一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的lc-ms-ms檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC?MS?MS檢測(cè)方法，屬于農(nóng)藥殘留量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本方法用乙腈溶液均質(zhì)提取樣品中殘留的乙基多殺菌素，提取液經(jīng)分散凈化后，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS?MS）檢測(cè)，采用不含待測(cè)農(nóng)藥的空白基質(zhì)溶液建立校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。本方法平均回收率為87.2%～96.5%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.77%～3.23%，本發(fā)明檢出限0.001mg/kg，定量檢出限0.01mg/kg。具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、定性定量準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。能滿足0.01mg/kg殘留限量的“一律標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)要求，為保障我國(guó)人民食品安全、對(duì)外出口貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。
【專利說(shuō)明】
一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種乙基多殺菌素殘留量的檢測(cè)方法，更具體地涉及一種蔬菜水果中 乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)檢測(cè)方法，屬于農(nóng)藥殘留量檢測(cè)技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙基多殺菌素（Spinetram)是一種從放線菌刺糖多孢菌 (Saccharopolysporaspinosa)發(fā)酵產(chǎn)生的生物殺蟲(chóng)劑，其原藥的有效成分是乙基多殺菌 素-J和乙基多殺菌素-L的混合物（比值為3:1)，他們的殺菌生物活性無(wú)顯著差異。分子式： 乙基多殺菌素 _J為C42H69NO1Q，乙基多殺菌素-L為C43H69NO10。
[0003] 乙基多殺菌素原藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.2%，是帶有霉味的灰白色固體，PH6.46(1%水 溶液，23.1°C );熔解溫度：乙基多殺菌素-J為143.4°C，乙基多殺菌素-L為70.8°C ;沸騰前 分解溫度：乙基多殺菌素-J為297.8°C，乙基多殺菌素-L為290.7°C ;溶解度(g/L，20°C ):甲 醇、丙酮、乙酸乙酯、1，2_二氯乙烷、二甲苯中>250，n-辛醇中132,庚烷中61;水中溶解度： 乙基多殺菌素-J為l〇.〇mg/L，乙基多殺菌素-L為31.9 mg/L;不易燃；（54±2)°C14d熱貯存 穩(wěn)定。乙基多殺菌素60g/L懸浮劑外觀為帶霉味的棕褐色液體;pH6~8;細(xì)度：多98%通過(guò)45mi 試驗(yàn)篩;懸浮率:100%;傾斜性:< 5%;冷、熱、常溫2年貯存穩(wěn)定。
[0004] 乙基多殺菌素原藥大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮LD50>5000mg/kg，急性吸入LC50>5.5mg/ L;對(duì)眼睛有刺激性，皮膚無(wú)刺激性;無(wú)致敏性;大鼠3個(gè)月亞慢性喂養(yǎng)毒性試驗(yàn)最大無(wú)作用 劑量:雄性大鼠為34.7mg/kg. d，雌性大鼠為10. lmg/kg. d;致突變?cè)囼?yàn):Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓 細(xì)胞微核試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)均為 陰性，未見(jiàn)致突變性。乙基多殺菌素60克/升懸浮劑大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮LD50>5000mg/kg， 急性吸入LC50>4.52mg/L;對(duì)眼睛有輕度刺激性，皮膚有刺激性;無(wú)致敏性。乙基多殺菌素 原藥(81.2%)為微毒，乙基多殺菌素60g/L懸浮劑為低毒殺菌劑。
[0005] 乙基多殺菌素作用機(jī)理是作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)中煙堿型乙酰膽堿受體和r-氨基丁酸 受體，致使蟲(chóng)體對(duì)興奮性或抑制性的信號(hào)傳遞反應(yīng)不敏感，影響正常的神經(jīng)活動(dòng)，直至死 亡。乙基多殺菌素具有胃毒和觸殺作用，主要用于防治鱗翅目害蟲(chóng)（小菜蛾、甜菜夜蛾）及 纓翅目害蟲(chóng)（薊馬）。經(jīng)室內(nèi)生物活性試驗(yàn)表明，對(duì)小菜蛾具有較好的殺蟲(chóng)活性 (LC500.1327mg/L);經(jīng)田間藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙基多殺菌素60克/升懸浮劑對(duì)甘藍(lán)小菜蛾 有較好防效。用藥量為300~600mL(制劑)/hm2或20~40mL(制劑)/667m2,使用方法為加水稀 釋后噴霧。該藥速效性一般，持效時(shí)間為7d左右。在農(nóng)業(yè)上，經(jīng)田間藥效表明，乙基多殺菌素 防治鱗翅目害蟲(chóng)(小菜蛾、甜菜夜蛾)作用效果好，使用劑量低，應(yīng)用范圍廣。
[0006] 隨著人們對(duì)食品中農(nóng)藥殘留毒性的關(guān)注，乙基多殺菌素殘留的檢測(cè)也受到重視。 歐盟于2012年6月發(fā)布規(guī)定，在部分水果產(chǎn)品上的最大殘留限量為0.2mg/kg，在木霉、覆盆 梅子等水果上的最大殘留限量為〇.8mg/kg。同時(shí)，作為我國(guó)主要出口市場(chǎng)的歐盟、日本等國(guó) 家規(guī)定若田間使用農(nóng)藥沒(méi)有在該國(guó)家登記，沒(méi)有制定相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，出口至其國(guó) 家的食品農(nóng)產(chǎn)品包括畜禽肉等動(dòng)物源性食品中殘留限量均實(shí)行〇.〇lmg/L的"一律標(biāo)準(zhǔn)"。
[0007] 目前乙基多殺菌素的檢測(cè)方法尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)頒布，關(guān)于多殺菌素和乙基多殺菌素 的原藥及其在水體、土壤、水稻等基質(zhì)中的殘留分析方法已有報(bào)道，主要采用的是高效液相 色譜法和超高效液相色譜(UPLC)法等。而利用液質(zhì)聯(lián)用方法在基質(zhì)較為復(fù)雜的各種蔬菜水 果中檢測(cè)多乙基多殺菌素殘留，并且適應(yīng)范圍廣、靈敏度高、重復(fù)性好、定性定量準(zhǔn)確的LC-MS-MS方法尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0008] 因此，一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、定性定量準(zhǔn)確的乙基多殺菌素在蔬菜 水果中的殘留檢測(cè)方法亟待開(kāi)發(fā)出來(lái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏度 高、重復(fù)性好、定性定量準(zhǔn)確的蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的檢測(cè)方法。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘 留量的LC-MS-MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1)試樣制備： 將市場(chǎng)采集樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加工機(jī)粉 碎，于-20°C冰柜密閉保存。
[0011] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶液(體積 比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0012] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的同種類基質(zhì)空白樣品按上述步驟(1)、（2)處理，得樣品提取凈 化液，用空白提取凈化液配制成至少5個(gè)濃度的乙基多殺菌素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0013] (4)測(cè)定和結(jié)果計(jì)算： 將步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行LC-MS-MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰 面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;在相同條件下將步驟(2)中凈化后的 樣品液進(jìn)行LC-MS-MS測(cè)定，測(cè)得樣品液中乙基多殺菌素的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到 樣品液中乙基多殺菌素含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計(jì)算得到樣品中乙基多殺 菌素殘留量。
[0014]步驟(1)中樣品若為脫水蔬菜和水果，需降低稱樣量，并加適量水充分浸潤(rùn)。
[0015] 步驟(2)中用乙腈提取時(shí)加入氯化鈉鹽析含水量較少的樣品鹽析時(shí)需加入一定量 的水。
[0016] 步驟(4)中所述的液相色譜的流動(dòng)相包括A相和B相，A相為甲醇，B相為0.05%甲酸 水;流速:0.3 mL/ min;進(jìn)樣體積：1.0yL;柱溫箱:45°C。
[0017] 步驟(4)中液相色譜使用梯度洗脫的方法，梯度洗脫程序?yàn)椋?br>步驟(4)中液相色譜的色譜柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18,2.1X50mm，1.8ym。
[0018] 步驟(4)中分析條件為：離子源溫度375°C .離子源:ESI.電噴霧電壓：5000V。霧化 器壓力:0.138MPa。輔助加熱氣:0.379MPa。掃描模式:正離子掃描。
[0019]步驟(4)中質(zhì)譜檢測(cè)使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式，乙基多殺菌素的母離子、子 尚子，去簇電壓和碰撞能量分別為：
步驟(4)中檢測(cè)所述濾液中農(nóng)藥的母離子和子離子對(duì)，若其離子色譜峰保留時(shí)間與標(biāo) 準(zhǔn)工作溶液一致;且濾液(樣品）中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)目瞻?基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度偏差不超過(guò)30%時(shí)，則判斷該樣品中存在該種農(nóng)藥;若上述 兩個(gè)條件不能同時(shí)滿足，則判斷不含該種農(nóng)藥。
[0020]本發(fā)明所具有的有益效果： 1、本發(fā)明采用LC-MS-MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)法定性定量測(cè)定蔬菜中殘留的以及多殺 菌素含量，采用外標(biāo)法定量，平均回收率為87.2 %~96.5%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)為 0.77%~3.23%%，靈敏度高、重復(fù)性好。
[0021 ] 2、本發(fā)明檢出限0.001mg/kg，定量檢出限0.01mg/kg，能夠簡(jiǎn)便、快速、定性定量準(zhǔn) 確的蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量，能滿足美國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家對(duì)相應(yīng)食品安全檢測(cè) 的0.01mg/kg殘留限量，8卩"一律標(biāo)準(zhǔn)"的技術(shù)要求，將為保障我國(guó)人民食品安全及對(duì)外出 口貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。
[0022] 3、建立了簡(jiǎn)便、快速并能有效避免樣品中基質(zhì)干擾的樣品前處理方法，將此前處 理方法結(jié)合LC-MS-MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)應(yīng)用于蔬菜、水果食品中乙基多殺菌素定性確 證和定量檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖2乙基多殺菌素標(biāo)樣0.1mg/L色譜圖； 圖3蘋(píng)果空白色譜圖； 圖4蘋(píng)果添加0. lmg/kg色譜圖； 圖5結(jié)球甘藍(lán)空白色譜圖； 圖6結(jié)球甘藍(lán)添加0. lmg/kg色譜圖； 圖7菠菜空白色譜圖； 圖8菠菜添加0. lmg/kg色譜圖； 圖9豇豆空白色譜圖； 圖10豇豆添加0 ? lmg/kg色譜圖； 圖11藍(lán)莓空白色譜圖； 圖12藍(lán)莓添加0 ? lmg/kg色譜圖。 具體實(shí)施例
[0024] 下列實(shí)施例是對(duì)發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不僅限于此。
[0025]實(shí)施例中使用的儀器： 液質(zhì)聯(lián)用儀:Agilent 6460 Triple Quad LC/MS;Trace 1310型氣相色譜-TSQ 8000型 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司）；Sartorius電子天平(千分之一，北京賽多利斯 天平有限公司）；IKA T18 Basic均質(zhì)器（德國(guó)IKA公司）；MS 3基本型渦旋混合器（IKA， Germany)〇
[0026] 藥品及標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（質(zhì)量濃度均 為100ug/mL)。乙腈(HPLC 級(jí)，Merke，Germany);甲酸(HPLC 級(jí)，CNW，Germany);甲醇、氯化鈉 為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0027] 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：用空白樣品基質(zhì)溶液配成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用 于制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，不同種類蔬菜或水果制得不同種類的基質(zhì)校正工作溶液，基質(zhì)匹配 標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0028]供試蔬菜水果:蘋(píng)果、結(jié)球甘藍(lán)、菠菜、豇豆、藍(lán)莓、葡萄，購(gòu)自本地超市。
[0029]實(shí)施例1蘋(píng)果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)： (1)試樣制備： 將采集蘋(píng)果樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加工機(jī)粉 碎，于-20°C冰柜密閉保存。
[0030] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好的蘋(píng)果試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入 2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶液(體 積比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0031] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的蘋(píng)果基質(zhì)空白樣品按上述步驟(1)、（2)處理，得樣品提取凈化 液，用空白提取凈化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)LC-MS/MS分析，以所得峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)樣濃度 (mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0032] (4)測(cè)定和結(jié)果計(jì)算： 將步驟(3)中的各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行LC-MS-MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰 面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;在相同條件下將步驟(2)中凈化后的 樣品液注入LC-MS-MS進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得樣品液中乙基多殺菌素的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到樣品液中乙基多殺菌素含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計(jì)算得到樣品中乙基 多殺菌素殘留量。
[0033]步驟(4)中所述的液相色譜的流動(dòng)相包括A相和B相，A相為甲醇，B相為0.05%甲酸 水;流速:0.3 mL/ min;流速:0.3 mL/ min;進(jìn)樣體積：l.OyL;柱溫箱:45°C。
[0034]步驟(4)中液相色譜使用梯度洗脫的方法，梯度洗脫程序如表1: 表1:實(shí)施例1的梯度洗脫程序
步驟(4)中液相色譜的色譜柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18,2.1X50mm，1.8ym。
[0035] 步驟(4)中分析條件為：離子源溫度375°C .離子源:ESI.電噴霧電壓：5000V。霧化 器壓力:0.138MPa。輔助加熱氣:0.379MPa。掃描模式:正離子掃描。
[0036] 步驟(4)中質(zhì)譜檢測(cè)使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式：乙基多殺菌素的母離子、子 離子，去簇電壓和碰撞能量分別如表2: 表2:實(shí)施例1的MRM檢測(cè)參數(shù)
步驟(4)中檢測(cè)所述濾液中農(nóng)藥的母離子和子離子對(duì)，若其離子色譜峰保留時(shí)間與標(biāo) 準(zhǔn)工作溶液一致;且濾液(樣品）中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)目瞻?基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度偏差不超過(guò)30%時(shí)，則判斷該樣品中存在該種農(nóng)藥;若上述 兩個(gè)條件不能同時(shí)滿足，則判斷不含該種農(nóng)藥。
[0037] 以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0038] 表3蘋(píng)果空白基質(zhì)中乙基多殺菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 加標(biāo)回收率和重復(fù)性：
在不含乙基多殺菌素的蘋(píng)果中加入0.01 mg/kg、0.1mg/kg和0.5 mg/kg3個(gè)濃度的添加 水平，待農(nóng)藥添加30min后按上述處理步驟進(jìn)行殘留量測(cè)定。將測(cè)定濃度與農(nóng)藥理論添加 濃度進(jìn)行比較，得到農(nóng)藥添加回收率，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，在3個(gè)加標(biāo)水平上，乙基多殺菌素的平均回收率為92.1 %~ 93.8 %，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.32 %~2.77 %，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率較高，重復(fù) 性好。 表4實(shí)施例1中乙基多殺菌素的回收率和重復(fù)性(n = 6)
檢出限:將不同濃度的乙基多殺菌素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS-MS，以最低濃度基 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰3倍信噪比和樣品處理過(guò)程的濃縮倍數(shù)計(jì)算檢出限，乙基多殺菌素的檢 出限為lyg/kg。
[0039] 實(shí)施例2結(jié)球甘藍(lán)中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)： (1)試樣制備： 將采集的結(jié)球甘藍(lán)樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加 工機(jī)粉碎，于-20 °C冰柜密閉保存。
[0040] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好的結(jié)球甘藍(lán)試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min， 加入2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶 液(體積比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0041 ] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的結(jié)球甘藍(lán)基質(zhì)空白樣品按上述步驟(1)、（2)處理，得樣品提取 凈化液，用空白提取凈化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)工作 溶液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)LC-MS/MS分析，以所得峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)樣濃 度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0042] 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)測(cè)定及定性鑒定的操作 步驟、色譜和質(zhì)譜條件與實(shí)施例1蘋(píng)果樣品中乙基多殺菌素的測(cè)定一致。
[0043] 加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 在不含乙基多殺菌素的結(jié)球甘藍(lán)中加入0? 01mg/kg、0? lmg/kg和0? 5 mg/kg3個(gè)濃度的 添加水平，待農(nóng)藥添加30min后按上述處理步驟進(jìn)行殘留量測(cè)定。將測(cè)定濃度與農(nóng)藥理論添 加濃度進(jìn)行比較，得到農(nóng)藥添加回收率，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè) 定結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出，在3個(gè)加標(biāo)水平上，乙基多殺菌素的平均回收率為90.8%~ 96.5 %，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.77 %~1.98 %，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率較高，重復(fù) 性好。 表5實(shí)施例2中乙基多殺菌素的回收率和重復(fù)性(n = 6)
檢出限:將不同濃度的乙基多殺菌素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS-MS，以最低濃度基 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰3倍信噪比和樣品處理過(guò)程的濃縮倍數(shù)計(jì)算檢出限，乙基多殺菌素的檢 出限為lyg/kg。
[0044]施例3菠菜中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)： (1)試樣制備： 將采集的菠菜樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加工機(jī) 粉碎，于-20°C冰柜密閉保存。
[0045] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好的菠菜試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入 2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶液(體 積比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0046] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的菠菜基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理，得樣品提取凈化 液，用空白提取凈化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)LC-MS/MS分析，以所得峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)樣濃度 (mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0047] 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)測(cè)定及定性鑒定的操作 步驟、色譜和質(zhì)譜條件與實(shí)施例1中蘋(píng)果樣品中乙基多殺菌素的測(cè)定一致。
[0048] 加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 在不含乙基多殺菌素的菠菜中加入0.01mg/kg、0. lmg/kg和0.5 mg/kg3個(gè)濃度的添加 水平，待農(nóng)藥添加30min后按上述處理步驟進(jìn)行殘留量測(cè)定。將測(cè)定濃度與農(nóng)藥理論添加濃 度進(jìn)行比較，得到農(nóng)藥添加回收率，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié) 果見(jiàn)表6。由表6可以看出，在3個(gè)加標(biāo)水平上，乙基多殺菌素的平均回收率為89.2%~ 96.3 %，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.49 %~3.23 %，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率較高，重復(fù) 性好。
[0049] 表6實(shí)施例3中乙基多殺菌素的回收率和重復(fù)性(n = 6)
檢出限:將不同濃度的乙基多殺菌素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS-MS，以最低濃度基 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰3倍信噪比和樣品處理過(guò)程的濃縮倍數(shù)計(jì)算檢出限，乙基多殺菌素的檢 出限為lyg/kg。
[0050] 實(shí)施例4豇豆中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)： (1)試樣制備： 將采集的豇豆樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加工機(jī) 粉碎，于-20°C冰柜密閉保存。
[0051 ] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好的5工豆試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入 2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶液(體 積比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0052] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的豇豆基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理，得樣品提取凈化 液，用空白提取凈化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)LC-MS/MS分析，以所得峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)樣濃度 (mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0053] 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)測(cè)定及定性鑒定的操作 步驟、色譜和質(zhì)譜條件與實(shí)施例1中蘋(píng)果樣品中乙基多殺菌素的測(cè)定一致。
[0054] 加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 在不含乙基多殺菌素的5工豆中加入0? 01mg/kg、0? lmg/kg和0? 5 mg/kg3個(gè)濃度的添加 水平，待農(nóng)藥添加30min后按上述處理步驟進(jìn)行殘留量測(cè)定。將測(cè)定濃度與農(nóng)藥理論添加濃 度進(jìn)行比較，得到農(nóng)藥添加回收率，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié) 果見(jiàn)表7。由表7可以看出，在3個(gè)加標(biāo)水平上，乙基多殺菌素的平均回收率為93.3%~ 95.1 %，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.49 %~1.71 %，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率較高，重復(fù) 性好。
[0055] 表7實(shí)施例4中乙基多殺菌素的回收率和重復(fù)性(n = 6)
檢出限:將不同濃度的乙基多殺菌素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS-MS，以最低濃度基 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰3倍信噪比和樣品處理過(guò)程的濃縮倍數(shù)計(jì)算檢出限，乙基多殺菌素的檢 出限為lyg/kg。
[0056] 實(shí)施例5藍(lán)莓中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)： (1)試樣制備： 將采集的藍(lán)莓樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加工機(jī) 粉碎，于-20°C冰柜密閉保存。
[0057] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好的藍(lán)莓試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入 2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶液(體 積比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0058] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的藍(lán)莓基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理，得樣品提取凈化 液，用空白提取凈化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)LC-MS/MS分析，以所得峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)樣濃度 (mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0059] 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)測(cè)定及定性鑒定的操作 步驟、色譜和質(zhì)譜條件與實(shí)施例1中蘋(píng)果樣品中乙基多殺菌素的測(cè)定一致。
[0060] 加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 在不含乙基多殺菌素的藍(lán)莓中加入0? 01mg/kg、0? lmg/kg和0? 5 mg/kg3個(gè)濃度的添加 水平，待農(nóng)藥添加30min后按上述處理步驟進(jìn)行殘留量測(cè)定。將測(cè)定濃度與農(nóng)藥理論添加濃 度進(jìn)行比較，得到農(nóng)藥添加回收率，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié) 果見(jiàn)表8。由表8可以看出，在3個(gè)加標(biāo)水平上，乙基多殺菌素的平均回收率為90.9%~ 94.6 %，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.11 %~1.54 %，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率較高，重復(fù) 性好。
[0061] 表8實(shí)施例5中乙基多殺菌素的回收率和重復(fù)性(n = 6)
檢出限:將不同濃度的乙基多殺菌素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS-MS，以最低濃度基 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰3倍信噪比和樣品處理過(guò)程的濃縮倍數(shù)計(jì)算檢出限，乙基多殺菌素的檢 出限為lyg/kg。
[0062]實(shí)施例6葡萄中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)： (1)試樣制備： 將采集的葡萄樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2X200g兩份，用食品加工機(jī) 粉碎，于-20°C冰柜密閉保存。
[0063] (2)提取及凈化： 稱取5.0g已制備好的葡萄試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入 2g NaCl，劇烈振搖lmin。取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL的甲醇和水混合溶液(體 積比1:1)過(guò)0.2mi尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品。
[0064] (3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制： 將不含乙基多殺菌素的葡萄基質(zhì)空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理，得樣品提取凈化 液，用空白提取凈化液配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)LC-MS/MS分析，以所得峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，以進(jìn)樣濃度 (mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0065] 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)測(cè)定及定性鑒定的操作 步驟、色譜和質(zhì)譜條件與實(shí)施例1中蘋(píng)果樣品中乙基多殺菌素的測(cè)定一致。
[0066] 加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 在不含乙基多殺菌素的葡萄中加入0? 01mg/kg、0? lmg/kg和0? 5 mg/kg3個(gè)濃度的添加 水平，待農(nóng)藥添加30min后按上述處理步驟進(jìn)行殘留量測(cè)定。將測(cè)定濃度與農(nóng)藥理論添加濃 度進(jìn)行比較，得到農(nóng)藥添加回收率，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié) 果見(jiàn)表9。由表9可以看出，在3個(gè)加標(biāo)水平上，乙基多殺菌素的平均回收率為87.2%~ 92.3 %，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.50 %~2.24 %，說(shuō)明本發(fā)明方法的回收率較高，重復(fù) 性好。
[0067]表9實(shí)施例6中乙基多殺菌素的回收率和重復(fù)性(n = 6)
檢出限:將不同濃度的乙基多殺菌素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS-MS，以最低濃度基 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰3倍信噪比和樣品處理過(guò)程的濃縮倍數(shù)計(jì)算檢出限，乙基多殺菌素的檢 出限為lyg/kg。
[0068] 數(shù)據(jù)表明，將實(shí)施例方法配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.511^/1乙基多殺菌素標(biāo) 準(zhǔn)工作溶液，以進(jìn)樣濃度（mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.001~ 0. lmg/L范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=3000000x-12253,相關(guān)系數(shù)為r=0.9987。
[0069]上述實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限 定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的 各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法 包括以下步驟:1)試樣制備:將采集樣品按照四分法縮分，用食品加工機(jī)粉碎，于-20°C冰柜 密閉保存;2)提取及凈化:稱取已制備好試樣于離心管中，加入乙腈，高速勻漿后加入NaCl， 劇烈振搖lmin;取上層乙腈相離心，取上清液加入體積比1:1甲醇和水混合溶液過(guò)0.2μπι尼 龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣品；3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:將不含乙基多殺菌 素的同種類基質(zhì)空白樣品按上述步驟1)、2)處理，得樣品提取凈化液，用空白提取凈化液配 制成至少5個(gè)濃度的乙基多殺菌素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液;4)測(cè)定和結(jié)果計(jì)算:將步驟3)中的 各濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行LC-MS-MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn) 行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;在相同條件下將步驟2)中凈化后的樣品液進(jìn)行LC-MS-MS 測(cè)定，測(cè)得樣品液中乙基多殺菌素的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品液中乙基多殺菌 素含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質(zhì)量計(jì)算得到樣品中乙基多殺菌素殘留量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于：步驟1)試樣制備中將樣品按照四分法縮分至500g，將此樣品分成2 X200g兩 份，用食品加工機(jī)粉碎，于-20 °C冰柜密閉保存。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟2)提取及凈化中稱取5.0g已制備好試樣于50 mL離心管中，加入10ml乙 腈，高速勾衆(zhòng)2min，加入2g NaCl，劇烈振搖lmin;取上層乙腈相離心，取lmL上清液加入lmL 的甲醇和水混合溶液(體積比1:1)過(guò)〇.2μπι尼龍微孔過(guò)濾膜，得到的液相部分即為待測(cè)樣 品。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于:步驟4)測(cè)定和結(jié)果計(jì)算中所述的LC-MS-MS測(cè)定中液相色譜的流動(dòng)相包括A相 和B相，A相為甲醇，B相為0.05%甲酸水;流速:0.3 mL/ min;流速:0.3 mL/ min;進(jìn)樣體積： 1.(^1^柱溫箱:45°(：。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟(4)中所述的LC-MS-MS測(cè)定中液相色譜使用梯度洗脫的方法，梯度洗脫程 序?yàn)椋?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟(4)中所述的LC-MS-MS測(cè)定中液相色譜的色譜柱ZORBAX ECLIPSE Plus C18,2.1 X 50mm, 1 ·8μηι〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟(4)中所述的LC-MS-MS測(cè)定中質(zhì)譜檢測(cè)使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式， 乙基多殺菌素的母離子、子離子，去簇電壓和碰撞能量分別為：8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟(4)中所述的LC-MS-MS測(cè)定中分析條件為：離子源溫度375°C，離子源： ESI.電噴霧電壓：5000V;霧化器壓力：0.138MPa;輔助加熱氣:0.379MPa;掃描模式:正離子 掃描。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟1)中樣品若為脫水蔬菜和水果，需降低稱樣量，并加適量水充分浸潤(rùn)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蔬菜水果中乙基多殺菌素殘留量的LC-MS-MS檢測(cè)方法， 其特征在于，步驟2)中用乙腈提取時(shí)加入氯化鈉鹽析含水量較少的樣品鹽析時(shí)需加水。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105929060SQ201610259187
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月25日
【發(fā)明人】陳子雷, 李慧冬, 方麗萍, 官帥, 杜紅霞, 徐錦錦
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所