專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的dna，含所述dna的重組載體和轉(zhuǎn)化的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(下文有時(shí)稱(chēng)為“PCK”)基因和含所述基因的重組載體。
背景技術(shù)：
PCK是反向催化磷酸烯醇丙酮酸羧化形成草酰乙酸之反應(yīng)的酶。ATP-依賴(lài)性PCK(EC4.1.1.49)和GTP-依賴(lài)性PCK(EC4.1.1.32)是已知的。植物PCK依賴(lài)于ATP，并在光合作用中由二氧化碳形成淀粉過(guò)程中起重要作用。
另一方面，C4植物主要包括屬于源于熱帶地區(qū)之禾本科的植物，而且它們與C3植物相比更適應(yīng)強(qiáng)光，高溫和缺水環(huán)境。更具體地說(shuō)，C4植物的最大光合作用率是C3植物的兩倍，而且光合作用不受空氣中氧的抑制。即使用使C3植物光合作用達(dá)到飽和的光強(qiáng)度照射C4植物，它們的光合作用也不會(huì)達(dá)到飽和。此外，C4植物進(jìn)行光合作用的最佳溫度高于C3植物。
正如上文提到的，植物的PCK在光合作用中起重要的作用。因此，如果轉(zhuǎn)化C3植物以使其生產(chǎn)C4植物的PCK，則預(yù)期可得到各種效果，例如提高光合作用率，有效利用陽(yáng)光，促進(jìn)在高溫下的光合作用。然而，到目前為止，還未對(duì)植物的PCK基因進(jìn)行完全定序，更不用說(shuō)C4植物的。
發(fā)明的公開(kāi)因此，本發(fā)明的目的是提供克隆的C4植物PCK基因，含有所述基因的重組載體，用所述重組載體轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明人進(jìn)行了刻意研究，結(jié)果成功地克隆了C4植物Urochloapanicoides的PCK基因，并確定了所述基因的完整序列以及由所述基因編碼的推導(dǎo)的氨基酸序列。本發(fā)明人還成功地構(gòu)建了含有PCK基因的重組載體并用所述重組載體成功地轉(zhuǎn)化了植物，從而得到表達(dá)PCK基因的轉(zhuǎn)化植物，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供編碼序列表中SEQ ID NO1、2或3所示之氨基酸序列或者在該氨基酸序列中增加、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且編碼具有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的多肽的克隆的DNA。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明DNA的重組載體，此載體在宿主細(xì)胞中可表達(dá)所述的DNA。本發(fā)明還提供用本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化的，生產(chǎn)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的植物。
通過(guò)本發(fā)明克隆了C4植物Urochloa panicoides的PCK基因并確定了其核苷酸序列。預(yù)期通過(guò)將所述基因?qū)隒3植物，可提高光合作用效率，可以更有效地利用光能，而且還可提高植物對(duì)高溫的抗性。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1表示為得到PCK1所用的cDNA的位置和長(zhǎng)度，所述cDNA是Urochloa panicoides的全長(zhǎng)cDNA序列；圖2表示為得到PCK2所用的cDNA的位置和長(zhǎng)度，所述cDNA是Urochloa panicoides的全長(zhǎng)cDNA序列；圖3表示PCK1編碼的氨基酸序列與PCK2編碼的氨基酸序列的比較；圖4是用于轉(zhuǎn)化水稻植物之重組載體的插入DNA區(qū)的基因圖譜；和圖5圖示表明PCK蛋白質(zhì)在水稻轉(zhuǎn)化體中的位置。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式用常規(guī)方法從Urochloa panicoides綠葉制備cDNA文庫(kù)，然后通過(guò)利用抗-PCK抗體的免疫印跡法鑒別生產(chǎn)PCK的克隆，從而克隆出本發(fā)明的基因。通過(guò)定序克隆中的cDNA插入片段可確定所述基因的核苷酸序列，然后推導(dǎo)由此編碼的氨基酸序列。具有推導(dǎo)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的分子量與經(jīng)純化的PCK的相同，從而認(rèn)為所述基因編碼全長(zhǎng)PCK。在下文實(shí)施例中將詳細(xì)描述上述方法。
通過(guò)上述方法，確定序列表SEQ ID NO1和2所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供分別編碼SEQ ID NO1和2所示之氨基酸序列的克隆DNA。此外，如在下述實(shí)施例中的具體描述，確定Urochloapanicoides之活性PCK的N-末端，結(jié)果測(cè)定了具有SEQ ID NO1所示之氨基酸序列的活性PCK，其N(xiāo)-末端分別為第57位氨基酸是Ser，第61位氨基酸是Glu，第66位氨基酸是Leu，第69位氨基酸是Gly且第75位氨基酸是Gly。因此，由此可看出至少?gòu)男蛄?的第75位氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列足以發(fā)揮PCK活性。由未發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID NO1第57位氨基酸Ser之上游N-末端的活性PCK這一事實(shí)，推測(cè)在PCK蛋白質(zhì)的純化過(guò)程中，截掉了從第1位氨基酸Met到第56位氨基酸Ala的氨基酸序列。在下述實(shí)施例中，通過(guò)表達(dá)含有從水稻基因組DNA制備的水稻Rubisco小亞單位序列的DNA和編碼第57位氨基酸Ser到C-末端之多肽區(qū)的DNA而對(duì)此加以證實(shí)。
另外，在下文實(shí)施例中，將示于SEQ ID NO1和2的氨基酸序列在KpnI位點(diǎn)相連(示于SEQ ID NO2的部分氨基酸序列位于上游側(cè))，然后將編碼源于水稻Rubisco小亞單位過(guò)肽的氨基酸序列的DNA與上述相連之DNA的上游相連(SEQ ID NO3)。從第52位Ser到C-末端的氨基酸序列編碼成熟PCK蛋白質(zhì)。可以肯定用所述DNA轉(zhuǎn)化的水稻植物生產(chǎn)由所述DNA編碼的具有PCK活性的PCK。因此，通過(guò)連接多個(gè)天然產(chǎn)生的PCK基因中的部分而制備的DNA也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本領(lǐng)域熟知，即使肽的氨基酸序列在小范圍內(nèi)被修飾，也即即使取代或缺失氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者即使將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入或插入氨基酸序列中，具有生理學(xué)活性之多肽的生理學(xué)活性仍可得到保留。編碼具有所述修飾但有PCK活性之多肽的DNA片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，編碼除增加、插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外具有與SEQ ID NO1、2或3所示相同之氨基酸序列并且具有PCK活性的多肽的DNA也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
通過(guò)本領(lǐng)域熟知(如，Nucleic Acid Research，vol.10.No.20，p6487-6500(1982))的位點(diǎn)特異性誘變修飾DNA，從而使由其編碼的氨基酸序列發(fā)生增加、插入、缺失或取代。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”指通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變可增加、插入、缺失或取代的氨基酸數(shù)。
例如通過(guò)用一合成的寡核苷酸引物即可完成位點(diǎn)特異性誘變，所述引物除如下文所需的突變外，與單鏈?zhǔn)删wDNA互補(bǔ)。即，用上述合成的寡核苷酸為引物，用噬菌體生產(chǎn)互補(bǔ)鏈，然后用所得的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)菌細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物涂布在瓊脂上，然后由含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成噬菌斑。理論上，50％的新菌落含有具有攜帶突變之單鏈的噬菌體，而另50％的菌落含有具有原始序列的噬菌體。然后在探針與含有所需突變的DNA序列雜交，而不與和探針不完全互補(bǔ)的原始DNA序列雜交的溫度下，將所得的噬菌體與激酶處理的合成探針雜交。然后檢出觀察到雜交的噬菌斑，培養(yǎng)并收集DNA。
除上述位點(diǎn)特異性誘變外，用于取代、缺失、插入或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而不喪失酶活性的方法包括用誘變劑處理基因的方法和選擇性裂解基因，取出加入或取代所選的核苷酸，然后連接基因的方法。
用下文實(shí)施例中詳細(xì)描述的方法可得到本發(fā)明DNA。另外，由于本發(fā)明確定了示于SEQ ID NOs1-3的Urochloapanicoides PCK基因的核苷酸序列，所以通過(guò)利用Urochloapanicoides的基因組DNA為模板的PCR方法或通過(guò)利用Urochloapanicoides cDNA為模板的RT-PCR方法可以很容易得到本發(fā)明的基因。
可將本發(fā)明的DNA插入植物表達(dá)載體以得到重組載體。用所得的重組載體轉(zhuǎn)化植物可得到表達(dá)Urochloa panicoides PCK的轉(zhuǎn)化植物。已確立了轉(zhuǎn)化植物的方法，而且利用根癌土壤桿菌的方法是優(yōu)選的。利用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域熟知的，而且可以轉(zhuǎn)化雙子葉植物(如日本特開(kāi)平4-330234)和單子葉植物(WO 94/00977)。導(dǎo)入本發(fā)明PCK基因的適宜植物包括水稻、玉米、番茄、煙草等，盡管不限于這些植物。在下文實(shí)施例中詳細(xì)描述轉(zhuǎn)化方法的實(shí)例。實(shí)施例本發(fā)明將利用實(shí)施例更具體地進(jìn)行描述。但應(yīng)注意到，本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例。實(shí)施例1克隆并鑒別PCK1(I)材料和方法(1)植物材料用于RNA分離的所有植物材料均來(lái)自U.Panicoides登記號(hào)CQ 2798，由CSIRO，Division of Tropical Crops and Pastures，Brisbane，Queensland，Australia提供。在夏季月份中，使光生長(zhǎng)植物在全光照下生長(zhǎng)5周。使暗生長(zhǎng)植物于28℃從播種在濕組織中的種子開(kāi)始生長(zhǎng)，所述濕組織在鋁箔包著的聚苯乙烯盒中。(2)純化PCK基本按在Burnell JN，Purification and properties ofphosphoenol pyruvate carboxyki nase fron C4plants，Aust.J.Plant.physiol.13577-587(1986)中的描述，除去掉第二個(gè)DEAE-Sepharose CL-6B柱(從Pharmacia購(gòu)買(mǎi)的)外，從光生長(zhǎng)的U.panicoides葉中純化PCK。將1ml含峰PCK活性的SephacrylS-300柱(可從Pharmacia購(gòu)買(mǎi))組分中，100μg和200μg間的蛋白質(zhì)與等體積125mM Tris HCl，pH6.8，2D％甘油，4％SDS，10％2-巰基乙醇，0.0025％溴酚藍(lán)混合，于85℃加熱2分鐘。在于16cm×18cm×0.2cm 10％SDS-聚丙烯酰胺分辨凝膠上，按已知方法(Laemmli UKCleavage of structural proteinsduring the assembly of the bead of bacteriophage T4，Nature 227680-685(1970))分離前，以12,000xg將樣品澄清5分鐘。用0.5％考馬斯蘭R-250，40％乙醇，10％乙酸將凝膠染色1小時(shí)，然后用10％甲醇、10％乙酸脫染。
在有關(guān)電洗脫的制備中，切下染色的蛋白質(zhì)帶，用0.15M NaCl、1％SDS，50mM Tris HCl，pH7.5然后用10mM Tris乙酸鹽pH8.6，1mMEDTA，1％SDS平衡。經(jīng)通過(guò)5ml注射管破碎凝膠片，然后放在LittleBlue Tank(商標(biāo))電洗脫裝置(ISCO，USA)板的陽(yáng)極孔中。所述的板用10mM Tris乙酸鹽，pH8.6，1mM EDTA，1％SDS填裝，而陽(yáng)極和陰極空間用40mM Tris乙酸鹽，pH8.6，1mM EDTA，1％SDS填裝。在3W的穩(wěn)定功率下完成3小時(shí)的電洗脫。所述板的陰極孔的蛋白質(zhì)回收率大于90％。用Centricon-30(商標(biāo))超濾盒(Amicon，Australia)經(jīng)離心濃縮電洗脫的PCK，用PBS(15mM磷酸鈉，pH7.2，140mM NaCl，3mM KCl)稀釋100倍，然后再濃縮。(3)制備抗PCK抗血清將500μl PBS中的約500μg凝膠純化的PCK與等體積的弗氏完全佐劑混合。將混合物的小樣(500μl)肌肉內(nèi)注射到兔(新西蘭長(zhǎng)耳變種)的各大腿中。在開(kāi)始注射后第30天和第48天，按上述，除用弗氏不完全佐劑外，加強(qiáng)免疫兔。在第二次加強(qiáng)免疫時(shí)和10到14天間隔時(shí)，從耳靜脈收集血液。使血樣凝結(jié)，然后以1000xg離心10分鐘進(jìn)行澄清。用0.02％疊氨化鈉制備澄清的血清，然后貯于4℃。(4)電印跡并免疫檢測(cè)PCK在10％丙烯酰胺分辨凝膠(Laemmli，上文)上進(jìn)行SDS-PAGE而分離蛋白質(zhì)，然后用考馬斯蘭R-250染色或用于電印跡。為了進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，用25mM Tris，192mM Gly，20％甲醇平衡凝膠，然后在Trans-Blot(商標(biāo))盒(Bio-Rad，Australia)在冰上用所述緩沖液以250mA，經(jīng)1小時(shí)電印跡到硝酸纖維素膜(Schleicherand schuell，Germany)。在加入澄清的兔抗-PCK抗血清并溫育1小時(shí)前，用在TBST(12.5mM Tris HCl，pH8.0，137mM NaCl，2.7mNKCl，0.1％吐溫20)中的0.5％脫脂奶粉阻斷印跡。用TBST 10分鐘將印跡洗滌3次，然后用ProtBlot(商標(biāo))檢測(cè)系統(tǒng)按制造商的說(shuō)明(Promega，Australia)檢測(cè)結(jié)合的抗體。為了進(jìn)行N-末端氨基酸序列測(cè)定，用上述電印跡，除用的箱緩沖液是10mM CAPS，pH11，10％甲醇外，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad，Australia)上。用50％甲醇中的0.1％考馬斯藍(lán)R-250將印跡染色，用50％甲醇脫色，然后空氣干燥。切下序列測(cè)定中所用的蛋白質(zhì)帶。(5)從U.panicoides中分離RNA用Chomczynski和Sacchi的方法(Chomczynski P.Sacchi NSingle-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate phenol chloroform extractionAnal.Biochem.162156-159(1987))后，從各種U.panicoides組織中純化總RNA。通過(guò)用寡核苷酸(dT)25-結(jié)合的順磁顆粒(Dynal，Norway)按制造商的方法成批處理從總RNA中分離poly(A)+RNA。(6)構(gòu)建并篩選U.panicoides cDNA文庫(kù)用TimeSaver(商標(biāo))cDNA合成試劑盒(Amrad-Pharmacia，Australia)按供應(yīng)商的說(shuō)明在3μg U.panicoides poly(A)+RNA的λgt11D中構(gòu)建定向的cDNA文庫(kù)。用Gigapack II(商標(biāo))包裝提取物(Stratagene，USA)包裝所述文庫(kù)，然后在Y1088涂布的細(xì)菌上滴定并擴(kuò)增(Sambrook J.Fritsch EF，Maniatis TMolecularCloning A.Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring harborlaboratory Press，Cold Spring Harbor NY(1989))。在于含10μl兔抗-PCK抗血清的50ml TBST中溫育16小時(shí)前，按上述經(jīng)1小時(shí)阻斷轉(zhuǎn)移進(jìn)行免疫印跡。洗滌轉(zhuǎn)移物，如在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中一樣檢測(cè)結(jié)合的抗體。
為了經(jīng)雜交進(jìn)行篩選，將噬菌斑轉(zhuǎn)移到Hybond-N+(商標(biāo))(Amersham，Australia)，變性然后按制造商的說(shuō)明用0.4M NaOH固定噬菌體DNA。在加入熱變性的放射性標(biāo)記的探針前，于42℃將膜在5×SSC(1×＝0.15M NaCl，15mM檸檬酸三鈉)50％甲酰胺，0.1％SDS，50mM磷酸鈉(pH7.0)，0.1％Ficoll(商標(biāo))(Amrad-Pharmacia，Australia)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白，250μg/ml熱變性的鯡魚(yú)精DNA中預(yù)雜交1小時(shí)。從瓊脂糖凝膠(Sambrook J.，等人，文獻(xiàn)同上)純化DNA限制片段探針，通過(guò)使用GIGAprime DNA標(biāo)記試劑盒(Bresatec，Australia)的隨機(jī)引發(fā)，用[α-32P]dCTP(NEN-DuPont，Australia)進(jìn)行放射性標(biāo)記。于42℃雜交16小時(shí).然后用2×SSC，0.1％SDS于42℃將膜15分鐘洗2次，再于65℃用0.1×SSC，0.1％SDS 15分鐘洗2次。(7)亞克隆并測(cè)序cDNA插入片段從平皿溶解產(chǎn)物中制備噬菌體DNA，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法(SambrookJ.等人，文獻(xiàn)同上)將插入片段亞克隆到pBluescript II-KS(商標(biāo)，Stratagene，USA)中。為了測(cè)序，用外切核酸酶III構(gòu)建數(shù)組嵌套缺失(Henikoff SUnidirectional digestion withexonuclease III creates targeted breakpoints for DNAsequencing，Gene 28351-359(1984))，然后用綠豆核酸酶消化后，再連接。經(jīng)堿煮而使適宜缺失質(zhì)粒的堿溶解小制品(SambrookJ.等人，文獻(xiàn)同上)變性(Yie Y.Wei Z，Tien PAsimplified and reliable protocol for plasmid DNAsequencingfast miniprep and denaturation Nucleic AcidRes 21361(1993))，然后用雙脫氧鏈終止法(Sanger F，Nicklen S，Coulson ARDNA sequencing with chainterminating inhibitors，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467(1977))用T7測(cè)序試劑盒(商標(biāo)，Amrad-Pharmacia，Australia)測(cè)序。限制酶和其他核酸修飾酶均來(lái)自Amrad-Phramacia，Australia。(8)Northern分析在含8mM甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上分離poly(A)+RNA(SambrookJ.等人，文獻(xiàn)同上)在75mmHg壓力下，用0.4M NaOH為緩沖液將RNA2小時(shí)轉(zhuǎn)移到Hybond-N+(商標(biāo))上。在0.9M NaCl，6mM EDTA，60mM NaH2PO4，pH7.4，50％甲酰胺，0.1％SDS，10％葡聚糖硫酸酯，0.04％Ficoll(商標(biāo))，0.04％聚乙烯吡咯烷酮，0.04％牛血清白蛋白，0.5mg/ml變性的鯡魚(yú)精DNA中于42℃將膜預(yù)雜交3-4小時(shí)。加入熱變性的放射性標(biāo)記的限制性片段，于42℃雜交16小時(shí)，按上述洗滌膜以除去噬菌斑。結(jié)果(1)制備兔抗-U.panicoides PCK抗血清U.panicoides PCK分子鑒定的第一步是得到抗純化PCK的抗血清。用硫酸銨分級(jí)分離、接著用離子交換和分子篩柱層析按Burnell JN(同上文)的方法從生長(zhǎng)U.panicoides的地中純化PCK。用SDS-PAGE分離從Sephacryl S-300(Pharmacia)柱層析得到的峰組分蛋白質(zhì)。用考馬斯蘭染色表明有約69、63、62、61和60kDa的5種蛋白質(zhì)。推測(cè)遷移到62kDa處的最豐富的帶是PCK并對(duì)其進(jìn)行凝膠純化。最后純化的產(chǎn)物在SDS-PAGE上是同質(zhì)的，因此用其作為抗原生產(chǎn)兔抗血清。
用所得的抗血清探測(cè)用于抗原純化的相同柱組分的免疫印跡。所得的圖像與被檢蛋白質(zhì)和所述5個(gè)種相對(duì)染色強(qiáng)度中的考馬斯蘭染色圖譜相同，然而，若用該抗血清探測(cè)U.panicoides的粗組織提取物，在染色強(qiáng)度方面發(fā)現(xiàn)有細(xì)微的差別。在粗提取物中，63、62和61kDa種有相同的染色強(qiáng)度，而60kDA種染色強(qiáng)度低得多，而在純化PCK中，63kDa種染色強(qiáng)度比其他種的低。(2)PCK cDNA的克隆并序列分析在λgt11衍生的載體中，用從生長(zhǎng)U.panicoides地中的綠葉分離的poly(A)+RNA構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫(kù)。若用抗-PCK抗血清篩選2×105個(gè)該文庫(kù)的噬菌斑，則得到40個(gè)有免疫反應(yīng)性的克隆。對(duì)其中的20個(gè)再篩選以達(dá)到均質(zhì)性。亞克隆cDNA插入片段，然后進(jìn)行末端測(cè)序。所有12個(gè)插入片段均與啤酒酵母的PCK序列(Stucka R etal.，Nucleotide sequence of the phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene from Saccaromyces cerevisiae.NucleicAcid Res.1610926(1988))同源。最長(zhǎng)的插入片段λPCK100101為1.4kb，因此不足以編碼約62kDa的PCK蛋白質(zhì)。為了得到覆蓋全部PCK開(kāi)放閱讀框架的cDNA，用放射性標(biāo)記的限制片段再篩選所述文庫(kù)，所述片段從cDNA的5′末端向3′方向逐漸延伸。在圖1中列出了在兩個(gè)方向均完全測(cè)序了的所得重疊克隆。λPCK110402插入片段分別與λPCK100101和λPCK190203插入片段重疊了675和132bp。這些克隆的重疊區(qū)有相同的序列。
結(jié)果，確定了共2220bp的cDNA序列，包括1872bp的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，出于序列表中的SEQ ID NO1。此ORF編碼具624個(gè)殘基的蛋白質(zhì)，將編碼該ORF的基因稱(chēng)為PCK1。PCK1 ORF兩側(cè)為288bp的延伸向poly(A)尾的3′非翻譯區(qū)和57bp的5′非翻譯區(qū)。(3)PCK1蛋白質(zhì)的特性推導(dǎo)的624個(gè)殘基的PCK1蛋白質(zhì)的分子量為68，474Da。Kyte和Doolittle算法(Kyte J.Doolittle RFA simple methodfor displaying the hydropathic character of a protein，J.Mol.Biol.157105-132(1982))表明PCK1有所有的親水特性，沒(méi)有根據(jù)Popot和de Vitry標(biāo)準(zhǔn)(Popot J-L，de VitryCOn the microassembly of integral membrane proteinsAnnu.Rev.Bi ophys，Chem.19369-403(1990))的跨膜區(qū)。這與其細(xì)胞溶質(zhì)定位一致。(4)PCK的氨基末端序列分析經(jīng)直接定序確定U.panicoides PCK的N-末端氨基酸序列。用SDS-PAGF分離在含峰PCK活性的Sephacryl S-300(Pharmacia)柱組分中的蛋白質(zhì)以使60-63kDa的蛋白質(zhì)跑成單一的寬帶。將所述材料印跡到PVDF膜上，然后使完整的帶經(jīng)12個(gè)循環(huán)的自動(dòng)Edman降解，每個(gè)循環(huán)釋放可檢測(cè)量的四或五個(gè)氨基酸。從此數(shù)據(jù)，鑒定了對(duì)應(yīng)于U.panicoides PCK cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列的共5個(gè)重疊序列。這些序列示于下文表1。
表1<

aX表示在測(cè)序循環(huán)未發(fā)現(xiàn)與cDNA推測(cè)的殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸如表1所示，所有5個(gè)序列均在彼此的19個(gè)殘基內(nèi)開(kāi)始，大部分N-末端從起始Met的56殘基開(kāi)始。在鑒定的N-末端中，序列I和III是最豐富的。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，按上文所述電泳PCK，然后分別將各帶測(cè)序。但是，只得到有關(guān)62和61kDa種的結(jié)果。62kDa帶只產(chǎn)生N-末端序列III和IV，分別對(duì)應(yīng)于推測(cè)分子量為61.8kDa和61.4kDa的蛋白質(zhì)。61kDa帶只產(chǎn)生序列V，得到推測(cè)分子量為60.8kDa的蛋白質(zhì)?？傊琋-末端測(cè)序?qū)嶒?yàn)表明，通過(guò)除去56-75個(gè)殘基的前導(dǎo)序列，69kDa的U.panicoides PCK翻譯產(chǎn)物被加工成60.8到62.7kDa之間的成熟蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明還提供編碼這5種蛋白質(zhì)的DNA。(5)光對(duì)PCK1表達(dá)的影響使U.panicoides種子萌發(fā)并使苗在暗中生長(zhǎng)7天，然后連續(xù)暴露于光96小時(shí)。黃化枝一般為5到6cm長(zhǎng)，15到20mg重。細(xì)長(zhǎng)的胚芽鞘是白色的，在完整的頂芽上均帶有可見(jiàn)的黃色不成熟的葉子。暴露于光6小時(shí)后，胚芽鞘的頂芽已斷裂，肉眼可見(jiàn)葉片開(kāi)始變綠并伸展開(kāi)。葉子繼續(xù)變綠并在光處理96小時(shí)后完全伸展。相反，剩下的胚芽鞘在暴露于光后，長(zhǎng)度沒(méi)什么變化，而且苗的重量只有輕微的增加。
在96小時(shí)的光處理期間的不同時(shí)間收集苗。從這些苗制備總RNA，在瓊脂糖凝膠上分離、印跡，然后用放射性標(biāo)記的λPCK100101的1.4kb插入片段檢測(cè)。還包括了來(lái)自光生長(zhǎng)植物根和綠葉組織的總RNA。在來(lái)自綠葉的總RNA中，用部分PCK cDNA探針檢測(cè)的主要種類(lèi)是2.7kb長(zhǎng)。所述探針還與異源的小于2.7kb的RNA條帶雜交。在使用來(lái)自poly(A)+RNA的實(shí)驗(yàn)中，只檢測(cè)到2.7kb RNA。因此，該種最有可能是PCK1 mRNA，而在總RNA中的異源條帶可能是沒(méi)有poly(A)尾的PCK1轉(zhuǎn)錄本。所述的未聚腺苷酸化的RNA可能產(chǎn)生于PCK1mRNA的降解或PCK1轉(zhuǎn)錄本的未成熟終止。
1.4kb的cDNA探針未在來(lái)自根和黃化苗的總RNA中檢測(cè)到PCK1mRNA。然而，變綠6小時(shí)后，在苗中檢測(cè)到PCK1 mRNA。在接下來(lái)的84小時(shí)中，所述DNA的豐度穩(wěn)定增加，但在光照期間，所述PCK mRNA的豐度與綠葉組織中的從不一樣。盡管僅在暴露于光6小時(shí)后就出現(xiàn)了2.7kb的轉(zhuǎn)錄本，但是在暴露于光48小時(shí)后才檢測(cè)到異源條帶。實(shí)施例2克隆并鑒定PCK2重復(fù)與實(shí)施例1中相同的方法。結(jié)果，通過(guò)分析在分離PCK1 cDNA中所得到的陽(yáng)性克隆，得到了與PCK1 cDNA高度同源但是其核苷酸序列不同于PCK1 cDNA的克隆。圖2中列出了重疊克隆。λPCK170204的插入片段與λPCK190202和λPCK110101的插入片段分別重疊227和107bp。這些克隆的重疊區(qū)有相同的序列。結(jié)果，確定了共2245bp的cDNA序列，含有1878bp的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，列于序列表的SEQ ID NO2。所述ORF編碼626個(gè)殘基的蛋白質(zhì)。編碼所述ORF的基因被稱(chēng)為PCK2。PCK2 ORF的兩側(cè)是延伸向poly(A)尾的304bp的3′非翻譯區(qū)和44bp的5′非翻譯區(qū)。PCK2編碼的氨基酸序列與PCK1編碼的氨基酸序列有96％的同源性，在這些序列中有26個(gè)氨基酸殘基不同，有22個(gè)氨基酸殘基是相似氨基酸殘基。在圖3中列出了PCK1和PCK2氨基酸序列間的比較。實(shí)施例3將PCK基因?qū)胨静⒈磉_(dá)1.構(gòu)建在植物中表達(dá)PCK cDNA的基因材料和方法植物材料和基因組DNA的分離用Komari等人的方法(Komari T，Saito Y，Nakakido F，Kumashiro TEfficient selection of somatic hybridsinNicotiana tabacum L.using a combination of drug-resi stance markers introduced by transformation.Theor，Appl.Genet.77547-552(1989))從生長(zhǎng)于溫室中的水稻植物(Oryza sativa cv.Nipponbare)的綠葉或玉米植物(Zea mayL.subsp.mays line B73)的綠葉出提取基因組DNA。DNA操作根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook J.et al.，上文)進(jìn)行DNA操作。用DNA合成儀392(Applied Biosystems，USA)制備寡DNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Mcpherson MJ，Quirke P，Taylor GRPCR.A practicalapproach.Oxford express press，Oxford NY(1991))進(jìn)行PCR。為了亞克隆PCR產(chǎn)物，使用TA克隆試劑盒(商標(biāo)Invitrogen，USA)。用DNA循環(huán)測(cè)序試劑盒(商標(biāo)Applied Biosystems，USA)和測(cè)序儀373A(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行測(cè)序。制備其他DNA區(qū)用基于玉米磷酸烯醇丙醇酸羧化酶啟動(dòng)子區(qū)的序列(HudspethRL，Grula JWStructure and expression of the maizegene encoding the phosphoenolpyruvate varboxylaseisozyme involved in photosynthesis.Plant Mol.Biol.12579-589(1989))合成的引物經(jīng)PCR方法從玉米基因組DNA中分離啟動(dòng)子。所用引物的核苷酸序列如下向前的引物5′-AGACGACTCTTAGCCACAGCC-3′反向引物5′-TCGATGGAGTGGTGCTTCTC-3′至于終止子，使用在質(zhì)粒DNA pGL2(Biland B.Iida S.Peterhans A，Potrykus I.Panszkowski JThe 3′-terminalregion of the hygromycin-B-resistance gene isimportant for its activity in Escherichia coli andNicotiana tabacum Gene 100247-250(1991)上的花椰菜花葉病毒35S終止子(SphI-EcoRI片段)。
使用基于水稻Rubisco小亞基序列(Matsuoka M，Kano-Murakame Y，Tanaka Y，Ozeki Y，Yamamoto NClassification and mucleotide sequence of cDNA encodingthe small subunit of ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylass from rice Plant Cell physiol，291015-1022(1988))合成的引物經(jīng)PCR方法從水稻基因組DNA中分離編碼過(guò)渡肽的區(qū)域。所用引物的核苷酸序列如下向前的引物5′-GGAATTCCATGGTGCATCTCAAGAAGTAC-3′反向引物5′-GCTCTAGACTGCATGCACCTGATCC-3′在λPCK170204和λPCK100101插入片段的KpnI位點(diǎn)連接編碼被運(yùn)輸?shù)饺~綠體的PCK的基因，將上述編碼過(guò)渡肽的基因連在PCK2編碼的第57位Ser的下游位點(diǎn)。
在質(zhì)粒DNA pUC18(Yanish-perron c，Vieira J，MessingJImproved M13 phage Cloning vectors and hoststrainsnucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19vector.Gene 33103-119(1985))的多克隆位點(diǎn)中按所述的順序插入啟動(dòng)子，編碼過(guò)渡肽和PCK基因，以及終止子。將所構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pPCK。
圖4中列出了所構(gòu)建質(zhì)粒的基因圖譜。所構(gòu)建的cDNA區(qū)的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO3。在SE3 ID NO3所示的核苷酸序列中，nt1-nt153是編碼源自水稻Rubisco小亞基之過(guò)渡肽的區(qū)域，nt154-nt966是編碼PCK2N-末端側(cè)的區(qū)域，nt967-nt1863是編碼PCK1 C-末端側(cè)的區(qū)域。
2.轉(zhuǎn)化水稻植物材料和方法用70％乙醇將Japonica水稻變種“Tsukinohikari”的種子表面消毒30秒，然后用1％次氯酸鈉消毒40秒，然后用無(wú)菌水洗滌3次。將種子放在2N6固體培養(yǎng)基上，于30℃在暗中培養(yǎng)，來(lái)自未成熟種子之scutella去分化的愈傷組織于25℃暗中次級(jí)培養(yǎng)于N6液體培養(yǎng)基中，同時(shí)以125rpm旋轉(zhuǎn)。每周在新鮮的培養(yǎng)基中次級(jí)培養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞。
將次級(jí)培養(yǎng)開(kāi)始3天的細(xì)胞懸于含有1.0％Cellulase Onozuka(Yakult Honsha，Japan)，1.0％Macerozyme(Yakult Honsha，Japan)，0.1％Pectoriaze Y-23(Seishin Seiyaku，Japan)，0.5％Dricellase(Kyowa Hakko，Japan)和0.4M甘露醇的酶溶液中，然后，將懸浮液放在30℃的暗中保持3小時(shí)。然后使細(xì)胞懸液通過(guò)20μm的尼龍篩過(guò)濾，將所得的濾物以50xg離心5分鐘。將所得的原生質(zhì)體沉淀懸浮于0.4M甘露醇中，用所述的溶液將原生質(zhì)體洗滌兩次。
將所得的原生質(zhì)體懸浮于EPAA緩沖液(Tada Y，Sakaoto M，F(xiàn)ujimura TEfficient gene introduction into rice byelectroporation and analysis of transgenic plantsuse of electroporation buffer lacking chloride ionsTheor.Appl.Genet.80475-180(1990))中，然后將懸液在冰上放5分鐘。向原生質(zhì)體懸液中加入10μg pGL2質(zhì)粒和30μgpPCK質(zhì)粒，用電穿孔儀(Bio-Rad，USA)將250μF，600V/cm的電脈沖用于所述的懸液，將脈沖處理的懸液在冰上放15分鐘，然后在室溫下放30分鐘。
經(jīng)離心收集原生質(zhì)體，然后懸浮于含1.25％Seeplaque(商標(biāo))瓊脂糖(FMC，USA)的R2-1培養(yǎng)基中，使細(xì)胞群體為3×105細(xì)胞/ml。在9cm培養(yǎng)皿上以小滴的形式固化懸浮液。向其中加入R2-1培養(yǎng)基和水稻Oc細(xì)胞(Baba A，Hasezawa S，ShonoKCultivation of rice protoplasts and theirtransformati on mediated by Agrobacterium Spheropl ast.Plant Cell Physiol.27463-471(1986))，于25℃在暗中培養(yǎng)所得的懸液。
兩星期后，除去液體培養(yǎng)基和Oc細(xì)胞，然后加入R2-t培養(yǎng)基，于25℃在連續(xù)光照下培養(yǎng)。一星期后，用含40mg/l潮霉素的R2-t培養(yǎng)基取代所述的培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)。一星期后，將含有直徑為0.2-0.5mm愈傷組織的瓊脂糖滴與少量無(wú)菌水一起破碎，將所得的產(chǎn)物放在N6-12培養(yǎng)基上，然后在連續(xù)光照下于25℃培養(yǎng)所得的產(chǎn)物。當(dāng)愈傷組織生長(zhǎng)到直徑不小于2mm時(shí)，將愈傷組織移植到含有40mg/l潮霉素的N6S3培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。將生長(zhǎng)到高度不低于10cm的分化植物移植到盆中，放在溫室中培養(yǎng)。培養(yǎng)基的組成2N6培養(yǎng)基(pH5.8)N6基本培養(yǎng)基(Chu 1978)酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2.4-D 2.0mg/ml蔗糖 20000mg/ml
Gelrite2000mg/mlN6液體培養(yǎng)基(pH5.8)N6基本培養(yǎng)基(Chu 1978)酪蛋白氨基酸 300mg/ml2，4-D 1.0mg/ml蔗糖 30000mg/mlR2-1培養(yǎng)基(pH5.8)R2培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽(Ohira等人，1973)MS培養(yǎng)基維生素(Murashige和Skoog 1962)酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2，4-D 1.0mg/mln-丙基沒(méi)食子酸 0.05mg/ml蔗糖 68500mg/ml葡萄糖 36000mg/mlR2-t培養(yǎng)基(pH5.8)R2培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)組分酪蛋白氨基酸 1000mg/ml2，4-D 1.0mg//ml蔗糖 20000mg/ml葡萄糖 10000mg/mlN6-12培養(yǎng)基(pH5.8)N6基本培養(yǎng)基酪蛋白氨基酸 2000mg/ml2，4-D 0.2mg/ml
6-BA 0.5mg/mlABA5.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlD-山梨醇 30000mg/mlGelrite2000mg/mlN6S3培養(yǎng)基半濃度的N6培養(yǎng)基主要鹽N6培養(yǎng)基微量鹽N6培養(yǎng)基維生素AA培養(yǎng)基氨基酸(Toriyama和Hinata 1985)酪蛋白氨基酸 1000mg/mlNAA0.2mg/ml激動(dòng)素 1.0mg/ml蔗糖 20000mg/mlGelrite3000mg/ml參考文獻(xiàn)Chu，C.-C.(1978)The N6 medium and its application toanther culture of cereal crops. In Proc. Symp. PlantTissue Culture. Peking Science Press，pp.43-50；Murashige，T. and Skoog，F(xiàn).(1962) A revised medium forrapid growth and bio assay with tobacco tissue culture.Physiol.Plant. 15473-497；Ohira，K.，Ojima，K. and Fujiwara，A.(1973) Studies on thenutrition of rice cell culture I. A simple，definedmedium for rapid growth in suspension culture. Plant CellPhysiol. 141113-1121；Toriyama，K.，Hinata，K.and Sasaki，T.(1986) Haploid和diploid plant regeneration from protoplasts of anthercallus in rice. Theor. Appl. Genet. 7316-19.
3.PCK蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)化水稻植物中的位置材料和方法從在人工氣候箱(28℃天/22℃夜，天長(zhǎng)方式16小時(shí))生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化水稻的綠葉中除去主要的葉脈，然后將葉子切成0.5-1mm寬的小片。于30℃將所得的葉片用含有0.8％Cellulase OnozukaRS，0.8％Fancellase(Yakult Honsha Japan)，0.25％PectriazeY-23，150mM磷酸鈉緩沖液(pH5.6)，0.3％牛血清白蛋白和0.4M甘露醇的酶溶液消化1小時(shí)。用緩沖液(50mM Hepes-KOH pH7.0，0.33M山梨醇，2mM EDTA，1mM MgCl2，1mM MnCl2，0.1％牛血清白蛋白)洗滌所處理的組織，然后懸浮于約10倍體積含有1mg/mm抗壞血酸鈉的冰緩沖液中，接著用Polytron勻漿器(商標(biāo)，KinematicaSwitzwerland)將組織勻漿。以最高動(dòng)力用Polytron勻漿器3秒鐘勻漿兩次。將所得的勻漿物通過(guò)4-ply Miracloth(商標(biāo)，Calbiochem，USA)過(guò)濾，然后將過(guò)濾物快速離心(當(dāng)其達(dá)到6000xg時(shí)，降低轉(zhuǎn)速)。將所得的沉淀懸浮于緩沖液中，將所得的懸浮液作為葉綠體樣品。向所述樣品中加入胰蛋白酶達(dá)到50μg/ml的濃度，將混合物在冰上放30分鐘。進(jìn)行完所述的胰蛋白酶處理后，通過(guò)10,000xg離心3分鐘收集葉綠體，然后懸浮于50mM Hepes-KOH(pH8.0)中。將所述的懸浮液凍于-80C，然后在室溫融解以破碎葉綠體。將破碎的葉綠體以10,000xg離心5分鐘，然后將所得的懸浮液(葉綠體的可溶組分)經(jīng)受SDS-PAGE。電泳后，將凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用抗U.panicoides PCK蛋白質(zhì)兔抗血清，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG山羊抗體(MBL)和HRP著色試劑盒(商標(biāo)，Bio-Rad，USA)檢測(cè)PCK蛋白質(zhì)。結(jié)果在所分離的葉綠體的可溶組分中，檢測(cè)到其大小與加工的過(guò)渡肽的大小相對(duì)應(yīng)的PCK蛋白質(zhì)。由于通過(guò)胰蛋白酶處理分離的葉綠體并未降低PCK蛋白質(zhì)，所以認(rèn)為PCK蛋白質(zhì)已被轉(zhuǎn)移到葉綠體中(基質(zhì)組分)。
4.檢測(cè)被轉(zhuǎn)化水稻的PCK活性材料和方法下列所有的操作均在4℃完成。用杵和臼將水稻轉(zhuǎn)化體(PKS 12和PKS 18)的各約0.2g綠葉與1ml提取緩沖液(50mM Hepes-KOH，pH7.0，2mM MnCl2，2mM MgCl2，1mM EDTA，0.1％(v/v)2-巰基乙醇，1mM PMSF，1mM芐脒，1mM 6-氨基-n-己酸，10％(w/v)甘油，0.2％(w/v)抗壞血酸鈉，2％(w/v)Polycral AT)一起磨碎。以15,000xg將所得的磨碎溶液離心20分鐘，將所得的上清液用于經(jīng)柱緩沖液(25mM Hepes-KOH，pH7.0，2mM MnCl2，2mM MgCl2，0.1％(v/v)2-巰基乙醇，10％(w/v)甘油)預(yù)先平衡的NAP5(商標(biāo))柱(Pharmacia，瑞典)以進(jìn)行脫鹽，由此得到粗提取物。根據(jù)Winterman和deMots的方法(Winterman JFGM，De Mots ASpectrophotometriccharacteristics of chlorophylls a and b and theirpheophytins in ethanol Biochem，Biophys，Acta 109448-453(1965))定量分析在磨碎溶液中的葉綠素。根據(jù)Bradford方法(33頁(yè))用Protein Assay試劑盒(商標(biāo)，Bio-Rad，USA)定量分析粗提取物中的蛋白質(zhì)。通過(guò)測(cè)量1ml反應(yīng)混合物在280nm草酰乙酸吸收值降低的速率來(lái)測(cè)量磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，所述的反應(yīng)混合物含有25mM Hepes-KOH pH7.5，4mM DTT，0.2mM草酰乙酸，1單位丙酮酸激酶，0.2mM ATP和50μl粗提取物。結(jié)果檢測(cè)在轉(zhuǎn)化水稻和非轉(zhuǎn)化水稻綠葉的粗提取物中的PCK活性。然而，在非轉(zhuǎn)化水稻中基本上沒(méi)有檢測(cè)到PCK活性。
表2轉(zhuǎn)化水稻的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性

這些結(jié)果表明活性PCK蛋白質(zhì)位于轉(zhuǎn)化水稻植物的葉綠體中，通過(guò)將編碼水稻Rubisco小亞單位的序列加到編碼從U.panicoides分離的PCK蛋白質(zhì)的cDNA中而制備的嵌合基因?qū)胨龅乃局参镏屑纯傻玫睫D(zhuǎn)化水稻植物。
序列表SEQ ID NO1序列長(zhǎng)度2220序列類(lèi)型核酸序列描述CTCCACACCG CTTCCTCGGC GGCCGGCGCA CGTCGCTGCT CCCGACGCTC GAACGAG 57ATG GCG TCG CCG AAC GGT GGT GTC ACG ACC TAT GAC TAC GAC GAC AGC105Met Ala Ser Pro Asn Gly Gly Val Thr Thr Tyr Asp Tyr Asp Asp Ser1 5 10 15GAC AGC GCG GCG CCG GTG CGC GCG CAG ACC ATC GAG GAG CTG CAT TCG153Asp Ser Ala Ala Pro Val Arg Ala Gln Thr Ile Glu Glu Leu His Ser20 25 30CTG CAG CGG AAG GCT GCC GCC ACG GCC AAG GAT AGC GCA TCG CCC CTG201Leu Gln Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Lys Asp Ser Ala Ser Pro Leu35 40 45CAG TCC ATC AGC GCG TCA TTG GCG TCT ACG GCA CGT GAA TAT GGC CCC249Gln Ser Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ser Thr Ala Arg Glu Tyr Gly Pro50 55 60AAC CTC GTC AAG GGT GAC CCG GAA GCG AAG GGC GCG CCG CCG GCG CCG297Asn Leu Val Lys Gly Asp Pro Glu Ala Lys Gly Ala Pro Pro Ala Pro65 70 75 80GTA AAG CAC CAG CAG GCC GCC GCC GCT GCC GCC ATC GCC GCC AGT GAC345Val Lys His Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp85 90 95AGC TCC CTC AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG393Ser Ser Leu Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Ash Leu Ser Pro Ala Glu100 105 110CTG TAC GAG CAG GCT TTC GGG CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG441Leu Tyr Glu Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser115 120 125ACC GGC GCG CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGT CGG TCG CCC489Thr Gly Ala Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro130 135 140AGG GAC AAG CGC GTC GTC AAG GAC GAC ACC ACC GCG CAG GAG GTG TGG537Arg Asp Lys Arg Val Val Lys Asp Asp Thr Thr Ala Gln Glu Leu Trp145 150 155 160TGG GGC AAG GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG585Trp Gly Lys Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val165 170 175ATC AAC AGG GAG CGG GCC CTG GAC TTC CTC AAC TCC CTG GAC AAG GTG633Ile Asn Arg Glu Arg Ala Leu Asp Phe Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val180 185 190TAC GTC AAC GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC CCC GAG AAC CGC ATC AAG681Tyr Val Asn Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Pro Glu Asn Arg Ile Lys195 200 205GTC CGG ATC ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTC ATG CAC AAC729Val Arg Ile Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn210 215 220ATG TGC ATC CGT CCC ACC GAG GAG GAG CTG GAG ACC TTC GGC ACG CCG777Met Cys Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Thr Phe Gly Thr Pro225 230 235 240GAC TTC ACC ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC825Asp Phe Thr Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala245 250 255AAC TAC ATG ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG873Asn Tyr Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg260 265 270GAG ATG GTG ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCT GGG GAG ATG AAG AAG GGC921Glu Met Val Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly275 280 285CTC TTC GGC GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGC GGC ATC CTC TCG969Leu Phe Gly Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser290 295 300CTG CAC TCC GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAA GGT CAC GTC GCC CTC TTC 1017Leu His Ser Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe305 310 315 320TTC GGG CTC TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAC 1065Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn325 330 335AGG CTC CTG ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC 1113Arg Leu Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val340 345 350TCC AAC ATT GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATC GAC CTG TCC AAG 1161Ser Asn Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Lys355 360 365GAG AAA GAA CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC ACG TTT GGA ACA GTG CTG 1209Glu Lys Glu Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Thr Phe Gly Thr Val Leu370 375 380GAA AAC GTC GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC 1257Glu Asn Val Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp385 390 395 400AAA TCT ATC ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC 1305Lys Ser Ile Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile405 410 415CCC AAC GCC AAG ATC CCA TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC 1353Pro Asn Ala Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile420 425 430CTC CTG GCC TGC GAC GCG TAC GGC GTG GTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC 1401Leu Leu Ala Cys Asp Ala Tyr Gly Vai Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu435 440 445AAC CTG GCG CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACT GCC ATC 1449Asn Leu Ala Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile450 455 460GTC GCC GGC ACG GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCG ACC TTC TCG 1497Val Ala Gly Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser465 470 475 480GCC TGC TTC GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCC 1545Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala485 490 495GCC ATG CTC GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC CGC ACC GGG TGG CTT 1593Ala Met Leu Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Arg Thr Gly Trp Leu500 505 510GTC AAC ACC GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC 1641Val Asn Thr Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile515 520 525AAG CTG CCG TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG 1689Lys Leu Pro Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu530 535 540CTC CTC ACC GCC AAC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC 1737Leu Leu Thr Ala Asn Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile545 550 555 560CCC ACC GAG ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATC CTC GAC CCC GTC AAC 1785Pro Thr Glu Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn565 570 575ACC TGG ACG GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACT CTC CTG AAG CTT GCC 1833Thr Trp Thr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala580 585 590GGG CTC TTC AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG 1881Gly Leu Phe Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly595 600 605GAC GAC AAC AGC CTG ACC GAA CAG ATC CTT GCC GCA GGC CCC AAC TTC 1929Asp Asp Asn Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Gly Pro Asn Phe610 615 620TGATTCCAAG CAATGGATCC GGAACGGCGA GGCGTTGGAG TTGGTTCAGA ATGAACCAGT 1989GGTGCGTGTG TGCGTGCGTG TGTTACGATG ATGATGATGA TGGCGAAAAA AAAACTGTTG 2049GACTGATGAT GTGCCAACAT GGAGTAGACC AGCTCTGTAT GCTATCATGT GTGTGTGGTG 2109TTGTTACCTG TGGTTTGTTC TATCTGGGCG TGGTCCTGGT GTAAATCTGT ATGCCTGTTC 2169GGCGGCCTGG TCCTGGTGTA AATCTGGGCG TGCTTTGCAT CTTGCCCGTG T 2220SEQ ID NO2序列長(zhǎng)度2245序列類(lèi)型核酸序列描述CCTCGGCGGC CGGCGCACGT CGCTGCTCCC GACGCTCGAA CGAG ATG GCG TCG CCG56Met Ala Ser ProAAC GGT GGT GTC ACG ACC TAC GAC TAC CAC GAC AGC GAC AGC GCG GCG104Asn Gly Gly Val Thr Thr Tyr Asp Tyr His Asp Ser Asp Ser Ala Ala5 10 15 20CCG GTG AAC GCG CAG ACC ATC GAA GAG CTG CAT TCG CTG CAG CGG AAG 152Pro Val Asn Ala Gln Thr Ile Glu Glu Leu His Ser Leu Gln Arg Lys25 30 35GCT GCC ACC ACG ACC AAG GAT GGC GCA TCG CCC CTG CAG TCC ATC AGC 200Ala Ala Thr Thr Thr Lys Asp Gly Ala Ser Pro Leu Gln Ser Ile Ser40 45 50GCG TCA TTG GCG TCT CTG GCA CGT GAA TAT GGC CCC AAC CTC GTC AAG248Aia Ser Leu Ala Ser Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys55 60 65GGT GAC CCG GAA GCG ACC AAG GGC GCG CCG CCG GTG CCG ATA AAG CAC296Gly Asp Pro Glu Ala Thr Lys Gly Ala Pro Pro Val Pro Ile Lys His70 75 80CAG CAG CCC TCC GCC GCC GCT GCC ACC ATC GCC GCC AGC GAC AGC TCC344Gln Gln Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ser Asp Ser Ser85 90 95 100CTC AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG TTG TAC392Leu Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu Leu Tyr105 110 115GAG CAG GCT TTC GGC CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG ACC GGC440Glu Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser Thr Gly120 125 130GCG CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGC CGG TCG CCC AGG GAC488Ala Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Arg Asp135 140 145AAG CGT GTC GTC AAG GAC CAG ACC ACC TCA CAG GAG CTC TGG TGG GGC536Lys Arg Val Val Lys Asp Glu Thr Thr Ser Gln Glu Leu Trp Trp Gly150 155 160AAG GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG ATC AAC584Lys Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val Ile Asn165 170 175 180AGG GAG CGG GCC CTG GAC TAC CTC AAC TCA CTG GAC AAG GTG TAC GTC632Arg Glu Arg Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val Tyr Val185 190 195AAC GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC TCG GAG AAC CGC ATC AAG GTC CGC680Asn Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Ser Glu Asn Arg Ile Lys Val Arg200 205 210ATC ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTT ATG CAC AAC ATG TGC728Ile Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn Met Cys215 220 225ATC CGG CCC ACG GAA GAG GAG CTG GAG AGC TTC GCC ACG CCG GAC TTC776Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Thr Pro Asp Phe230 235 240ACC ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC AAC TAC824Thr Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala Asn Tyr245 250 255 260ATG ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG GAG ATG872Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Asn Glu Met265 270 275GTA ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCC GGG GAG ATG AAG AAG GGG CTC TTT920Val Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Leu Phe280 285 290GGC GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGA GGC ATC CTC TCG CTG CAC968Gly Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser Leu His295 300 305TCC GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAG GGT GAC GTC GCC CTC TTC TTT GGG 1016Ser Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly310 315 320CTC TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAT AGG CTC 1064Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn Arg Leu325 330 335 340CTG ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC TCC AAC 1112Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val Ser Asn345350 355ATT GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATT GAC CTG TCC CAG GAG AAG 1160Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Gln Glu Lys360 365 370GAA CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC AAG TTT GGA ACT GTG CTG GAG AAC 1208Glu Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Lys Phe Gly Thr Val Leu Glu Asn375 380 385GTC GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC AAA TCT 1256Val Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp Lys Ser390 395 400ATC ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC CCC AAC 1304Ile Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile Pro Asn405 410 415 420GCC AAG ATC CCG TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC CTC CTG 1352Ala Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu425 430 435GCG TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC AAC CTG 1400Ala Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu Asn Leu440 445 450GCG CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACC GCC ATC GTC GCC 1448Ala Gin Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile Val Ala455 460 465GGC ACA GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCC ACA TTC TCG GCC TGC 1496Gly Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ala Cys470 475 480TTC GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCA GCC ATG 1544Phe Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala Ala Met485 490 495 500CTC GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC GCC ACC GGG TGG CTT GTC AAC 1592Leu Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Leu Val Asn505 510 515ACT GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC AAG CTG 1640Thr Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile Lys Leu520 525 530CCG TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG CTC CTC 1688Pro Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu Leu Leu535 540 545AAC GCC AGC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC CCC ACC 1736ASn Ala Ser Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile Pro Thr550 555 560GCG ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATT CTC GAC CCC GTC AAC ACC TGG 1784Ala Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn Thr Trp565 570 575 580ACG GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACG CTC CTG AAG CTT GCC GGG CTC 1832Thr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Leu585 590 595TTC AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG AAC AAC 1880Phe Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly Asn Asn600 605 610AAC AGC CTG ACA GAA CAG ATC CTC GCC GCA GCG CCC AAC TTC 1922Asn Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Ala Pro Asn Phe615 620 625TGATTCCAAG CAATGGATCT GGAACGGCGA GGCGATGGAG TTGGTTCAGA ATAAACCGGT 1982GGTGCGTGCG TGCGTGTGTT ACGATGATGA TGATGGCAAA AAAAAAAACT GTTGGACTGA 2042TTATGTGCCA ACATGCAGTA GACCAGCTCT GTATGCTATC ATGTGTGTGT GGTGGTGTTA 2102CCTGTAAGGT TTGTTCTATC AGCTGGTTCG GCGGCCTGGT TCTGGTGTAA ATCTGGGCGT 2162GCTTTGCATC TTGCCCGTGT ATTCCCTCTT GTTTCAGAAT TTGAATATAT ACTATCTTAT 2222TTCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 2245SEQ ID NO3序列長(zhǎng)度2109序列類(lèi)型核酸序列描述ATG GCC CCC TCC GTG ATG GCG TCG TCG GCC ACC ACC GTC GCT CCC TTC 48Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe1 5 10 15CAG GGG CTC AAG TCC ACC GCC GGC ATG CCC GTC GCC CGC CGC TCC GGC 96Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly20 25 30AAC TCC AGC TTC GGC AAC GTC AGC AAT GGC GGC AGG ATC AGG TGC ATG144Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met
35 40 45CAG TCT AGA TCT CTG GCA CGT GAA TAT GGC CCC AAC CTC GTC AAG GGT192Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys Gly50 55 60GAC CCG GAA GCG ACC AAG GGC GCG CCG CCG GTG CCG ATA AAG CAC CAG240Asp Pro Glu Ala Thr Lys Gly Ala Pro Pro Val Pro Ile Lys His Gln65 70 75 80CAG CCC TCC GCC GCC GCT GCC ACC ATC GCC GCC AGC GAC AGC TCC CTC288Gln Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ser Asp Ser Ser Leu85 90 95AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG TTG TAC GAG336Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu Leu Tyr Glu100 105 110CAG GCT TTC GGC CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG ACC GGC GCG384Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser Thr Gly Ala115 120 125CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGC CGG TCG CCC AGG GAC AAG432Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Arg Asp Lys130 135 140CGT GTC GTC AAG GAC GAG ACC ACC TCA CAG GAG CTC TGG TGG GGC AAG480Arg Val Val Lys Asp Glu Thr Thr Ser Gln Glu Leu Trp Trp Gly Lys145 150 155 160GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG ATC AAC AGG528Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val Ile Asn Arg165 170 175GAG CGG GCC CTG GAC TAC CTC AAC TCA CTG GAC AAG GTG TAC GTC AAC576Glu Arg Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val Tyr Val Asn
180 185 190GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC TCG GAG AAC CGC ATC AAG GTC CGC ATC624Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Ser Glu Asn Arg Ile Lys Val Arg Ile195 200 205ATC ACC TCC AGG GcG TAC CAC GCC CTC TTT ATG CAC AAC ATG TGC ATC672Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn Met Cys Ile210 215 220CGG CCC ACG GAA GAG GAG CTG GAG AGC TTC GGC ACG CCG GAC TTC ACC720Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Thr Pro Asp Phe Thr225 230 235 240ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC AAC TAC ATG768Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala Asn Tyr Met245 250 255ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG GAG ATG GTA816Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg Glu Met Val260 265 270ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCC GGG GAG ATG AAG AAG GGG CTC TTT GGC864Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Leu Phe Gly275 280 285GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGA GGC ATC CTC TCG CTG CAC TCC912Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser Leu His Ser290 295 300GGG TGC AAC ATG GGC AAGGAG GGT GAC GTC GCC CTC TTC TTT GGG CTC 960Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly Leu305 310 315 320TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAC AGG CTC CTG 1008Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn Arg Leu Leu
325 330 335ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC TCC AAC ATT 1056Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val Ser Asn Ile340 345 350GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATC GAC CTG TCC AAG GAG AAA GAA 1104Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Lys Glu Lys Glu355 360 365CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC ACG TTT GGA ACA GTG CTG GAA AAC GTC 1152Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Thr Phe Gly Thr Val Leu Glu Asn Val370 375 380GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC AAA TCT ATC 1200Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp Lys Ser Ile385 390 395 400ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC CCC AAC GCC 1248Thr Glu ASn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile Pro Asn Ala405410 415AAG ATC CCA TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC CTC CTG GCC 1296Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu Ala420 425 430TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC AAC CTG GCG 1344Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu Asn Leu Ala435 440 445CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACT GCC ATC GTC GCC GGC 1392Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile Val Ala Gly450 455 460ACG GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCG ACC TTC TCG GCC TGC TTC 1440Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ala Cys Phe465 470 475 480GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCC GCC ATG CTC 1488Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala Ala Met Leu485 490 495GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC CGC ACC GGG TGG CTT GTC AAC ACC 1536Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Arg Thr Gly Trp Leu Val Asn Thr500 505 510GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC AAG CTG CCG 1584Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile Lys Leu Pro515 520 525TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG CTC CTC ACC 1632Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu Leu Leu Thr530 535 540GCC AAC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC CCC ACC GAG 1680Ala Asn Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile Pro Thr Glu545 550 555 560ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATC CTC GAC CCC GTC AAC ACC TGG ACG 1728Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn Thr Trp Thr565 570 575GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACT CTC CTG AAG CTT GCC GGG CTC TTC 1776Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Leu Phe580 585 590AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG GAC GAC AAC 1824Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Asp Asn595 600 605AGC CTG ACC GAA CAG ATC CTT GCC GCA GGC CCC AAC TTC TGATTCCAAG1873Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Gly Pro Asn Phe
610 615 620CAATGGATCC GGAACGGCGA GGCGTTGGAG TTGGTTCAGA ATGAACCAGT GGTGCGTGTG 1933TGCGTGCGTG TGTTACGATG ATGATGATGA TGGCGAAAAA AAAACTGTTG GACTGATGAT 1993GTGCCAACAT GGAGTAGACC AGCTCTGTAT GCTATCATGT GTGTGTGGTG TTGTTACCTG 2053TGGTTTGTTC TATCTGGGCG TGGTCCTGGT GTAAATCTGT ATGCCTGTTC GGCGGC 2109
權(quán)利要求
1.編碼序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它編碼序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列。
3.編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的DNA，它編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列。
5.編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第61氨基酸Glu到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第61氨基酸Glu到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA，它編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第61氨基酸Glu到C-末端的氨基酸序列。
7.編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第66氨基酸Leu到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第66氨基酸Leu到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA，它編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第66氨基酸Leu到C-末端的氨基酸序列。
9.編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第69氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第69氨基酸Gly到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的DNA，它編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第69氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列。
11.編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第75氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第75氨基酸Gly到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的DNA，它編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的第75氨基酸Gly到C-末端的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的DNA，它具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列區(qū)的核苷酸序列，所述的區(qū)域編碼權(quán)利要求1-12所述的氨基酸序列。
14.編碼序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外與SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的DNA，它編碼序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
16.編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第57氨基酸Ser到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的DNA，它編碼SEQ ID NO2所示第57氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的DNA，它具有SEQ IDNO2所示核苷酸序列區(qū)的核苷酸序列，所述的區(qū)域編碼權(quán)利要求14-17所述的氨基酸序列。
19.編碼序列表SEQ ID NO3所示氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外與SEQ ID NO3所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的DNA，它編碼序列表SEQ ID NO3所示氨基酸序列。
21.編碼SEQ ID NO3所示氨基酸序列的第52氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外，與從SEQ ID NO3所示氨基酸序列的第52氨基酸Ser到C-末端相同的氨基酸序列的克隆DNA，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的DNA，它編碼SEQ ID NO3所示氨基酸序列的第52氨基酸Ser到C-末端的氨基酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)的DNA，它具有SEQ IDNO3所示核苷酸序列區(qū)的核苷酸序列，所述的區(qū)域編碼權(quán)利要求19-22所述的氨基酸序列。
24.含有權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述DNA的重組載體，它可以在所述的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述的DNA。
25.用權(quán)利要求24的所述重組載體轉(zhuǎn)化的植物，它可產(chǎn)生磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的植物，為水稻。
全文摘要
公開(kāi)了編碼C4植物磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的克隆DNA。本發(fā)明的DNA編碼序列表SEQ IDNO1，2或3所示氨基酸序列或編碼除加入、缺失、插入或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸外與SEQ ID NO1，2或3所示氨基酸序列相同的氨基酸序列，條件是具有所述氨基酸序列的所述多肽有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1134171SQ95190782
公開(kāi)日1996年10月23日 申請(qǐng)日期1995年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月9日
發(fā)明者鈴木莊一, 新井雅雄, 村井宣彥, P·M·芬尼根, J·N·伯奈爾 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社 被以下專(zhuān)利引用 (1),