專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組fn多肽在制備敗血癥等嚴(yán)重感染疾病的藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其屬于重組FN肝素結(jié)合域多肽的制備及其在敗血癥等嚴(yán)重感染、血小板減少出血和彌漫性血管內(nèi)凝血的藥物中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：纖維連接蛋白，fibi"onectin，以下簡(jiǎn)稱(chēng)FN;重組纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽，含237個(gè)氨基酸，分子量為29kDa，簡(jiǎn)稱(chēng)rhFNHN-29，重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽，含272個(gè)氨基酸，分子量為36kDa，簡(jiǎn)稱(chēng)rhFNHC-36;纖維連接蛋白肝素結(jié)合域I,即纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域，簡(jiǎn)稱(chēng)H印I;纖維連接蛋白肝素結(jié)合域II，即纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域，簡(jiǎn)稱(chēng)H印II;彌漫性血管內(nèi)凝血，DisseminatedIntravascularCoagulation,簡(jiǎn)稱(chēng)DIC;Ampicillin，氨節(jié)青霉素，簡(jiǎn)稱(chēng)Amp;牛血清白蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)BSA;T載體，簡(jiǎn)稱(chēng)pGEM-T@vector;YPD培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱(chēng)YPD;含甲醇培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱(chēng)B匿；含甘油培養(yǎng)基，簡(jiǎn)稱(chēng)BMGY;Lipopolysaccharide內(nèi)毒素脂多糖，簡(jiǎn)稱(chēng)LPS;D-Galactosamine半乳糖胺，簡(jiǎn)稱(chēng)GalN。纖維連結(jié)蛋白(FN)是一個(gè)多功能的大分子糖蛋白，與細(xì)胞的粘連、遷移過(guò)程相關(guān)，參與胚胎發(fā)生、損傷修復(fù)、止血、自主防衛(wèi)、腫瘤轉(zhuǎn)移等。它廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜及各種體液。體內(nèi)FN可分血清FN和細(xì)胞FN，前者由肝細(xì)胞合成和分泌，后者主要由成纖維細(xì)胞合成分泌，其他多種細(xì)胞也可合成分泌FN。FN基因位于2q34，有二個(gè)轉(zhuǎn)錄變異型的全序列已經(jīng)測(cè)定完畢，F(xiàn)N1和FN2。FN基因可在三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行差異剪接，產(chǎn)生近20種不同的轉(zhuǎn)錄本和結(jié)構(gòu)功能相異的蛋白質(zhì)。FN分子是一個(gè)二聚體，其單體亞單位由三種類(lèi)型(1、II、III型)的結(jié)構(gòu)域重復(fù)不同次數(shù)構(gòu)成。其中I型結(jié)構(gòu)域重復(fù)出現(xiàn)12個(gè)，1I型結(jié)構(gòu)域重復(fù)出現(xiàn)2個(gè)，III型結(jié)構(gòu)域重復(fù)出現(xiàn)16個(gè)。12個(gè)I型結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成數(shù)目36、39、44、45、45、31、39、38、39、45、42、41。平均40.33土4.249，其中45個(gè)出現(xiàn)三次，39個(gè)出現(xiàn)三次。2個(gè)II型結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成數(shù)均為49個(gè)。16個(gè)III型結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成數(shù)目70、54、66、79、77、88、91、65、78、80、79、79、91、79、78、79，平均77.07±9.61，其中79個(gè)出現(xiàn)五次，78個(gè)出現(xiàn)二次。敗血癥(S印sis)和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)，是臨床常見(jiàn)危重癥。敗血癥尤其由其產(chǎn)生的感染性休克容易誘發(fā)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)，而一旦形成彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)，又進(jìn)一步加重休克。由DIC引起的出血危害性極大。DIC也可導(dǎo)致多器官功能衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥，病死率高。血液病患者常表現(xiàn)為感染和血小板減少出血并存的情況。由于感染和出血相互影響，形成惡性循環(huán)，臨床上血液病患者內(nèi)毒素血癥和出血的發(fā)生率和死亡率都很高。纖維連接蛋白(FN)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成份，為一種具有多種功能的糖蛋白大分子，能與肝素、膠原、纖維蛋白以及整合素家族的細(xì)胞表面受體結(jié)合，參與細(xì)胞的粘附與遷移、止血過(guò)程、損傷修復(fù)、在抗感染、維持微血管的完整性等方面具有重要作用，故曾有"調(diào)理性a2表面結(jié)合蛋白"，"細(xì)胞表面蛋白"及"細(xì)胞粘附因子"之稱(chēng)。大量的臨床研究表明血漿纖維連接蛋白FN水平對(duì)于感染性休克、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的預(yù)后判斷具有重要意義。這些病人血漿FN水平明顯而急劇地下降。若給敗血癥患者補(bǔ)充富含F(xiàn)N的冷沉淀物(cryoprecipitate)，則在患者血漿FN水平恢復(fù)的同時(shí)，伴有心肺功能的改善及敗血癥的控制，DIC的發(fā)生率也明顯下降。Barkagan等給106例敗血癥伴DIC患者輸注含F(xiàn)N的冷沉淀物，取得顯著療效。BrodinB等給26例嚴(yán)重感染住院患者補(bǔ)充冷沉淀物，觀察血漿FN水平及DIC相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者血漿FN水平恢復(fù)正常，且無(wú)一例發(fā)生DIC。提示FN可用于治療敗血癥及DIC。由于從血漿中分離FN將造成血資源的浪費(fèi)和可能傳播血源性傳染病，同時(shí)由于FN是一種大分子量的糖蛋白，其分子量高達(dá)450kDa，利用基因工程合成整個(gè)FN分子，目前技術(shù)上存在著一定的困難。因此本研究在以往成功制備重組PN細(xì)胞結(jié)合域多肽(rhFN55)，發(fā)現(xiàn)其具有治療敗血癥小鼠和DIC大鼠作用的基礎(chǔ)上，制備重組FN肝素結(jié)合域多肽，并研究其對(duì)敗血癥小鼠和DIC大鼠的治療作用。FN分子結(jié)構(gòu)中含有二個(gè)與肝素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)位于FN的N端，由五個(gè)I型的同源結(jié)構(gòu)組成，該結(jié)構(gòu)域的分子量為29kDa，由237個(gè)氨基酸組成。另一個(gè)位于FN的C端，由第12,13，14三個(gè)in型的同源結(jié)構(gòu)組成，該結(jié)構(gòu)域的分子量為36kDa，由272個(gè)氨基酸組成。應(yīng)用FN分子結(jié)構(gòu)中的肝素結(jié)合域多肽研究其對(duì)鼠敗血癥和DIC模型的作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出重組FN肝素結(jié)合域多肽的制備及其在敗血癥等嚴(yán)重感染、血小板減少出血和彌漫性血管內(nèi)凝血的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是所述的二種重組纖維連接蛋白N和C端肝素結(jié)合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五個(gè)I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Ser46"Gly282的237個(gè)氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到1113bp，長(zhǎng)711bp，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)741bp，雙酶切后片斷長(zhǎng)729bp;由酵母表達(dá)的多肽分子量為28.52kl)a。所述的另一種重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽，其特征在于是由FN分子中的I11-12、111-13、III-14三個(gè)III型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Tyrl720-Tyrl991的272個(gè)氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從5428bp到6244bp，長(zhǎng)816bp，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)835bp，雙酶切后片斷長(zhǎng)828bp,由酵母表達(dá)的多肽分子量為36.09kDa。本發(fā)明的主要內(nèi)容包括以下幾方面-1.重組FNN端肝素結(jié)合域和重組FNC端肝素結(jié)合域多肽酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及多肽的制備根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)克隆位置，結(jié)合酵母表達(dá)載體的酶切特點(diǎn)，設(shè)計(jì)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆的PCR擴(kuò)增引物和酶切位點(diǎn)。利用所設(shè)計(jì)和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHN-29和rhFNHC-36基因。將rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆至pGEM-T載體上。將重組的pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，進(jìn)行DNA序列測(cè)定。正確的克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，提取重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pAo815SM載體中。將重組的pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，DNA序列測(cè)定和雙酶切鑒定，提取陽(yáng)性克隆的重組pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pPIC9K整合型酵母表達(dá)載體上。重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，進(jìn)行DNA序列測(cè)定和雙酶切鑒定。正確的克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，提取重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒。用BglII酶切重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒，使其線性化。將線性化的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體轉(zhuǎn)染GS115酵母細(xì)胞，進(jìn)行篩選，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)、鑒定rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表達(dá)量，挑選高水平表達(dá)的菌株進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)。發(fā)酵液先用80%硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上S-100柱和SP柱純化rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽。對(duì)純化的rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽進(jìn)行SDS-PAGE分析，并經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計(jì)算其分子量。通過(guò)斑點(diǎn)雜交和Westernblot方法，檢測(cè)多肽結(jié)合肝素能力和FN的抗原性。2.rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36對(duì)敗血癥小鼠作用的研究應(yīng)用半乳糖胺增敏內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠模型對(duì)rhFNHN-29多肽抗敗血癥作用進(jìn)行研究。按LeistM等用半乳糖胺(Galactosamine，GalN)敏化內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立敗血癥小鼠模型，即給每只小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和內(nèi)毒素(300ng)。建立敗血癥模型小鼠(BABL/C)共40只，雌雄各半，隨機(jī)分二組，每組20只，一組為rhFNHN-29多肽治療組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。在給小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和內(nèi)毒素(300yg)前半小時(shí)，后1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)兩組小鼠分別從其尾靜脈注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg)和等體積生理鹽水。于腹腔注射藥物后6小時(shí)，眶靜脈采血250wl，枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，測(cè)定血漿TNFa水平,并觀察72小時(shí)小鼠生存率。腹腔注射藥物后72小時(shí)，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做組織病理形態(tài)學(xué)觀察。同時(shí)取肝組織做電鏡觀察。3.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)DIC大鼠作用的研究應(yīng)用內(nèi)毒素誘導(dǎo)的DIC大鼠模型對(duì)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗DIC作用進(jìn)行研究。按TakahashiY等用內(nèi)毒素誘導(dǎo)法建立大鼠DIC模型的方法，即每只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，股靜脈注射LPS(50mg/kg)。共建立DIC模型SD大鼠20只，體重200-250克，雌雄各半，隨機(jī)分兩組，每組10只，一組為rhFNHN-29多肽治療組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。治療組分別于注射LPS前半小時(shí)，注射后2小時(shí)，4小時(shí)尾靜脈注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg)，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。于注射LPS后6小時(shí)，對(duì)側(cè)股靜脈抽血500yl，50ulEDTA抗凝，用于檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)，血紅蛋白(Hb)，血小板(Plat)，450ul用4.5"l3.8%的枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血槳,測(cè)定血漿TNFa水平。于股靜脈注射LPS后24小時(shí)處死大鼠，取大鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)服染色，做組織病理形態(tài)學(xué)觀察。4.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠作用的研究應(yīng)用半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠模型基礎(chǔ)上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)的血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型對(duì)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗血小板減少內(nèi)毒素血癥作用進(jìn)行研究。模型是在Leist建立的半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠模型基礎(chǔ)上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)。即給每只小鼠腹腔注射血小板抗血清(APS)lOOjxl,30分鐘后腹腔注射500nl含內(nèi)毒素脂多糖(LPS)300叫加半乳糖胺(GalN)10mg的混合液。通過(guò)監(jiān)測(cè)血小板和72小時(shí)后小鼠的肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察驗(yàn)證模型是否成功構(gòu)建。所建立的血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型小鼠(BABL/C)共90只，雌雄各半，隨機(jī)分三組，每組30只。rhFNHN-29治療組、rhFNHC-36治療組及生理鹽水對(duì)照組分別于注射血小板抗體前半小時(shí)，注射內(nèi)毒素脂多糖和半乳糖胺后l個(gè)小時(shí)，2個(gè)小時(shí)，3個(gè)小時(shí)，自尾靜脈注射rhFNHN-29或rhFNHC-36各10mg/kg或等體積的生理鹽水。另外設(shè)兩個(gè)對(duì)照組，每組20只，分別腹腔注射APS100^1(血小板抗體組，APS組)或腹腔注射500pl含LPS300pg加GalN10mg的混合液(半乳糖胺敏化內(nèi)毒素血癥組，LPS+GalN組)。注射APS6小時(shí)后，從每組取10只小鼠，眶靜脈采血700nl，取5(Hi1(EDTA抗凝)測(cè)血常規(guī)白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HB)、血小板(Pit)，65(^1用1/10體積3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，-20'C冷凍，備測(cè)凝血象及TNF^a水平。各組剩余小鼠觀察72小時(shí)死亡率。本發(fā)明取得如下結(jié)果和結(jié)論1.成功構(gòu)建了重組rhFNHN-29和rhFNHC-36酵母表達(dá)載體，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)及制備了rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽。制備的rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測(cè)定分子量，rhFNHC-36多肽分子量為36.09kDa,rhFNHN-29多肽分子量為28.52kDa。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證明兩多肽均能與肝素結(jié)合，但都不能與FN抗體結(jié)合。說(shuō)明所合成的多肽在體外具有結(jié)合肝素的能力而沒(méi)有FN的抗原性。說(shuō)明利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FN肝素結(jié)合域多肽是可行的。2.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠和DIC大鼠具有一定的治療作用。在rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽治療小鼠敗血癥的實(shí)驗(yàn)研究中，治療組的死亡率分別為15%和19%，對(duì)照組的死亡率為70%。兩多肽能明顯降低內(nèi)毒素?cái)⊙Y的死亡率(P〈O.OD。從肝臟病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組小鼠肝臟組織呈現(xiàn)廣泛的變性與嚴(yán)重壞死，而多肽治療組的肝臟組織僅見(jiàn)局灶性的變性與輕微壞死。兩組的腎、脾、肺、心、腦等組織未見(jiàn)明顯病理改變。電鏡觀察，生理鹽水對(duì)照組肝細(xì)胞胞質(zhì)松散，染色變淺，細(xì)胞器崩解，而多肽治療組小鼠輕微變性，胞質(zhì)和細(xì)胞器均未見(jiàn)明顯改變，出現(xiàn)糖原和脂肪顆粒，并偶見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)小鼠血漿TNFa水平，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組的TNFa水平顯著高于正常對(duì)照組小鼠的水平(P〈0.01),而用多肽治療小鼠的TNFa水平顯著低于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)。RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織TNFa、IL-1g、IL-6mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組小鼠的TNFa、IL-1P、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組小鼠的水平(P〈0.01)，而用rhFNHN-29多肽治療的小鼠顯著低于生理鹽水對(duì)照組小鼠的水平(P〈0.01),在rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽治療LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠實(shí)驗(yàn)研究中，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管出現(xiàn)廣泛血栓，肝小靜脈和毛細(xì)血管也出現(xiàn)廣泛血栓和廣泛出血，而多肽治療組僅見(jiàn)較輕微血栓形成和少量的出血。生理鹽水對(duì)照組的腎、脾、心、腦組織也見(jiàn)血栓形成和出血，而多肽治療組的腎、脾、心、腦組織見(jiàn)少量血栓形成，未見(jiàn)明顯出血。ELISA法檢測(cè)大鼠血槳TNFa水平，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組的TNFa水平顯著高于正常對(duì)照組(P〈0.01)，多肽治療組顯著低于生理鹽水對(duì)照組(P〈0.01)。血象和凝血象分析顯示生理鹽水對(duì)照組的WBC、HB、Plat和Fbg顯著低于正常對(duì)照組，PT和APTT顯著高于正常對(duì)照組。而多肽治療組的WBC、HB、Plat和Fbg顯著高于生理鹽水對(duì)照組，PT和APTT顯著低于生理鹽水對(duì)照組。3.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠具有保護(hù)作用。rhFNHN-29多肽能明顯降低血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率。生理鹽水對(duì)照組小鼠的72小時(shí)死亡率達(dá)90%，F(xiàn)rhFNHN-29多肽治療組小鼠72小時(shí)死亡率分別為25%。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠肝、腦、肺可出現(xiàn)廣泛的變性、壞死、出血，而rhFNHN-29多肽治療組則僅見(jiàn)局灶性的變性，輕微壞死。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞呈典型性壞死改變，而rhPNHN-29多肽治療組肝細(xì)胞大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)大致正常。RT-PCR檢測(cè)表明生理鹽水對(duì)照組小鼠肝組織TNF-a、IL_6、IL-1PmRNA表達(dá)水平高于正常小鼠，F(xiàn)N治療組及rhFNHN-29多肽治療組小鼠肝組織TNF-a、IL-6、IL-iemRNA表達(dá)水平則較對(duì)照組有明顯下降。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠血槳TNF-a表達(dá)水平顯著增高，rhFNHN-29多肽治療組小鼠血漿表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。血象和凝血象檢測(cè)表明rhFNHN-29多肽治療組的血象、凝血象較生理鹽水對(duì)照組有明顯改善。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的制備工藝合理。所制得的重組纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽和重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽，在抗敗血癥小鼠實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水對(duì)照組小鼠的死亡率為70%，肝臟病理組織學(xué)形態(tài)呈廣泛變性與嚴(yán)重壞死，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞呈嚴(yán)重的變性和壞死，胞質(zhì)蔬松，染色變淺，部分細(xì)胞器已經(jīng)崩解，肝組織TNFa、IL-1e、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著增高，血漿TNFa水平顯著增高。以上各項(xiàng)指標(biāo)顯示用生理鹽水對(duì)照處理的小鼠處于內(nèi)毒素?cái)⊙Y狀態(tài)。這證明本實(shí)驗(yàn)敗血癥小鼠模型建立是成功的。而用rhFNHN-29多肽治療的小鼠死亡率僅為15%，rhFNHC-36多肽治療的小鼠死亡率僅為15%和19%，顯著低于生理鹽水對(duì)照組(P〈0.01),說(shuō)明兩多肽能明顯降低敗血癥小鼠的死亡率。肝組織僅呈小面積變性和輕微壞死，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞輕微變性，胞質(zhì)和細(xì)胞器均未見(jiàn)明顯改變，偶見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，說(shuō)明兩多肽能有效地降低內(nèi)毒素?cái)⊙Y所造成的肝組織損害。肝組織TNFa、IL-ie、IL-6mRNA表達(dá)水平和血漿TNFa水平顯著低于生理鹽水對(duì)照的小鼠。TNFa、IL-1P、IL-6是重要的促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子。在內(nèi)毒素?cái)⊙Y時(shí)，內(nèi)毒素刺激機(jī)體單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，釋放大量炎性細(xì)胞因子。這些炎癥細(xì)胞因子損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，裂解內(nèi)皮下基質(zhì)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附力降低，微血管完整性遭到破壞，通透性增高，相應(yīng)地血漿蛋白清除率增加，血槳大量滲出，使有效循環(huán)血量減少。血漿和組織間的平衡發(fā)生障礙，使組織器官功能受損傷。所以說(shuō)明兩多肽可能是通過(guò)降低促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平而起到對(duì)內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠的保護(hù)作用。在多肽抗DIC大鼠實(shí)驗(yàn)中，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組大鼠肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管出現(xiàn)廣泛血栓和較大面積的出血，肝組織小靜脈和毛細(xì)血管也出現(xiàn)血栓形成和嚴(yán)重的肝組織出血，腎、脾、心、腦組織也見(jiàn)血栓形成和出血，WBC、HB、Plat和Fbg降低，而PT和APTT延長(zhǎng)，血漿TNFa水平增高。說(shuō)明以生理鹽水處理的大鼠處于DIC狀態(tài)中，提示本實(shí)驗(yàn)成功地建立了DIC大鼠。血漿TNFa水平下降。以上結(jié)果顯示兩多肽對(duì)DIC大鼠有一定的治療作用。用rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽治療的大鼠，肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管僅出現(xiàn)少量血栓形成和小面積的出血，肝組織則僅見(jiàn)輕微血栓形成和少量出血，腎、脾、心、腦組織見(jiàn)少量血栓形成，WBC、HB、Plat和Fbg較生理鹽水對(duì)照組增高，PT和APTT縮短，rhFNHN-29多肽能明顯降低血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率。生理鹽水對(duì)照組小鼠的72小時(shí)死亡率達(dá)90%，F(xiàn)rhFNHN-29多肽治療組小鼠72小時(shí)死亡率分別為25%。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠肝、腦、肺可出現(xiàn)廣泛的變性、壞死、出血，而rhFNHN-29多肽治療組則僅見(jiàn)局灶性的變性，輕微壞死。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞呈典型性壞死改變，而rhFNHN-29多肽治療組肝細(xì)胞大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)大致正常。RT-PCR檢測(cè)表明生理鹽水對(duì)照組小鼠肝組織TNF-a、IL-6、IL-1PmRNA表達(dá)水平高于正常小鼠，F(xiàn)N治療組及rhFNHN-29多肽治療組小鼠肝組織TNF-a、IL-6、IL-1PmRNA表達(dá)水平則較對(duì)照組有明顯下降。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠血漿TNF-a表達(dá)水平顯著增高，rhFNHN-29多肽治療組小鼠血漿表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。血象和凝血象檢測(cè)表明rhFNHN-29多肽治療組的血象、凝血象較生理鹽水對(duì)照組有明顯改善。因此，本發(fā)明的重組纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽和重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽能作為在制備敗血癥等嚴(yán)重感染、血小板減少出血和彌漫性血管內(nèi)凝血的藥物中的應(yīng)用。圖1-1為本發(fā)明的rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重組載體上的PCR鑒定圖。圖中1pUC8;2rhFNHC-36;3rhFNHN-29圖1-2為本發(fā)明的重組pAo815SM-FNHN-29載體EcoRI和BamH雙酶切鑒定圖。圖中1pUC18;2pAo815SM-FNHN-29載體；3空載體對(duì)照?qǐng)D1-3為本發(fā)明的bacmid-FNHC-36重組載體上rhFNHC-36基因的PCR和雙酶切鑒定圖。圖中1PCR鑒定；2雙酶切鑒定；3pl)C8圖1-4為本發(fā)明的rhFNHN-29基因的正向測(cè)序圖。圖1-5為本發(fā)明的rhFNHN-29基因的反向測(cè)序圖。圖卜6為本發(fā)明的rhFNHC-36基因的正向測(cè)序圖。圖1-7為本發(fā)明的rhFNHC-36基因的反向測(cè)序圖。圖1-8為本發(fā)明的FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析圖。圖1-9為本發(fā)明的純化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析圖。圖中1純化的FNHC-36多肽；2M圖1-10為本發(fā)明的rhFNHN-29多肽的分子量測(cè)定圖。圖1-11為本發(fā)明的rhFNHC-36多肽分子量測(cè)定圖。圖1-12為本發(fā)明的多肽結(jié)合肝素斑點(diǎn)雜交放射顯影圖。圖中左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽圖1-13為本發(fā)明的多肽結(jié)合肝素斑點(diǎn)雜交酶聯(lián)反應(yīng)顯色圖。圖中左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽圖1-14為本發(fā)明的半乳糖胺敏化內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠生理鹽水對(duì)照組肝臟病理形態(tài)(10X10)圖。圖1-15為本發(fā)明的半乳糖胺敏化內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠多肽治療組肝臟病理形態(tài)(10X10)圖。圖l-16為本發(fā)明的生理鹽水對(duì)照組肝組織電鏡超微結(jié)構(gòu)(X15000)圖。圖1-17為本發(fā)明的多肽治療組肝組織電鏡超微結(jié)構(gòu)(X12000)圖。圖1-18為本發(fā)明的細(xì)胞因子IL-1e表達(dá)圖譜(619bp為e-actin:132bp為IL-1P)圖。圖中l(wèi)多肽治療組；2生理鹽水對(duì)照組；3正常肝組織；MpUc8圖1-19為本發(fā)明的細(xì)胞因子IL-6表達(dá)圖譜(619bp為e-actin;455bp為IL-6)圖。圖中1多肽治療組；2生理鹽水對(duì)照組；3正常肝組織；MpUc8圖1-20為本發(fā)明的細(xì)胞因子TNFa表達(dá)圖譜(619bp為P-actin;396bp為T(mén)NFa)圖。圖中1治療組；2生理鹽水對(duì)照組；3正常肝組織；MpUC8圖1-21為本發(fā)明的LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠生理鹽水對(duì)照組肺臟病理形態(tài)(10X10)。圖l-22為本發(fā)明的LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠多肽治療組肺臟病理形態(tài)(10X10)。圖1-23為本發(fā)明的LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠生理鹽水對(duì)照組肝臟病理形態(tài)(10X10)。圖l-24為本發(fā)明的LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠多肽治療組肝臟病理形態(tài)aOX10〉。圖1-25為本發(fā)明的生理鹽水對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)肝細(xì)胞出現(xiàn)大量明顯變性、壞死現(xiàn)象，肝組織放射狀條索結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(X250)。圖1-26為本發(fā)明的多肽治療組小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)(X250)。圖l-27為本發(fā)明的多肽治療組小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)(X250)。圖l-28為本發(fā)明的LPS+GalN組小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)(X250)。圖1-29為本發(fā)明的APS組小鼠肝細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)(X250)。圖1-30為本發(fā)明的生理鹽水對(duì)照組小鼠腦組織蛛網(wǎng)膜下腔出血，大量紅細(xì)胞聚集，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(X400)。圖1-31為本發(fā)明的LPS+GalN組小鼠腦組織少量小血管擴(kuò)張，血管周?chē)g隙增寬(X250)。圖l-32為本發(fā)明的治療組小鼠腦組織(X250)。圖1-33為本發(fā)明的生理鹽水對(duì)照組小鼠肺組織肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多槳液性滲出物，含大量紅細(xì)胞和一定量的炎性細(xì)胞(X250)。圖l-34為本發(fā)明的多肽治療組小鼠肺組織(X250)。圖l-35為本發(fā)明的生理鹽水對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞(X3600)。圖l-36為本發(fā)明的多肽治療組小鼠肝細(xì)胞(X6000)。圖1-37為本發(fā)明的IL-6/actin圖。圖1-38為本發(fā)明的IL-1/actin圖。圖1-39為本發(fā)明的TNF-a/actin圖。圖中M:Puc8MixMarker;1正常組；2APS組；3LPS+GalN組；4生理鹽水對(duì)照組5rhFNHN-29治療組；6多肽rhFNHC-36治療組具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述一、重組FN肝素結(jié)合域多肽酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及多肽的制備本發(fā)明將FNC端的肝素結(jié)合域多肽基因和FNN端的肝素結(jié)合域多肽基因克隆至酵母表達(dá)載體，并在GS115酵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。1.1)FNC端和FNN端肝素結(jié)合域多肽基因PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHC-36)和N端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29)的克隆位置，結(jié)合酵母表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)重組rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR引物和酶切位點(diǎn)。FNN端肝素結(jié)合域多肽是由FN分子中N端的五個(gè)I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有237個(gè)氨基酸(Ser46-Gly282)。編碼該多肽的DNA序列長(zhǎng)711bp(403bp-1113bp)，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)741bp，雙酶切后片斷長(zhǎng)729bp，該多肽命名為rhFNHN-29。其目的基因片斷PCR擴(kuò)增的引物如下上游引物5-ATGCTC^TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCAGTCAMGCAAGCCCGCTTGTTA-3下游引物5-ACGTAG^AATTCTCCGCTCGATGTGGTCTGCA-3上游酶切位點(diǎn)XhoI，下游酶切位點(diǎn)EcoRI。FNC端肝素結(jié)合域多肽是由FN分子中的111-12、111-13、III-14三個(gè)III型同源結(jié)構(gòu)組成，含有272個(gè)氨基酸(Tyrl720-Tyrl991)。編碼該多肽的DNA序列長(zhǎng)816bp(5428bp-6244bp),PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)835bp，雙酶切后片斷長(zhǎng)828bp，該多肽命名為rhFNHC-36。其目的基因片斷PCR擴(kuò)增的引物如下上游引物5-ATGCTc4"CGAGMMGAGAGGCTGAAGGCACCAACTGAC-3下游引物5-acgtagImttctccgctcgtctgtctttttccttcc-3上游酶切位點(diǎn)XhoI，下游酶切位點(diǎn)EcoRI。1.2)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR擴(kuò)增及純化回收PCR擴(kuò)增體系FNcDNA0,1y1(50ng)，IOX緩沖液5ul，dNTPlul，pfulu1(3U)，上下游引物各1u1(lOpmol),雙蒸水41u1，構(gòu)成50u1反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增條件:94。C5分鐘預(yù)變性，94。C30秒，63°C(rhFNHN-29，66°C)40秒，72°C40秒，25個(gè)循環(huán)，72。C10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%低溶點(diǎn)膠電泳，割取含目的基因的低溶點(diǎn)膠，用膠回收試劑盒回收純化目的基因片斷，加雙蒸水溶解，測(cè)OD值。1.4)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接至酵母表達(dá)載體1.4.1)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接到pGEM-T載體rhFNHN-29和rhFNHC-36基因末端加A。反應(yīng)體系20ul:PCR回收產(chǎn)物12.4nl,MgCL21.6u1，ATP2y1,10X緩沖液2ul，Taq酶2ul，在72。C連接30分鐘。rhFNHN-29和rhFNHC-36基因連接pGEM-T載體。反應(yīng)體系20u1:pGEM-T載體2y1,末端加A的rhFNHN-29基因6u1，2X緩沖液10u1，T連接酶2u1，4'C連接16小時(shí)。1.4.2)陽(yáng)性重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)載體的選擇10ii1連接產(chǎn)物加入到50ulDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，加150li1LB(AMP—)，37'C225rpm振搖1小時(shí)。100U1的轉(zhuǎn)染液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單個(gè)菌斑至5mlAMP+的LB中37'C225rpm振搖6小時(shí)，提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序和酶切鑒定。1.4.3)rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因連接到pAo815SM載體將以上挑選鑒定正確的陽(yáng)性菌斑進(jìn)一步振搖擴(kuò)增，用UNIQ-200柱式質(zhì)粒大量抽提試劑盒提取pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)陽(yáng)性質(zhì)粒。操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒的Xhol酶切重組pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒20ul(1lil含100ng),10X緩沖液20nl，10XBSA20ul，Xhol1.51^1，雙蒸水138.5ul，200ul體系，37X:酶切2小時(shí)。酶切產(chǎn)物分兩管，分別用95%乙醇沉淀，一管加10ul雙蒸水，電泳觀察酶切效果。若已酶切徹底，另一管再用EcoRI酶切。重組pGEM-T-FNHN-29質(zhì)粒的EcoRI酶切另一管繼續(xù)EcoRI酶切，上述酶切沉淀質(zhì)粒，IOX緩沖液4ul，10XBSA4ul，EcoRI2ul，雙蒸水30ul.40ul體系，37°C2小時(shí)。1%低溶點(diǎn)瓊脂糖回收FNHN-29(rhFNHC-36)基因片斷，加10ul雙蒸水溶解。pAo815SM載體的酶切。取pAo815SM質(zhì)粒，用Xhol酶切，酶切體系pAo815SM質(zhì)粒20ul(lul含100ng)，10X緩沖液20ul，10XBSA20ul，XhoI1.5yl，雙蒸水138.5ii1，200ul體系，37。C酶切2小時(shí)，瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切效果，酶切完全后用95%乙醇沉淀，加10yl雙蒸水溶解。得到的產(chǎn)物再用EcoRI酶切，酶切體系上述酶切沉淀質(zhì)粒，10X緩沖液4ul，10XBSA4ul，EcoRI2ul，雙蒸水30ul.40ul體系，37。C2小時(shí)。1%低溶點(diǎn)瓊脂糖回收pAo815SM線性質(zhì)粒，加10ul雙蒸水溶解。連接反應(yīng)以上rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因酶切回收產(chǎn)物2ul，10X緩沖液1.5u1,T連接酶lnl,酶切回收的pAo815SM載體lnl，雙蒸水10ul，15.5yl體系，14°C連接過(guò)夜。1.4.4)重組pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞選擇陽(yáng)性克隆以上15.5y1的連接產(chǎn)物加入到50u1DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，力n150y1LB(AMP-)，37。C225rpm振搖1小時(shí)。每100u1轉(zhuǎn)染后的DH5a菌液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜。從轉(zhuǎn)化平板上挑出5個(gè)單菌落分別到5mlAMP+的LB中，37。C225rpm振搖過(guò)夜。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，EcoRI酶切驗(yàn)證。選出陽(yáng)性克隆繼續(xù)下一步試驗(yàn)。pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒雙酶切(EcoRI):pAo815SM-FNHN-29質(zhì)粒30ul，10X緩沖液(M)6ul，10XBSA6ul，EcoRI2nl，BamHI2ul雙蒸水14u1，60p1體系，37'C酶切3小時(shí)。瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切充分后，酶切物用2%瓊脂糖和1%低溶點(diǎn)膠回收rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因。雙蒸水溶解。1.4.5rhFNHN-29基因(rhFNHC-36)連接到酵母表達(dá)載體pPIC9KpPIC9K質(zhì)粒雙酶切(EcoRI和BamH):pPIC9K空質(zhì)粒用EcoRI和BamH在37。C酶切3小時(shí)。瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切充分后，用2%瓊脂糖和1%低溶點(diǎn)膠回收pPIC9K線性質(zhì)粒，雙蒸水溶解。連接反應(yīng)EcoRI和BamH雙酶切回收的FNHN-29(rhFNHC-36)基因6ul，EcoRI和BamHI雙酶切的pPIC9K1n1,T4緩沖液lu1，T4連接酶lu1,雙蒸水1u1，10Ul體系，14'C連接16小時(shí)。1.4.6重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNH036)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞選擇陽(yáng)性克隆lu1重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)載體加入到50u1DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42。C熱休克90秒，力B150u1LB(AMP—)，37。C225rpm振搖2時(shí)。每lOOu1轉(zhuǎn)染后的菌液涂至三塊AMP+的LB板上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜。挑單菌斑至5mlAMP+的LB中37°C325rpm振搖6小時(shí)，測(cè)序和提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)一步擴(kuò)增，在lOOmlLB(AMP+)中振搖6時(shí)，測(cè)0D值，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中，用大柱提取質(zhì)粒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，所提取的質(zhì)粒溶于50ul雙蒸水中。1.5)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽在酵母細(xì)胞中的表達(dá)1.5.3)重組pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表達(dá)線性質(zhì)粒的準(zhǔn)備取20ul重組的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)質(zhì)粒進(jìn)行酶切。酶切體系質(zhì)粒20ul，10X緩沖液40ul，10XBSA40ul，Bgin6ul，雙蒸水294n1,400ul體系。37'C酶切過(guò)夜。酶切物用氯仿按1:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，上清用95%乙醇沉淀，70%乙醇清洗一次，真空抽干，加雙蒸水lOul溶解，得到重組的pPIC9K-FNHN-29線性質(zhì)粒(pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)/BglII)，-20。C保存?zhèn)溆?。線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞取2ul重組的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的GS115細(xì)胞涂布于RDB平板上，28。C培養(yǎng)4-5日，挑取10單菌斑至2mlYPD中，28°C，250rpro振搖培養(yǎng)過(guò)夜。取100p1菌液加100U130%甘油混合，-8(TC冰箱保存。剩余菌液全部倒入20mlBMMY中，28°C,250rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。再誘導(dǎo)48小時(shí)培養(yǎng)，早晚各補(bǔ)加0.25%甲醇誘導(dǎo)，48小時(shí)后，4。C中，離心取上清,4X緩沖液上樣電泳,鑒定是否表達(dá)及表達(dá)的量。挑選出表達(dá)最好的菌種，并保存菌種于-80'C中。將表達(dá)量最高的菌液150u1接種到3ralYPD中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)過(guò)夜的3ml菌液全部再接種到200mlBMGY中，28°C，250rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)過(guò)夜的菌液再按1:20比例接種到BMMY中，早晚各補(bǔ)加0.25%甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)48小時(shí).誘導(dǎo)結(jié)束后,4'C中，6000rpm離心5分鐘，取40ul上清做SDS-PAGE電泳分析，鑒定是否表達(dá)及表達(dá)的里o1.5.4)rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的分離純化酵母發(fā)酵液的沉淀分離80%硫酸胺沉淀酵母發(fā)酵液上清(以4000ml為單位)，調(diào)Ph至7.3，放置30分鐘，2(TC,10000rpm離心20分鐘，去上清，沉淀物再用200ml去離子水溶解，離心，去上清，150ml去離子水再溶解，40iil做SDS-PAGE電泳分析。S-IOO柱的分離純化將以上沉淀分離的樣品液50ml，上樣至980ml的FFS-100柱子上。用平衡液進(jìn)行洗脫純化，平衡液為10mraNaCl，20mraTris-Cl,Ph8.5。洗脫純化過(guò)程中，收集各個(gè)峰洗脫液體，并做SDS-PAGE電泳分析，以確定rhFNHN-29多肽所在的峰。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脫液體，再進(jìn)行SP柱純化。SP柱的分離純化從S-100純化中收集的第二個(gè)峰洗脫液調(diào)Ph值至7.0，稀釋一倍后再上SP柱進(jìn)一步純化。A液10mMNaCl，20mMTris-Cl,Ph7.0;B液200函aCl，20^lMTris-Cl，Ph7.0。洗脫純化過(guò)程樣品上柱平衡好后，60%B液洗脫。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脫液體，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析、分子量測(cè)定、含量測(cè)定、濃縮處理。1.6)純化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的生物學(xué)特性分析1.6.1)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的含量測(cè)定用Bradford試劑盒測(cè)定純化液中目的蛋白的含量，按說(shuō)明書(shū)操作，在酶標(biāo)儀(354型，thermoLabSysteras)上測(cè)590nm光密度值(OD值)，計(jì)算待測(cè)樣品濃度，再用透析袋透析濃縮。1.6.2)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽分子量測(cè)定將純化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE電泳凝膠在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測(cè)定多肽的分子量，以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為參照。1.6.3)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽結(jié)合肝素活性與FN抗原性rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽是FN分子中的肝素結(jié)合區(qū)域。在完整的FN分子中該區(qū)域具有結(jié)合肝素的活性，為了驗(yàn)證在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的rhFNHC-36多肽和在酵母細(xì)胞中表達(dá)的rhFNHN-29多肽是否保留結(jié)合肝素的能力及是否具有FN抗原性的特性，特設(shè)計(jì)了Westernblot和斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)。Westernblot:按SDS-PAGE常規(guī)方法制膠，分離膠濃度為7%，濃縮膠濃度為3%膠大小為lOcmXlOcm，20ulrhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽樣品(40ug)，加20ul2X上樣緩沖液，煮沸5分鐘，上樣電泳(上樣時(shí)以相同的排列順序上樣兩處，中間以一空泳道相隔，以便制成兩張相似的膜，一張用于酶聯(lián)顯色，一張用于放射顯影)，電泳條件為濃縮膠8mA穩(wěn)流電泳30分鐘，分離膠18niA穩(wěn)流電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，小心將膠移至轉(zhuǎn)膜儀上，在膠的上方放上一張同樣大小的硝酸纖維素膜，在穩(wěn)壓30V狀態(tài)下過(guò)夜轉(zhuǎn)膜。次日將轉(zhuǎn)好的膜切成兩張(一張用于酶聯(lián)顯色，一張用于放射顯影)，將硝酸纖維素膜置1腿SA的TBS緩沖液中封閉1小時(shí)，再將膜置含肝素鈉(625單位/ml)的TBS緩沖液中，室溫孵育1小時(shí)，TBS緩沖液漂洗二次后，將膜置于含大鼠抗肝素抗體(2ug/ml)的TBS緩沖液，室溫孵育1小時(shí)，TBS緩沖液漂洗后，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG(H+L),室溫孵育l小時(shí)，顯色液顯色。另一張進(jìn)行放射顯影將膜放在保鮮膜上，于暗室中用化學(xué)發(fā)光工作液WesternBlot—tingL咖inolReagent(SantaCruz〉按每2cm2膜各加顯色液A，B0.5ml，均勻覆蓋NC膜，蓋上保鮮膜，室溫反應(yīng)5分鐘。然后移入X射線膠片盒中，在預(yù)先裁減好的X射線膠片(KODAK)上爆光，時(shí)間為2分鐘、5分鐘。FN抗原性檢測(cè)的一抗為鼠抗人FN單抗，二抗為羊抗鼠IgG-HRP(斑點(diǎn)雜交相同)。斑點(diǎn)雜交取20ul的rhFNHC-36、rhFNHN-29多肽樣品(40ug)直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上(同時(shí)處理兩張膜，一張用于酶聯(lián)顯色，一張用于放射顯影)，待樣品稍干后，封膜、結(jié)合肝素、結(jié)合抗肝素抗體、結(jié)合二抗和顯色同Westernblot。另一張膜進(jìn)行放射顯影，方法同前。結(jié)果1目的基因在重組載體上的鑒定1.1rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重組載體上的PCR鑒定見(jiàn)圖1-11pUC8;2rhFNHC-36:3rhFNHN-291.2重組pAo815SM-FNHN-29載體EcoRI和BamH雙酶切鑒定見(jiàn)圖1-21pUC18;2pAo815SM-FNHN-29載體；3空載體對(duì)照1.3重組pAo815SM-FNHC-36載體的BaniII和HindIII雙酶切鑒定見(jiàn)圖1-3bacmid-FNHC-36重組載體上rhFNHC-36基因的PCR和雙酶切鑒定1PCR鑒定；2雙酶切鑒定；3pUC81.5重組pGEM"T-FNHN-29載體中目的基因的DNA序列測(cè)定見(jiàn)圖l-4rhFNHN-29基因的正向測(cè)序圖見(jiàn)圖l-5rhFNHN-29基因的反向測(cè)序圖1.4重組bacmid/FNHC-36載體中目的基因的DNA序列測(cè)定見(jiàn)圖1-6rhFNHC-36基因的正向測(cè)序圖見(jiàn)圖l-7rhFNHC-36基因的反向測(cè)序圖2.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽SDS-PAGE分析見(jiàn)圖1-8FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析見(jiàn)圖1-9純化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析1純化的FNHC-36多肽；2M2.2rhFNHN-29多肽的分子量測(cè)定rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE電泳圖，經(jīng)凝膠圖象分析儀掃描分析，計(jì)算其分子量為28.52KD。rhFNHN-29多肽分子量測(cè)定左圖為圖1-10標(biāo)準(zhǔn)蛋白；右圖為圖1-101rhFNHN-292.3rhFNHC-36多肽的分子量測(cè)定rhFNHC-36多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳，在凝膠圖像分析儀中掃描計(jì)算，其分子量為36.09。見(jiàn)圖l-llrhFNHC-36多肽的分子量測(cè)定左圖FNHC-3多肽右圖標(biāo)準(zhǔn)蛋白2.4斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽與肝素及FN抗體結(jié)合的能力，用酶聯(lián)顯色和放射顯影法，結(jié)果兩多肽均能與肝素結(jié)合，均不能與FN抗體結(jié)合。多肽結(jié)合肝素斑點(diǎn)雜交放射顯影圖，見(jiàn)圖1-12左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽多肽結(jié)合肝素斑點(diǎn)雜交酶聯(lián)反應(yīng)顯色圖，見(jiàn)圖1-13左右箭頭為rhFNHC-36多肽，中間箭頭為rhFNHN-29多肽討論本發(fā)明將纖維連接蛋白N端和C端的肝素結(jié)合域多肽基因片斷克隆至酵母表達(dá)載體中，成功獲得了重組的含纖維連接蛋白N端和C端肝素結(jié)合域多肽基因片斷的酵母表達(dá)載體pPICK-FNHN-29(FNHC-36)，并在GS115酵母細(xì)胞中表達(dá)多肽。本發(fā)明在用Westernblot法檢測(cè)多肽結(jié)合肝素能力時(shí)，多肽未能與肝素結(jié)合，可能的原因是在Westernblot檢測(cè)中，多肽在SDS-PAGE電泳時(shí)其空間結(jié)構(gòu)被破壞，故不能與肝素結(jié)合。而在用FN抗體結(jié)合時(shí)，多肽同樣未能與FN抗體結(jié)合。多肽結(jié)合肝素的能力在斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中得到了確認(rèn)。在斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中多肽仍不能與FN抗體結(jié)合，提示多肽不具有FN的抗原性。以上結(jié)果顯示利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FN肝素結(jié)合域多肽是可行的。表達(dá)的多肽具有相應(yīng)的結(jié)合肝素的活性。二、rhFNHN-29及rhFNC-36多肽對(duì)敗血癥小鼠和DIC大鼠治療作用的研究FN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成份，為一種具有多種功能的糖蛋白大分子，能與肝素、膠原、纖維蛋白以及整合素家族的細(xì)胞表面受體結(jié)合，參與細(xì)胞的粘附與遷移、止血過(guò)程、損傷修復(fù)等。在細(xì)胞外基質(zhì)中，F(xiàn)N具有防御和吞噬效應(yīng)，在機(jī)體抗感染過(guò)程中起重要作用。首先，F(xiàn)N具有調(diào)理作用，血漿FN分子結(jié)構(gòu)中既有與巨噬細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)，也有與纖維蛋白原、膠原、細(xì)菌以及其他一些細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)。當(dāng)FN與這些物質(zhì)結(jié)合后又與巨噬細(xì)胞結(jié)合，從而促使巨噬細(xì)胞吞噬這些物質(zhì)。其次，F(xiàn)N能夠增強(qiáng)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)觸發(fā)的中性粒細(xì)胞功能，使多形核細(xì)胞釋放含氧基團(tuán)增多，增強(qiáng)其殺菌、吞噬功能。由于從血漿中分離和純化FN存在著許多的問(wèn)題，如血資源的浪費(fèi)、血源性傳染病的傳播(艾滋病、肝炎等)。利用基因工程技術(shù)全分子表達(dá)FN，目前還存在著技術(shù)上的難度。所以表達(dá)FN的功能多肽，研究FN多肽的功能，并以FN的多肽來(lái)替代臨床治療中對(duì)FN的需求是一可行的方法。我們前期的研究已經(jīng)證明我們制備的重組FN細(xì)胞結(jié)合域多肽(rhFN55多肽)對(duì)鼠敗血癥小鼠和DIC大鼠具有治療作用。但FN肝素結(jié)合域多肽對(duì)鼠敗血癥和DIC的治療作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。在前期的研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗敗血癥和DIC的作用進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。1.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)半乳糖胺增敏內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠的作用1.1.1內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠模型建立和rhFNHC-36多肽的治療按LeistM等用半乳糖胺(Galactosamine，GalN)敏化LPS小鼠建立敗血癥小鼠模型，即給每只小鼠腹腔注射內(nèi)毒素脂多糖(LPS,Sigma)300ug和半乳糖胺(GalN，Sigma)lOmg(將內(nèi)毒素脂多糖300wg和半乳糖胺10mg溶于0.5ml的生理鹽水中)。BABL/C小鼠60只，雌雄各半，體重20-25克，隨機(jī)分三組，每組20只，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療各一組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。治療組分別于注射(LPS和GalN)前半小時(shí)，注射后1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)尾靜脈注射rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽(10mg/kg)，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。另外10只，腹腔注射等體積生理鹽水作為正常對(duì)照。各組小鼠于腹腔注射藥物后6小時(shí)，眶靜脈采血250ul，加10ul3.8呢的枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，用于測(cè)定血漿TNFa水平,并觀察72小時(shí)小鼠生存率。1.1.2病理組織學(xué)觀察各組小鼠于腹腔注射藥物72小時(shí)后，頸椎脫臼法處死小鼠，每只小鼠取肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)冊(cè)染色。1.1.3電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察每只小鼠取肝組織，用3%戊二醛_1.5%多聚甲醛-0.1MPBS(pH7.2)4°C固定2小時(shí)以上。用O.1MPBS(pH7.2)漂洗3次。再以1%鋨酸-1.5ME鐵氰化鉀4。C固定1.5小時(shí)；再用0.1MPBS(pH7.2)漂洗3次，再經(jīng)脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色，最后在日立Hu-12A型透射電鏡下觀察并攝片。1.1.4肝臟細(xì)胞因子表達(dá)的影響1.1.4.1肝組織總RNA的提取應(yīng)用Trizol法(InvitrogenLifeTechnology)提取總RNA。具體步驟頸椎脫臼法處死小鼠后，立即取l克肝組織置液氮冷凍，30分鐘后取出，加入lmlTrizol勻漿，加入1/10體積氯仿，振蕩15秒后冰浴5分鐘，4'C，12000，離心15分鐘，吸取水相加等體積異丙醇溶液混勻，冰浴15分鐘，4°C,12000，離心15分鐘，可見(jiàn)白色沉淀物于EP管底部，棄上清，用75%乙醇小心漂洗，7500，4"C，離心10分鐘，棄上清，沉淀物室溫吹干，加適量滅菌三蒸水溶解，所取得的RNA用紫外分光光度儀準(zhǔn)確定量和2呢瓊脂糖電泳分析。1.1.4.2cDNA合成和細(xì)胞因子的PCR擴(kuò)增cDNA合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為總RNA1yg，隨機(jī)引物100ng，RNA酶抑制劑20U，lOraMd鮮s2u1,AMV反轉(zhuǎn)錄酶15U,反轉(zhuǎn)錄緩沖液(10X)2ul，加滅菌三蒸水至20u1.該反應(yīng)體系置42。C60分鐘，99t:滅活5分鐘。以所獲得的cDNA為模板，對(duì)TNFa、IL-ie、IL-6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物是根據(jù)基因庫(kù)上小鼠cDNA序列應(yīng)用oligo軟件設(shè)計(jì)，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系cDNA1.5ul，dNTPs0.2mM,PCR緩沖液(10X)2.5yl，25mMMgCL21.5ul，上下游引物各25pmo1,Taq酶lU,加滅菌三蒸水至25u1，在PCR儀中擴(kuò)增(2400型PE)，以擴(kuò)增P-actin為內(nèi)參照。有關(guān)細(xì)胞因子和P-actin引物序列、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度、PCR條件見(jiàn)表1。表1肝臟細(xì)胞因子PCR擴(kuò)增引物序列與擴(kuò)增條件細(xì)胞因子引物序列擴(kuò)增片斷退火溫度循環(huán)數(shù)TNFa上5，CGAGTGACMGCCTGTAGC3，下5，TACTTGGGCAGATTGACCTCA3，396bp54。C35IL-ie上5，TGGGCTGTCCAGATGAGAG3'下5，MGGTCCACGGGAAAGACA3，132bp56。C35IL-6上5，GGATACMCTCCCMCAGAC3'下5，GTCTTGGTCCTTAGCCACTC3'455bp55。C35上5，CGCTGCGCTGGTCGTCGACA3，下5，GTCACGCACGATTTCCCGCT3'619bp56°C351.1.5ELISA法檢測(cè)小鼠血漿TNFa水平采用小鼠TNFaELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血漿TNFa水平。方法如下實(shí)驗(yàn)小鼠于腹腔注射藥物6小時(shí)后，眶靜脈采血250nl，加25ul3.8%的枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，將標(biāo)準(zhǔn)品按比例稀釋?zhuān)賹⒋郎y(cè)小鼠血漿(100ul)和稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入酶標(biāo)板中，每孔IOOli1，設(shè)3個(gè)平行孔，室溫孵育2小時(shí)，洗漆液洗3次，每孔加100lil生物素標(biāo)記的TNFa抗體，室溫孵育l小時(shí)，洗滌液洗3次，每孔加100ul鏈霉親和素包被的辣根過(guò)氧化酶，室溫孵育0.5小時(shí)，洗滌液洗3次，每孔加100ul酶結(jié)合工作液，洗滌液洗3次，加入顯色劑IOOti1，顯色20分鐘，最后加100ul終止液終止顯色。在酶標(biāo)儀上用主波長(zhǎng)450nm，輔助波長(zhǎng)630nm，測(cè)每孔光密度值(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值和濃度，取雙對(duì)數(shù)，建立直線回歸方程，計(jì)算各待測(cè)樣品TNFa濃度。1.2rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠的作用1.2.1DIC大鼠模型建立及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的治療按TakahashiY等用內(nèi)毒素誘導(dǎo)法建立大鼠DIC模型的方法，即給每只SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，股靜脈注射內(nèi)毒素脂多糖(LPS)50mg/kg，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。共建立DICSD大鼠30只，體重200-250克，雌雄各半，隨機(jī)分兩組，每組IO只，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療各一組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。治療組分別于注射LPS前半小時(shí)，注射后2小時(shí)，4小時(shí)尾靜脈注射rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽(10mg/kg)，生理鹽水對(duì)照組注射等體積生理鹽水。另設(shè)正常對(duì)照組SD大鼠10只，注射等體積生理鹽水。各組大鼠于注射LPS后6小時(shí)，對(duì)側(cè)股靜脈抽血500ul，50ul(EDTA抗凝)用于測(cè)血常規(guī)白細(xì)胞(WBC)，血紅蛋白(HB)，血小板(Plat)，450ul用4,5ul3.8%的枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿,用于測(cè)定血漿TNFa水平、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和纖維蛋白原(Fbg)。注射等體積生理鹽水。1.2.2病理組織學(xué)觀察于注射LPS后24小時(shí)處死大鼠，取大鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)服染色。1.2.3血常規(guī)測(cè)定各組大鼠于注射LPS后6小時(shí)，對(duì)側(cè)股靜脈抽血50ul(EDTA抗凝)在全自動(dòng)血球儀上測(cè)定白細(xì)胞(WBC)，血紅蛋白(Hb)和血小板(Plat)。1.2.4凝血象測(cè)定1.2.4.1凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定取50ul血漿，置37'C，孵育2分鐘，加入37-C預(yù)溫的凝血活酶100w1，混勻，立即在半自動(dòng)血凝儀上測(cè)定PT。1.2.4.2活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定(APTT)取50ul血漿，加入50ulKPTT部分凝血活酶懸液，混勻后，置37"，孵育3分鐘，然后加入50ul0.025CaCL2溶液，混勻，立即在半自動(dòng)血凝儀上測(cè)定APPT。1.2.4.3纖維蛋白原(Fbg)測(cè)定取50wl血漿加950ul緩沖液，以l:20稀釋?zhuān)靠准?00ul，置37。C，孵育2分鐘，加入37。C預(yù)溫的凝血酶50nl，混勻，立即在半自動(dòng)血凝儀上測(cè)定Fbg。1.2.5ELISA法檢測(cè)大鼠血漿TNFa水平采用大鼠TNFaELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血漿TNFa水平。具體方法同小鼠血槳TNFa檢測(cè).2、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用xa檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。結(jié)果1rhFNHN-29多肽對(duì)半乳糖胺敏化小鼠內(nèi)毒素?cái)⊙Y的治療作用1.1rhFNHN-29多肽對(duì)半乳糖胺敏化內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠死亡率的影響半乳糖胺敏化內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠生理鹽水對(duì)照組小鼠72小時(shí)死亡率為70%,而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組小鼠的死亡率僅為15%和25%，見(jiàn)表2。表2rhFNHN-29多肽治療內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*vs正常對(duì)照組，P〈0.01，**vs多肽治療組，P〈0.011.2病理組織學(xué)觀察病理組織學(xué)觀察半乳糖胺敏化內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠肝臟病理組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組肝組織呈廣泛變性與嚴(yán)重壞死，而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組肝組織呈小面積變性和輕微壞死，兩組小鼠的腎、脾、肺、心、腦組織均未見(jiàn)明顯變性與壞死改變。見(jiàn)圖1-14和圖1-15。1.3電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡觀察生理鹽水對(duì)照組和多肽治療組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組肝細(xì)胞呈嚴(yán)重的變性和壞死，胞質(zhì)蔬松，染色變淺，可見(jiàn)部分細(xì)胞器已經(jīng)崩解，而多肽治療組輕微變性，胞質(zhì)和細(xì)胞器均未見(jiàn)明顯改變，偶見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖1-16、圖1-17。1.4多肽治療對(duì)肝臟細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織TNFa、IL-1P、IL-6raRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠的TNFa、IL-13、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組小鼠的水平(P〈0.01)，而rhFNHN-29多肽rhFNHC-36多肽治療組顯著低于生理鹽水對(duì)照組小鼠的水平(P<0.01)，見(jiàn)表3。見(jiàn)圖1-18、圖1-19,圖中l(wèi)多肽治療組；2生理鹽水對(duì)照組；3正常肝組織；MpUc8;見(jiàn)圖1-20,圖中l(wèi)多肽治療組；2生理鹽水對(duì)照組；3正常肝組織；MpUC8表3肝臟細(xì)胞因子表達(dá)PCR電泳條帶灰度值(細(xì)胞因子/e-actin,x±SD,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*vs正常對(duì)照組，P<0.01，**vs多肽治療組，P〈0.Q11.5小鼠血漿TNFa水平ELISA法檢測(cè)小鼠血漿TNFa水平，結(jié)果顯示半乳糖胺敏化小鼠內(nèi)毒素?cái)⊙Y的血漿TNFa水平，生理鹽水對(duì)照組顯著高于正常對(duì)照組小鼠的水平(P<0.01)，而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組顯著低于生理鹽水對(duì)照組小鼠的水平(P〈0.01)，見(jiàn)表4。表4rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療敗血癥小鼠血槳TNFa水平(x±SD，n=10，pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*vs正常組，P<0.01,林vs治療組，P<0.012rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)DIC大鼠的治療作用2.1多肽對(duì)LPS所致DIC大鼠血象和凝血象的影響LPS所致DIC大鼠的血像和凝血像分析，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組的WBC、冊(cè)、Plat和Fbg顯著低于正常對(duì)照組(P〈0.01),PT和APTT顯著高于正常對(duì)照組(P〈0.01)。而rhFNHN-29rhFNHC-36多肽治療組的WBC、HB、Plat和Fbg顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P〈0.01)，PT和APTT顯著低于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)表5。表5rhFNHN-29多肽治療的DIC大鼠血像和凝血像(r^10)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.2病理組織學(xué)觀察病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組大鼠肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管出現(xiàn)廣泛血栓和較大面積的出血，而rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治療組大鼠肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管僅出現(xiàn)少量血栓形成和小面積的出血。生理鹽水對(duì)照組大鼠肝組織小靜脈和毛細(xì)血管也出現(xiàn)血栓形成，但更突出的病理改變則是見(jiàn)到廣泛而嚴(yán)重的肝組織出血，而rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治療組大鼠肝組織則見(jiàn)較輕微的血栓形成和少量出血。生理鹽水對(duì)照組的腎、脾、心、腦組織也見(jiàn)血栓形成和出血，而rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治療組的腎、脾、心、腦組織見(jiàn)少量血栓形成，未見(jiàn)明顯出血。見(jiàn)圖1-21、圖1-22、圖1-23、圖1-24。2.3大鼠血槳TNFa水平ELISA法檢測(cè)大鼠血漿TNFa水平，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠，生理鹽水對(duì)照組的TNFa水平顯著高于正常對(duì)照組大鼠的水平(P〈0.01),而rhFNHN-29多肽治療組的水平顯著低于生理鹽水對(duì)照組大鼠的水平(P〈0.01)，見(jiàn)表6。表6rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治療DIC大鼠血漿TNFa水平(x±SD,n=10，pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>三、rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠作用的研究1.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的作用1.1.1血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型建立及rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽的治療模型是在Leist建立的半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠模型基礎(chǔ)上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)。即給每只小鼠腹腔注射血小板抗血清(APS)100ul，30分鐘后腹腔注射500W含內(nèi)毒素脂多糖(LPS)300Pg加半乳糖胺(GalN)10mg的混合液。通過(guò)監(jiān)測(cè)血小板和72小時(shí)后小鼠的肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察驗(yàn)證模型是否成功構(gòu)建。所建立的血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型小鼠(BABL/C)共90只，雌雄各半，隨機(jī)分三組，每組30只。rhFNHN-29治療組、rhFNHC-36治療組及生理鹽水對(duì)照組分別于注射血小板抗體前半小時(shí)，注射內(nèi)毒素脂多糖和半乳糖胺后l個(gè)小時(shí)，2個(gè)小時(shí)，3個(gè)小時(shí)，自尾靜脈注射rhFNHN-29或rhFNHC-36各10mg/kg或等體積的生理鹽水。另外設(shè)兩個(gè)對(duì)照組，每組20只，分別腹腔注射APS100W(血小板抗體組，APS組)或腹腔注射500W含LPS300Pg加GalN10rag的混合液(半乳糖胺敏化內(nèi)毒素血癥組，LPS+GalN組)。注射APS6小時(shí)后，從每組取10只小鼠，眶靜脈采血700W，取50W(EDTA抗凝)測(cè)血常規(guī)白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HB)、血小板(Pit)，650^1用1/10體積3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，-20'C冷凍，備測(cè)凝血象及TNF-a水平。各組剩余小鼠觀察72小時(shí)死亡率。1.1.2病理組織學(xué)檢測(cè)同敗血癥治療1.1.3電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)同敗血癥治療1.1.4肝臟細(xì)胞因子表達(dá)的影響1.1.4.1肝組織總RNA的提取同敗血癥治療1.1.4.2cDNA合成和細(xì)胞因子的PCR擴(kuò)增同敗血癥治療1.1.5血常規(guī)檢測(cè)同WC治療1.1.6ELISA法檢測(cè)小鼠血漿TNF-a水平同敗血癥治療1.1.7凝血象檢査同DIC治療1.1.7.1凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定同DIC治療1.1.7.2活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)定同DIC治療1.1.7.3纖維蛋白原(Fbg)測(cè)定同DIC治療2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用X2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。結(jié)果1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的作用1.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的保護(hù)作用生理鹽水對(duì)照組小鼠的死亡率達(dá)90%，rhFNHN-29治療組小鼠的死亡率為20%，rhFNHC-36治療組小鼠的死亡率為25%而半乳糖胺敏化內(nèi)毒素血癥組(LPS+GalN組)小鼠的死亡率為70%，血小板抗體組(APS組)小鼠的死亡率為0%,見(jiàn)表7表7各組小鼠死亡率組別實(shí)驗(yàn)鼠存活鼠死亡鼠死亡率rhFNHN-29治療組2015520%★rhFNHC-36治療組2015525%★生理鹽水對(duì)照組2021890%LPS+Ga雄103770%APS組101000%*表示與生理鹽水對(duì)照組比較，P<0.01。1.2病理組織學(xué)觀察肝臟生理鹽水對(duì)照組小鼠肝組織出現(xiàn)大量明顯變性、壞死現(xiàn)象，肝組織放射狀條索結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)呈火焰狀、多角形，胞漿豐富的Kuffer細(xì)胞。LPS+CalN組小鼠肝細(xì)胞混濁腫脹，部分肝細(xì)胞變性壞死。而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組肝細(xì)胞僅見(jiàn)部分輕微變性壞死現(xiàn)象。而APS組小鼠肝細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死現(xiàn)象，見(jiàn)圖l-251-29。腦生理鹽水對(duì)照組小鼠腦組織出現(xiàn)變性、出血現(xiàn)象，包括部分腦實(shí)質(zhì)充血，小血管擴(kuò)張，血管周?chē)g隙增寬。部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)變性，神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，神經(jīng)元細(xì)胞軸突消失。蛛網(wǎng)膜下腔出血，大量紅細(xì)胞聚集，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。小腦顆粒層充血，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞聚集。LPS+GalN組小鼠腦細(xì)胞可見(jiàn)少量小血管擴(kuò)張，血管周?chē)g隙增寬。APS組小鼠小腦顆粒層充血，較生理鹽水對(duì)照組充血程度輕，蛛網(wǎng)膜下腔未擴(kuò)張出血。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組未見(jiàn)變性、出血等現(xiàn)象，見(jiàn)圖1_301-32。肺生理鹽水對(duì)照組肺組織出現(xiàn)滲出、水腫現(xiàn)象，包括肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多漿液性滲出物，含大量紅細(xì)胞和一定量的炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組僅有輕微滲出、水腫現(xiàn)象，部分肺泡組織毛細(xì)血管稍擴(kuò)張，可見(jiàn)少量漿液性滲出。而LPS+GalN組和APS組未見(jiàn)異常。各組的腎、心、脾等組織未見(jiàn)變性壞死改變。1.3電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)生理鹽水對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞核內(nèi)高度致密的染色質(zhì)邊集，胞漿內(nèi)細(xì)胞器顯著退變，呈典型壞死性改變。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組肝細(xì)胞大小形態(tài)大致正常，肝細(xì)胞呈多邊形，核居中，染色質(zhì)豐富，少量異染色質(zhì)小塊散在分布于核基質(zhì)中，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖l-35，1-36。1.4rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)血小板減少內(nèi)毒素血癥組小鼠肝臟細(xì)胞因子表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)表明生理鹽水對(duì)照組及LPS+GalN組小鼠肝臟組織細(xì)胞因子TNF-a、IL-1P、IL-6mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常小鼠，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽組小鼠肝臟組織細(xì)胞因子TNF-a、IL-1P、IL-6mRNA表達(dá)水平則接近正常小鼠。見(jiàn)圖卜37,圖1-38,圖l-39和表8。表8肝臟細(xì)胞因子表達(dá)PCR電泳條帶灰度值(細(xì)胞因子/actin土SD)基因IL-6IL-1TNF-a正常組0.20±0.030.73±0.080.96±0.02生理鹽水對(duì)照組0.73±0.03*1.33±0.04*1.56±0.18*APS組0.20±0.050.77±0.090.94±0,05LPS+Gal鄉(xiāng)0.61±0.10*1.19±0.02*1.28±0.11*rhFNHN-29治療組0.45±0.08#0.85±0.17#1,02±0.03#rhFNHC-36治療組0.51士0.04弁0.97±0.05#1.18±0.08#*表示與正常組比較，P<0.01;#表示與生理鹽水對(duì)照組比較，P<0.01。3.5血常規(guī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組小鼠血槳血小板(Pit)顯著下降。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組小鼠血楽血小板(Pit)高于生理鹽水對(duì)照組。見(jiàn)表9。表9rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠血象(X土SD)分組(n-6)冊(cè)C(X109)朋(g/L)Pit(X109)正常組5.6±1.5137±9.6683±92生理鹽水對(duì)照組4.6±1.8128±4.121±16*APS組6.3士0.7112±5.093土31*LPS+GalN組6.8±0.9105±9.3270±56*FN治療組5.4±2.9149±9.7139±85#rhFNHN-29治療組6.3±2.1132±8.6102±96#*表示與正常組比較，P<0.01;#表示與生理鹽水對(duì)照組比較，P<0.01。3.6ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理鹽水組及LPS+GalN組小鼠血漿TNF-a表達(dá)水平顯著增高，F(xiàn)N治療組及rhFNHN-29治療組小鼠血漿TNF-a表達(dá)水平明顯低于生理鹽水對(duì)照組。見(jiàn)表IO。表IOrhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠血漿TNF-a水平(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*表示與正常組比較，P<0.01;#表示與生理鹽水對(duì)照組比較，P<0.01。3.7凝血象檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組及LPS+GalN組小鼠血漿PT、APTT顯著增高，F(xiàn)bg水平下降。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組小鼠血漿PT、APTT明顯低于生理鹽水對(duì)照組，F(xiàn)bg水平較生理鹽水對(duì)照組升高。見(jiàn)表ll。表11rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠凝血象(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*表示與正常組比較，P<0.01;#表示與生理鹽水對(duì)照組比較，P<0.01。討論敗血癥和DIC，是臨床常見(jiàn)危重癥。敗血癥尤其由其產(chǎn)生的感染性休克容易誘發(fā)DIC，而一旦形成DIC，又進(jìn)一步加重休克。由DIC引起的出血危害性極大。DIC也可導(dǎo)致多器官功能衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥，病死率高。本發(fā)明對(duì)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗敗血癥小鼠和DIC大鼠治療作用進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。在多肽抗敗血癥小鼠實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水對(duì)照組小鼠的死亡率為70%，肝臟病理組織學(xué)形態(tài)呈廣泛變性與嚴(yán)重壞死，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞呈嚴(yán)重的變性和壞死，胞質(zhì)蔬松，染色變淺，部分細(xì)胞器已經(jīng)崩解，肝組織TNFa、IL-ie、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著增高，血漿TNFa水平顯著增高。以上各項(xiàng)指標(biāo)顯示用生理鹽水對(duì)照處理的小鼠處于內(nèi)毒素?cái)⊙Y狀態(tài)。這證明本實(shí)驗(yàn)敗血癥小鼠模型建立是成功的。而用rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療的小鼠死亡率僅為15%和25%，顯著低于生理鹽水對(duì)照組(P〈0.01),說(shuō)明rhFNHN-29和rhFNHO36多肽能明顯降低敗血癥小鼠的死亡率。肝組織僅呈小面積變性和輕微壞死，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞輕微變性，胞質(zhì)和細(xì)胞器均未見(jiàn)明顯改變，偶見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，說(shuō)明rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽能有效地降低內(nèi)毒素?cái)⊙Y所造成的肝組織損害。肝組織TNFa、IL-1P、IL-6mRNA表達(dá)水平和血漿TNFa水平顯著低于生理鹽水對(duì)照的小鼠。在內(nèi)毒素?cái)⊙Y時(shí)，內(nèi)毒素刺激機(jī)體單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，釋放大量炎性細(xì)胞因子。所以說(shuō)明rhFNHN-29多肽可能是通過(guò)降低促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平而起到對(duì)內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠的保護(hù)作用。在多肽抗DIC大鼠實(shí)驗(yàn)中，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對(duì)照組大鼠肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管出現(xiàn)廣泛血栓和較大面積的出血，肝組織小靜脈和毛細(xì)血管也出現(xiàn)血栓形成和嚴(yán)重的肝組織出血，腎、脾、心、腦組織也見(jiàn)血栓形成和出血，WBC、HB、Plat和Fbg降低，而PT和APTT延長(zhǎng)，血槳TNFa水平增高。說(shuō)明以生理鹽水處理的大鼠處于DIC狀態(tài)中，提示本實(shí)驗(yàn)成功地建立了DIC大鼠。用rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療的大鼠，肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管僅出現(xiàn)少量血栓形成和小面積的出血，肝組織則僅見(jiàn)輕微血栓形成和少量出血，腎、脾、心、腦組織見(jiàn)少量血栓形成，WBC、HB、Plat和Fbg較生理鹽水對(duì)照組增高，PT和APTT縮短，血漿TNFa水平下降。以上結(jié)果顯示rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)DIC大鼠有一定的治療作用。其機(jī)制可能主要是多肽結(jié)合肝素和抗凝血的作用。為了模擬血液病患者常有的感染和血小板減少并存的情況，我們建立了血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型，并觀察rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)其療效作用。模型是在Leist建立的半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠模型基礎(chǔ)上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)小鼠在腹腔注射APS后6小時(shí)，血小板已降至約原水平的10%，42小時(shí)左右血小板降至最低點(diǎn)，約為原水平的2%,后開(kāi)始逐漸恢復(fù)，96小時(shí)左右恢復(fù)至正常水平。因此我們采取在注射半乳糖胺和內(nèi)毒素之前30分鐘予小鼠腹腔注射APSIOOW的給藥方法。由于本試驗(yàn)的觀察時(shí)限為72小時(shí)，這種給藥方式可以保證小鼠在試驗(yàn)中始終是處于血小板減少的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)前后的血常規(guī)監(jiān)測(cè)也予以證明。造模后死亡小鼠的解剖也發(fā)現(xiàn)腹腔出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血等表現(xiàn)。造模小鼠的肝細(xì)胞病理檢査可見(jiàn)變性壞死，與文獻(xiàn)報(bào)道用半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠選擇性發(fā)展為肝功能衰竭相一致。因此血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型的建立達(dá)到了感染和血小板減少出血并存的要求。本研究中rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組的血小板數(shù)較生理鹽水對(duì)照組高，但仍低于正常水平。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組小鼠雖然生存率較半糖胺敏化內(nèi)毒素血癥組高，但其血小板數(shù)卻較半乳糖胺敏化內(nèi)毒素血癥組低。提示血小板減少并不是血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠致死的主要原因，內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)才是最主要的致死原因。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽不能大幅度地提高血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的血小板數(shù)，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽的治療作用是通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、提供穩(wěn)定的微血管環(huán)境，促進(jìn)凝血以減少出血等方面來(lái)提高小鼠的生存率。病理組織觀察表明血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠肝、腦、肺出現(xiàn)變性、壞死、充血等現(xiàn)象，相對(duì)的給予rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療組小鼠肝、腦、肺則病變減輕。肝細(xì)胞的電鏡結(jié)果也表明給予FN能減輕肝細(xì)胞的損害。凝血象檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠血漿FT、APTT顯著增高，F(xiàn)bg水平下降。繪予rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療后小鼠血漿PT、APTT較生理鹽水對(duì)照組明顯降低，F(xiàn)bg水平較生理鹽水對(duì)照組升高。本研究表明rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治療有助于糾正血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的凝血系統(tǒng)紊亂。可能是由于rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用，使得肝臟仍能分泌穩(wěn)定凝血系統(tǒng)所需的凝血因子物質(zhì)。另外，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽維持血管內(nèi)膜完整性，減少微血管損傷，及時(shí)清除易導(dǎo)致微血管栓塞引發(fā)DIC的纖維蛋白多聚體等物質(zhì)，保持止血和凝血功能的穩(wěn)定，減少凝血因子的消耗，這都有利于改善小鼠止血和凝血功能。權(quán)利要求1、一種重組纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽和重組纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽在制備敗血癥嚴(yán)重感染、血小板減少出血和彌漫性血管內(nèi)凝血的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了重組纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽和C端肝素結(jié)合域多肽，所述的N端肝素結(jié)合域多肽是由FN分子中N端的五個(gè)I型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Ser46-Gly282的237個(gè)氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從403bp到1113bp，長(zhǎng)711bp，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)741bp，雙酶切后片斷長(zhǎng)729bp；由酵母表達(dá)的多肽分子量為28.52kDa。所述的C端肝素結(jié)合域多肽是由FN分子中的三個(gè)III型同源結(jié)構(gòu)組成，含有從Tyr1720-Tyr1991的272個(gè)氨基酸；編碼該多肽的DNA序列從5428bp到6244bp，長(zhǎng)816bp，PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)835bp，雙酶切后片斷長(zhǎng)828bp，由酵母表達(dá)的多肽分子量為36.09kDa。在制備敗血癥嚴(yán)重感染、血小板減少出血和彌漫性血管內(nèi)凝血的藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61P31/00GK101121018SQ20071000919公開(kāi)日2008年2月13日申請(qǐng)日期2007年7月10日優(yōu)先權(quán)日2007年7月10日發(fā)明者勇吳,鄒起練,郭江睿,陳元仲,陳小芳申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院