專利名稱：一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法，包括制備小分子干擾RNA (SiRNA)和抗人HNP抗體等阻斷劑，阻斷、中和及減少中性粒細(xì)胞HNP的產(chǎn)量、功能和生物活性，治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他相關(guān)疾病。
背景技術(shù)：
已知中性粒細(xì)胞在敗血癥及多器官功能衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用參閱文獻(xiàn)Brown，等，Lancet 368，157-169 Q006)。中性粒細(xì)胞含有大量的多肽、酶、小分子等物質(zhì)。他們?cè)跉⑺?、裂解和消滅被吞噬進(jìn)入中性粒細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌、病毒和真菌有重要作用。 然而，這一作用只有在中性粒細(xì)胞內(nèi)可以完全發(fā)揮。一旦中性粒細(xì)胞自身裂解，這些物質(zhì)可以損傷周邊細(xì)胞、組織、乃至器官。因此，保護(hù)中性粒細(xì)胞完整是治療敗血癥的重要手段。防御肽(defensin)在機(jī)體天然免疫中發(fā)揮重要作用參閱文獻(xiàn)Klotman等，Nat Rev Immunol 6，447-56 Q006)和 klsted等，Nat Immunol 6，551-7 Q005)。他們直接或間接地殺傷細(xì)菌、病毒、真菌及其他微生物。人體白細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌多種防御肽。 人中性粒細(xì)胞分泌的有中性粒細(xì)胞防御肽(HNP)，包括ΗΝΡ-1、-2、-3和-4，是主要的α -防御肽，它們?cè)谥行粤＜?xì)胞防御和控制感染中起到重要作用。腸道Paneth細(xì)胞也分泌α-防御肽。它們是HD-5和HD-6 二種，是腸道防御和控制感染的主要門戶。許多表皮細(xì)胞，如多種上皮細(xì)胞及皮膚細(xì)胞等則分泌β -防御肽，如hBD-1、hBD-2、hBD-3、hBD-4等等。中性粒細(xì)胞中多達(dá)40%的蛋白成分是HNP參閱文獻(xiàn)Ganz等，Curr OpinImmunol 6,584-9(1994)和 klsted 等，J Clin Invest 76，1436-1439 (1985)。這些 HNP 在正常情況下包囊在中性粒細(xì)胞的分泌顆粒內(nèi)。因此，正常情況下人血清中HNP的濃度非常低， 多數(shù)檢測(cè)不到，最高在0. 2微克/毫升。然而，在病理情況下，特別是在細(xì)菌感染時(shí)，大量中性粒細(xì)胞被活化并破壞，血液中HNP含量明顯升高參閱文獻(xiàn)Brown，等，Lancet 368， 157-169(2006)。已有報(bào)道稱細(xì)菌感染性敗血癥時(shí)血液中HNP量可以達(dá)到170微克/毫升參閱文獻(xiàn) Ihi 等，Clin Infect Dis 25,1134-1140(1997)和 Panyutich 等，J Lab Clin Medl22, 202-207 (1993)。這提示HNP除了直接殺滅外侵的微生物之外，還可能有病理性致病作用。文獻(xiàn)尚未報(bào)道過HNP在敗血癥中有病理性致病作用。只有一篇文獻(xiàn)提到大劑量HNP 用于正常大鼠肺部時(shí)致使其肺功能低下和肺功能衰竭參閱文獻(xiàn)^iang等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 280, L947-L954 (2001) ] 這只能間接表明HNP可能在敗血癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。到目前為止，尚無醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方法來阻斷、減少和中和中性粒細(xì)胞HNP的產(chǎn)量、功能和生物活性，用于治療細(xì)菌感染引起的敗血癥等疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是用醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方法來阻斷、減少和中和中性粒細(xì)胞外HNP的產(chǎn)量、功能和生物活性，治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他相關(guān)疾病。首創(chuàng)一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥和其他相關(guān)疾病的方法，包括制備小分子干擾RNA(SiRNA)和抗人 HNP抗體阻斷劑，阻斷、減少和中和中性粒細(xì)胞HNP產(chǎn)量、功能和生物活性，治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他相關(guān)疾病。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的，本發(fā)明中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。1、制備siRNA。經(jīng)酶切的雙鏈RNA會(huì)形成很多小片段，稱為小片段抑制 RNA (siRNA)。siRNA與信使RNA (mRNA)的同源序列互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA降解成小片段RNA，從而導(dǎo)致mRNA失去功能，不能被翻譯成蛋白質(zhì)。設(shè)計(jì)siRNA，5 ‘ -AGGCACUGCUCUCCAAGAU-3 ‘， 并應(yīng)用化學(xué)合成法體外制備siRNA小片段，保存于含有RNA穩(wěn)定劑的溶液中。理論上，siRNA 小片段可以用于減少中性粒細(xì)胞所有HNP亞型(HNP-1-4)的表達(dá)水平。該小分子siRNA可以有效地減少中性粒細(xì)胞產(chǎn)生HNP (見圖1)。從而確保單一 siRNA制劑可以有效降低同源互補(bǔ)HNP蛋白。2、制備抗人HNP-I抗體。為了生產(chǎn)特異的抗人HNP-I抗體，設(shè)計(jì)生產(chǎn)了 HNP-I多肽，CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC。把這一多肽與KLH交聯(lián)，然后免疫試驗(yàn)兔，取得大量抗體血清。再經(jīng)免疫學(xué)親和層析的方法純化兔血清，獲得兔免疫球蛋白(IgG)。經(jīng)動(dòng)物和細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，該抗人HNP-I抗體可以有效地中和中性粒細(xì)胞外HNP (見圖2和圖 3)。為了達(dá)到治病這一目的，需要生產(chǎn)特異的人源化單克隆抗人HNP抗體。應(yīng)用上述相同的 HNP-I 多肽，CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC，與 KLH 交聯(lián)后，免疫 Balb/c 小鼠，ELISA 方法證明產(chǎn)生了高效價(jià)的抗人HNP-I抗體。制備抗HNP-I抗體的可變區(qū)，然后制成人源化單克隆抗人HNP-I抗體。圖4為人源化單克隆抗人HNP抗體的生產(chǎn)程序。HNP阻斷劑治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他各類疾病是本發(fā)明的核心部分。 siRNA和抗人HNP-I抗體，均能有效地抑制和阻斷HNP產(chǎn)量、功能和生物活性?？谷薍NP-I 抗體能夠抑制HNP引起的細(xì)胞損傷，也能抑制HNP導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。siRNA和抗人HNP-I抗體是二種不同的制劑。siRNA減少HNP在中性粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，然而抗人HNP-I抗體則是中和中性粒細(xì)胞外的HNP-1，所以這二種制劑同時(shí)應(yīng)用可能有加強(qiáng)作用。本發(fā)明具有減少、抑制和消除HNP在細(xì)菌感染性疾病中的致病作用。與抗生素聯(lián)合用藥，可以加強(qiáng)抗生素的治療效果。


圖1 :siRNA降低HNP表達(dá)水平。從人骨髓分離培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞，用每毫升1 X 16_8 慢病毒Pfu感染骨髓細(xì)胞導(dǎo)入siRNA48小時(shí)后，取1. 5微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，50倍稀釋后定量PCR檢測(cè)HNP表達(dá)水平。圖2 抗HNP-I抗體中和中性粒細(xì)胞外HNP激活A(yù)kt。從人痰液中提取的HNP復(fù)合物與抗人HNP-I抗體孵育30分鐘后作用于肺癌A549細(xì)胞30分鐘。裂解細(xì)胞后用免疫酶標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt活性。*，#p < 0. OOlvs HNP組。圖3 抗HNP-I抗體中和中性粒細(xì)胞外HNP引起細(xì)胞凋亡。從人痰液中提取的HNP 復(fù)合物與抗人HNP-I抗體孵育30分鐘后共同作用于肺癌A549細(xì)胞8小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 *，#p < 0. OOlvs HNP 組。
圖4人源化單克隆抗人HNP抗體的生產(chǎn)程序
具體實(shí)施例方式為進(jìn)一步描述本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1為高效表達(dá)siRNA，使用了慢病毒載體(Lentiviral vector)系統(tǒng)，因?yàn)槁《据d體較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍?；蛐蛄蠥GGCACTGCTCTCCAAGAT被組裝入自行研制的慢病毒載體中。慢病毒載體與其他載體成分共同導(dǎo)入人細(xì)胞中，以便復(fù)制表達(dá)慢病毒。48小時(shí)后，慢病毒滴度達(dá)到每毫升IXlO13空斑形成單位(pfu)。為了檢驗(yàn)上述siRNA能夠有效抑制HNP表達(dá)，從大鼠骨髓中制備骨髓細(xì)胞。頸椎脫臼處死2只Wistar大鼠。75%酒精消毒全身，共取4根股骨。用RPMI1640 (ρΗ7. 2)在無菌環(huán)境中沖洗出全部骨髓細(xì)胞。用吸管吹打5次，再通過4號(hào)針頭5次，制成單細(xì)胞懸液。 在1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，棄上清。沉淀用RPMI1640液調(diào)細(xì)胞濃度至每毫升1 X IO7 個(gè)。用2%臺(tái)盼藍(lán)染色檢查骨髓細(xì)胞活性，每次制備的細(xì)胞活性都在95%以上。于6孔板中加入1毫升1 X IO7個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)。次日，用每毫升1 X 108pfu慢病毒感染骨髓細(xì)胞48小時(shí)后提取總RNA，用1. 5微克總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，50倍稀釋后定量PCR檢測(cè)HNP表達(dá)水平。 如圖1所示，在每毫升1 X 106pfu慢病毒感染后骨髓細(xì)胞的HNP表達(dá)水平即有明顯下降。用每毫升1 X 108pfu慢病毒感染后更大程度地降低了骨髓細(xì)胞表達(dá)HNP。實(shí)施例2為了闡明抗人HNP-I抗體能夠有效中和中性粒細(xì)胞外HNP的活性，作了二個(gè)試驗(yàn)。 第一個(gè)試驗(yàn)，從30例慢性支氣管肺炎病人的混合痰液中提取了復(fù)合HNP(70%*HNP-1、 21 %是HNP-2和只有5%是HNP-3，沒有可檢測(cè)的HNP-4)參閱文獻(xiàn)Khine,等，Blood 107， 2936-2942(2006)。100微克/毫升HNP復(fù)合物與抗人HNP-I抗體(1,10和200微克/毫升)室溫下孵育30分鐘后，取其混合物10微克/毫升作用于肺癌A549細(xì)胞，30分鐘后裂解細(xì)胞用免疫酶標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt酶活性。結(jié)果顯示抗人HNP-I抗體可以阻斷HNP激活肺癌A549細(xì)胞內(nèi)Akt酶活性見圖2。第二個(gè)試驗(yàn)，用人痰液中提取的100微克/毫升 HNP復(fù)合物與抗人HNP-I抗體(1、10和200微克/毫升)孵育30分鐘后，共同作用于肺癌 A549細(xì)胞，8小時(shí)后用Apoptosis Detection Kit檢測(cè)細(xì)胞凋亡見圖3。很明顯，單用 HNP復(fù)合物(100微克/毫升)后，65%細(xì)胞凋亡?？谷薍NP-I抗體在1微克/毫升水平即已明顯阻止HNP的細(xì)胞毒性作用。劑量加大后，抗人HNP-I抗體的這種阻斷效應(yīng)增強(qiáng)。最后，用抗人HNP抗體治療敗血癥動(dòng)物模型。敗血癥動(dòng)物模型是在Wi star大鼠中建立的。總共6只Wistar大鼠被用于試驗(yàn)，其中3只大鼠腹腔內(nèi)注射抗人HNP-I抗體 (50微克/公斤)，3只大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水作對(duì)照。生理鹽水注射大鼠均成功誘導(dǎo)敗血癥，而抗人HNP-I抗體治療者無一例敗血癥誘導(dǎo)成功。
權(quán)利要求
1.一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法，其特征在于包括制備小分子干擾RNA(SiRNA)和抗人HNP抗體等阻斷劑，阻斷、中和及減少中性粒細(xì)胞HNP的產(chǎn)量、功能和生物活性，治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他相關(guān)疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法，其特征在于所述的小分子干擾RNA(SiRNA)阻斷劑是用以下方法來制備的，經(jīng)酶切的雙鏈RNA會(huì)形成為小片段抑制(siRNA)，siRNA與信使RNA (mRNA)的同源序列互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA降解成小片段，從而導(dǎo)致mRNA失去功能；設(shè)計(jì)siRNA，AGGCACUGCUCUCCAAGAU，并應(yīng)用化學(xué)合成法體外制備siRNA小片段，保存于含有RNA穩(wěn)定劑的溶液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法，其特征在于所述的抗人HNP抗體阻斷劑是用以下方法來制備的，設(shè)計(jì)生產(chǎn)HNP-I多肽，CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC，與KLH交聯(lián)，免疫試驗(yàn)兔，取得大量的抗體血清；再經(jīng)免疫學(xué)親和層析的方法純化兔血清，獲得兔免疫球蛋白；同一個(gè)HNP-I多肽， CACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC，與KLH交聯(lián)后，免疫Balb/c小鼠，制成人源化單克隆抗人HNP抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中性粒細(xì)胞抗菌肽阻斷劑治療敗血癥的方法，其特征在于治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他相關(guān)疾病時(shí)，是采用阻斷、中和及減少中性粒細(xì)胞 HNP的產(chǎn)量、功能和生物活性的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中性粒細(xì)胞抗菌肽(HNP)阻斷劑治療敗血癥的方法，包括制備小分子干擾RNA(siRNA)和抗人HNP抗體等阻斷劑，阻斷、中和及減少中性粒細(xì)胞HNP的產(chǎn)量、功能和生物活性。通過設(shè)計(jì)和化學(xué)合成法，體外制備小分子siRNA。通過設(shè)計(jì)生產(chǎn)HNP-1多肽與KLH交聯(lián)，然后免疫試驗(yàn)兔，獲得兔免疫球蛋白。用同一個(gè)HNP-1多肽，免疫小鼠，制備抗HNP-1抗體的可變區(qū)，然后制成人源化單克隆抗人HNP-1抗體。小分子siRNA和抗人HNP-1抗體均能有效阻斷、中和及減少中性粒細(xì)胞的HNP產(chǎn)量、功能和生物活性，可用于治療細(xì)菌感染引起的敗血癥和其他相關(guān)疾病。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK102552306SQ201010583270
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者劉輝宇, 張雪晴 申請(qǐng)人:馬鞍山中美德康生物科技有限公司