專利名稱：制備干酪的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由酶處理干酪(cheese)用乳來(lái)制備干酪的方法，以及所獲得的干酪在作為食品成分中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在干酪產(chǎn)品中，脂肪相的狀態(tài)對(duì)干酪的特性非常重要。脂肪相對(duì)于制作和成熟過(guò)程中干酪的穩(wěn)定尤其重要，對(duì)于要使用的最終于酪也很重要，如食用或制備即食食品例如比薩餅、烤面包或夾餡包(burgers)中的應(yīng)用也很重要。
同樣，干酪產(chǎn)品的油脂析出(oiling-off)特性是重要的質(zhì)量參數(shù)。油脂析出是在貯藏和熔解中形成游離油的一種趨向。過(guò)度油脂析出經(jīng)常與利用干酪的加熱產(chǎn)品如比薩餅及相關(guān)食品有關(guān)的最主要缺點(diǎn)(參考文獻(xiàn)如KindstedtJ.S；Rippe J.K.1990，J Dairy Sci.73867-873)。越來(lái)越需要控制/消除這種缺點(diǎn)，這是由于消費(fèi)者關(guān)注食用脂肪含量的增加。產(chǎn)品中游離油/脂肪被認(rèn)為脂肪含量高，而通常不受人們所歡迎。
因此需要對(duì)干酪的制備工藝進(jìn)行改進(jìn)，特別是需要干酪中的脂肪穩(wěn)定性得到改善的制備工藝。
WO 00/54601公開(kāi)了一種制備特性改善的干酪的方法，特別是改善了脂肪的穩(wěn)定性，其中包括如下步驟a)用磷脂酶處理制干酪用乳和b)由制干酪用乳獲得干酪。磷脂酶可選自磷脂酶A1，磷脂酶A2，磷脂酶B及它們的組合，加入量達(dá)到足以降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種制備干酪的方法，包括將磷脂酶A和溶血磷脂酶組合加入到制干酪用乳中，加入的酶量可有效降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量，進(jìn)而由制干酪用乳制得干酪。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入選自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其組合的磷脂酶；和溶血磷脂酶；以降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量；和由制干酪用乳制得干酪。
因此，本發(fā)明提供一種制備改善特性的干酪的方法，特別是，干酪和制干酪用乳中的脂肪穩(wěn)定性得到改善。雖然不局限于操作上的任何理論，相信在制備干酪過(guò)程中加入磷脂酶A和溶血磷脂酶于制干酪用乳可以提高由所述處理的制干酪用乳中制備成的干酪的熱處理過(guò)程中的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明方法也提供一種增加干酪產(chǎn)品的產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及磷脂酶A和溶血磷脂酶組合使用于干酪產(chǎn)品的制造過(guò)程中，其中磷脂酶A和溶血磷脂酶于干酪制備過(guò)程中對(duì)制干酪用乳進(jìn)行處理。本發(fā)明也涉及能得到的干酪，具體地說(shuō)是通過(guò)此處描述的任何方法獲得的干酪。
本發(fā)明也涉及一種制備干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入選自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其組合的純化的磷脂酶；與溶血磷脂酶；以降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量，進(jìn)而由制干酪用乳獲得干酪。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種制備干酪的方法，包括將磷脂酶A和溶血磷脂酶組合加入到制干酪用乳，以降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量，由制干酪用乳制得干酪。磷脂酶A優(yōu)選地選自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其組合。
磷脂酶A和溶血磷脂酶在干酪制作過(guò)程中加入到制干酪用乳中，在此處，術(shù)語(yǔ)“制干酪用乳”是指用于制備干酪的基于乳的組合物。
磷脂酶A和溶血磷脂酶可在干酪制作過(guò)程中的任何合適的階段中加入。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶是在制干酪用乳的脂肪和/或蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)化的時(shí)候加入，更優(yōu)選地，在制干酪用乳填充到干酪槽中的同時(shí)、在起子培養(yǎng)物加入到制干酪用乳中的同時(shí)或干酪凝乳酶(rennet)加入制干酪用乳的同時(shí)加入所述酶。
在干酪制作過(guò)程中，將磷脂酶A和溶血磷脂酶同時(shí)或按先后順序加入。在一個(gè)實(shí)施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶在制作過(guò)程的不同階段加入，例如磷脂酶A在溶血磷脂酶加入之前加入或溶血磷脂酶在磷脂酶A加入之前加入。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶在制作干酪過(guò)程中是同時(shí)加入的。
制干酪用乳和干酪制備在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“干酪”是指任何形式的干酪，諸如天然的干酪、干酪類(lèi)似物、融化干酪(processed cheese)。用現(xiàn)有技術(shù)中合適的方法獲得的干酪，如用凝乳酶對(duì)制干酪用乳進(jìn)行酶凝，或用食品降解酸或乳酸細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酸對(duì)制干酪用乳進(jìn)行酸凝。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法制作的干酪是凝乳酶凝乳的干酪。凝乳酶可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得，如Naturen(動(dòng)物凝乳酶)、Chy-max(發(fā)酵產(chǎn)生的凝乳酶)、Microlant(發(fā)酵產(chǎn)生的微生物助凝劑)、及來(lái)自Chr.Hansen A/S(Denmark)的產(chǎn)品。制干酪用乳可以用于常規(guī)干酪制作過(guò)程中。
融化干酪優(yōu)選由天然干酪或干酪類(lèi)似物經(jīng)過(guò)烹飪處理和乳化干酪來(lái)獲得，例如，用乳化鹽(如磷酸鹽和檸檬酸鹽)。進(jìn)一步地可包括加入香料/調(diào)味品。
術(shù)語(yǔ)“干酪類(lèi)似物”指類(lèi)干酪產(chǎn)品，包含脂肪如乳脂(如奶油)作為組成成分的一部分，并且進(jìn)一步地包含非乳成分如植物油作為組合物成分的一部分。干酪基料(base)是干酪類(lèi)似物的例子之一。
本發(fā)明方法生產(chǎn)的干酪包括所有種類(lèi)的干酪，例如Campesino、Chester、Danbo、Drabant、Herregard、Manchego、Provolone、Saint、Paulin、Soft cheese、Svecia、Taleggio、White cheese，包括由干酪凝乳的凝乳酶凝乳制備的凝乳酶凝乳干酪；成熟干酪如Cheddar、Colby、Edam、Muenster、Gryere、Emmenthal、Camembert、Parmesan和Romano；新鮮干酪如Mozzarella和Feta；酸凝干酪如奶油干酪、Neufchatel、Quarg、Cottage Cheese和QuesoBlanco；以及pasta filata干酪。一個(gè)具體實(shí)施方式
涉及本發(fā)明方法產(chǎn)生的牛奶軟干酪(pizza cheese)產(chǎn)品。
在干酪制備過(guò)程中，對(duì)乳中的酪蛋白進(jìn)行凝結(jié)的方式優(yōu)選的有兩種稱為凝乳酶酶凝干酪和酸凝干酪。這兩種凝結(jié)方式的干酪產(chǎn)品構(gòu)成兩大類(lèi)干酪類(lèi)型。新鮮酸凝干酪指通過(guò)酸化或酸與熱結(jié)合使乳、奶油或乳清凝結(jié)產(chǎn)生的各種類(lèi)型干酪，其中在成熟過(guò)程沒(méi)有完成即可消費(fèi)。新鮮酸凝干酪通常與酶凝干酪種類(lèi)(如Camembert、Cheddar、Emmenthal)不同，因后者凝結(jié)是通常通過(guò)凝乳酶于pH6.4-6.6下作用導(dǎo)致的，其中凝結(jié)通常在接近酪蛋白的等電點(diǎn)即pH4.6附近或當(dāng)提高溫度而在更高pH下發(fā)生，如Ricotta中的凝結(jié)是在pH6.0和80℃下發(fā)生。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，干酪屬于凝乳酶凝結(jié)干酪種類(lèi)。
Mozzarella是所謂pasta filata或伸展凝乳(stretched curd)干酪中的一種，通常特點(diǎn)是通過(guò)獨(dú)特的增塑和捏合于熱水中處理新凝結(jié)的凝乳的干酪，賦予成品干酪具有纖維結(jié)構(gòu)特性和融化和伸展特性，參考文獻(xiàn)如“Mozzarellaand Pizza cheese”by Paul S.Kindstedt，CheeseChemistry，physics andmicrobiology，Volume 2Major Cheese groups，second edition，page 337-341，Chapman & Hall。在此處，牛奶軟干酪包括適合于制備比薩餅的干酪，且它通常是pasta filata/伸展凝乳(stretched curd)干酪。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括正如pasta filata干酪如制備Mozzarella過(guò)程中的熱/伸展處理。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式，制干酪用乳完全或部分由干乳部分，如全脂奶粉、脫脂奶粉、酪蛋白、酪蛋白酸鹽、總?cè)榈鞍踪|(zhì)或酪乳粉，或它們的任何組合制備而成。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，將要用于磷脂酶A和溶血磷脂酶處理的制干酪用乳包括或由奶油組成。進(jìn)一步的實(shí)施方式，將要用于磷脂酶A和溶血磷脂酶處理的制干酪用乳包括或由黃油組成。更進(jìn)一步的實(shí)施方式，將加入了磷脂酶A和溶血磷脂酸的制干酪用乳包括或由酪乳組成。
由不同種類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生的奶均可用于生產(chǎn)干酪。因此，“奶”可以是通過(guò)奶牛、綿羊、山羊、水牛(buffaloe)或駱駝擠奶獲得的乳分泌液。
用于生產(chǎn)干酪的奶可通過(guò)去除所有或部分原料乳中的成分和/或通過(guò)增加額外量的這些成分來(lái)使其達(dá)到欲期標(biāo)準(zhǔn)。這可在到達(dá)乳場(chǎng)時(shí)將原料乳分成奶油和脫脂乳。因此，可通過(guò)常規(guī)方法對(duì)原料乳進(jìn)行分餾和將分餾餾份重新組合以獲得欲期最終的制干酪用乳組合物?？赏ㄟ^(guò)連續(xù)離心分離得到低脂肪含量(也即例如＜0.5％)脫脂乳部分和如＞35％脂肪的奶油。制干酪用乳可通過(guò)將奶油和脫脂乳混合而得到。
加入了磷脂酶A和溶血磷脂酶的制干酪用乳包含磷脂，如卵磷脂。發(fā)現(xiàn)制干酪用乳含有的總脂肪含量應(yīng)可適合于通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)干酪，如約25％的脂肪(干物質(zhì))，范圍為10-50％，其中例如占總脂肪含量的約0.06％為磷脂，例如總脂肪含量范圍的0.02％-5％(w/w)是磷脂。
可通過(guò)常規(guī)步驟將制干酪用乳中的細(xì)菌數(shù)控制在安全范圍內(nèi)。通常不優(yōu)選利用巴氏滅菌法對(duì)脫脂乳進(jìn)行滅菌，因?yàn)樵谥聘衫矣萌橹泻袩嶙冃缘鞍讓?duì)奶的凝結(jié)有負(fù)作用，并延遲干酪的成熟。脫脂乳部分中的細(xì)菌數(shù)可通過(guò)其它技術(shù)如微量過(guò)濾或細(xì)菌離心法(bactofugation)來(lái)控制。奶油優(yōu)選通過(guò)巴氏滅菌法來(lái)降低細(xì)菌數(shù)量。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，制干酪用乳是未經(jīng)巴氏滅菌的原料乳。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，制干酪用乳在用于生產(chǎn)干酪之前進(jìn)行勻化處理，如在生產(chǎn)Danish Blue Cheese的過(guò)程中。
酶處理在本發(fā)明方法中的酶處理可以是將磷脂酶A和溶血磷脂酶分散于制干酪用乳中，在合適的溫度下保持合適時(shí)間以進(jìn)行酶反應(yīng)。用磷脂酶A和溶血磷脂酶進(jìn)行處理可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的原則來(lái)確定所選擇的酶的反應(yīng)條件。
酶處理可在任何合適的pH，如pH2-10范圍內(nèi)，或pH4-9或5-7范圍進(jìn)行。可以優(yōu)選地讓磷脂酶A和溶血磷脂酶在干酪制備過(guò)程中的制干酪用乳的本身pH條件進(jìn)行酶處理。
按照能夠使磷脂酶A和溶血磷脂酶起反應(yīng)的溫度條件，如25-45℃下進(jìn)行酶處理(如至少反應(yīng)5分鐘、例如至少10分鐘或至少30分鐘，如反應(yīng)5-60分鐘)。
任選地，在磷脂酶A和溶血磷脂酶在制干酪用乳中發(fā)揮作用后，對(duì)磷脂酶A和/或溶血磷脂酶蛋白進(jìn)行去除、減少、失活或其組合等操作。
加入合適量的磷脂酶A和溶血磷脂酶以產(chǎn)生具有期望特性的干酪。優(yōu)選地，磷脂酶A和溶血磷脂酶的加入量能有效地降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量。磷脂酶A的合適劑量通常為每克乳脂加入0.003-0.3mg酶蛋白，優(yōu)選為0.01-0.3mg，更優(yōu)選為0.03mg酶蛋白。
溶血磷脂酶的用量通常為每克乳脂加入0.005-0.5mg酶蛋白，優(yōu)選為0.01-0.5mg，更優(yōu)選為0.05mg酶蛋白。
可用于本發(fā)明方法的酶磷脂，如卵磷脂或磷脂酰膽堿，由兩個(gè)脂肪酸在外部(sn-1)和中部(sn-2)位置酯化及在第三個(gè)位由磷酸酯化的甘油所構(gòu)成；磷酸也可以對(duì)氨基醇進(jìn)行酯化。磷脂酶是參與磷脂水解的酶。可以區(qū)分幾種類(lèi)型的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，可水解一個(gè)酯?；鶊F(tuán)(分別在sn-1和sn-2位置)而形成溶血磷脂。溶血磷脂中殘留的酯?；鶊F(tuán)被溶血磷脂酶所水解。
在本發(fā)明方法中使用的酶包含磷脂酶A和溶血磷脂酶。術(shù)語(yǔ)磷脂酶A包括磷脂酶A1、磷脂酶A2和兩者的結(jié)合，如將具有磷脂酶A1活性的酶與具有磷脂酶A2活性的酶結(jié)合使用或同時(shí)具磷脂酶A1和磷脂酶A2兩種活性的單一酶。
磷脂酶A1根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酶EC分類(lèi)被定義為EC3.1.1.32。
法定名稱為磷脂酶A1。
催化的反應(yīng)磷脂酰膽堿+H(2)O＜＞2-?；视土姿崮憠A+脂肪酸陰離子。
備注具有比EC3.1.1.4更廣泛的特異性。
磷脂酶A2根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酶EC分類(lèi)被定義為EC3.1.1.4。
法定名稱為磷脂酶A2。
別名磷脂酰膽堿2-?；饷?、卵磷酯酶a、磷脂酶或磷脂酰脂酶(phosphatidolipase)。
催化的反應(yīng)磷脂酰膽堿+h(2)O＜＞1-?；视土姿崮憠A+脂肪酸陰離子。
備注也可作用于磷脂酰乙醇胺、膽堿縮醛磷脂和磷脂，去除第2位上的脂肪酸。
溶血磷脂酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酶EC分類(lèi)被定義為EC3.1.1.5。
法定名稱為溶血磷脂酶。
別名卵磷酯酶b、溶血卵磷脂酶、磷脂酶B或PLB。
催化的反應(yīng)2-溶血磷脂酰膽堿+h(2)O＜＞甘油磷酸膽堿+脂肪酸陰離子。
磷脂酶A活性也可能由具有其它活性的酶提供，如具有磷脂酶A活性的脂肪酶。磷脂酶A活性可以是來(lái)自于例如附帶磷脂酶A活性的脂肪酶。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，磷脂酶A活性是由基本上只有磷脂酶A活性的酶提供，其中磷脂酶A活性不是附帶的活性。
可用任何來(lái)源的磷脂酶A，如來(lái)源于動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)，如來(lái)自胰腺(如牛或豬的胰腺)，或來(lái)源于蛇毒液或蜜蜂毒液等?？蛇x地，磷脂酶A來(lái)源于微生物，如來(lái)自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌，如曲霉屬(Aspergillus)的種類(lèi)，黑曲霉(A.niger)、Dictyostelium的例如D.discoideum；毛霉屬(Mucor)的例如爪哇毛霉(M.javanicus)，大毛霉(M.mucedo)，細(xì)胞毛霉(M.subtilissimus)；鏈孢霉屬(Neurospora)的例如粗糙鏈孢霉(N.crassa)；Rhizomucor的例如R.pusillus；根霉屬(Rhizopus)的例如無(wú)根根霉(R.arrhizus)；日本根霉(R.japonicus)和葡枝根霉(R.stolonifer)；核盤(pán)菌屬(Sclerotinia)的例如大豆核盤(pán)菌(S.libertiana)；發(fā)癬菌屬(Trichophyton)的深紅色發(fā)癬菌(T.rubrum)；Whetzelinia的例如W.Sclerotiorum；芽孢桿菌屬(Bacillus)的例如巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)；檸檬桿菌屬(Citrobacter)的例如弗勞地氏檸檬桿菌(C.freundii)；腸桿菌屬(Enterobacter)的例如產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)、愛(ài)德華氏菌屬(E.dwardsiella)、遲鈍愛(ài)德華氏菌(E.tarda)；歐文氏桿菌屬(Erwinia)的例如草生歐文氏桿菌(Eherbicola)；埃希氏桿菌屬(Escherichia)的例如大腸桿菌(E coli)；克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)的例如肺炎克雷白氏桿菌(K.Pneumoniae)；變形菌屬(Proteus)的例如普通變形菌(P.vulgaris)；普羅威登斯菌屬(Providencia)的例如司徒氏普羅威斯菌(P.stuartii)；沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)的例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌屬(Serratia)的例如解凝沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)；志賀氏菌屬(Shigella)的例如弗氏志賀氏菌(S.flexneri)；鏈霉菌屬(Streptomyces)的例如S.violeceoruber；耶爾森氏菌屬(Yersinia)的例如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Y.Enterocolitica)。因此，磷脂酶A可以來(lái)自于真菌例如核菌綱(Pyrenomycetes)，如鐮孢屬(Fusarium)，例如黃色鐮孢(F.culmorum)，異孢鐮孢(F.Heterosporum)、腐皮鐮孢(F.Solani)或尖鐮孢(F.Oxysporum)等菌株。磷脂酶A可以來(lái)自于曲霉屬的絲狀真菌菌種，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)。優(yōu)選地磷脂酶來(lái)自鐮孢屬的菌株，具體的是描述于WO 98/26057的來(lái)自于尖鐮孢(F.oxysporum)的DSM 2672菌株，尤其是可參見(jiàn)WO98/26057的權(quán)利要求36和SEQ ID NO.2。進(jìn)一步的實(shí)施方式中，磷脂酶A是公開(kāi)于WO 00/32758(Novozymes A/S，Denmark)的一種磷脂酶。
溶血磷脂酶術(shù)語(yǔ)“溶血磷脂酶”此處指包括具有溶血磷脂酶活性的酶。
溶血磷脂酶活性也可能由具有其它活性酶提供，如具有溶血磷脂酶活性的脂肪酶。溶血磷脂酶活性可以是來(lái)自于例如脂肪酶附帶的溶血磷脂酶活性。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，溶血磷脂酶活性是由基本上只有溶血磷脂酶活性的酶提供，其中溶血磷脂酶活性不是附帶的活性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，溶血磷脂酶不是如WO 98/26057中定義的具有溶血磷脂酶附帶活性的脂肪酶。
可用任何來(lái)源的溶血磷脂酶，如來(lái)源于動(dòng)物源(如哺乳動(dòng)物)，如來(lái)自肝(如大鼠肝)。可選地，溶血磷脂酶來(lái)源于微生物，如來(lái)自絲狀真菌、酵母或細(xì)菌，如曲霉屬的例如臭曲霉、煙曲霉(A.fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉、米曲霉；葡萄孢屬(Botrytis)的例如灰色葡萄孢(B.cinerea)；假絲酵母屬(Candida)的白色假絲酵母(C.albicans)；隱球酵母屬(Cryptococcus)的例如新型隱球酵母(C.neoformans)；埃希氏桿菌屬的例如大腸桿菌；鐮孢屬的例如擬分枝孢鐮孢(F.sporotrichioides)、F.Venenatum、F.verticillioides；Hyphozyma；克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)的例如乳克魯維氏酵母(K.lactis)；Magnaporte的例如M.grisea；綠僵菌屬(Metarhizium)的例如金龜子綠僵菌(M.anisopliae)；球腔菌屬(Mycosphaerella)的例如禾生球腔菌(M.graminicola)；鐮孢霉屬(Neurospora)的例如粗糙鐮孢霉(N.Crassa)；青霉屬(Penicillium)的例如點(diǎn)青霉(P.notatum)；糖酵母屬(Saccharomyces)的例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)；裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)的例如粟酒裂殖糖酵母(S.pombe)；有孢圓酵母屬(Torulaspora)的例如戴爾凱氏有孢圓酵母(T.delbrueckii)；弧菌屬(Vibrio)的例如霍亂弧菌(V.Cholerae)。優(yōu)選地溶血磷脂酶來(lái)自曲霉屬的菌株，具體的是來(lái)自于黑曲霉的溶血磷脂酶LLPL-1或LLPL-2，它們包含在大腸桿菌DSM 13003或DSM 13004克隆中，或者來(lái)自于米曲霉的溶血磷脂酶LLPL-1 or LLPL-2，例如它們包含在大腸桿菌DSM 13082或DSM 13083中，這些均描述于WO 01/27251，具體參見(jiàn)其權(quán)利要求1和SEQ ID NOs.2、4、6或8。
兼有磷脂酶A和溶血磷脂酶活性的酶本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，磷脂酶A和溶血磷脂酶活是由兼具這兩種酶活性的單酶所提供。例如，一個(gè)實(shí)施方式中使用的單酶兼有磷脂酶A1活性和溶血磷脂酶活性，另外一個(gè)實(shí)施方式中的單酶兼有磷脂酶A2活性和溶血磷脂酶活性，再有的實(shí)施方式中的單酶兼有磷脂酶A1活性、磷脂酶A2活性和溶血磷脂酶活性。
因此，本發(fā)明也涉及一種制備干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入一種兼有磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活性的酶，以降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量，由制干酪用乳制得干酪。
兼有磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活性的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。兼有磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活的酶的例子可見(jiàn)于Saito et al.，Methods inEnzymology(1991)197，446-456和Lee et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，19725-19730。
酶源和成分(formulation)本發(fā)明方法使用的磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可以衍生自或可獲得自此處提及的任何來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“衍生”在本文中指可以從生物體中分離出的天然存在酶，即酶的氨基酸序列同一性與天然酶一致。術(shù)語(yǔ)“衍生”也指由宿主生物體重組產(chǎn)生的酶，重組酶可具有與天然酶的氨基酸序列完全相同，也可具有修飾的氨基酸序列，例如一或多個(gè)氨基酸被缺失、插入和/或取代，即重組酶是天然氨基酸序列的突變體和/或其片段。此外，術(shù)語(yǔ)“衍生”包括合成制備的酶如通過(guò)肽合成方法。術(shù)語(yǔ)“衍生”也包含在體內(nèi)或體外被修飾的酶，如糖基化、磷酸化等修飾。術(shù)語(yǔ)“可獲得的”在本文中指具有與天然酶的氨基酸一致的酶。該術(shù)語(yǔ)包含從生物體中分離出的天然酶，或由同一或不同的宿主生物體重組產(chǎn)生的酶，或如通過(guò)肽合成方法合成的酶。對(duì)于重組產(chǎn)生的酶而言，術(shù)語(yǔ)“可獲得的”和“衍生”指酶的同一性，而不是重組產(chǎn)生其的宿主生物的同一性。
相應(yīng)地，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可用合適的技術(shù)從微生物中獲得。例如，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶的制備可通過(guò)選擇合適的微生物進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)而用已知的方法從發(fā)酵液或微生物菌體中分離出磷脂酶A和/或溶血磷脂酶。也可通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)獲得磷脂酶A和/或溶血磷脂酶。這種方法通常包括培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中載體含有編碼所研究的磷脂酶A或溶血磷脂酶的DNA序列，并且該DNA序列可操作連接于合適的表達(dá)信號(hào)以便在合適的能夠表達(dá)出相應(yīng)的酶培養(yǎng)條件下能表達(dá)磷脂酶A酶和溶血磷脂酶，進(jìn)而可從培養(yǎng)基中收集相應(yīng)的酶。DNA序列也可整合到宿主細(xì)胞的基因組中。DNA序列也可以是基因組DNA、cDNA或合成的DNA或者它們的組合，并可根據(jù)已知方法來(lái)分離或合成。
合適的磷脂酶可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。實(shí)際應(yīng)用的酶的典型例子，優(yōu)選地使用衍生自胰腺的磷脂酶A2，如Lecitase(Novozymes A/S)。合適的溶血磷脂酶是描述于WO 01/27251的可由黑曲霉(Aspergillus niger)重組表達(dá)產(chǎn)生的A.niger溶血磷脂酶LLPL-2。
本發(fā)明方法所用磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可以是純化的。在此處使用的術(shù)語(yǔ)“純化的”含蓋不含有來(lái)自于生物體的其它成分的磷脂酶A或溶血磷脂酶蛋白。術(shù)語(yǔ)“純化的”也含蓋不含有天然生物體的其它成分的磷脂酶A或溶血磷脂酶蛋白，也稱為“基本純”的磷脂酶A或溶血磷脂酶，尤其可以是天然產(chǎn)生的磷脂酶A或溶血磷脂酶而沒(méi)有進(jìn)行遺傳修飾，如缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
因此，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶純化至只含有極微量的其它蛋白。所述“其它蛋白”尤其指其它的酶。在此處“純化的”指除去了來(lái)自磷脂酶A或溶血磷脂酶的細(xì)胞的其它成分，尤其是去除了其它蛋白，更尤其是去除了其它的酶。磷脂酶A或溶血磷脂酶可以“基本純”的，即不含有來(lái)自產(chǎn)生其的生物體的其它成分，如不含來(lái)自重組產(chǎn)生磷脂酶A或溶血磷脂酶的宿主細(xì)胞的其它成分。優(yōu)選地，酶至少75％(w/w)的純度，更優(yōu)選為至少80％、85％、90％，甚至至少95％的純度。在更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，磷脂酶A或溶血磷脂酶至少98％的純度。在其它的實(shí)施方式中，磷脂酶A和/或溶血磷脂酶不是奶中的天然存在的酶。
術(shù)語(yǔ)“磷脂酶”和“溶血磷脂酶”包括了對(duì)于酶的催化反應(yīng)所需要的輔助物質(zhì)，如適當(dāng)?shù)氖荏w和協(xié)同因子，它們可以是也可以不是反應(yīng)體系中自然存在的物質(zhì)。
磷脂酶A和/或溶血磷脂酶可以是適合于所述用途的任何形式，如干粉或顆粒狀、無(wú)粉塵的顆粒、液體、穩(wěn)定化液體或保護(hù)酶。顆粒的制備可按如US 4106991和US 4661452中公開(kāi)的方法進(jìn)行，任選地用已知方法對(duì)酶進(jìn)行包覆?？砂垂姆椒?，例如通過(guò)添加穩(wěn)定劑如蔗糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有機(jī)酸等使液體酶制劑穩(wěn)定?？筛鶕?jù)EP 238216披露的方法制備保護(hù)酶。
與其它類(lèi)似方法但沒(méi)有用此處所提及的磷脂酶A和溶血磷脂酶進(jìn)行處理所得的干酪相比，通過(guò)本發(fā)明方法制備的干酪，其中的卵磷脂含量相比降低至少5％，例如至少10％，至少20％，至少50％，例如在5％-95％的范圍內(nèi)。
對(duì)牛奶而言，磷脂中有超過(guò)95％的是卵磷脂，而溶血卵磷脂大約只占1％。雖然在牛奶中，磷脂通常只占總脂肪含量的不到1％，但起到非常重要的作用，通常主要存在于奶脂肪球(milk fatglobue)膜。通過(guò)本發(fā)明方法，獲得的干酪中卵磷脂含量低于總磷脂含量的90％、例如低于80％、例如低于60％或低于50％。卵磷脂含量可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行測(cè)定，如通過(guò)HPLC。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用按本發(fā)明方法獲得的干酪在比薩餅、即食食品(ready-to-eat dishes)、融化干酪的應(yīng)用或作為其它食品的成分。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明方法獲得的干酪可用于進(jìn)一步加工的食品，如融化干酪(processedcheese)、比薩餅(pizza)、夾餡包(burgers)、烤面包(toast)、調(diào)味料(sauces)、調(diào)味品(dressing)、干酪干粉(cheese powder)或干酪調(diào)料(flavours)。
進(jìn)一步的實(shí)施方式，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括對(duì)干酪進(jìn)行加熱處理，如加熱到150-350℃。
本發(fā)明也涉及可獲得的干酪(cheese obtainable)，尤其是通過(guò)本發(fā)明方法獲得的干酪。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，但不對(duì)本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范圍有任何限制。
實(shí)施例1添加磷脂酶A和溶血磷脂酶以生產(chǎn)干酪酶制劑
A0.03mg酶蛋白/g脂的磷脂酶A(Lecitase10 L，由Novozymes A/S，Denmark生產(chǎn))B0.05mg/g乳脂的溶血磷脂酶(黑曲霉溶血磷脂酶LLPL-2，由黑曲霉重組產(chǎn)生，見(jiàn)于WO 01/27251)。
C上述A和B酶的組合。
干酪的制備用巴氏滅菌的非勻化奶油(North Carolina State University Dairy Plant)將巴氏滅菌的非勻化脫脂乳標(biāo)準(zhǔn)化至3.5％脂肪以生產(chǎn)全脂的Mozzarella干酪。
起子培養(yǎng)物制備是通過(guò)添加0.1g Rhodia LH100和0.3g Rhodia TA061起子培養(yǎng)物于50ml脫脂乳中，于35℃溫和連續(xù)攪拌培養(yǎng)以平衡。標(biāo)準(zhǔn)化的制干酪用乳預(yù)平衡到35℃，并分成3份。1.4％起子培養(yǎng)物加入到每一批中，同時(shí)將上述提及的A、B和C酶制劑在溫和攪拌下分別加入到一份中去。
當(dāng)pH達(dá)到6.45-6.50時(shí)，將0.01％凝乳酶(Chymax，發(fā)酵產(chǎn)生的凝乳酶，由Chr.Hansens Lab.，Denmark制造)在劇烈攪拌下3分鐘內(nèi)加入到每一份中。移去攪拌器，讓奶進(jìn)行凝結(jié)。用刀或抹刀向下切入凝乳中來(lái)確定適當(dāng)?shù)那邢鲿r(shí)間(cutting time)。然后，將抹刀插入到凝乳的切口的下面，再垂直于切口方向進(jìn)行切削，并將凝乳升高。當(dāng)凝乳通過(guò)提升可分隔開(kāi)，并且鋒利的邊緣保持在切口邊緣的上表面時(shí)，認(rèn)為可以進(jìn)行切削。用1/2英尺刀片進(jìn)行切削，并且在切削后靜止5分鐘。
在溫和和間歇地?cái)嚢钘l件下，將溫度升高到41℃，并保持至pH達(dá)到5.65-5.70。然后，排除乳清，將凝乳微粒倒入到不銹鋼杯中。杯于41℃水浴中漂浮以保持凝乳的溫度，繼續(xù)定期的排除過(guò)多乳清，直到剛剛足以覆蓋凝乳以保持其熱量為止。
當(dāng)凝乳的pH達(dá)到5.25-5.3時(shí)，去除所有的乳清，凝乳淹沒(méi)于57℃的去離子水中5分鐘。用手將凝乳拉伸1分鐘，并返回到57℃水中以恢復(fù)所需要的溫度。拉伸的凝乳插入到室溫自來(lái)水中10-15分鐘，然后印干和冷藏。
油脂析出的確定將干酪用攪拌機(jī)磨碎20秒至均勻的樣品。約3.0克磨碎干酪入模到金屬環(huán)中(2.2cm直徑)，置于Whatman#4過(guò)濾紙的中間，再置于烤爐中90℃保持5分鐘以熔化。每一個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試三次。用圖像分析法測(cè)定油脂析出，因?yàn)樵谌刍^(guò)程中，金屬環(huán)中的干酪周?chē)纬捎铜h(huán)和干酪圓周的面積之間的具有差值。計(jì)算油脂析出的公式如下油脂析出＝(總面積-干酪面積)×100/干酪的面積結(jié)果下表1中列出了結(jié)果(蛋白質(zhì)、濕度、脂肪和油脂析出)。
表1

從表1的結(jié)果可知，添加磷脂酶A比添加溶血磷脂酶能更好的減少油脂析出，但兩種酶都添加時(shí)，油脂析出更低，表明兩種酶之間有增效作用。
實(shí)施例2奶與磷脂酶A和溶血磷脂酶反應(yīng)形成長(zhǎng)鏈脂肪酸底物制備和酶處理用脫脂乳將奶油標(biāo)準(zhǔn)化成25％的脂肪含量。用磷脂酶A(Lecitase10 L，Novozymes A/S，Denmark)、溶血磷脂酶(黑曲霉溶血磷脂酶LLPL2，由黑曲霉重組表達(dá)，見(jiàn)WO 01/27251)樣品以及兩種酶的組合處理樣品，所用酶量如表3所示。如果需要，將酶預(yù)先溶解于水中，再按適當(dāng)?shù)膭┝考尤氲侥逃椭小悠酚?5℃攪拌1.5小時(shí)。加入用于脂質(zhì)抽提的有機(jī)溶劑以終止反應(yīng)。
脂質(zhì)提取通過(guò)向樣品混合1ml水，進(jìn)而加入9ml氯仿/甲醇(2∶1)以抽提總奶脂質(zhì)。樣品劇烈混合均勻，于3000rpm離心5分鐘。將下層的6微升氯仿(CHCl3)相去除，并真空干燥。樣品在2ml氯仿中重新組合(reconstitute)。脂肪酸進(jìn)一步用固相抽提(SPE)進(jìn)行純化。每一個(gè)氯仿抽提樣品在真空下通過(guò)氨丙基SPE柱進(jìn)行純化。用4ml的氯仿/異戊醇(2∶1)以去除中性脂肪。脂肪酸用4ml冰醋酸(2％v/v)化的二乙醚進(jìn)行洗提。醚抽提物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，并用1.0ml甲醇進(jìn)行重組，以用于HPLC分析。
HPLC方法用Phenomenex(Torrance，CA USA)生產(chǎn)的LunaC8(150×4.6mm，5μ，100A)柱進(jìn)行反相色譜，其中流動(dòng)相是含0.1％三氟乙酸的乙腈和水。表2列出所用的梯度洗脫方案。被洗提的脂肪酸的檢測(cè)用蒸發(fā)光散射法(evaporative light scattering)進(jìn)行。選擇的HPLC脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)(亞麻酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸)是基于它們?cè)谂Ｄ痰目傊局惺莾?yōu)勢(shì)的脂肪酸。按照常規(guī)方法用100％甲醇制成2-10mg/ml的母液(stock solution)。用100％甲醇將脂肪酸母液稀釋到適當(dāng)濃度制備成HPLC校準(zhǔn)器。
表2用于HPLC脂肪酸分析的梯度洗脫方案

A＝100％乙腈B＝水/0.1％三氟乙酸磷脂酶A和/或溶血磷脂酶處理奶油樣品后產(chǎn)生的游離長(zhǎng)鏈脂肪酸的量如表3所示。從中可知，將磷脂酶A的用量由0.04mg/(g脂肪)增加到0.18mg/(g脂肪)，并沒(méi)有明顯增加產(chǎn)生游離脂肪酸的量。當(dāng)溶血磷脂酶與磷脂酶A組合使用時(shí)，產(chǎn)生的脂肪酸量明顯增加。
表3.用磷脂酶A和/或溶血磷脂酶處理奶油后產(chǎn)生的游離長(zhǎng)鏈脂肪酸的量

權(quán)利要求
1.一種制備干酪的方法，包括向制干酪用乳中加入選自磷脂酶A1、磷脂酶A2或其組合的磷脂酶；和溶血磷脂酶；降低干酪中的油脂析出效應(yīng)和/或提高干酪產(chǎn)量；并由制干酪用乳制備干酪。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中磷脂酶A的量為0.003-0.3mg酶蛋白/g乳脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中磷脂酶A的量為0.01-0.3mg酶蛋白/g乳脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中磷脂酶A的用量為0.03mg酶蛋白/g乳脂。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中磷脂酶A和/或溶血磷脂酶在制干酪用乳的脂肪和/或蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)化期間加入。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中磷脂酶A和/或溶血磷脂酶與起子培養(yǎng)物同時(shí)加入。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中磷脂酶A和/或溶血磷脂酶與干酪凝乳酶同時(shí)加入。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在磷脂酶A和/或溶血磷脂酶在制干酪用乳中已被允許發(fā)揮作用之后，去除或減少磷脂酶A和/或溶血磷脂酶蛋白含量的步驟。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在磷脂酶A和/或溶血磷脂酶在制干酪用乳中已被允許發(fā)揮作用之后，滅活磷脂酶A和/或溶血磷脂酶蛋白的步驟。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中干酪選自由凝乳酶凝結(jié)干酪凝乳產(chǎn)生的凝乳酶凝乳干酪、成熟干酪、新鮮干酪或酸凝干酪。
11.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中干酪選自Campesino，Chester，Danbo，Drabant，Herregard，Manchego，Provolone，Saint Paulin，Soft cheese，Svecia，Taleggio，White cheese，Cheddar、Colby、Edam、Muenster，Gryere，Emmenthal，Camembert，Parmesan，Romano，Mozzarella，F(xiàn)eta；cream cheese，Neufchatel，Quarg，或Queso Blanco。
12.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中制干酪用乳在制備干酪之前進(jìn)行均質(zhì)化處理。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中干酪是Danish Blue Cheese。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中磷脂酶A活性和溶血磷脂酶活性由兼具這兩種酶活性的單酶所提供。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將干酪加工成食物產(chǎn)品的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述食物產(chǎn)品選自比薩餅、即食食品、烤面包、夾餡包、寬面條(lasagna)、調(diào)味料、調(diào)味品、干酪粉或干酪調(diào)料或融化干酪。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)方法制備的干酪。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用酶處理制干酪用乳以制備干酪的方法，以及所獲得的干酪在作為食品成分中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及一種用磷脂酶A和溶血磷脂酶處理制干酪用乳來(lái)制備干酪的方法。
文檔編號(hào)A23L1/24GK1638647SQ03804373
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月20日
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