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烯酮還原酶的制作方法

文檔序號:548446閱讀:560來源:國知局
專利名稱:烯酮還原酶的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及參與從2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮(此后稱為酮異佛爾酮)生產(6R)-2,2,6-三甲基環(huán)己烷-1,4-二酮(此后成為左旋二酮)的新酶和生產所述酶的方法,其中所述酶作為烯酮還原酶起作用。
背景技術
左旋二酮是類胡蘿卜素,如玉米黃質合成中的重要中間體。公知從酮異佛爾酮生產左旋二酮的微生物方法,見例如美國專利4,156,100。
本發(fā)明的酶屬于烯酮還原酶類并且可以從酵母如乳酒假絲酵母(Candida kefyr)或者Zygosaccharomyces rouxii得到。從乳酒假絲酵母分離的酶是依賴于NADH和NADPH的,凝膠過濾層析下其分子量為61.3kDa。變性電泳條件下發(fā)現其由45kDa單亞基組成并且顯示出具有278,376和460nm吸收峰的紫外可見吸收光譜。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種具有下面的理化性質的分離的烯酮還原酶a)分子量61,300±5,000Da(由分子量45,000±5,000Da的一個亞基組成)b)輔因子NADPH和NADHc)底物專一性對α,β-不飽和酮具活性d)最適溫度pH7.4下55-60℃e)最適pH4.5-8.5。
如本文中所用的術語“烯酮還原酶”根據國際生物化學和分子生物學協(xié)會命名委員會(NC-IUBMB)提供的酶命名法包括催化羰基活化的雙鍵的酶促還原的蛋白。其還涉及具有上述烯酮還原酶活性的蛋白,所述蛋白優(yōu)選催化將酮異佛爾酮轉變成左旋酮。
更具體地,本發(fā)明涉及具有上述烯酮還原酶活性的分離蛋白,其源自能夠產生具有上述理化性質的所述蛋白的微生物。
本發(fā)明所用的微生物選自酵母,包括但不限于能夠產生此前所定義的烯酮還原酶的假絲酵母屬(Candida)或接合酵母屬(Zygosaccharomyces)微生物。所述微生物的功能性等價物、傳代培養(yǎng)物、突變株和變體也能夠用于本發(fā)明中。
在本發(fā)明的一個實施方案中,微生物是酵母,優(yōu)選假絲酵母,更優(yōu)選乳酒假絲酵母,最優(yōu)選乳酒假絲酵母(Candida macedoniensis)IFO 0960或它們的功能性等價物、傳代培養(yǎng)物、突變株和變體。菌株乳酒假絲酵母(Candida macedoniensis)IFO 0960可從大阪發(fā)酵研究所(Institute forFermentation Osaka,IFO)(17-85Juso-honmachi 2-chome,Yodogawa-ku,大阪,532-8686日本)公開地得到。
如本文所用,微生物“乳酒假絲酵母”或“Zygosaccharomyces rouxii”也包括如原核生物命名法國際編碼所定義的、具有相同理化性質的這些菌種的同物異名或有效名。
可通過在有氧條件下在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)合適的微生物,破壞微生物的細胞并從破壞的微生物細胞的無細胞提取物中分離純化烯酮還原酶來制備本發(fā)明提供的烯酮還原酶。
從而,本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產具有上面定義的理化性質的烯酮還原酶的方法,該方法包括在有氧條件下于水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產生上述性質的烯酮還原酶的微生物,破壞微生物的細胞并從所述細胞提取物中分離純化烯酮還原酶。
用于生產烯酮還原酶的方法中的微生物是上面已經定義的微生物。在本發(fā)明的一個實施方案中,用于生產烯酮還原酶的微生物是酵母,優(yōu)選假絲酵母,更優(yōu)選乳酒假絲酵母,最優(yōu)選乳酒假絲酵母(Candidamacedoniensis)IFO 0960或它們的功能性等價物、傳代培養(yǎng)物、突變株和變體。
本發(fā)明提供的烯酮還原酶可用作由酮異佛爾酮生產左旋二酮的催化劑。從而本發(fā)明的另一個目的是提供從酮異佛爾酮生產左旋二酮的方法,該方法包括(i)在NADH或NADPH存在下將酮異佛爾酮與具有上面定義的理化性質的烯酮還原酶接觸,(ii)將酮異佛爾酮與能夠產生(i)中定義的酶的所述微生物的細胞或無細胞提取物接觸,以及在每種情況下,從反應混合物中分離所得左旋二酮。
在一個實施方案中,能夠生產上面定義的酶并且用于生產左旋二酮的微生物是酵母,優(yōu)選假絲酵母,更優(yōu)選乳酒假絲酵母,最優(yōu)選乳酒假絲酵母IFO 0960或它們的功能性等價物、傳代培養(yǎng)物、突變株和變體??蓪⑽⑸锱囵B(yǎng)于含有糖(如葡萄糖或蔗糖)、醇(如乙醇或甘油)、脂肪酸(如油酸,硬脂酸)或其酯或油(如菜籽油或大豆油)作為碳源;硫酸銨、硝酸鈉、胨、氨基酸、玉米漿、麩、酵母提取物等作為氮源;硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等作為無機鹽來源;麥芽汁、肉膏等作為其他營養(yǎng)源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。可以進行有氧培養(yǎng),通常培養(yǎng)時間為1到7天,培養(yǎng)基pH3到9,培養(yǎng)溫度10到40℃。更優(yōu)選地,培養(yǎng)時間為2到4天,培養(yǎng)基pH5到8,培養(yǎng)溫度25到35℃。
下面簡單描述培養(yǎng)后從微生物中分離純化烯酮還原酶的實施方案(1)通過離心或過濾從培養(yǎng)液收獲細胞,(2)用水、生理鹽水或具有適宜pH的緩沖液洗滌收獲的細胞;(3)將洗滌后的細胞懸浮于緩沖液中并通過勻漿器、超聲器、弗氏壓碎器或用溶菌酶處理等進行破壞以得到破壞的細胞的溶液;和(4)從破壞的細胞的無細胞提取物中分離純化烯酮還原酶。
可以在溶劑如Tris-HCI緩沖液、磷酸緩沖液等中,在NADH或NADPH存在下,及pH約4.5到約8.5下進行反應。本發(fā)明的一個實施方案涉及用上面定義的烯酮還原酶或微生物從酮異佛爾酮生產左旋二酮的方法,其中反應在pH4.5到8.5下進行,優(yōu)選pH范圍5.0到8.0。
本發(fā)明的另一個方面涉及用上面定義的烯酮還原酶或微生物從酮異佛爾酮生產左旋二酮的方法,其中反應的溫度為30到60℃,優(yōu)選55到60℃。
當pH和溫度分別設定在5.0到8.0和45℃到60℃時,反應通常得到最佳結果。優(yōu)選地,pH為5.0到8.0并且溫度為55到60℃。
溶劑中酮異佛爾酮的濃度可以發(fā)生變化,這取決于其他反應條件,但是通常濃度為1mM到2M,優(yōu)選10mM到100mM。
反應中,烯酮還原酶也可以以具有合適載體的固定化狀態(tài)使用。可以使用本領域中一般公知的任何固定酶的方法。例如,酶可以直接結合到具有一個或多個官能團的樹脂膜或顆粒等上,或者其可以通過具有一個或多個官能團的橋接化合物如戊二醛結合到樹脂上。
本發(fā)明不僅涉及具有上述烯酮還原酶活性的酶的分離,還涉及用本領域已知的方法克隆編碼這些酶的相應基因。這些克隆的基因的cDNA可以用于導入合適的表達載體,然后將載體導入宿主細胞,例如大腸桿菌或酵母。重組蛋白可用于將酮異佛爾酮轉化成左旋二酮,這是生產類胡蘿卜素如actinol或玉米黃質的重要中間步驟。
根據下文提到的實施例制備的烯酮還原酶的純化樣品的理化性質如下1)酶活性根據下式,本發(fā)明的新烯酮還原酶在輔因子存在下催化酮異佛爾酮還原為左旋二酮酮異佛爾酮+NADH(HADPH)左旋二酮+NAD(NADP)如下進行標準的酶分析試驗將總體積1ml基本反應混合物(200μl1M Tris-HCl緩沖液pH7.5,100μl 80mM NADH或NADPH,100μl0.658M酮異佛爾酮,600μl H2O)補加5μl酶溶液并在40℃孵育。一單位酶活力定義為每分鐘催化1μmol酮異佛爾酮氧化的酶量。用1ml乙酸乙酯萃取反應混合物以將左旋二酮回收到乙酸乙酯層。通過氣相層析分析萃取物[柱子ULBON HR-20M(Shinwa,日本)0.25mmφ×30m,柱子溫度160℃(恒定),注射器溫度250℃,載氣He(約1ml/min)]。通過使用Bio-Rad蛋白分析試劑盒(Bio-Rad,美國)確定蛋白濃度。
2)分子量用凝膠過濾柱Superdex 200(Amersham Biosciences AB,SE-751 84Uppsala,瑞典)測量該蛋白的分子量(MW)。與分子量標準蛋白(BoehringerMannheim Biochemica德國)鐵蛋白(分子量450,000Da)、過氧化氫酶(分子量240,000Da)、醛縮酶(分子量158,000Da)、牛血清白蛋白(分子量68,000Da)、卵白蛋白(分子量45,000Da)、胰凝乳蛋白酶原(分子量25,000Da)和細胞色素c(分子量12,500Da)比較計算得到該酶的表觀分子量是61,300±5,000Da。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)給出單一條帶,與分子量標準蛋白(Amersham BiosciencesAB)磷酸化酶b(分子量97,000Da)、牛血清白蛋白(分子量66,3000Da)、卵白蛋白(分子量42,400Da)、碳酸酐酶(分子量30,000Da)和大豆胰蛋白酶抑制劑(分子量20,100Da)相比具有分子量45,000±5,000Da。這說明該酶由一個亞基組成。
3)輔因子研究了酶將酮異佛爾酮轉化成左旋二酮的輔因子要求。結果,NADH和NADPH可以作為該還原反應的輔因子。
4)底物專一性用除以下例外情況外與上面(1)中描述相同的酶分析試驗測定酶的底物專一性,所述例外為使用各種底物溶液(反應混合物中0.05%終濃度)代替酮異佛爾酮,并且在30℃下進行反應。在表1中比較了不同底物的相對活性(%),用3-丁烯-2-酮得到最好的結果。
表1

5)最適溫度通過使用除以下例外情況外與上面(1)描述相同的酶分析試驗在20到70℃的溫度下測量酶的活力,所述例外為使用2-環(huán)己烯-1-酮作為底物。如表2中所概述的,酶活力的最適溫度為55-60℃。
表2

6)最適pH用除以下例外情況外與上述(1)中相同的酶分析試驗測量酶活力和反應混合物的pH值之間的相互關系,所述例外為使用各種pH和緩沖液,并且使用0.05%(終濃度)2-環(huán)己烯-1-酮作為底物。酶反應的最適pH為4.5-8.5,如表3所示。
表3

7)金屬離子和其他化合物的影響除以下不同之處外,用與上面(1)中描述相同的酶分析試驗研究金屬離子和其他化合物對酶活力的影響,所述不同為使用2-環(huán)己烯-1-酮作為底物,并且將各種金屬和其他化合物加入到反應混合物中,其中金屬的終濃度為1mM。鉛離子和吖啶黃強烈抑制酶活力。Ag、Hg、Cu、V離子和胍適度抑制酶活力。結果描述于表4。
表4

8)純化步驟原則上烯酮還原酶的純化可以通過已知純化方法(如用沉淀劑如硫酸銨、聚乙二醇等分級分離、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾層析、凝膠電泳和鹽析及透析)的任何組合進行。
下面的實施例進一步舉例闡明本發(fā)明。
實施例1烯酮還原酶的制備除非另外說明,所有操作都在4℃于20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.0)中進行。
(1)培養(yǎng)乳酒假絲酵母(Candida macedoniensis)IFO 0960將生長在瓊脂板上的乳酒假絲酵母IFO 0960接種于試管中5ml培養(yǎng)基(pH6.0)中并在28℃孵育2天,培養(yǎng)基由D-葡萄糖(5%)、胨(0.5%)、KH2PO4(0.2%)、K2HPO4(0.1%)、MgSO4·7H2O(0.02%)和酵母提取物(0.1%)組成。將這樣制得的10ml種子培養(yǎng)物接種于裝在2lSakaguchi瓶中的500ml與上相同的培養(yǎng)基中,并在28℃孵育2天。將從由此制備的10個瓶中得到的5升培養(yǎng)物在8,000rpm,4℃下離心20分鐘??偣驳玫?0.5g濕細胞。
(2)無細胞提取物的制備將濕細胞(60.5g)懸浮于121ml緩沖液中,并用Kubota Insonator 201超聲器(Kubota,日本)以190W的功率超聲2小時。超聲后,將樣品在10,000rpm離心20分鐘。結果得到含有1,550mg蛋白的139ml無細胞提取物。
(3)硫酸銨沉淀用固體硫酸銨對前面步驟中得到的無細胞提取物(80ml)進行分級分離。將40-80%級分(78.5ml)對5l緩沖液透析4次,得到91ml透析過的溶液。
(4)二乙基氨基乙基-Sephacel柱層析將上面制備的透析樣品加到用緩沖液平衡的二乙基氨基乙基(DEAE)-Sephacel柱(直徑2.5cm,高14cm;Amersham Biosciences AB,瑞典)。用200ml相同緩沖液洗滌柱子后,用530ml線性梯度NaCl(0-0.6M)洗脫酶。用0.1M NaCl洗脫出酶活性。
(5)苯基-Superose HR10/10柱層析將前面一步得到的樣品補加NaCl得到終濃度4M。將柱子(1cm直徑×30cm高;Amersham Biosciences AB,瑞典)用含有4M NaCl的緩沖液平衡并加載上面的樣品。通過160ml線性梯度緩沖液(4-0M NaCl)洗脫酶。在2M NaCl濃度時洗脫出酶活性。
(6)Superdex 200 HR10/30柱層析將前面步驟得到的樣品應用于Superdex 200 HR10/30柱(1cm直徑×30cm長;Amersham Biosciences AB,瑞典)進行層析。柱子用含有2MNaCl的緩沖液平衡并過柱。收集具有酶活性的級分。酶的純化步驟概述于表5中。
表5

(7)反應產物的鑒定將由溶于50mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液的10mg/ml酮異佛爾酮、0.6mg/ml NADP+、0.2mg/ml葡萄糖脫氫酶(Amano Enzyme,日本)和50mg/ml D-葡萄糖組成的反應混合物(1ml)補加50毫單位來自表5Superdex200級分的酶。在28℃孵育24小時后,將混合物用1ml乙酸乙酯萃取。萃取物用氣相色譜分析。與左旋二酮標準樣品比較鑒定產物為左旋二酮。
權利要求
1.一種具有下面的理化性質的分離的烯酮還原酶(a)分子量61,300±5,000Da(由分子量45,000±5,000Da的一個亞基組成),(b)輔因子NADPH和NADH,(c)底物專一性對α,β-不飽和酮具活性,(d)最適溫度pH7.4下55-60℃,(e)最適pH4.5-8.5。
2.一種根據權利要求1的烯酮還原酶,其來源自能夠生產具有權利要求1中定義的性質的烯酮還原酶的微生物。
3.一種根據權利要求2的烯酮還原酶,其中微生物是酵母。
4.一種根據權利要求2的烯酮還原酶,其中微生物是乳酒假絲酵母(Candida macedoniensis)IFO 0960、其功能等價物、傳代培養(yǎng)物、突變株或變體。
5.一種生產具有下面理化性質的烯酮還原酶的方法(a)分子量61,300±5,000Da(由分子量45,000±5,000Da的一個亞基組成),(b)輔因子NADPH和NADH,(c)底物專一性對α,β-不飽和酮具活性,(d)最適溫度pH7.4下55-60℃,(e)最適pH4.5-8.5,該方法包括在氧條件下于水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產生具有上面性質的烯酮還原酶的微生物,破壞微生物的細胞并從所述提取物中分離純化烯酮還原酶。
6.根據權利要求5的方法,其中微生物是酵母。
7.一種由酮異佛爾酮生產左旋二酮的方法,該方法包括(i)在NADH或NADPH存在下將酮異佛爾酮與具有下面的理化性質的烯酮還原酶接觸(a)分子量61,300±5,000Da(由分子量45,000±5,000Da的一個亞基組成),(b)輔因子NADPH和NADH,(c)底物專一性對α,β-不飽和酮具活性,(d)最適溫度pH7.4下55-60℃,(e)最適pH4.5-8.5;或者(ii)將酮異佛爾酮與能夠產生(i)中定義的酶的微生物的細胞或無細胞提取物接觸,和從反應混合物中分離所得左旋二酮。
8.根據權利要求7的方法,其中微生物是酵母。
9.根據權利要求7或8的方法,其中反應在pH4.5到8.5進行。
10.根據權利要求7到9任一項的方法,其中反應溫度為30℃到60℃。
11.基本上如前面所描述的,特別是參照實施例描述的本發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的烯酮還原酶,其特征在于分子量為61,300±5,000Da;輔因子為NADPH和NADH;pH7.4下最適溫度55-60℃;最適pH為4.5-8.5;并且對α,β-不飽和酮具底物專一性。本發(fā)明還涉及從微生物生產該酶的方法和用該還原酶從酮異佛爾酮生產左旋二酮的方法。
文檔編號C12R1/72GK1636057SQ03804272
公開日2005年7月6日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權日2002年2月22日
發(fā)明者片岡道彥, 清水昌 申請人:Dsm Ip 資產有限公司
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