSC、100μg/ml酵母tRNA(Boehringer公司制造)、0.5％SDS、0.1％Ficoll、0.1％PVP、0.1％BSA溶液中，在46℃、16小時(shí)的條件下進(jìn)行雜交。
放射自顯影圖的結(jié)果顯示，在來自HLV感染的啤酒花的點(diǎn)樣上觀察到信號(hào)，而來自無病毒啤酒花的點(diǎn)樣未觀察到信號(hào)。由此證實(shí)了，根據(jù)有無信號(hào)可以區(qū)分HLV感染的啤酒花和無病毒啤酒花。
按照本發(fā)明，弄清楚了HLV外殼蛋白基因的結(jié)構(gòu)，研制、開發(fā)了HLV基因診斷法，不需要以往進(jìn)行的HLV分離、抗血清的制備、抗體的純化等煩雜的操作，比利用ELISA能夠更簡(jiǎn)便且高靈敏度地診斷HLV感染的啤酒花的病毒。進(jìn)而利用該基因，能夠?qū)ιa(chǎn)抗該病毒的啤酒花作出貢獻(xiàn)。序列表序列號(hào)1長(zhǎng)度1375類型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAATG60GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360CCGTACAATA AACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCGT CTGCAGGTTG 660TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780AATGCTGCGG CTGTGCAACC ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAGAAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGATA 1200ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCACC 1375序列號(hào)2長(zhǎng)度19類型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型DNA序列描述TGAGGTCGTGTCAAACAAC序列號(hào)3長(zhǎng)度18類型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型DNA序列描述GTTGATCTGGAGGGGTTG序列號(hào)4長(zhǎng)度20類型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型DNA序列描述TCTCGGCATCCTTCTTTATT序列號(hào)5長(zhǎng)度21類型核酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型DNA序列描述TTTCAACGTAATCCAAGCAAT序列號(hào)6長(zhǎng)度306類型氨基酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述Met Ala Asp Lys Gln Gly Gln Met Thr Glu Gln Gln Lys Val Asp Ser Gln Lys1 10Leu Gln Gly Glu Ala Lys Asn Lys Glu Lys Ala Glu Ser Ser Lys Arg Lys Asp20 30Glu Leu Leu Lys Lys Tyr Ile Asp Pro Gly Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu40 50Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lys Leu Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg60 70Ala Ala Ile Arg Val Thr Asn Ala Gly Leu Glu Thr Gly Arg Pro Ala Leu Lys80 90Pro Thr Pro Asp Met Leu Pro Asp Pro Thr Asn Pro Tyr Asn Lys Pro Ser Leu100Asp Ala Leu Leu Met Ile Lys Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Thr Ser110 120Glu Asp Met Met Lys Ile Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu130 140His Val Gln Ser Val Ile Leu Gln Ala Val Phe Tyr Cys Lys Asp Ser Ser Ser150 160Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Trp Arg Gly Gly Ala Ile Ser170 180Ala Asp Ser Val Leu Ala Ile Ile Lys Lys Asp Ala Glu Thr Leu Arg Arg Val190Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Thr Trp Asn Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro200 210Pro Ser Asp Trp Ser Glu Met Gly Phe Gln Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe220 230Asp Cys Leu Asp Tyr Val Glu Asn Ala Ala Ala Val Gln Pro Leu Glu Gly Leu240 250Ile Arg Val Pro Tyr Ala Arg Glu Lys Ile Ala Asn Lys Thr His Lys Asp Leu260 270Ala Leu Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gln Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu Ile280Thr Gly Gly Lys Asn Gly Pro Glu Leu Gln Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Asn Asn290 300 306序列號(hào)7長(zhǎng)度104類型氨基酸鏈性單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lys Phe Leu Glu Gln Cys10Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met Ile Ser Leu Gln Val His Arg Pro20 30Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Ala Lys Leu Val Gly40 50Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Trp Pro Pro Thr Ala Phe Thr Thr Arg Cys60 70Asp Asn Lys Thr Cys Phe Pro Gly Leu Thr Tyr Asn Ala Ser Ile Ala Arg Phe80 90Ile Arg Asp Gly Val Thr Glu Val Ile Pro Ser Ala Pro Asn100 10權(quán)利要求
1.在來自啤酒花潛伏病毒基因組的基因中，編碼啤酒花潛伏病毒外殼蛋白的并具有序列表的序列號(hào)1的堿基序列的DNA。
2.編碼從序列表的序列號(hào)1的堿基序列中的第58-975位堿基序列翻譯的306個(gè)氨基酸殘基的DNA。
3.編碼從序列表的序列號(hào)1的堿基序列中的第981-1292位堿基序列翻譯的104個(gè)氨基酸殘基的DNA。
4.具有序列表的序列號(hào)2的堿基序列的合成DNA。
5.具有序列表的序列號(hào)3的堿基序列的合成DNA。
6.具有序列表的序列號(hào)4的堿基序列的合成DNA。
7.具有序列表的序列號(hào)5的堿基序列的合成DNA。
8.啤酒花潛伏病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，以從啤酒花中提取的核酸作為模板，通過使用權(quán)利要求4-7中任一頂記載的合成DNA作為引物的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。
9.檢測(cè)啤酒花潛伏病毒的診斷方法，其特征在于，使用權(quán)利要求4記載的合成DNA和權(quán)利要求6記載的合成DNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，電泳分析所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)有無233堿基對(duì)的特異DNA片段，檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
10.檢測(cè)啤酒花潛伏病毒的診斷方法，其特征在于，使用權(quán)利要求5記載的合成DNA和權(quán)利要求6記載的合成DNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，電泳分析所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)有無181堿基對(duì)的特異DNA片段，檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
11.檢測(cè)啤酒花潛伏病毒的診斷方法，其特征在于，使用權(quán)利要求4記載的合成DNA和權(quán)利要求7記載的合成DNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，電泳分析所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)有無377堿基對(duì)的特異DNA片段，檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
12.檢則啤酒花潛伏病毒的診斷方法，其特征在于，使用權(quán)利要求5記載的合成DNA和權(quán)利要求7記載的合成DNA，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，電泳分析所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)有無325堿基對(duì)的特異DNA片段，檢測(cè)啤酒花潛伏病毒。
13.啤酒花潛伏病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，將權(quán)利要求6和權(quán)利要求7中任一項(xiàng)記載的合成DNA，或用該DNA作為引物延伸合成的互補(bǔ)鏈DNA作為探針，與從啤酒花中提取的核酸進(jìn)行雜交。
14.啤酒花潛伏病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，以權(quán)利要求1記載的DNA的限制性內(nèi)切酶酶切片段作為探針，與從啤酒花中提取的核酸進(jìn)行雜交。
15.啤酒花潛伏病毒的外殼蛋白，它是從序列表的序列號(hào)1的堿基序列的58-97位翻譯而來并包含序列表的序列號(hào)6的306個(gè)氨基酸殘基序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了啤酒花潛伏病毒感染株的有效的基因診斷法。還涉及在來自啤酒花潛伏病毒基因組的基因中，編碼啤酒花潛伏病毒外殼蛋白并具有序列表的序列號(hào)1的堿基序列的DNA。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1157325SQ96120370
公開日1997年8月20日 申請(qǐng)日期1996年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月27日
發(fā)明者須田成志, 絲賀裕, 畑谷達(dá)兒 申請(qǐng)人:薩波羅啤酒株式會(huì)社