專利名稱：早期檢測敗血癥及檢測敗血癥的嚴重程度并對敗血癥病程進行跟蹤評估的方法，以及實 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷敗血癥的方法，特征是涉及敗血癥的早期檢測，敗血癥嚴重程度的檢測以及對敗血癥的治療效果進行跟蹤檢測的方法。該方法以如下新見解為基礎(chǔ)某種本身已知的肽和它的某些合適的片段代表了這類疾病的可靠生物指標，由于在發(fā)病時它們表現(xiàn)為高濃度，所以用傳統(tǒng)的檢測方法就能很方便地對其進行測定。
根據(jù)對這一疾病的更新的理解，目前所說的“敗血癥”這個詞概括了諸項臨床特征，一般地說可觀察到發(fā)熱，血細胞增多，意識改變，肌力過度循環(huán)(熱休克)以及代謝亢進，其主要原因在于微生物侵入了正常無菌組織。而象過去那樣以檢測血液中病菌作為敗血癥特征的方法，在敗血癥的診斷中已經(jīng)變得不那么重要了。在臨床研究中可以看到，對敗血癥病人病情的預(yù)斷并不依據(jù)感染，尤其是細菌引起的感染的嚴重程度，而是依據(jù)生物體的膿毒性反應(yīng)的嚴重程度(參見GPiLzSFateh-Moghadam和kWerdan在Krankenpflege雜志，29卷1991年P(guān)P.483-492頁，以及其所引用的出版物)。因此，目前在對敗血癥的評估中，采用并測定多種實驗室參數(shù)及血液動力學參數(shù)進行診斷和病情評估，取代了陽性血培養(yǎng)的方法，或與之并用。在必要時，還要用到計算機輔助的所謂Score系統(tǒng)，如上面提到的文獻中所講的APACHZ(急性生理學及慢性健康狀況評估)ⅡScore系統(tǒng)，但迄今為止還沒有找到一個可以作為確切的生物指標，對敗血癥的診斷有重大意義的參數(shù)。目前所用的所有參數(shù)，要么特異性不夠好，要么不能對敗血癥的嚴重程度作出確切的評估，也不能做療法監(jiān)測，除此之外，測出諸如腫瘤壞死因子(TNF)或白介素如白介素6(IL-6)等物質(zhì)對臨床測定而言太復(fù)雜、昂貴并且費時。
因此，急需一個易于測定并且其定性及定量對于敗血癥的診斷和進展評估具有重要指導(dǎo)性意義的生物指標。
本發(fā)明的目地是提供一種早期檢測敗血癥并對其嚴重程度進行檢測的方法，該方法以在臨床條件下切實可行的方式確定了一個新的生物指標，得到了與診斷敗血癥并評估治療進展有重要關(guān)系的結(jié)果。
通過權(quán)利要求書中所述的方法和藥盒已達到這一目的。本發(fā)明以一個驚人的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，這一發(fā)現(xiàn)是本身已知的肽前降鈣素或其高分子分裂產(chǎn)物，是與敗血癥密切相關(guān)的生物指標，它們在病人的體液樣品中的濃度與敗血癥的嚴重程度密切相關(guān)，因而對敗血癥的進展評估及療法監(jiān)測而言，是一個很有價值的參數(shù)。
因此，通過測定肽前降鈣素來診斷敗血癥的可能性具有重大的實際意義。因為在敗血癥病例中可能出現(xiàn)的其他生物指標，如胞質(zhì)分裂素(白介素，TNF)是一些不穩(wěn)定的分子，一般只以很低的濃度出現(xiàn)，因此要在常規(guī)的臨床診斷中測定它們困難很大，也很費時，因而花費很大。完全意想不到的是，根據(jù)本發(fā)明，憑以往的醫(yī)學知識可以測定前降鈣素，在敗血癥情況下，其以上含量劇增，因而可測得納克(ng)級的濃度(每一毫升血清或血漿中達一納克上，特別是10納克～500納克以上)，而對于健康人，即使用當今最好的測定方法也檢測不到前降鈣素的含量(樣品濃度低于0.1ng/ml)，同時，根據(jù)本發(fā)明，在敗血癥病例中，未觀察到降鈣素濃度增加，這值得注意，因為迄今為止，前降鈣素一般被視為降鈣素的前體，它的出現(xiàn)也導(dǎo)致降鈣素的形成。
本發(fā)明的方法要測定的肽前降鈣素及其可能出現(xiàn)的蛋白水解分裂產(chǎn)物都是已知的，適宜定量及定性免疫診斷測定方法也是已知的。
前降鈣素是一種由116個氨基酸組成的肽，并且據(jù)目前所知，它是某種基因(CALC-1)轉(zhuǎn)譯表達的中間產(chǎn)物，并做為降鈣素的前體，在大多數(shù)組織中，尤其是在甲狀腺C細胞及腫瘤細胞中導(dǎo)致了肽激素降鈣素的形成，而原始基因(CALC-1)除了形成前降鈣素以外，還控制與前降鈣素一基因有關(guān)的肽的形成，后者與前降鈣素的長度及其51至116氨基酸序列有明顯區(qū)別。參見J，Biol，chem，261∶31(1986)，pp，14386-14391。
根據(jù)常識，前降鈣素是伯蛋白前降鈣素前體的水解降解的產(chǎn)物，基因CALC-1表達成某種形式就形成了前降鈣素的前體，前降鈣素通常按照表現(xiàn)出來的幾種形式，借助于完整的降鈣素的釋放，進行逐步的分段降解，完整的降鈣素與一個由32個氨基酸組成的序列(前降鈣素的60～81氨基酸)相對應(yīng)。在這一過程中，開始有兩個更大的肽與其它的肽一同形成，它們可能被稱作N-前降鈣素-(1-57)-肽及C-前降鈣素-(60～116)-肽，后者能進一步分裂成激素降鈣素及被稱作為下降鈣素的肽(Bio-chem，J，256，1986，PP245-250，和cdncerResearch，49，1989，PP6845-6851)。目前根據(jù)J，Biol，Chem，226(36)，PP24627-24631文獻報導(dǎo)可知，除了上述文獻中描述的前降鈣素以外，在人甲狀腺C細胞中還形成一種前降鈣素的變體，它在C末端的最后8個氨基酸與前者不同這個肽在本發(fā)明意義上也被視作“前降鈣素”，因為目前本發(fā)明的研究所采用的免疫診斷測定的方法分辨不出這兩種前降鈣素以及可能出現(xiàn)的其它與之密切相關(guān)的肽。因此，本發(fā)明意義上的“前降鈣素”表示一種或多種肽，包括已知分子的前降鈣素和上面提到的在C末端含有不同氨基酸組分的變體及在所用的選擇性免疫診斷測定法中，特別是在下面將提到的單克隆免疫放射測定法中具有類似反應(yīng)性的可能存在的變體。(參見CancerRes，49，1989，P6845-6851)所有這些肽都包含由57個以上氨基酸組成的肽序列，特別是象完整的前降鈣素那樣的116個氨基酸序列，它們或與已知的序列一致，或者部分一致，只是在相應(yīng)于前降鈣素的第108至116的氨基酸區(qū)域可能存在差別。
根據(jù)以前對測定降鈣素及其有關(guān)肽方法用于診斷的嘗試可知，降鈣素對許多惡性疾病是一個有價值的生物指標(腫瘤指標)，并且已經(jīng)研究出大量專門用于測定降鈣素的免疫疹斷測定法，通過使用特異的單克隆抗體，這些方法得以實現(xiàn)(舉例參見ClinicaOhimicaActa1988174PP35-54;和ImmunolVol141PP3156-3163和J，Endocr1988119PP351-357)。
還是為了測定降鈣素的前體，如前降鈣素及C-前降鈣素-(60～119)-肽，已經(jīng)研究出一種免疫診斷測定法，這一方法根據(jù)免疫放射測定法的原理，除了可以測定降鈣素外，還可以通過一對單克隆抗體選擇地測定前降素鈣素，這一對抗體中的一個特異于降鈣素序列的外部(下降鈣素的1～11氨基酸或前降鈣素的96～107氨基酸)，例如以一種固定形式從包含這一序列的分析樣品中提取肽;而這一對單克隆抗體中的另一個則用于構(gòu)成免疫放射測定法的夾層特異于降鈣素中相應(yīng)于第11～17氨基酸的區(qū)域(前降鈣素的70～76氨基酸)。在免疫測定中，用這一方式只能測定出那些具有與下降鈣素的第1～11氨基酸區(qū)域一樣的降鈣素區(qū)域的肽。即或者相當于一個完整的前降鈣素，或者是一個具有該指定區(qū)域的肽，如C-前降鈣素-(60～116)-肽(參見Cancer Res 49 1989 PP 6845-6851)。用已知的方法，從現(xiàn)有的眾多單克隆抗體中選出那些締合常數(shù)在Kasn＝0.9～3.0×1010M-1范圍的單克隆抗體命名為MAbKcoI和MAbcTo8)。這一已知的方法可直接運用于本發(fā)明相應(yīng)的測定方法中，也可使用由J Immunol vol 141 No9 1988 PP3156-3163提供的方法獲得的相似單克隆抗體。在這一公開方法中，為了在臨床上用具有特別明確意義同時又容易估算的方法測定前降鈣素的增加，需要用幾對與上述抗體具有相似的強親合力的抗體。
例如，用于本發(fā)明中的單克隆抗體對，可以根據(jù)以前所述的用于產(chǎn)生與CT21具有相似結(jié)合特性的抗體的免疫方法(MotteetalJImmunol1381987P3332)，e用CT-TT(降鈣素-破傷風菌疫苗)作為免疫原來產(chǎn)生。用kc-TT(下降鈣素-破傷風菌疫苗)對Biozzi快速響應(yīng)小鼠進行免疫(BiozzietalJZXPMed1321970P152)，可以獲得與KcoI具有相似結(jié)合特性的抗體，根據(jù)所述方法每次以不同途徑注射進15ug的肽，共注射4次。皮下注射完全弗氏佐劑(FCA)皮下注射不完全弗氏佐劑(FIA)，腹膜注射FIA，及靜脈注射0.15mol/l波度的氯化鈉，這一免疫進程歷時13至30周，最后一次靜脈注射三天后小鼠死亡。取出脾臟，用40%的聚乙烯乙二醇將其脾細胞與Nsl大鼠的骨髓瘤細胞系融合(BelletetalJ.ClinEndocrinolMetab561983P530)，用ELISA測定法可將這一雜合物的上清液篩分出來用于制造特異的抗體，經(jīng)有限稀釋克隆后，把這些雜化細胞植入BALB/C無毛小鼠的腹膜內(nèi)，10至14天后收集所產(chǎn)生的腹水?？梢韵驧anil等報導(dǎo)的奸樣(JImmunolMethods901986P.25)，用4℃的50%硫酸胺作沉淀劑，以蛋白A層析法提純單克隆抗體。通過用戊二醛作偶合試劑分別將CT或TT連接到KC上，來制備半抗原載體結(jié)合物CT-TT或KC-TT。(AudibertetalprocNatlAcadSuiUsA791982P5042)。
用了一對單克隆抗體進行如下例所述的測定，它們是上面提到過的抗體MAbkoI和抗體MAbT21，后者被視為與前降鈣素分子親合且其親合性與上述文獻描述的抗體MAbcTo8極其相似(締合常數(shù)Kasn＝3.0×1010M-1)。按照布達佩斯條約，將產(chǎn)生單克隆抗體KcoI和CT21的雜合物存放在德國的“DSM-Deutsche sammlung Von Mikroorganismen and Zelukulturen GmbH，”Mascheroderweg IB，38124 Braunschmeig，收藏號分別為DSM Acc2124和DSMAcc2125，日期是1993年4月20日。
根據(jù)CancerRes49(1989)，PP6845-6851所述方法可測得樣品中所含前降鈣素C-前降鈣素-(60-119)肽或它們兩者的濃度值，如果這兩者的或穩(wěn)定性相差不大，還可測得樣品中前降鈣素的初始濃度。對于本發(fā)明可能用到的測定前降鈣素的幾個方法，我們直接參考了上面提到的文獻及這些文獻引用的文獻，并將它們的目錄置于本申請的參考文獻中，以補充本申請的技術(shù)方案。
在上面提到的文獻中，為了檢驗前降鈣素是否適合于作為腫瘤指標，也對其進行了測定?，F(xiàn)已確認，前降鈣素與降鈣素的水平在腫瘤病人體內(nèi)的表現(xiàn)相似，因而得出這樣一個結(jié)論，即它們都是從甲狀腺的C細胞瘤衍生出來的，上述文獻還進一步確認，那些并未患惡性疾病而只是患某些較嚴重的病毒感染性疾病的人的前降鈣素的水平也有所增加。在這些情形下，降鈣素的水平并不同時增加，這些病人不是敗血性病人，億們的疾病也與敗血癥無任何關(guān)系。
在本發(fā)明令人意想不到地確認了降鈣素的水平與敗血癥的存在及其嚴重程度有密切的關(guān)系之后，又著手研究了敗血病情況下前降鈣素的水平上升而降鈣素水平不同時上升的原因，以及更進一步，是什么導(dǎo)致那些嚴重病毒感染性疾病與敗血癥的直接區(qū)別。對于一個甲狀腺全部切除的敗血癥患者，也測得其前降鈣素的水平上升到典型敗血癥患者的水平，顯然在敗血癥情況下，前降鈣素不是在甲狀腺形成的，而另有一個器官可以形成前降鈣素。如果考慮到在病毒性肝炎情況下前降鈣素水平的上升，因而假設(shè)這另一器管是肝臟，因而先將前降鈣素水平的上升解釋成是病毒性疾病直接作用于肝細胞的結(jié)果，再進一步考慮到是由與敗血癥有關(guān)的病菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素間接地，但更有效地對這些肝細胞產(chǎn)生的影響。但是，要注意這一事后的解釋仍只是一個假設(shè)，而不是經(jīng)實驗證明的理論。
在嚴重的病毒性疾病情況下前降鈣素的水平上升這一現(xiàn)象對本發(fā)明的敗血癥診斷方法有一定影響，因而當前降鈣素水平只上升到一個較低程度，別的嚴重病毒性疾病也能達到這一值時，在作敗血病診斷前就先排除這一病毒疾病。
另外，患有慢性腎衰竭的病人會排泄出無序的肽，因而會有人預(yù)料其象前降鈣素這類的肽的水平會上升，但這一上升在臨床上與上面所述的上升沒多大關(guān)系，因為上面提到的都是腎臟方面沒有毛病的病人。但是，負責臨床診斷的內(nèi)科醫(yī)生會容易考慮到這些情況。
本發(fā)明并不局限于僅用上述方法測定前降鈣素，還可使用其他公知的測定方法，包括使用別的單克隆或多克隆抗體，如特異于N-前降鈣素-(1-57)-肽，尤其是其第51至57氨基酸的抗體。常用多克隆抗體對應(yīng)N-前降鈣素-(1-57)-肽區(qū)域取代上述方法中用mAbkoI與標記好的單克隆抗體共同與前降鈣素的降鈣素區(qū)域結(jié)合，因而可以發(fā)現(xiàn)在兩種情況下測得的前降鈣素含量的濃度值相似，但事實上如要使用上述的多克隆抗體，只能檢測到完整的前降鈣素肽中的一個分子中的區(qū)域，據(jù)此可以得出這樣一個結(jié)論，即在敗血癥情況下，事實上主要是完整的前降鈣素水平上升，因而不完整的肽的形成至少是次要的。
從原理上講，也可以通過以不同于免疫疹斷的方式測得前降鈣素實現(xiàn)本發(fā)明的方法，例如用高壓液相色譜法，只要存在或可以研究出這些有足夠靈敏度及專一性的方法就行。
另外，盡管目前本發(fā)明主要是在血清或血漿樣品中測定前降鈣素，但從原理上講本發(fā)明的方法還包括在其他體液中比如全血和尿中測定前降鈣素，只需證明可以用可再現(xiàn)的方式測得這些液體中的前降鈣素的水平。
關(guān)于本領(lǐng)域的現(xiàn)狀還需指出，據(jù)Surgergvol108，6，(1990)PP1097-1101報導(dǎo)，敗血癥病人血漿中與降鈣素有關(guān)的肽CGRP的水平以pg級的幅度稍有上升(達14.9+3.2pg/ml，而對照組為2.0+0.3pg/ml)。這一發(fā)現(xiàn)得不出任何關(guān)于其他有關(guān)的肽的水平的結(jié)論，并且絕對濃度相當?shù)?，敗血癥病人較之正常人的相對濃度的增加值與本發(fā)明方法的增加值相比也相當?shù)停詫GRP確定的敗血癥的指標是不合適的。
另外，據(jù)Lancer⊥，(1983)，P294報導(dǎo)，當兒童患嚴重腦膜炎雙球菌血癥時，其降鈣素的水平上升兩至三倍，但接著又有Pediatr，Res，18，(1984)，P811頁修改了這一說法，認為測得的物質(zhì)可能不是完整的降鈣素，但又未能指出實際上測得的到底是什么物質(zhì)。我們不得不將在這種情況下觀察到的接近三倍于正常值的增加與本發(fā)明方法中前降鈣素的增加幅度達1000倍相比較，可見所述文獻并不代表與本發(fā)明有關(guān)的技術(shù)方案。
下面將用能證實上述有關(guān)報導(dǎo)的臨床數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明的方法。
根據(jù)CancerRes49(1989)，PP6845-6851描述的單克隆抗體KCOI(DSMAcc2124)和CT21(DSMACC2125)(見上述)測定前降鈣素的方法對全部前降鈣素進行測定。
這些例子是用來說明本發(fā)明的，不應(yīng)理解成是對本發(fā)明的限制。
例1對因各種疾病住院的兒童的前降鈣素水平的測定。
測定了不同病組的因各種疾病住院的兒童的前降鈣素水平(PCT)。
結(jié)果見表1。
可見，敗血癥患者的PCT(前降鈣素水平)高達180ng/ml，而“正?！辈《拘约膊』颊叩腜CT值最高只達到2ng/ml，只是在極嚴重的腸道及肝臟的病毒疾病情況下升至16nm/ml，只有一例達35ng/ml。
例2敗血癥患者PCT水平的相關(guān)性、根據(jù)APACHE(急性生理學及慢性健康狀況評估)Ⅱscore觀察到的病程狀況及他們患病的嚴重程度。
對20例經(jīng)心臟手術(shù)后的敗血癥患者靜脈注射假單胞菌屬一免疫球蛋白IgG治療敗血癥，在五天內(nèi)觀察了其PCT水平，同時根據(jù)APACHEⅡScore對他們的病狀進行了評估，總結(jié)出來的結(jié)果見下表2。
lP≤0.05(M-W)2P≤0.05(wilcoxon)3P≤0.05(chi2)從表2可以清楚地看出，對敗血癥治療有較好反應(yīng)者(治療有效者)的PCT水平隨著臨床狀況的改善而下降，而對治療沒有反應(yīng)者(治療無效者)的PCT幾乎一成不變地保持較高水平。還可看出，治療無效者的初始PCT水平就明顯高于治療有效者，即前者疾病的嚴重程度更大，比較APACHEⅡScore值也可清楚地看到，PCT的值與敗血癥的不同嚴重等級有明顯的關(guān)系，死亡率的數(shù)據(jù)也證實了這一點。
這些結(jié)果還進一步表明，在敗血癥早期治療過程中跟蹤測定PCT水平能提供可靠的療效信息，因此，在必要時可及時改變治療方案，例如可以另選一種抗菌素制劑。
從燒傷者的病例也可以得出相似的結(jié)果，這些燒傷者因植皮而患敗血癥，被施以各種抗菌素制劑進行治療。有效的治療總與PCT濃度明顯下降相伴隨，因而當用第一種抗菌素制劑治療無效時一由PCT濃度保持不變而確定一可以改用第二種可使PCT水平立即下降的抗菌素制劑。
權(quán)利要求
1.用于實現(xiàn)早期檢測敗血癥及檢測敗血癥的嚴重程度并對治療過程進行跟蹤評估的方法的藥盒，從中可測得病人體液樣品中的肽前降鈣素和/或尚未形成完整的降鈣素的肽片段，這種肽的存在及其含量預(yù)示著敗血癥的存在，嚴重程度以及/或者對敗血癥的治療效果，其特征在于用于測定前降鈣素含量為0.1至500ng/ml的血清或血漿的藥盒內(nèi)含有一個或多個固定在載體上用以與樣品中的前降鈣素結(jié)合的第一單克隆或多克隆抗體(抗體群)；另一個攜帶標記并且與前降鈣素在不同于第一抗體(群)的結(jié)合區(qū)域的另一區(qū)域相結(jié)合的抗體；以及一般輔助物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥盒，其特征在于測定出前降鈣素和/或N-前降鈣素-(1-57)-肽和/或C-前降鈣素-(60-116)肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述藥盒，其特征在于，所述方法為免疫診斷方法，所述抗體本身或彼此結(jié)合后對前降鈣素或其形成的肽具有專一性，以區(qū)別于完整的降鈣素和CGRP肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥盒，其特征在于，通過免疫測定法測定前降鈣素，所述的用于與樣品中的前降鈣素相結(jié)合的第一抗體是一個單克隆抗體，它與前降鈣素結(jié)合的區(qū)域不同于作為標記的第二單克隆抗體與前降鈣素結(jié)合的區(qū)域，因此可以區(qū)分出前降鈣素及其水解降解產(chǎn)物，包括降鈣素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述藥盒，其特征在于，通過能選擇性地檢測完整的前降鈣素及/或C-前降鈣素-(60-116)-肽的免疫測定法測定前降鈣素。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述藥盒，其特征在于通過能選擇性地檢測完整的前降鈣素及/或N-前降鈣素-(1-57)-肽的免疫測定法測定前降鈣素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述藥盒，其特征在于樣品中前降鈣素含量超過1ng/ml預(yù)示可能存在敗血癥，前降鈣素含量達到10ng/ml至500ng/ml或更高與敗血癥加重以及惡化有關(guān)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述藥盒，其特征在于，同時對降鈣素水平進行測定，沒有測得降鈣素水平上升，就能對敗血癥進行診斷。
9.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述藥盒，其特征在于，如果可以將也能引起前降鈣素上升的嚴重病毒性疾病的存在排除，那么當前降鈣素水平接近20ng/ml時，就可診斷為敗血癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一個所述的藥盒，其特征在于，用作樣品的體液為血漿或血清。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一個所述的藥盒，其特征在于所述的第一個和另一個單克隆抗體分別是抗體kcol(DSMACC2124)和抗體CT21(DSM ACC2125)。
12.單克隆抗體由雜合物KCOI(DSM ACC2124)產(chǎn)生。
13.單克隆抗體由雜合物CT21(DSM ACC2125)產(chǎn)生。
14.雜合物KCOI(DSM ACC2124)。
15.雜合物CT21(DSM ACC2125)。
全文摘要
公開了一種早期檢測敗血癥及檢測敗血癥的嚴重程度并對治療過程進行跟蹤評估的方法，以及實現(xiàn)所述方法的藥盒。根據(jù)本發(fā)明，測定了患者的體液樣品中的肽前降鈣素和/或其形成的非完整降鈣素的肽片段的含量。通過測定這種確定的肽是否存在，含量多少，得出有關(guān)是否有敗血癥，敗血癥的嚴重程度以及/或者治療效果的結(jié)論。
文檔編號C12N5/20GK1090928SQ9311834
公開日1994年8月17日 申請日期1993年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月19日
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