專利名稱：新型人腫瘤壞死因子突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)腫瘤壞死因子(TNF)主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種非糖基化可溶性多功能細(xì)胞因子，由157個(gè)氨基酸組成，其主要生物學(xué)活性是能夠較為特異性地殺傷多種腫瘤細(xì)胞，引起腫瘤細(xì)胞壞死，這就使得人TNF成為一種潛在的抗腫瘤藥物，其開發(fā)前景在國(guó)內(nèi)外引起了廣泛的重視。但是，臨床試驗(yàn)研究表明，全身大劑量應(yīng)用人TNF可產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，而小劑量又難以達(dá)到治療效果。因此，如何提高天然TNF對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，降低對(duì)組織器官的毒副作用已成為TNF研究的一個(gè)重要組成部分，是TNF能否作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵問(wèn)題。
本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)TNF基因進(jìn)行了改造，構(gòu)建了工程菌，對(duì)工程菌表達(dá)水平、表達(dá)產(chǎn)物的純度及生物活性均進(jìn)行了研究，取得了滿意的效果，將此工程菌進(jìn)一步應(yīng)用到臨床可為惡性腫瘤的治療提供一種安全有效的藥品。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的1.nrhTNF基因克隆采用亞磷酰胺法合成2條引物，引物1的序列及組成為5′GC GAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC 3′EcoR I起始碼Arg Lys Arg hTNF11-14位氨基酸編碼序列引物2的序列及組成為5′CG GACGTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC 3′Pst I終止碼Phe hTNF156-153位氨基酸編碼序列應(yīng)用含hTNF cDNA的質(zhì)粒pBVINF202為PCR擴(kuò)增模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一長(zhǎng)約470bp的DNA片段。將擴(kuò)增片段經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切后，克隆入pUC18和pUC19的EcoR I和Pst I酶切位點(diǎn)之間，測(cè)定擴(kuò)增片段的DNA序列，結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增片段與天然人TNF相比較，5′未端缺失了7個(gè)氨基酸的編碼序列，天然人TNF基因中編碼Pro8Ser9Asp10的編碼序列由ArgLysArg的編碼序列取代，157位Leu的密碼子被Phe的密碼子取代。
2.高效表達(dá)載體的構(gòu)建將含人TNF突變基因的pUC19經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收470bp的DNA片段，插入原核高效表達(dá)載體pBV220中。
3.工程菌的建立宿主菌為大腸桿菌DH5a。將連接好的pBVnrhTNF用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a株，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上挑取菌落，LB培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Pst I雙酶切，篩選出目的菌株。
4.pBV nrhTNF在大腸桿菌中的表達(dá)將經(jīng)篩選后的pBVnrhTNF/DH5a30℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)5小時(shí)，菌體經(jīng)載樣緩沖液處理，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，染色，脫色，干膠后掃描分析，在分子量16.5KD左右處有明顯表達(dá)條帶，此帶占菌體總蛋白的67.4％。
5.nrhTNF實(shí)驗(yàn)室純化pBVnrhTNF/DH5a表達(dá)菌經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體。菌體用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)2SO4達(dá)50％飽和度，上清用10mmol/Tris·ClpH8.5，1mmol/L EDTA充分透析。粗提液經(jīng)Q--Sepherose柱層析，0-0.5mol/L NaCl線性梯度洗脫，收集含有nrhTNF的第一峰。透析除鹽后，經(jīng)S-Sepherose柱層析，0-1mol/L NaCl線性梯度洗脫，收集nrhTNF活性峰，稀釋，過(guò)濾，分裝，冷凍干燥。
經(jīng)菌株穩(wěn)定性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵、分離純化后表明此工程菌株具有良好的穩(wěn)定性，表達(dá)量占菌體蛋白的67.4％。層析純化后比活性達(dá)1×109U/mg蛋白，說(shuō)明此工程菌株適合于開發(fā)生產(chǎn)。
生物活性分析應(yīng)用中性紅攝入法測(cè)定nrhTNF對(duì)L929細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果表明，nrhTNF殺傷活性大于4×108/ml，比活性大于8×108/mg蛋白。
蛋白含量測(cè)定應(yīng)用Lowry′S法測(cè)定nrhTNF蛋白含量約為0.5mg/ml。
純度分析SDS-PAGE和HPLC鑒定nrhTNF半成品純度大于95％。
等電點(diǎn)測(cè)定平板等電聚焦法測(cè)定nrhTNF等電點(diǎn)為7-8。
N端氨基酸序列分析1-4位氨基酸為Met Arg Lys Arg，其后為天然hTNF第11位以后的氨基酸序列。
肽圖測(cè)定nrhTNF與天然hTNF之間的大部分色譜峰是一致的，僅在25min和30min時(shí)有一定的差別，初步說(shuō)明nrhTNF與天然hTNF大部分結(jié)構(gòu)是一致的，兩者的差別可能是N端不一致造成的。此外，nrhTNF的肽圖具有良好的批間重復(fù)性。
nrhTNF半成品紫外掃描呈蛋白質(zhì)吸收曲線，未測(cè)出氨芐青霉素活性，殘余DNA含量在100pg以下。
試驗(yàn)采用小鼠肉瘤180(S180)、肝癌H22、黑色素瘤B16等動(dòng)物移植性腫瘤對(duì)新型基因工程人腫瘤壞死因子(nrhTNF)進(jìn)行抑瘤作用觀察，并與重組人腫瘤壞死因子(TNF)同時(shí)進(jìn)行療效比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示37.5、75、150萬(wàn)U/kg劑量對(duì)動(dòng)物每日一次，連續(xù)8天肌肉注射給藥，nrhTNF對(duì)各瘤株生長(zhǎng)均顯示了較明顯的抑制作用，劑量反應(yīng)關(guān)系及重現(xiàn)性較好，相同劑量下療效明顯好于重組人TNF。
臨床前藥理、毒理研究表明，與天然重組人TNF相比，nrhTNF的毒性明顯降低(急毒nrhTNF LD50為1.149mg/kg，天然重組人TNFLD50為0.412mg/kg，毒性降低2.7倍)；對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性和對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用明顯增強(qiáng)；nrhTNF對(duì)小鼠的自主活動(dòng)、行為活動(dòng)、犬的呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響；對(duì)小鼠外源性脾結(jié)節(jié)生成單位無(wú)抑制作用；可激活恒河猴PBMC T淋巴細(xì)胞。nrhTNF無(wú)致突變作用，無(wú)肌肉刺激和全身致敏作用。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，nrhTNF肌肉注射后吸收很快，0.5h達(dá)高峰，T1/2為1h，其分布以血、腎、肺、肝、小腸、心濃度較高，主要從尿中排泄。
權(quán)利要求
1.新型人腫瘤壞死因子突變體，其特征在于a.nrhTNF基因克隆采用亞磷酰胺法合成2條引物，引物1的序列及組成為5′GC GAATTC ATG CGT AAA CGT AAG CCT GTA GCC 3′EcoR I起始碼Arg Lys Arg hTNF11-14位氨基酸編碼序列引物2的序列及組成為5′CG GACGTC TCA GAA GGC AAT GAT CCC 3′Pst I終止碼Phe hTNF156-153位氨基酸編碼序列應(yīng)用含hTNF cDNA的質(zhì)粒pBVTNF202為PCR擴(kuò)增模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一長(zhǎng)約470bp的DNA片段。將擴(kuò)增片段經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切后，克隆入pUC18和pUC19的EcoR I和Pst I酶切位點(diǎn)之間，測(cè)定擴(kuò)增片段的DNA序列，結(jié)果表明，該P(yáng)CR擴(kuò)增片段與天然人TNF相比較，5′未端缺失了7個(gè)氨基酸的編碼序列，天然人TNF基因中編碼Pro8Ser9Asp10的編碼序列由ArgLysArg的編碼序列取代，157位Leu的密碼子被Phe的密碼子取代。b.高效表達(dá)載體的構(gòu)建將含人TNF突變基因的pUC19經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收470bp的DNA片段，插入原核高效表達(dá)載體pBV220中。c.工程菌的建立宿主菌為大腸桿菌DH5a。將連接好的pBVnrhTNF用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a株，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上挑取菌落，LB培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Pst I雙酶切，篩選出目的菌株。d.pBV nrhTNF在大腸桿菌中的表達(dá)將經(jīng)篩選后的pBVnrhTNF/DH5a30℃培養(yǎng)，42℃誘導(dǎo)5小時(shí)，菌體經(jīng)載樣緩沖液處理。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，染色，脫色，干膠后掃描分析，在分子量16.5KD左右處有明顯表達(dá)條帶，此帶占菌體總蛋白的67.4％。e.nrhTNF實(shí)驗(yàn)室純化pBVnrhTNF/DH5a表達(dá)菌經(jīng)誘導(dǎo)后收集菌體。菌體用溶菌酶裂解，取裂菌上清加入(NH4)2SO4達(dá)50％飽和度，上清用10mmol/Tris·Cl pH8.5，1mmol/L EDTA充分透析。粗提液經(jīng)Q-Sepherose柱層析，0-0.5mol/LNaCl線性梯度洗脫，收集含有nrhTNF的第一峰。透析除鹽后，經(jīng)S-Sepherose柱層析，0-1mol/L NaCl線性梯度洗脫，收集nrhTNF活性峰，稀釋，過(guò)濾，分裝，冷凍干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型人腫瘤壞死因子突變體，其特征在于還可將帶有此突變體基因的菌株做為工程菌來(lái)生產(chǎn)治療腫瘤的生物藥品。
全文摘要
新型人腫瘤壞死因子突變體,涉及基因工程技術(shù),應(yīng)用PCR技術(shù)將人腫瘤壞死因子基因中編碼氨基末端的7個(gè)氨基酸序列缺失,將編碼Pro
文檔編號(hào)C12N15/70GK1182793SQ96118830
公開日1998年5月27日 申請(qǐng)日期1996年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月19日
發(fā)明者張英起, 王增祿, 趙寧 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)