本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法。

背景技術：

米糠占整粒稻谷的8%，但卻集中了稻米中64%的營養(yǎng)素和90%的人體必需元素，以及多種的功能活性物質，如維生素、γ-谷維素、角鯊烯、甾醇以及谷物多酚等，是稻米功效成分最密集的部位。米糠經(jīng)過脫脂后，除部分脂溶性維生素等功能成分隨米糠油被提走外，大部分水溶性多糖、氨基酸及膳食纖維等活性因子仍保留在糠粕內。米糠蛋白中的主要成分是清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白，這4種蛋白的比例大概為37：36：22：5?？扇苄缘鞍准s70%，米糠蛋白具有低過敏性，極易吸收，營養(yǎng)價值較為理想。所具有的氨基酸組成接近fao/who推薦模式，是作為嬰幼兒斷乳食品的理想原料。米糠多糖廣泛存在于稻谷穎果皮層中，主要是由以a-1，6糖苷鍵為主要結構的多糖組成。其中，水溶性多糖與一般聚糖不同，是一種結構復雜的雜聚糖，由木聚糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等組成。它們都具有顯著的生物活性和保健功能，如抗腫瘤、免疫增強和降血糖等。

采用物理化學等方法提取的功能成分比較單一，微生物發(fā)酵在提升農產品及其加工副產物附加值中有著廣泛的應用。隨著發(fā)酵工藝的發(fā)展，微生物發(fā)酵的生產方式已從單一菌種發(fā)酵向多菌種協(xié)同發(fā)酵方向發(fā)展，并注重不同微生物之間的協(xié)同性和互補性，使其發(fā)揮正組合效應。由于多菌種發(fā)酵有利于各菌種協(xié)同作用于半干法基質上，往往比單獨菌種作用效果更明顯，使之成為當前研究的熱點。酵母菌富含氨基酸、核酸、維生素等多種生理活性物質，其代謝能產生多種酶類，并易于與其他菌種協(xié)同發(fā)酵?？莶菅挎邨U菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法的技術方案。

本發(fā)明是在多種復合菌配合下的大量篩選實驗后，首次公開優(yōu)選利用酵母菌和枯草芽孢桿菌雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠，發(fā)酵后用于活性成分米糠蛋白與米糠多糖的提取，脫脂米糠經(jīng)過雙菌半干法發(fā)酵處理后，提高米糠蛋白與米糠水溶性多糖的產量，對其組成有改變。以往的微生物發(fā)酵，大多是2-3種菌對混合底料進行發(fā)酵，并且直接用為飼料，對利用酵母菌和枯草芽孢桿菌雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠沒見報道，由于單獨基質如脫脂米糠的蛋白與多糖與其他的天然基質組成就不同，再用經(jīng)過篩選的不同組合的菌發(fā)酵，獲得蛋白與多糖的組成也不同，特別是我們還將他們分離出來，有利于食品、營養(yǎng)品和醫(yī)藥等的精致應用。步驟如下：

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）取粉碎后的脫脂米糠加入水，使其含水量達到30%-50%，再將該脫脂米糠滅菌后進行發(fā)酵，發(fā)酵方式以0.2-2%的接種量按酵母菌和枯草芽孢桿菌質量比=1:1雙菌接菌，28-40℃發(fā)酵3-6d；

2）取步驟1）得到的發(fā)酵后脫脂米糠與水按重量比1:10混合，調ph=11，超聲提取10分鐘，過濾，得到濾液1和濾渣1；濾液1調ph=4.5，過濾，得到濾渣2和濾液2，濾渣2冷凍干燥即為米糠蛋白質，濾渣1和濾液2備用；

3）將步驟2）得到的濾渣1，按液料的重量比1：10加水，ph值中性條件下超聲萃取20分鐘，過濾，得到濾液3和濾渣3，濾液2與濾液3合并濃縮至一半，用60%乙醇沉淀，獲米糠多糖；

4）步驟3）得到的濾渣3經(jīng)水洗滌、烘干，得到膳食纖維；

5）對雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的進行分析。

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于所述步驟1）中含水量為35-45%。

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于所述步驟1）中接種量為0.5-1.5%。

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于所述步驟1）中發(fā)酵溫度30-35℃，發(fā)酵時間4-6d。

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于所述步驟1）中酵母菌為啤酒酵母菌，菌總數(shù)180億/克，枯草芽孢桿菌菌總數(shù)200億/克。

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于所述步驟2）中超聲提取條件為超聲功率50w、頻率80khz。

所述的雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法，其特征在于所述步驟3）中超聲萃取條件條件為超聲功率50w、頻率80khz。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的方法下，改變了米糠蛋白和米糠多糖的成分，并提高了提取率。2.發(fā)酵后的米糠(包括底物、菌體及其代謝物)盡其用，既保留其活性成分又不會引起廢液污染。3.兩種菌發(fā)酵有利于各菌種協(xié)同作用于半干法基質上，往往比單獨菌種作用效果更明顯，使脫脂米糠活性物品質提高，物盡其用。

具體實施方式

以下結合實施例來進一步說明本發(fā)明。

實施例1

粉碎后的脫脂米糠50g加入適當?shù)乃恳阅蟪蓤F不能從指縫滲出水為宜，含水量為40%，放入250ml三角瓶中，塞上棉塞，12l℃滅菌15min。發(fā)酵方式以1%的接種量按酵母菌和枯草芽孢桿菌質量比=1:1雙菌接菌，其中酵母菌為啤酒酵母菌，菌總數(shù)180億/克，枯草芽孢桿菌菌總數(shù)200億/克，35℃發(fā)酵5d。發(fā)酵后脫脂米糠不處理，直接與水按重量比1:10混合，調ph=11，超聲提?。ǔ暪β?0w、頻率80khz）10分鐘，40℃，過濾，得到濾液1和濾渣1，濾液1調ph=4.5，有沉淀，過濾，得到濾渣2和濾液2，濾渣2冷凍干燥即為米糠蛋白質，獲5g；米糠蛋白提取后的濾渣1和沉淀蛋白中和后濾液2備用。將米糠蛋白提取后的濾渣1，按液料的重量比1：10加水調，ph中性條件下超聲萃?。ǔ暪β?0w、頻率80khz）20分鐘，過濾，得到濾液3和濾渣3，將濾液3和濾渣3分離，濾液2與濾液3合并濃縮一半，用60%乙醇沉淀，獲米糠多糖4g；米糠多糖提取后的濾渣3經(jīng)水洗滌、烘干后可作為膳食纖維38g。對雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的進行分析。

實施例2

粉碎后的脫脂米糠50g加入適當?shù)乃?，含水量以捏成團不能從指縫滲出水為宜，含水量為40%，放入250ml三角瓶中，塞上棉塞，12l℃滅菌15min。發(fā)酵方式以1.5%的接種量按酵母菌和枯草芽孢桿菌質量比=1:1雙菌接菌，其中酵母菌為啤酒酵母菌，菌總數(shù)180億/克，枯草芽孢桿菌菌總數(shù)200億/克,35℃發(fā)酵6d。發(fā)酵后脫脂米糠不處理，直接與水按重量比1:10混合，調ph=11，超聲提?。ǔ暪β?0w、頻率80khz）10分鐘，40℃，過濾，得到濾液1和濾渣1，濾液1調ph=4.5，有沉淀，過濾，得到濾渣2和濾液2，濾渣2冷凍干燥即為米糠蛋白質，獲5.1g；米糠蛋白提取后的濾渣1和沉淀蛋白中和后濾液2備用。將米糠蛋白提取后的濾渣1，按液料的重量比1：10加水調，中性條件下超聲萃取（超聲功率50w、頻率80khz）20分鐘，過濾，得到濾液3和濾渣3，將濾液3和濾渣3分離，濾液2與濾液3合并濃縮一半，用60%乙醇沉淀，獲米糠多糖3.8g；米糠多糖提取后的濾渣3經(jīng)水洗滌、烘干后可作為膳食纖維37g。對雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠獲得活性物的進行分析。

實施例3

對比實驗1：不用雙菌半干法發(fā)酵脫脂米糠，利用脫脂米糠直接提取蛋白質和多糖。對比實驗2：雙菌（2:1）半干法發(fā)酵脫脂米糠，然后提取發(fā)酵脫脂米糠蛋白質和多糖。對比實驗3：雙菌（1:2）半干法發(fā)酵脫脂米糠，然后提取發(fā)酵脫脂米糠蛋白質和多糖。

對比實驗1：利用脫脂米糠直接提取蛋白質和多糖。脫脂米糠直接與水1:10（重量比）混合，調ph=11，超聲提取10分鐘，40度，過濾，濾液1調ph=4.5，有沉淀，過濾，濾渣冷凍干燥即為米糠蛋白質，獲4g；米糠蛋白提取后的濾渣2和沉淀蛋白中和后濾液2備用。將米糠蛋白提取后的濾渣2，按液料的重量比1：10加水調，中性條件下超聲萃取20分鐘，過濾，濾液3和濾渣3分離，濾液2與濾液3合并濃縮一半，用60%乙醇沉淀，獲米糠多糖3g；米糠多糖提取后的濾渣3經(jīng)水洗滌、烘干后可作為膳食纖維39g。對脫脂米糠獲得活性物的進行分析。

對比實驗2：實驗步驟參照實例1，雙菌（1:1）半干法發(fā)酵脫脂米糠改為雙菌（2:1）半干法發(fā)酵脫脂米糠。雙菌（2:1）指酵母菌：枯草芽孢桿菌質量比=2:1。

對比實驗3：實驗步驟參照實例1，雙菌（1:1）半干法發(fā)酵脫脂米糠改為雙菌（1:2）半干法發(fā)酵脫脂米糠。雙菌（1:2）指酵母菌：枯草芽孢桿菌質量比=1:2。

表1：實例1與對比實驗1～3獲得米糠多糖的分析

從表1可見，利用我們優(yōu)化的條件（實例1），獲得的米糠多糖收率最多。在不用雙菌發(fā)酵直接提取米糠多糖（對比實驗1），及其他比例的雙菌發(fā)酵提取米糠多糖（對比實驗2，對比實驗3），米糠多糖收率的收率都沒有實例1的高。如果雙菌發(fā)酵比例不妥，如對比實驗3還不如對比實驗1的收率也不是很理想。表中還原糖含量增加，是雙菌發(fā)酵的結果；說明雙菌對大分子多糖有酶解作用。

表2：實例1與對比實驗1～3獲得米糠蛋白質的分子量測定

由表2可見，雙菌發(fā)酵提取的米糠蛋白質，由四大組分組成，但與不用雙菌發(fā)酵直接提取米糠蛋白質（對比實驗1）相比，每一組分的分子量相對都略變低。這是由于雙菌發(fā)酵會產生許多其他酶，對細胞壁有酶解作用，不但提高了米糠蛋白的溶出效率，還使一些蛋白片段發(fā)生酶解。米糠蛋白質分子量變低，有利于米糠蛋白的利用吸收。

實施例4

實驗1：提取米糠還原糖的測定

(1)樣品的處理：準確稱取5g發(fā)酵米糠提產物,于250ml容量瓶中(用100ml水分數(shù)次洗入容量瓶中)。慢慢加入5ml21.9%的醋酸鋅溶液及10.6%的亞鐵氰化鉀溶液5ml，振搖lmin,加水至刻度,搖勻。放置30min,干過濾,棄去初濾液,與濾液中加入少量的草酸鉀固體，若有沉淀則過濾,濾液共測定用。(2)樣品的預測、精確預測及滴定。

實驗2：提取米糠總糖的測定

（1）樣品的處理：同直接滴定測還原糖。(2)吸取處理后的樣液50ml，放入100ml容量瓶中。加入5ml(1+l)鹽酸溶液,置68-70℃水浴中加熱15min,取出迅速冷卻至室溫,加兩滴甲基紅指示劑,用30%naoh溶液中和至中性,加水至刻度,混勻。然后直接滴定。

采用激光光散射法對米糠多糖樣品進行分子量分析，結果見表1。

實驗3：

提取米糠蛋白質的分子量測定

實驗方法：高效液相色譜分析：agilent1100高效液相色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺,美國agilent公司產品,包括自動進樣器、光電二極管陣列檢測器(dad)、柱溫箱、進樣瓶、渦漩振蕩器、針管過濾器、0.45μm尼龍濾膜;hplc色譜柱:tskgelg2000swxl(7.8mm×300mm)；流動相：乙腈：水：三氟乙酸，12：88：0.1（體積比）；檢測波長：uv220nm；流速：1.0ml/min；柱溫：26℃；進樣體積：10μl。

（1）分子量校正曲線的確定

分別將標準的磷酸化酶b蛋白（97kda）、牛血清蛋白（66.2kda）和兔肌動蛋白（43kda）用流動相配制成質量分數(shù)為0.1%的不同分子量蛋白標準品溶液，用孔徑為0.45μm尼龍濾膜過濾后，分別取10μl上機進樣，流動相：乙腈：水：三氟乙酸，12：88：0.1（體積比），流速為1.0ml/min，柱溫26℃，吸收波長為243nm條件下，進行檢測。

（2）目標產物分子量范圍的確定

稱取樣品約20.0mg于10ml容量瓶中，用流動相定容至刻度，超聲振蕩10min，使樣品充分溶解混勻，用0.45μm尼龍濾膜過濾后，上機進樣。

實驗結果：根據(jù)保留時間（min），米糠蛋白質有4大組分組成。根據(jù)分子量標準曲線判斷出四種米糠分級蛋白分子量分布，分離組分經(jīng)高效液相色譜法測定后，通過分子量分子量標準曲線確定出米糠蛋白組分的分子量范圍見表2。

以上列舉的僅是本發(fā)明的一些具體實施例，顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形，本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。

項目資助：國家自然科學基金30870553；國家國際科技合作項目2010dfa34370；浙江省國際科技合作專項2013c14012。