專(zhuān)利名稱(chēng)：重組美殺菌素及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及肽抗生素美殺菌素(mersacidin)的結(jié)構(gòu)基因順序。順序分析表明，前美殺菌素由非常長(zhǎng)的48個(gè)氨基酸的前導(dǎo)順序和20個(gè)氨基酸的原部分肽組成。
肽原部分在生物合成中被修飾為成熟的羊毛硫氨酸抗生素(lantibiotic)。
Mersacidin屬于一類(lèi)殺菌肽，為表明這些肽含有稀有氨基酸羊毛硫氨酸和/或3—甲基羊毛硫氨酸，稱(chēng)之為羊毛硫氨酸抗生素。通常還含有一些被修飾的氨基酸如脫氫丙氨酸和脫氫酷脂，而僅在一些羊毛硫氨酸抗生素中發(fā)現(xiàn)有S—氨基乙烯基半胱氨酸和賴(lài)氨酸丙氨酸縮合物(G.Jung(1991)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.301051-1068)羊毛硫氨酸抗生素由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生.從核糖體合成的前肽得到。發(fā)現(xiàn)羊毛硫氨酸抗生素的結(jié)構(gòu)基因或者在細(xì)菌染色體上(例如枯草桿菌素和肉桂霉素)，或者與可移動(dòng)成分如易位子(如，乳酸鏈球菌肽)或大質(zhì)粒(如，表皮纖維和Pep5)有關(guān)。前肽由一個(gè)N末端前導(dǎo)順序(自生產(chǎn)細(xì)胞排出之后被切掉和一個(gè)C末端前肽組成，前肽翻譯后被修飾為成熟的羊毛硫氨酸抗生素(G.Jung(1991)，上述文章在修飾的第一步，將絲氨酸和蘇氨酸殘基脫水分別成脫氫丙氨酸(Dha)或脫氫酪脂(Dhb)(H.-P.Weil)等。(1990)，Eur.J.Biochem.194217-223)，隨后，半胱氨酸殘基的巰基與Dha或Dhb殘基的雙鍵反應(yīng)，分別形成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。
美殺菌素被從枯草桿菌HLY—85,54728培養(yǎng)液的上清液中分離出來(lái)而且由于它對(duì)于抗二甲氧基苯青霉素的金黃色葡萄菌(MRSA)有顯著的體內(nèi)活效，引起了人們的興趣(S.Chatteruee等人(1992)，J.Antibiotics 45839-845)它是迄今為止分離出的最小的羊毛硫氨酸抗生素(1825道爾頓)，由含20個(gè)氨基酸的肽原合成，含有三個(gè)甲基羊毛硫氨酸殘基、一個(gè)脫氫丙氨酸和一個(gè)S一氨基乙烯基—2—甲基半胱氨酸(附圖1A)(S.Chatterjee(1992)，J.Antibiotics 45832-838)。美殺菌素不帶凈電荷，總體上具有疏水性。，近期結(jié)果表明，美殺菌素阻礙肽聚糖的生物合成。這最可能通過(guò)與目前便用的抗MRSA的抗生素不同的機(jī)制在轉(zhuǎn)糖基作用水平上發(fā)生。
因此，本發(fā)明涉及具有附圖2中所示從第1至第68個(gè)氨基酸的氨基酸順序的前美殺菌素和具有附圖2中所示從第49至第68個(gè)氨基酸的氨基酸順序的美殺菌素原。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是編碼前美殺菌素或美殺菌素原的DNA，尤其是具有附圖2中所示第22至255核苷酸順序的編碼前美殺菌素原的DNA或第166至225核苷酸順序的編碼美殺菌素原的DNA；含有所述DNA的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。
另一個(gè)實(shí)施方案是一種利用所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的基因技術(shù)手段生產(chǎn)前美殺菌素、美殺菌素原或成熟的美殺菌素的方法，即在適宜條件下，培養(yǎng)含有所述編碼前美殺菌素或前殺菌素原的DNA的合適的宿主細(xì)胞，然后分離出由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的前美殺菌素、美殺菌素原或成熟的美殺菌素。宿主細(xì)胞優(yōu)選革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如桿菌屬、鏈霉菌屬或鏈球菌屬。
最后，例如象WO90/00558所述的那樣，本發(fā)明的前美殺菌素或美殺菌素原肽或者其基因能夠用于成熟美殺菌素的生產(chǎn)。
作為實(shí)例，成熟的美殺菌素作為肽抗生素對(duì)食品的保存(尤其對(duì)于抗二甲氧基苯青霉素的金黃色葡萄球菌)或作為治療由金黃色葡萄球菌引起的人或動(dòng)物感染的抗生素是有用的。本發(fā)明可進(jìn)一步用于獲得具有突出的抗菌譜或不同功效的美殺菌素衍生物(氨基酸順序上進(jìn)行了修飾)。另外，本發(fā)明為通過(guò)遺傳工程大量表達(dá)美殺菌素或其衍生物開(kāi)辟了道路。


附圖1A)羊毛硫氨酸抗生素美殺菌素的結(jié)構(gòu)B)推斷的前肽順序和用于結(jié)構(gòu)基因鑒定的51個(gè)堿基的推測(cè)子(guessmer)的順序。附圖2羊毛硫氨酸抗生素美殺菌素的結(jié)構(gòu)基因mrsA的核苷酸順序和推斷的前肽的氨基酸順序。ATG起始密碼子前的核糖體結(jié)合部位用方框標(biāo)出，加工部位用箭頭標(biāo)出。推斷的P—獨(dú)立終止區(qū)在其下劃線標(biāo)出。附圖3幾種羊毛硫氨酸抗生素的前導(dǎo)順序的比較。
共有順序已用黑體字標(biāo)出。
實(shí)施例1.美殺菌素結(jié)構(gòu)基因的克隆推測(cè)的美殺菌素肽原順序(附圖1B)是從美殺菌素的結(jié)構(gòu)推斷的，并以羊毛硫氨酸抗生素有關(guān)生物合成的一般信息為依據(jù)。所述探針是根據(jù)在PCR—MateR(Applied Biosystems，Weiterstadt，F(xiàn)RG)上優(yōu)選便用的芽孢桿菌密碼子，被合成為51個(gè)堿基的推測(cè)子并用異羥基洋地黃毒甙元(Boehringer Mannheim，Mannheim，F(xiàn)RG)(附圖1B)加以標(biāo)記。氨基丁酰殘基(Abus-甲基羊毛硫氨酸的一半)從蘇氨酸得到，而丙氨酸殘基(Alas—甲基羊毛硫氨酸的一半)在肽原中被編碼為半胱氨酸。形成末端環(huán)形結(jié)構(gòu)的S—氨基乙烯基—2—甲基半胱氨酸可能是由甲基羊毛硫氨酸形成的。象所示的含有C末端S—氨基乙烯基半胱氨酸的表皮纖維一樣，這種甲基羊毛硫氨酸已被氧化脫羧(T.Kupke等人(1992)，J.Bcateriol.1745354-5361).
由于不能在生產(chǎn)菌株中檢測(cè)出質(zhì)粒，所以用Marmur所述的方法(.J.Marmur(1961)，J.Mol.Biol.3208-218)制備染色體DNA，不同的是僅進(jìn)行一種氯仿提取和沉淀，隨后將DNA溶解于平稀緩沖液中，在Qiagen-tipR100柱(Diagen，Hilden，F(xiàn)RG)上純化。在51℃下，用HindIII限制性酶切染色體，其2kb帶與Southern印跡的探針雜交(E.M.Souther(1975)，J.Mol.Biol.98503-517)。大小范圍為1.9至2.3kb的片段從凝膠上切下來(lái)，用BIOTRAPR(Schleieher and Schiill，DQssel，F(xiàn)RG)洗脫，在大腸桿菌的PUC18(C.Yanisch-Perron等人(1985)，Gene33103-109)中再克隆。用Birnboim和Doly方法(H.C.Bimboim and J.Doly(1979)，Nucl.Acids Res.71513-1523)制備幾種重組菌落的質(zhì)粒，用HindIII酶切并用推測(cè)子探查。通過(guò)用多種酶限制性酶切和隨后的Southern印跡可進(jìn)一步分析其中段一種產(chǎn)生.陽(yáng)性信號(hào)的克隆。最后，將1.3kb的EcoRI-HindIII片段再克隆至大腸桿菌的pEMBL18和pEMBL19(I.Dente等人(1983)，Nucleic Acids.Res.111645-1655)中。進(jìn)而，在用性別轉(zhuǎn)換基因位點(diǎn)定向誘變藥盒(Clontech，Palo.Alto，USA)進(jìn)行EcoRI位點(diǎn)到EcoRIV位點(diǎn)的位點(diǎn)定向誘變后，在載體pCUI(J.Augustin等人(1992)，Eur.J.Biahem.2041149—1154)中克隆0.6kb的EcoRV片段。2.美殺菌素結(jié)構(gòu)基因mrsA的核苷酸順序利用雙脫氧鏈終止法(F.Sanger等(1977)，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 745463-5467)在A.L.F自動(dòng)DNA順序分析儀上(Pharmocia，Brussels，Belgium)測(cè)出了雙鏈DNA的0.6kb片段的DNA順序。為了引發(fā)Auto Read順序分析藥盒(Pharmaciq，Brussels，Belgiun)的通用和逆轉(zhuǎn)引物，使用了兩種合成的寡核苷酸5’—(TCTCTTCCAATTTTTTTG)3’和5’—(AAAT-(AAATTAACAAATAC)3’。美殺菌素結(jié)構(gòu)基因mrsA的核苷酸順序示于附圖2。在開(kāi)放讀碼的起始密碼子ATG上游8個(gè)堿基對(duì)處發(fā)現(xiàn)了潛在的核糖體結(jié)合部位(AGGGGG)。該順序的C末端部分與已發(fā)表過(guò)的美殺菌素一級(jí)結(jié)構(gòu)(S.Chatterjee等人(1992)，J.Antibiotics45832—838)和其推薦的肽原順序一致。N末端部分由48個(gè)氨基酸的前導(dǎo)順序組成(附圖2中的箭頭)。美殺菌素原含有20個(gè)氨基酸。因此，前肽的全長(zhǎng)為68個(gè)氨基酸，計(jì)算的分子量為7728道爾頓。在(赭石型)終正密碼子TAA的上游8個(gè)堿基對(duì)處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)自由能值為-86.7KJ.mol-1柄尺寸為14個(gè)堿基對(duì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由于它后面是緊接著TTTATT這一順序，故可在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中作為P—獨(dú)立終止區(qū)(附圖2)。3.美殺菌素前肽的表征羊毛硫氨酸抗生素已被細(xì)分為兩類(lèi)(G.Jung(1991)，上述文章。A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素是能在敏感性細(xì)菌的膜中形成瞬時(shí)孔的延伸的兩親性肽(H.-G.Sahl(1991)，Pore formation in bac-terial nernbranes byCationic lantibiotics，P.347-358.ln G.Jungand H.-G.Sahl(ed.)，Nisin and novel lantibiotics，Escom，Leiden)。B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素是由鏈霉菌屬產(chǎn)生的球狀肽，其分子量小于2100道爾頓，至于它們的氨基酸順序和包括頭尾縮合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是高度同源的(G.Jung(1991)上述文章。迄今美殺菌素不能歸入任何一類(lèi)(G.Bierbaum and H.-G.Sahl(1993)，zbl.Bakt.2781-22)。鑒于此，比較美殺菌素與A類(lèi)和B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素的前肽順序具有特殊意義。
美殺菌素中保留了羊毛硫氨酸抗生素前導(dǎo)順序的兩個(gè)共同特征i)在前導(dǎo)順序中沒(méi)有半胱氨酸(G.Jung(1991)，上述文章)；ii)推測(cè)出前導(dǎo)順序的C末端部分具有2—螺旋傾向。通過(guò)在三氟乙醇/水混合物中的圓二色性測(cè)定，預(yù)測(cè)并表明了A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素具有這樣的結(jié)構(gòu)單元(A.G.Beck-Sickinger and G.Jung.Synthesis and conrormational analysis oflantibiotic leader-，Pro-and prepeptides.P.218-230.In G.Jung and H.-G.Sahl(ed)，Nisin and novel lamtibiotics，Escom，Leiden 199)。在其它任何方面，美殺菌素前導(dǎo)順序與迄今所述的A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素前導(dǎo)順序不同。如附圖3中所示，它在長(zhǎng)度和電荷分布上(48個(gè)氨基酸/口個(gè)電荷)更類(lèi)似于B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素肉桂霉素的非常長(zhǎng)的59個(gè)氨基酸的前導(dǎo)順序(11個(gè)電荷)(C.Kaletta等人(1989)，Pep5，a new lantibioticStructural gene isolation andPrepeptide sequence.Arch.Microbiol.15216-19)。與此相反，典型的帶高電荷的A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素前導(dǎo)順序，例如，Pep5前導(dǎo)肽，總共只有26個(gè)氨基酸卻含有10個(gè)帶電荷的殘基(C.Kaletta等人(1989)，上述文章。A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素的保留順序(例如，F(xiàn)D/N LD/E motif)在美殺菌素的前導(dǎo)肽中并未發(fā)現(xiàn)。美殺菌素前導(dǎo)順序的蛋白酶切點(diǎn)(-4M--3E--2A--1A-+1C)不同于A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素的共同切點(diǎn)(附圖3)。這里，我們找到乳酸鏈球菌肽型切點(diǎn)(-1，帶正電荷的氨基酸；-2，脯氨酸；-3，帶負(fù)電荷的或極性的；-4，疏水的)或含有乳酸菌素(lacyticin)481(J.-C.Piard等人(1993)，J.Biol.Chem.，268.16361-16368)或鏈球菌A—FF22(W.L.Hynes等.(1993)，Appl.Env.Microblol.591969-1971)切點(diǎn)的疏水性甘氨酸。肉桂霉素的(-3A--2F--1A)切點(diǎn)(C.Kaletta等人(1989)，上述文章符合通過(guò)Sec途徑分泌的蛋白質(zhì)的(-3A--2X--1A)規(guī)則?？傊罋⒕厍半膶?duì)A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素前導(dǎo)順序的保留順序不顯示同源性。在長(zhǎng)度和電荷分布上與肉桂霉素的前肽有相似之處，但在氨基酸水平上沒(méi)有明顯的順序同源性。美殺菌素比A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素小，不帶正電荷，不能使膜極化，但能抑制肽聚糖的生物合成。除了前導(dǎo)肽的特性之外。這也表明美殺菌素與B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素比與A類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素更相關(guān)。最近，另一種也能抑制細(xì)胞壁生物合成的羊毛硫氨酸抗生素—actagardine的順序和橋連類(lèi)型已被闡明(S.Sommo等人，Antimi-crob.Agents Chemother.11396-401，1977)。與美殺菌素的比表明，在兩種羊毛硫氨酸抗生素中幾乎完全保留一個(gè)環(huán)。鑒于至今表征的B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素—耐久霉素A.B.C.ancovenin和肉桂霉素的高度同源性，就象觀察到的表皮纖維和gallidermin或乳酸鏈球菌肽A和Z一樣，這些肽也可被視為結(jié)構(gòu)變異體。因此，我們建議，美殺菌素和actagardine應(yīng)被歸入B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素，B類(lèi)羊毛硫氨酸抗生素的名稱(chēng)不應(yīng)專(zhuān)門(mén)留給耐久霉素的結(jié)構(gòu)變異體，而應(yīng)包括帶低電荷且能抑制酶活力的小球狀羊毛硫氨酸抗生素。
順序一覽表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)赫徹斯特股份公司(B)街—(C)城市美因河畔法蘭克福(D)州—(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(zip)65921(G)電話069—305—6031(H)傳真069—35 7175(I)電傳41234700 hod(ii)發(fā)明名稱(chēng)重組美殺菌素及其生產(chǎn)方法(iii)順序的數(shù)目4(iv)機(jī)讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM—PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直線(ii)分子類(lèi)型DNA(基團(tuán)組的)(iii)假設(shè)的是(iii)反義是(vi)特點(diǎn)(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵外顯子(B)位置1…17(ix)順序描述SEQ ID NO 1TCTCTTCCAT TTTTTTG(2)SEQ ID NO 2的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直線(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假設(shè)的是(iii)反義是(vi)特點(diǎn)(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵外顯子(B)位置1…19(ix)順序描述SEQ ID NO 2A AATCAAATT AACAAATAC(2)SEQ ID NO 3的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度288個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直線(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假設(shè)的否(iii)反義是(vi)原始來(lái)源(A)學(xué)名美殺菌素(B)菌株芽孢桿菌(C)個(gè)體分離菌HIL Y85，54728(ix)特點(diǎn)(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵RBS(B)位置1…21(ix)特點(diǎn)(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵CDS(B)位置22…225(ix)特點(diǎn)(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵終止區(qū)(B)位置208…288(xi)順序描述SEQ ID NO 3CTTAATAAGG GGGTGAATAC A ATG AGT CAA GAA GCT ATC ATT CGT TCA TGG51Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp1 5 10AAA GAT CCT TTT TCC CGT GAA AAT TCT ACA CAA AAT CCA GCT GGT AAC99Lys Asp Pro Phe Ser Arg Glu Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn15 20 25CCA TTC AGT GAG CTG AAA GAA GCA CAA ATG GAT AAG TTA GTA GGT GCG 147Pro Phe Ser Glu Leu Lys Glu Ala Glu Met Asp Lys Leu Val Gly Ala30 35 40GGA GAC ATG GAA GCA GCA TGT ACT TTT ACA TTG CCT GGT GGC GGC GGT 195Gly Asp Met Glu Ala Ala Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly45 50 55GTT TGT ACT CTA ACT TCT GAA TGT ATT TGT TAATTTGATT TATATAGGCT 245Val Cys Thr Leu Thr Ser Glu Cys Ile Cys60 65GTTTCCCTTC AGAAGGAACA GCCTATATTT TATTATATAA ACT 288(2)SEQ ID NO 4的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)直線(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)順序描述SEQ ID NO 4Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp Lys Asp Pro Phe Ser Arg1 5 10 15Glu Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn Pro Phe Ser Glu Leu Lys20 25 30Glu Ala Gln Met Asp Lys Leu Val Gly Ala Gly Asp Met Glu Ala Ala35 40 45Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly Val Cys Thr Leu Thr Ser50 55 60Glu Cys Ile Cys6權(quán)利要求
1.具有附圖2中所示從第1至第68個(gè)氨基酸的氨基酸順序的前美殺菌素。
2.具有附圖2中所示從第49至第68個(gè)氨基酸的氨基酸順序的美殺菌素原。
3.編碼根據(jù)權(quán)利要求1的前美殺菌素的DNA。
4.具有附圖2中所示從第22至第225個(gè)核酸的核酸順序的編碼前美殺菌素的DNA。
5.編碼根據(jù)權(quán)利要求2的美殺菌素原的DNA。
6.具有附圖2中所示從第166至第255個(gè)核酸的核酸順序的編碼美殺菌素原的DNA。
7.含有根據(jù)權(quán)利要求3，4，5，或6之一的DNA的載體。
8.含有根據(jù)權(quán)利要求7的載體的宿主細(xì)胞。
9.生產(chǎn)前美殺菌素，美殺菌素原或成熟美殺菌素的方法，包括如下步驟(a)在適宜條件下，培養(yǎng)含有根據(jù)權(quán)利要求3—6的DNA順序的合適的宿主細(xì)胞；以及(b)分離出前美殺菌素，美殺菌素原或成熟美殺菌素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2的前美殺菌素或美殺菌素原用于成熟美殺菌素的生產(chǎn)的用途。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及肽抗生素美殺菌素的結(jié)構(gòu)基因順序。順序分析表明，美殺菌素原由非常長(zhǎng)的48個(gè)氨基酸的前導(dǎo)順序和20個(gè)氨基酸的肽原部分組成。肽原部分在生物合成中被修飾為成熟的羊毛硫氨酸抗生素。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1131192SQ9511623
公開(kāi)日1996年9月18日 申請(qǐng)日期1995年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月12日
發(fā)明者K·P·考勒, H·G·薩爾, G·比爾伯姆 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司