專利名稱：用于發(fā)酵米糠和麩皮提取液生產(chǎn)灰樹花多糖的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株適合在米糠和麩皮提取液復(fù)合培養(yǎng)基中生長并高產(chǎn)灰樹花多糖的一株灰樹花誘變新菌株。
背景技術(shù)：
國內(nèi)外科學(xué)研究和國內(nèi)市場表明食用菌多糖能增強人體免疫力，輔助治療腫瘤等疾病，已成為腫瘤生物療法選用的輔助用品。國內(nèi)由食用菌子實體制成的藥字號產(chǎn)品有安徽蕪湖的靈芝膠囊、浙江慶元的灰樹花膠囊等，由食用菌提取物制成的非藥字號保健品也有銷售。國際上新西蘭產(chǎn)有“GanoPoly”(甘諾寶力)多糖提取物系列產(chǎn)品，銷往美國、澳大利亞、中國(包括香港和臺灣)等地方。該產(chǎn)品的發(fā)明人高益槐是國際知名食用菌產(chǎn)品開發(fā)專家，曾經(jīng)獲得愛因斯坦發(fā)明獎。高益槐發(fā)明的“GanoPoly”系列產(chǎn)品主要由靈芝、云芝、猴頭等提取的多糖與殼聚糖一道復(fù)合構(gòu)成，用于提高免疫力、輔助抗腫瘤治療 等。新西蘭安發(fā)保健品有限公司現(xiàn)在中國福建泉州建有食用菌多糖的生產(chǎn)基地。在各種食用菌多糖的研究中，現(xiàn)在已有研究說明，藥食兩用食用菌灰樹花的多糖也具有較好的提高免疫力、輔助抗腫瘤治療等的功效，值得引起足夠的重視，例如Ohno Naohito、SuzukiIwao等從灰樹花菌體中提取灰樹花多糖的藥效試驗表明，灰樹花多糖具有抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)作用(參考文獻見① Ohno N, Lino K, Suzuki I et al. Neutral and acidicant I tumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of LrrifolaFrondosa[J]. Chem. Pharm. Bull, 1985，33(3):1181-1186 ;② Naohito Ohno, YoshiyukiAdachi, Iwao Suzuki,et al. Characterization of the antiumor glucan obtainedfrom liquid-cultured Grifola frondosa [J].Chem. pharm. Bull. 1986, 34(4):1709 ；③Iwao Suzuki, Koichi Hashimoto, Shozo Oikawa, et al. Antiumor and immunmodulatingactivity of a β -glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa [J].chem. Pharm Bull,1986,37 (2):410.)?；覙浠?Cri/b/a /roflt/iosa)是ー種藥食兩用的食用菌,屬擔子菌亞門，層菌綱,無隔擔子菌亞綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花屬?；覙浠ㄓ卸喾N名稱，如貝葉多孔菌、千佛菌、栗子蘑、蓮花菌、奇果菌、舞茸等。野生灰樹花分布于日本、歐洲、北美和我國許多地區(qū)，如黑龍江、吉林、河北、四川、云南、廣西、福建等省區(qū)。近年來，國內(nèi)灰樹花已在一些省份如河北、浙江、福建等省獲得栽培，用于鮮食或提取功能成分?；覙浠ㄔ耘嗟娜秉c是占用土地，生產(chǎn)周期相對較長。為高效生產(chǎn)灰樹花多糖，研究人員對能エ廠化生產(chǎn)的液體培養(yǎng)方法的研究十分重視，形成多種研究成果。1986年Ohno N等報道了灰樹花液態(tài)培養(yǎng)的研究。國內(nèi)江南大學(xué)陳石良的博士論文研究了灰樹花深層發(fā)酵技術(shù)及灰樹花的抗腫瘤多糖(參考文獻見陳石良.藥用真菌灰樹花深層發(fā)酵技術(shù)及其抗腫瘤多糖的研究[D].博士學(xué)位論文.無錫江南大學(xué)，2000.)。這類研究的內(nèi)容主要涉及培養(yǎng)基研制、培養(yǎng)エ藝、適宜菌種選育等。研究的重點是降低生產(chǎn)成本和提高多糖產(chǎn)量。多數(shù)エ藝采用葡萄糖、糧食類原料如淀粉、馬鈴薯等作為培養(yǎng)基，即使用到農(nóng)產(chǎn)品加工的副產(chǎn)品如米糠或麩皮，也是作為次要成分加入，一般還是以葡萄糖、糧食類原料或其他原料為主要碳源或氮源?，F(xiàn)有的灰樹花菌種難以在不添加葡萄糖或其他糧食類原料的米糠或麩皮的培養(yǎng)基上生長。本專利的設(shè)計人劉偉民、張建曾對原有灰樹花菌種進行過初步微波-紫外復(fù)合誘變的處理，其誘變菌株在米糠、麩皮培養(yǎng)基上(不添加葡萄糖)液體發(fā)酵產(chǎn)灰樹花多糖效果較好，菌絲干重和多糖較原有菌株分別提高39. 24%和42. 58%，并提交了中國發(fā)明專利申請，申請專利的名稱是用于米糠和麩皮復(fù)合原料生產(chǎn)多糖的灰樹花菌株，申請?zhí)枮?01010579078. 5。盡管該菌株生產(chǎn)的多糖較實驗室原有的菌株生產(chǎn)的多糖有較大的提高，但誘變菌種會退化，從穩(wěn)定誘變菌種、提高生產(chǎn)效率的角度而言，不斷誘變菌種，獲得更高的多糖產(chǎn)量仍是需要不斷研究的問題和更高的發(fā)明創(chuàng)造的目標。另外，申請?zhí)枮?01010579078. 5的灰樹花菌株比較適合的發(fā)酵エ藝是需要對米糠和麩皮先進行植物纖維酶的酶解，提供發(fā)酵所需的碳源，但引入酶解エ藝會増加生產(chǎn)成本。如果誘變出高效灰樹花菌株，在沒有先期酶解的情況下，也能高效轉(zhuǎn)化米糠和麩皮，則將達到創(chuàng)新的效果，本發(fā)明瞄準此目標，進行灰樹花菌種的新誘變，以求獲得新的生產(chǎn)灰樹花多糖的高效菌株。中國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)副產(chǎn)品來源豐富。米糠、麩皮作為稻谷和小麥加工的副產(chǎn)物，不但其營養(yǎng)成分豐富，而且價格低廉。米糠中富含淀粉、纖維素等物質(zhì)，而麩皮富含蛋白 、纖維素等物質(zhì)。從理論上講，米糠和麩皮復(fù)合已經(jīng)具備了灰樹花生長所需要的碳源和氮源物質(zhì)。在灰樹花自身纖維素酶及其他酶的作用下，灰樹花可將米糠和麩皮轉(zhuǎn)化成自身的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長，生產(chǎn)灰樹花多糖。因此，運用米糠、麩皮等廉價農(nóng)副產(chǎn)品，完全替代葡萄糖等灰樹花液體發(fā)酵所需的營養(yǎng)物質(zhì)，生產(chǎn)具有輔助腫瘤治療的灰樹花多糖，將具有經(jīng)濟價值。其關(guān)鍵問題為必須得到適宜在米糠和麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長的灰樹花菌株，所以必須對已有菌株進行誘變篩選。如能篩選出適宜的灰樹花菌株，則研究和生產(chǎn)將有可能取得突破。目前微生物的物理選育方法主要有紫外誘變、離子束誘變、微波誘變等。本發(fā)明在實驗室已有的菌株JSUlO (即發(fā)明人已擁有的上述已申請專利的菌株)的基礎(chǔ)上采用原生質(zhì)體激光誘變方法，進ー步誘變得到適合在米糠和麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)灰樹花多糖的高效菌株，所得菌株為首次發(fā)明得到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，為了進一歩降低生產(chǎn)成本，考慮采用大宗農(nóng)產(chǎn)品稻谷和小麥等加工的副產(chǎn)品米糠和麩皮作為培養(yǎng)基，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，進行液體發(fā)酵，以節(jié)約原料成本、減少使用土地和縮短生產(chǎn)周期，但實現(xiàn)這一目標仍需要誘變篩選出在米糠麩皮提取液培養(yǎng)基中適宜生長的灰樹花菌株。因此，為實現(xiàn)上述目的，在自然選育之外，通過不同的生物技術(shù)手段對灰樹花菌株進行誘變，篩選出適宜的高產(chǎn)菌株尤為重要。本發(fā)明將通過原生質(zhì)體激光誘變的方法，以高產(chǎn)多糖為指標，定向高效轉(zhuǎn)化米糠麩皮提取液為基礎(chǔ)，選育出高產(chǎn)、低成本的灰樹花菌株。通過一系列的穩(wěn)定性、遺傳性等篩選方法的建立，保證灰樹花的優(yōu)良性狀，為進一歩大規(guī)模利用低成本的米糠和麩皮生產(chǎn)高價值的灰樹花多糖奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供一種用于高效發(fā)酵米糠和麩皮提取液生產(chǎn)灰樹花多糖的灰樹花菌株 Grifola sp. JSU10-2,該灰樹花菌株 Grifola sp. JSU10-2 已經(jīng)于 2011 年 4 月 7 日保藏在中國武漢的武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC )，保藏菌株編號為CCTCCM2011113，名稱為Cri/bh sp. JSU 10_2。該菌株可以在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮提取液培養(yǎng)基中具有高生長速率和高多糖產(chǎn)量的灰樹花變株；
在本發(fā)明的ー個方面中，提供上述灰樹花菌株fri/bh sp. JSU10-2的用途，用于發(fā)酵米糠和麩皮提取液復(fù)合培養(yǎng)基生產(chǎn)灰樹花多糖。本發(fā)明的有益效果
國內(nèi)外采用原生質(zhì)體激光誘變技術(shù)選育灰樹花高產(chǎn)菌株鮮見報道，針對不加其他碳源和氮源的米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基進行原生質(zhì)體激光的灰樹花誘變選育未見報道，故本發(fā)明由實驗室現(xiàn)有的菌株fri/bh sp. CGMCC4179為出發(fā)菌株進行原生質(zhì)體激光誘變，以生長速率、菌絲干重和菌絲多糖為指標進行篩選，最終獲得在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮提取液復(fù)合培養(yǎng)基中較出發(fā)菌株生長速度更快，多糖產(chǎn)量更高的誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10-2，其菌絲干重和菌絲多糖比已經(jīng)提交發(fā)明專利申請的Cri/bh sp. CGMCC4179菌株又分別提高了 31. 7和32. 6%，同時米糠和麩皮不用酶解處理，節(jié)約了酶的使用成本，獲得了顯著的效果。本發(fā)明的創(chuàng)新不加其他碳源和氮源的米糠麩皮提取液液復(fù)合培養(yǎng)基技術(shù)；在Grifola sp. CGMCC4179菌株基礎(chǔ)上，得到在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮未用酶解的提取液復(fù)合培養(yǎng)基上生長速度更快、多糖產(chǎn)量更高的誘變新菌株Cri/bh sp. JSU 10-2,使得本發(fā)明具有明顯的經(jīng)濟效益，節(jié)約原料成本、減少使用土地和降低生產(chǎn)周期，生產(chǎn)出高價值的具有輔助抗腫瘤治療效果的灰樹花多糖。該方法使用原生質(zhì)體激光誘變法誘變并篩選實驗室現(xiàn)有的sp. CGMCC4179灰樹花菌種，進ー步得到具有高生長速率和高多糖產(chǎn)量的突變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2，所得菌株適合在米糠和麩皮未用酶解的提取液復(fù)合培養(yǎng)基中快速生長并高產(chǎn)灰樹花多糖，其液體發(fā)酵的菌絲干重和多糖較出發(fā)菌株分別提高了 31. 7%和32. 6%?；覙浠ǘ嗵蔷哂休o助抗腫瘤治療的價值，使得灰樹花已經(jīng)成為ー種重要的藥用真菌，但灰樹花多糖大規(guī)模生產(chǎn)依然要面對成本高、產(chǎn)量低等一系列問題?；诖耍景l(fā)明解決了ー個技術(shù)問題提供一株在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮未用酶解的提取液復(fù)合培養(yǎng)基中生長速度更快、多糖產(chǎn)量更高的灰樹花誘變菌株Grifola sp.JSU 10-2，所述誘變株是由實驗室現(xiàn)有的灰樹花菌株Cri/bh sp. CGMCC4179采用原生質(zhì)體激光誘變技術(shù)選育，所述誘變株fri/bh sp. JSU 10-2在相同條件下菌絲干重較出發(fā)菌IGrifola sp. CGMCC4179 提高了 31. 7%，多糖產(chǎn)量較出發(fā)菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179提高了 32. 6%，并經(jīng)過拮抗試驗、蛋白電泳譜圖比、酯酶同エ酶電泳譜圖比對和過氧化物酶同エ酶電泳譜圖比對證明誘變后的菌株fri/bh sp. JSU 10-2與出發(fā)菌株Cri/bh sp.CGMCC4179遺傳特性和發(fā)酵性能不同，從而得到了新的菌株，產(chǎn)生了有益的效果。


圖I為本發(fā)明菌株原生質(zhì)體激光誘變選育方法的流程 戰(zhàn)2%Grifola sp. JSU 10-2與出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的拮抗圖，其中注左邊為 Cri/b7a sp. JSU 10_2、右邊為出發(fā)菌株sp. CGMCC4179 ；
圖3為蛋白電泳譜圖，注I. Marker ；2.出發(fā)菌株Grifola sp. CGMCC4179 ；3.Grifola sp. JSU 10-2 ； 4. JSU10-1 (另ー種誘變方法獲得的多糖產(chǎn)量不及本發(fā)明Grifola sp. JSU 10-2 的菌株)；
圖4為酯酶同エ酶電泳譜圖，注I.出發(fā)菌株fri/bh sp. CGMCC4179 ；2. Grifolasp. JSU 10-2 ；3. JSU10-1 ；
圖5為過氧化物酶同エ酶電泳譜圖，注I.出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179 ；2.Grifola sp. JSU 10-2 ;3. JSU10-1。
具體實施例方式本發(fā)明按照說明書附圖I所示的流程，提供了原生質(zhì)體激光誘變選育在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮復(fù)合培養(yǎng)基上具有高生長速率和高多糖產(chǎn)量的灰樹花菌株的方法，所述方法包括下列步驟 取實驗室現(xiàn)有的灰樹花sp. CGMCC4179為出發(fā)菌株；
將灰樹花菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上進行恒溫培養(yǎng)；
菌體長成后接種于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到灰樹花種子液；
將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵得到灰樹花菌絲體；
純化菌絲體；
制備及純化原生質(zhì)體；
將上述得到的原生質(zhì)體懸液在激光下照射進行誘變后，無光暗培養(yǎng)，一次篩選出生長速率較快、比較穩(wěn)定的菌株；
在米糠、麩皮液體發(fā)酵培養(yǎng)基上進行發(fā)酵，二次篩選出高生長速率和高多糖產(chǎn)量的菌
株;
進行穩(wěn)定性和遺傳性分析與鑒定；
在一個實施方案中，所用的固體斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸ニ氫鉀I. 5g/L，硫酸鎂O. 75g/L，維生素B1 10mg/L，瓊脂20g/L, pH自然。在一個實施方案中，所述恒溫為28°C。在一個實施方案中，所述液體種子培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L,磷酸ニ氫鉀I. 5g/L,硫酸鎂O. 75g/L,維生素B1 10mg/L, pH自然。在一個實施方案中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠20g/L，麩皮30g/L (米糠、麩皮沸水煮3h后去渣取汁)，磷酸ニ氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.75g/L，維生素BilOmg/し pH自然，250mL錐形瓶中分裝IOOmL培養(yǎng)液，O. IMPa條件下滅菌30min。在一個實施方案中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為在250mL三角瓶中裝IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種10%，在28°C、150r/min條件下培養(yǎng)七天。在一個實施方案中，所述純化菌絲體方法為用滅菌的紗布過濾收集菌絲，依次用無菌水、O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑多次洗滌，3500r/min離心20min，棄去上清液，用滅菌濾紙吸干菌絲體水分。在一個實施方案中，所述制備及純化原生質(zhì)體方法為加酶量按每300mg濕菌絲體加ImL酶解液，室溫下以lOOr/min水浴振蕩酶解3h。酶解結(jié)束后，用滅菌的G3砂芯漏斗過濾除去殘留的菌絲碎片，3000r/min離心IOmin,去上清液,沉淀用滲透壓穩(wěn)定劑清洗離心兩次后，得到純化的原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋成懸液數(shù)。
在一個實施方案中,所述酶解液為復(fù)合植物水解酶Viscozyme L (丹麥諾維信公司生產(chǎn)，對購得的纖維素酶進行濾紙酶活力測定，F(xiàn)PU酶活=1590. 41 IU/mL)，用O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑配制成濃度為3%的高滲酶解液，儲存于4°C冰箱中，用之前用滅菌的O. 45 μ m微孔膜過濾除菌。在一個實施方案中，所述原生質(zhì)體激光誘變?yōu)閷⑺频玫脑|(zhì)體懸液調(diào)整到適當濃度，取ImL原生質(zhì)體懸液置于I. 8mL凍存管中，在LJL40-HA型氦氖激光治療機上使凍存管與氦氖激光光源照射方向垂直，凍存管距光源3cm，照射時間60min。在一個實施方案中，誘變結(jié)束后吸取O. 2mL涂布于米糠麩皮再生篩選培養(yǎng)基平板上，在28°C避光再生培養(yǎng)4天。在一個實施方案中，所述無光暗培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為米糠麩皮再生平板培養(yǎng)基米糠20g/L (100°C水煮3小時全米糠)，麩皮30g/L (同米糠)，磷酸ニ氫鉀1.5g/L，硫酸鎂
O. 75g/L,維生素B1 10mg/L,瓊脂20g/L,pH自然,用O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑配制。在一個實施方案中，所述篩選方法為平板直徑測定法。在一個實施方案中，所述一次篩選步驟為取原生質(zhì)體激光照射懸液O. 2ml，用無菌玻璃涂棒均勻地涂滿米糠麩皮篩選培養(yǎng)基平板表面，每批涂4個平皿，待單菌落長成后選10株生長速度快且濃密的誘變菌株接種至新的篩選培養(yǎng)基平板上，在28°C恒溫箱中培養(yǎng)約3天，制備種子液，發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體，制取新的原生質(zhì)體懸液，進行第二批誘變。如此連續(xù)誘變5批，最后挑選出25株較優(yōu)良誘變株，對其傳代培養(yǎng)，以菌絲生長速率為指標進行篩選，從中選出4株生長速度相對較快、形狀較好、穩(wěn)定性較高的變異株。在一個實施方案中，所述二次發(fā)酵篩選步驟為一次生長確定的較優(yōu)良變異株作為二次篩選的對象，與出發(fā)菌株一起進行二次發(fā)酵篩選從而確定變異株優(yōu)良性狀穩(wěn)定表達的菌株。將一次篩選菌株和出發(fā)菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，連續(xù)發(fā)酵5代，按指標確定目的誘變株。在一個實施方案中，所述搖瓶為250mL錐形瓶。在一個實施方案中，所述米糠、麩皮液體發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠20g/L，麩皮30g/L(米糠、麩皮水煮3h取汁)，磷酸ニ氫鉀I. 5g/L，硫酸鎂O. 75g/L，維生素B1 10mg/L,pH自然。在一個實施方案中，所述指標為菌絲多糖和菌絲干重。本發(fā)明中轉(zhuǎn)化米糠和麩皮復(fù)合原料的灰樹花突變株的分析鑒定方法，所述方法包括下列步驟
種子液形態(tài)比對；
穩(wěn)定性分析；
遺傳性分析。在一個實施方案中，所述為種子液形態(tài)比對，將斜面上的出發(fā)灰樹花菌株Cri/bhsp. CGMCC4179和Cri/bh sp. JSU 10_2菌株接種到液體種子培養(yǎng)基內(nèi)，在28°C恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)5天，觀察包括液體(清澈度、黏度)、菌球(大小、密度)、菌絲(長度、斷裂現(xiàn)象)和
香味等。在一個實施方案中，所述穩(wěn)定性分析為以菌絲生長速度為指標考察穩(wěn)定性,對最終篩選出4株較優(yōu)的變異菌株，經(jīng)5次傳代，選出最優(yōu)的fri/bh sp. JSU 10-2菌株，并與出發(fā)菌株sp. CGMCC4179對比。
在一個實施方案中，所述遺傳性分析包括拮抗分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量(Mr)、酯酶同エ酶同エ酶電泳分析和過氧化物酶同エ酶電泳分析。實施例I灰樹花原生質(zhì)體激光誘變 a.滲透壓穩(wěn)定劑的配制
O.6mol/L的甘露醇。b.酶解液的 配制
復(fù)合植物水解酶Viscozyme L(丹麥諾維信公司生產(chǎn)，對購得的纖維素酶進行濾紙酶活力測定，F(xiàn)PU酶活=1590. 41 IU/mL):用O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑配制成濃度為3%的高滲酶解液，儲存于4°C冰箱中，用之前用滅菌的O. 45 μ m微孔膜過濾除菌。c.菌絲的培養(yǎng)和純化
用米糠麩皮培養(yǎng)基作為出發(fā)菌株培養(yǎng)基，在250mL三角瓶中裝IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種10%,在28°C、150r/min條件下培養(yǎng)七天得菌絲體。用滅過菌的紗布過濾收集菌絲，依次用無菌水、O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑多次洗漆，3500r/min離心20min,棄去上清液,用滅菌濾紙將菌絲體水分吸干。d.原生質(zhì)體的制備和純化
加酶量按每300mg濕菌絲體加ImL酶解液，室溫下以100r/min水浴振蕩酶解3h。酶解結(jié)束后，用滅菌的G3砂芯漏斗過濾除去殘留的菌絲碎片，3000r/min離心lOmin，去上清液，沉淀用滲透壓穩(wěn)定劑清洗離心兩次后，得到純化的原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋成懸液。e.原生質(zhì)體激光誘變
將所制得的原生質(zhì)體懸液調(diào)整到適當濃度，取ImL原生質(zhì)體懸液置于I. SmL凍存管中，光源照射方向與管體垂直，距凍存管3cm，照射時間60min。誘變結(jié)束后吸取O. 2mL涂布于米糠麩皮再生培養(yǎng)基平板上，在28°C避光再生培養(yǎng)4天。f.誘變菌株的篩選
取激光照射的原生質(zhì)體懸液O. 2mL，用無菌玻璃涂棒均勻地涂滿米糠麩皮再生篩選培養(yǎng)基平板表面，每批涂4個平皿，待單菌落長成后選10株生長速度快且濃密的誘變菌株接種至新的篩選培養(yǎng)基平板上，在28°C恒溫箱中培養(yǎng)約3天，制備種子液，發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體，制取新的原生質(zhì)體懸液，進行第二批誘變。如此連續(xù)誘變5批，挑選出25株較優(yōu)良誘變株，對其傳代培養(yǎng)，以菌絲生長速率為指標進行篩選，從中選出4株生長速度相對較快、形狀較好、穩(wěn)定性較高的變異株。將上述灰樹花誘變株進行五代平板傳代試驗(以菌絲生長速度為指標考察穩(wěn)定性)和五代搖瓶發(fā)酵試驗(以菌絲多糖、菌絲干重為指標)，篩選出目的誘變株fri/bh sp.JSU 10-2。表I選出菌株各代生長速度
_各代生長速度(ητη%)_
蓓_號_第—！代第2代第3代第4代第5代
Grifola ψ CCMCC4119 0—348O SI 0^70 O 904
CCTCC M201HB1.000 0.902 0.83 0.882 O 925表2變異菌株各代發(fā)酵菌絲體多糖 表3變異菌株各代發(fā)酵菌絲干重
從表中I中看出誘變菌株fri/bh sp. JSU 10-2各代的生長速度均高于出發(fā)菌IGrifola sp. CGMCC4179，其生長速度在第三代稍有退化，但并不很明顯，經(jīng)過適應(yīng)階段后生長速度有所提高，到第五代生長速度為0.925mm/h，高于出發(fā)菌株Cri/bh sp.CGMCC4179。從表2和3中看出誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2菌絲多糖及干重產(chǎn)量相對穩(wěn)定，均高于出發(fā)菌株，其第五代菌絲多糖和干重產(chǎn)量分別提高了 28. 9%和12. 9%，菌株于2011年4月15日保藏在位于中國武漢的武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株編號為 CCTCC No:M2011113，名稱為 Cri/bh sp. JSU 10-2。試驗ー變異菌株的分析
I、種子液形態(tài)學(xué)比對將斜面上的出發(fā)灰樹花菌株Cri/bh sp. CGMCC4179和Cri/bh sp. JSU 10_2菌株接種到液體種子培養(yǎng)基內(nèi)，在28°C恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)5天，觀察包括液體(清澈度、黏度)、菌球(大小、密度)、菌絲(長度、斷裂現(xiàn)象)和香味等現(xiàn)象。結(jié)果為變異菌株的種子液與Grifola sp. CGMCC4179差異較大，變異菌株液體清澈度較sp. CGMCC4179差，液體黏度較大；菌球大小比sp. CGMCC4179小，密度比Cri/bh sp. CGMCC4179大；菌絲長度稍短于Cri/bh sp. CGMCC4179，有輕微的斷裂現(xiàn)象；均有濃郁的令人愉悅的香味。、穩(wěn)定性分析
以菌絲生長速度為指標考察穩(wěn)定性，對最終篩選出25株較優(yōu)的變異菌株，經(jīng)3次傳代，選出較優(yōu)的4株菌株，將4株變異菌株進行五代平板傳代試驗(以菌絲生長速度為指標考察穩(wěn)定性)選出目的菌株Cri/bh sp. JSU 10-2，再將Cri/bh sp. JSU 10-2進行五代搖瓶發(fā)酵試驗(以菌絲多糖、菌絲干重為指標考察穩(wěn)定性)，從而確定目的誘變株Grifola sp.JSU 10-2的穩(wěn)定性，其結(jié)果已經(jīng)示于上述表I、表2、表3。誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2各代的生長速度均高于出發(fā)菌株，其生長速度在第三代稍有退化，但并不很明顯，經(jīng)過適應(yīng)階段后生長速度有所提高，到第五代生長速度為O. 925mm/h，高于出發(fā)菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179。誘變菌株 Cri/bh sp. JSU 10-2 菌絲多糖及干重產(chǎn)量相對穩(wěn)定，均高于出發(fā)菌株，其第五代菌絲多糖和干重產(chǎn)量分別提高了28. 9%和12.9%。由此可見灰樹花經(jīng)原生質(zhì)和激光誘變后產(chǎn)生的性狀變異可以遺傳。、遺傳性分析(I) 拮抗性分析
把同樣大小的變異菌株和出發(fā)菌株sp. CGMCC4179的菌塊接種在同一 PDA平板上，兩菌株相距一定的距離，放在28°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后觀察菌落間的拮抗現(xiàn)象。不同種的食用菌菌絲在生長發(fā)育中，菌絲會相互限制對方的生長蔓延，產(chǎn)生拮抗，在交界處形成拮抗線，這就是拮抗現(xiàn)象。拮抗現(xiàn)象不僅在食用菌的不同種間存在，而且在同種但遺傳特性有差異的菌株之間也存在，菌株之間拮抗作用的強弱反映了菌株間遺傳差異性的大小，因此拮抗現(xiàn)象不僅可以用于判斷菌株間的親緣關(guān)系，而且可以用于育種，鑒定菌株是否產(chǎn)生變異。本試驗將出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179與變異菌株接于同一平板上產(chǎn)生了一定的拮抗，從說明書附圖2可以看出左邊變異菌株fri/bh sp. JSU 10-2的生長形態(tài)發(fā)生了一定的變化，其菌絲生長致密，生長速度明顯快于右邊的出發(fā)菌株，且與出發(fā)菌株形成了拮抗線，說明了出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179和變異菌株Cri/bh sp. JSU10-2產(chǎn)生了遺傳差異性。(2) 電泳分析
電泳分析試驗包含三部分SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量(MJ、酯酶同エ酶同エ酶電泳分析和過氧化物酶同エ酶電泳分析。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量(Mr) ①蛋白提取
稱取米糠麩皮培養(yǎng)基上生長并干燥后的菌絲O. 5g，加6mL緩沖液(內(nèi)含O. 065mol/L Tris-檸檬酸，pH8.2)，_20°C下冷凍24h，置于研缽中，冰浴下研磨成糊狀，4°C下離心(10000r/min, lOmin)，取上清液放于4°C冰箱保存?zhèn)溆?上清液保存時間超過15小時須重
新配置)。②貯液配制
Ars/Bis貯液配制稱取150g丙烯酰胺和4g雙丙烯酰胺置于洗凈烘干的燒杯中，カロ300mL重蒸水，用干凈玻璃棒攪勻溶解，將溶液定容在500mL容量瓶內(nèi)，盛于棕色瓶中放在4 °C冰箱中避光保存。I. 5mol/L Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8· 8)貯液:稱取 90. 75 Tris 放入 500mL 燒杯中，加蒸餾水400mL溶解，用lmol/L鹽酸調(diào)pH值至8. 8，倒入500mL容量瓶中，加蒸餾水定容到500mL，盛于試劑瓶中放在4 V冰箱中避光保存。0. 5mol/L Tris-HCl 緩沖液(ρΗ6· 8)貯液:稱取 12g Tris 放入 IOOmL 燒杯中，加蒸餾水溶解，用lmol/L鹽酸調(diào)pH值至6. 8，倒入200mL容量瓶中，加蒸餾水定容到200mL，盛于試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。10%過硫酸銨稱取0. 5g過硫酸銨溶于50mL重蒸水中，盛于棕色試劑瓶中，現(xiàn)配先用。I X Tris-甘氨酸電極緩沖液貯液稱取3. 025g Tris、18. 75g甘氨酸、IgSDS用于IOOOmL蒸餾水中。IXSDS 上樣緩沖液50mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)、20%SDS、0. 1% 溴酚藍、10% 甘油、IOOmM DTT (現(xiàn)加)，保存于一20°C冰箱。即用時每O. 5 mL上樣緩沖液加O. 0072g DTT。1%溴酚藍溶液稱0. 5g溴酚藍加重蒸水50mL溶于滴瓶內(nèi)備用。TEMED溶液直接用原液，小瓶分裝，避免揮發(fā)。染色液甲醇450mL,冰こ酸IOOmL,雙蒸水450mL,考馬斯亮藍R-250 2. 5g。脫色液冰こ酸75mL，甲醇50M1，加蒸餾水定容道1000mL。保存液7%的醋酸溶液。③凝膠配制(現(xiàn)配先用)
5% 濃縮膠組成為Tris-HCl 緩沖液(pH6. 8) 2. 50mL、Ars/Bis 貯液 I. 7mL、10%AP0. 15mL、TEMED6PL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 5. 60mL。10% 分離膠組成為Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8· 8)2. 50mL,Ars/Bis 貯液 3. 25mL、10%AP0. 10mL、TEMED4KL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 4. 25mL。
④操作步驟
A.電泳
a.將玻璃板洗浄、晾干、固定。b.配制分離膠，將分離膠注入玻璃板夾層中至玻璃板上端約Icm處，緩緩注入約ImL正丁醇封于分離膠之上，保持膠面平整。放在37°C恒溫條件下靜止30-60min，直到分離膠層與正丁醇之間形成平直清晰的界面。c.配制濃縮膠，傾斜倒出分離膠表面正丁醇(也可用濾紙吸取)，以濃縮膠緩沖液淋洗分離膠上端空腔2 3次，吸干，插點樣梳于兩玻璃板夾縫中，灌注濃縮膠，沒過梳子。d.室溫放置約60min，待濃縮膠凝固后迅速拔出梳子，用ΙΟΟμ 微量注射器抽取電極緩沖液清洗加樣孔。

e.將凝膠連同玻璃板從制膠器上取下，放入電泳儀下槽，先將上槽加入電極緩沖液，然后在下槽內(nèi)加入電極緩沖液(最高可至距平玻璃板上沿3mm處)。f.加樣
樣品預(yù)處理取50 μ 上樣緩沖液(現(xiàn)加O. 0072g DTT)和50 μ 樣品液，混勻，于沸水浴中加熱I 2min。進樣用微量注射器吸取樣品預(yù)處理液20μ ，插入樣品槽底部膠面上，推動樣品液進入樣品小槽底部，加樣畢，輕輕抽出進樣器。g.電泳
加樣完畢后靜止3min，使樣品完全沉入樣品槽底部，打開電源，開始穩(wěn)壓70V，待溴酚藍進入分離膠后加大電壓至120V，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部邊緣上約O. 5^1cm吋，即刻停止電泳。B.檢測蛋白
a.剝膠電泳結(jié)束后，放掉電極緩沖液，松開斜插板，取出玻璃膠室，在兩塊玻璃下角空隙內(nèi)用刀片背面輕輕撬動，除去濃縮膠，取出凝膠，并切角做記號。b.染色凝膠放入染色盤中，加適量染色液至液面完全覆蓋凝膠，將染色盤置于脫色搖床，室溫染色I 2h。c.脫色傾去染色液，用蒸餾水清晰凝膠幾次，加入脫色液，在脫色搖床上室溫脫色幾次至背景脫凈為止。d.保存脫色完成后將凝I父保存于7%的醋酸溶液中。⑤電泳圖譜分析
染色后的膠板用卡尺測量指示劑及各條酶帶的遷移距離，按式計算遷移率Rf值。Rf = —xl00%
‘ち
式中，A為酶帶遷移距離為指示劑遷移距離。圖譜見說明書附圖3。電泳分析結(jié)果為
從附圖3蛋白圖譜中可以看出，出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179有10條譜帶，分子量分別為 44，000,36, 900,31, 100,27, 100、21，700、20，600、17，300、16，500、15，500 和
14，200道爾頓，與Cri/bh sp. CGMCC4179相比較變異菌株Cri/bh sp. JSU 10-2在分子量44，000道爾頓位置上譜帶消失，而在分子量40，900道爾頓出現(xiàn)譜帯。說明誘變菌株遺傳特性相對于出發(fā)菌株發(fā)生了變化。聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析酯酶同エ酶 ①蛋白提取
稱取米糠麩皮培養(yǎng)基上生長并干燥后的菌絲O. 5g，加6mL緩沖液(內(nèi)含O. 065mol/L Tris-檸檬酸，pH8.2)，_20°C下冷凍24h，置于研缽中，冰浴下研磨成糊狀，4°C下離心(10000r/min, lOmin)，取上清液放于4°C冰箱保存?zhèn)溆?上清液保存時間超過15小時須重
新配置)。
②貯液配制
Ars/Bis貯液配制稱取150g丙烯酰胺和4g雙丙烯酰胺置于洗凈烘干的燒杯中，カロ300mL重蒸水，用干凈玻璃棒攪勻溶解，將溶液定容在500mL容量瓶內(nèi)，盛于棕色瓶中放在4 °C冰箱中避光保存。I. 5mol/L Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8· 8)貯液:稱取 90. 75 Tris 放入 500mL 燒杯中，加蒸餾水400mL溶解，用lmol/L鹽酸調(diào)pH值至8. 8，倒入500mL容量瓶中，加蒸餾水定容到500mL，盛于試劑瓶中放在4 V冰箱中避光保存。O. 5mol/L Tris-HCl 緩沖液(ρΗ6· 8)貯液:稱取 12g Tris 放入 IOOmL 燒杯中，加蒸餾水溶解，用lmol/L鹽酸調(diào)pH值至6. 8，倒入200mL容量瓶中，加蒸餾水定容到200mL，盛于試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。10%AP :稱取0. 5g過硫酸銨溶于50mL重蒸水中，盛于棕色試劑瓶中，現(xiàn)配先用。I X Tris-甘氨酸電極緩沖液貯液稱取3. 025g Tris、18. 75g甘氨酸、IgSDS用于IOOOmL蒸餾水中。IXSDS 上樣緩沖液50mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)、20%SDS、0. 1% 溴酚藍、10% 甘油、IOOmM DTT (現(xiàn)加)，保存于一20°C冰箱。即用時每O. 5 mL上樣緩沖液加O. 0072g DTT。1%溴酚藍溶液稱0. 5g溴酚藍加重蒸水50mL溶于滴瓶內(nèi)備用。TEMED溶液直接用原液，小瓶分裝，避免揮發(fā)。染色液A :稱取IOOmg醋酸-α -萘酯和IOOmg醋酸-β _萘酷，分別用5mL丙酮溶解，溶解后的醋酸萘酯用0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6. 4)定容至100mL。染色液B 4%的鐵氰化鉀溶液(現(xiàn)配先用)。保存液7%的醋酸溶液。③凝膠配制(現(xiàn)配先用)
5% 濃縮膠組成為Tris-HCl 緩沖液(pH6. 8) 2. 50mL、Ars/Bis 貯液 I. 7mL、10%AP0. 15mL、TEMED6PL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 5. 60mL。10% 分離膠組成為Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8· 8)2. 50mL,Ars/Bis 貯液 3. 25mL、10%AP
0.10mL、TEMED4KL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 4. 25mL。④操作步驟 A.電泳
a.將玻璃板洗浄、晾干、固定。b.配制分離膠，將分離膠注入玻璃板夾層中至玻璃板上端約Icm處，緩緩注入約ImL正丁醇封于分離膠之上，保持膠面平整。放在37°C恒溫條件下靜止30-60min，直到分離膠層與正丁醇之間形成平直清晰的界面。
c.配制濃縮膠，傾斜倒出分離膠表面正丁醇(也可用濾紙吸取)，以濃縮膠緩沖液淋洗分離膠上端空腔2 3次，吸干，插點樣梳于兩玻璃板夾縫中，灌注濃縮膠，沒過梳子。d.室溫放置約60min，待濃縮膠凝固后迅速拔出梳子，用ΙΟΟμ 微量注射器抽取電極緩沖液清洗加樣孔。e.將凝膠連同玻璃板從制膠器上取下，放入電泳儀下槽，先將上槽加入電極緩沖液，然后在下槽內(nèi)加入電極緩沖液(最高可至距平玻璃板上沿3mm處)。f.加樣 樣品預(yù)處理取50 μ 上樣緩沖液(現(xiàn)加O. 0072g DTT)和50 μ 樣品液，混勻。進樣用微量注射器吸取樣品預(yù)處理液20μ ，插入樣品槽底部膠面上，推動樣品液進入樣品小槽底部，加樣畢，輕輕抽出進樣器。g.電泳
加樣完畢后靜止3min，使樣品完全沉入樣品槽底部，打開電源，開始穩(wěn)壓70V，待溴酚藍進入分離膠后加大電壓至120V，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部邊緣上約O. 5^1cm吋，即刻停止電泳。B.檢測蛋白
a.剝膠電泳結(jié)束后，放掉電極緩沖液，松開斜插板，取出玻璃膠室，在兩塊玻璃下角空隙內(nèi)用刀片背面輕輕撬動，除去濃縮膠，取出凝膠，并切角做記號。b.染色凝膠放入染色盤中，加適量染色液A至液面完全覆蓋凝膠，將染色盤置于脫色搖床，37°C保溫染色15 20min，棄去染色液A，用蒸餾水稍加漂洗，再用染色液B染色，直至顯出酶帯，待酶帶清晰后用蒸餾水沖洗干凈。C.保存染色完成后將凝膠保存于7%的醋酸溶液中。⑤電泳圖譜分析
染色后的膠板用卡尺測量指示劑及各條酶帶的遷移距離，按式計算遷移率Rf值。電泳分析結(jié)果為
從附圖4酯酶同エ酶圖譜可知，出發(fā)菌株Grifola sp. CGMCC4179和誘變菌株Grifolasp. JSU 10-2均有2條譜帶，位置分別為-.Rn=O. 292，Rf2=Q. 580。即誘變菌株JSU10-1相比出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的譜帶位置沒變，且酶帶條數(shù)也沒有變化，但誘變菌株Grifola sp. JSU 10-2 在/ =0· 292 處的酶帶比出發(fā)菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179 略深，在/^=O. 580處的酶帶比出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179略淺，即誘變后與誘變前菌株的酶活性不同，說明誘變菌株遺傳特性相對于出發(fā)菌株發(fā)生了變化。聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析過氧化物酶同エ酶 ①蛋白提取
稱取米糠麩皮培養(yǎng)基上生長并干燥后的菌絲O. 5g，置于預(yù)先在冰浴中冷卻的小研缽中，加樣品提取液(pH8. OTris-HCl緩沖液)6mL，冰浴下研磨成糊狀，4°C下離心(IOOOOr/min, lOmin)，取上清液放于4°C冰箱保存?zhèn)溆?上清液保存時間超過15小時須重新配置)。②貯液配制Ars/Bis貯液配制稱取150g丙烯酰胺和4g雙丙烯酰胺置于洗凈烘干的燒杯中，カロ300mL重蒸水，用干凈玻璃棒攪勻溶解，將溶液定容在500mL容量瓶內(nèi)，盛于棕色瓶中放在4 °C冰箱中避光保存。Tris-HCl緩沖液(pH8. 9)貯液稱取36. 8gTris放入燒杯中，用少量重蒸水溶解，加入48mLlmol/L HCl調(diào)pH值至8. 9后，定容至IOOmL,盛于試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。Tris-HCl緩沖液(pH6. 7)貯液稱取5. 98gTris放入燒杯中，用少量重蒸水溶解，加入48mLlmol/L HCl調(diào)pH值至8. 9后，定容至IOOmL,盛于試劑瓶中放在4°C冰箱中避光
保存。 10%AP :稱取O. 5g過硫酸銨溶于50mL重蒸水中，盛于棕色試劑瓶中，現(xiàn)配先用。O. 04g/L核黃素溶液稱取4mg核黃素溶于IOOmL重蒸水中，盛于棕色試劑瓶中，放入4°C冰箱，可保存一周。IOXTriS-甘氨酸電極緩沖液貯液(pH8. 3):稱取6g Tris、28. 8g甘氨酸用無離子水定容到IOOOmL,用時稀釋10倍。40%蔗糖溶液稱取蔗糖40g，加無離子水定容到IOOmL，4°C冰箱中避光保存。樣品提取液(pH8. OTris-HCl緩沖液):稱取12. Ig Tris加無離子水溶解，用Imol/L HCl調(diào)pH值至8. O后，定容至IOOOmL,盛于試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。0. 2%溴酚藍溶液稱取0. 2g溴酚藍溶于IOOmL無離子水中，放在4°C冰箱中保存。TEMED溶液直接用原液，小瓶分裝，避免揮發(fā)。染色液(聯(lián)苯胺染色液)稱取0. Ig聯(lián)苯胺溶于5mL無水こ醇中，加I. 5mol/LNaAc溶液IOmL, I. 5mol/LHAc溶液IOmL,蒸餾水70mL，用前滴加H2O2原液5滴(約250 μ L)。保存液7%的醋酸溶液。③凝膠配制(現(xiàn)配先用)
濃縮膠組成為=Tris-HCl 緩沖液(pH6. 7)0. 625mL、Ars/Bis 貯液 0. 7mL、10%AP 0. 25mL、TEMED1(^L、0. 04g/L 核黃素溶液 lmL、雙蒸水 2. 7mL。分離膠組成為Tris-HCl緩沖液(pH8. 9) I. 8mL、Ars/Bis 貯液 3. 5mL、10%AP0. 15mL、TEMED6PL、0. 04g/L 核黃素溶液 2mL、雙蒸水 7. 7mL。④操作步驟 A.電泳
a.將玻璃板洗浄、晾干、固定。b.配制分離膠，將分離膠注入玻璃板夾層中至玻璃板上端約Icm處，緩緩注入約ImL正丁醇封于分離膠之上，保持膠面平整。放在37°C恒溫條件下靜止30-60min，直到分離膠層與正丁醇之間形成平直清晰的界面。c.配制濃縮膠，傾斜倒出分離膠表面正丁醇(也可用濾紙吸取)，以濃縮膠緩沖液淋洗分離膠上端空腔2 3次，吸干，插點樣梳于兩玻璃板夾縫中，灌注濃縮膠，沒過梳子。d.室溫放置約60min，待濃縮膠凝固后迅速拔出梳子，用100μ 微量注射器抽取電極緩沖液清洗加樣孔。e.將凝膠連同玻璃板從制膠器上取下，放入電泳儀下槽，先將上槽加入電極緩沖液，然后在下槽內(nèi)加入電極緩沖液(最高可至距平玻璃板上沿3mm處)。
f.加樣
樣品預(yù)處理取一定量的樣品液和等量的40%蔗糖溶液混合，加總體積1/5的O. 2%的溴酚藍溶液(作為指示劑)，混勻。進樣用微量注射器吸取樣品預(yù)處理液30μ ，插入樣品槽底部膠面上，推動樣品液進入樣品小槽底部，加樣畢，輕輕抽出進樣器。g.電泳
加樣完畢后靜止3min，使樣品完全沉入樣品槽底部，打開電源，開始穩(wěn)壓70V，待溴酚藍進入分離膠后加大電壓至120V，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部邊緣上約O. 5^1cm吋，即刻停止電泳。
B.檢測蛋白
a.剝膠電泳結(jié)束后，放掉電極緩沖液，松開斜插板，取出玻璃膠室，在兩塊玻璃下角空隙內(nèi)用刀片背面輕輕撬動，除去濃縮膠，取出凝膠，并切角做記號。b.染色凝膠放入染色盤中，加適量染色液至液面完全覆蓋凝膠，將染色盤置于脫色搖床，37°C保溫染色30min，待酶帶清晰后倒去染色液，用蒸餾水沖洗干凈。c.保存染色完成后將凝膠保存于7%的醋酸溶液中。⑤電泳圖譜分析
染色后的膠板用卡尺測量指示劑及各條酶帶的遷移距離，按式計算遷移率Rf值。4='χ100%
χ2
式中，A為酶帶遷移距離為指示劑遷移距離。圖譜見說明書附圖5。電泳分析結(jié)果為
從附圖5過氧化物酶同エ酶圖譜可知，出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179和誘變菌IGrifola sp. JSU 10_2均有2條譜帶，位置分別為Wi7=O. 226，/ 〃=(). 555。即誘變菌株Grifola sp. JSU 10_2相比出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的譜帶位置沒變，且酶帶條數(shù)也沒有變化，但誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2在/ Λ=0. 226和/^=O. 555處的酶帶比出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179都淺，即誘變后與誘變前菌株的酶活性不同，說明誘變菌株遺傳特性相對于出發(fā)菌株發(fā)生了變化。試驗ニ突變菌株Cri/bh sp. JSU 10-2 和出發(fā)菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179 產(chǎn)量比較
液體發(fā)酵培養(yǎng)基為米糠120g/L，麩皮120g/L，米糠、麩皮常壓下95°C浸提3h后，去渣取汁，磷酸ニ氫鉀O. 2g/L,硫酸鎂O. lg/L,維生素Bpmg/L, pH自然。O. IMPa條件下滅菌30mino液體種子培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸ニ氫鉀I. 5g/L，硫酸鎂O. 75g/L，維生素B1 10mg/L, pH自然。裝樣量為發(fā)酵罐容積的80%，培養(yǎng)溫度為28°C，通風量為裝罐液體體積/mim，攪拌速度150r/min，罐表壓O. 05MPa,接種量8%，培養(yǎng)時間4d。稱重法測定菌絲干重，苯酚硫酸法測定菌絲多糖。將液體培養(yǎng)所得的菌絲體經(jīng)離心分離后，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風干燥箱中，在60°C條件下干燥至恒重，經(jīng)稱量即得菌絲干重。向烘干的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經(jīng)研磨后，在80°C水浴中浸提3h,3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白后,再用3倍體積的95%的こ醇溶液醇沉提取胞內(nèi)多糖，采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖。試驗結(jié)果為(I)突變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2和出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179在相同條件和培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌絲干重分別為10. 8g/L和8. 2g/L，突變菌株Grifola sp. JSU 10-2的菌絲干重較出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179發(fā)菌株的菌絲干重提高了 31. 7%。(2)突變菌lGrifola sp. JSU 10_2和出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179在相同條件和培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌絲多糖分別為I. 262g/L和O. 952g/L，突變菌株Grifola sp. JSU 10-2的菌絲多糖較出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的菌絲多糖提高了 32.6%。發(fā)酵試驗表明，突變菌株 Grifola sp. JSU 10-2和出發(fā)菌株Cri/bh sp. CGMCC4179相比，發(fā)酵性能發(fā)生了變化。
權(quán)利要求
1.用于發(fā)酵米糠和麩皮提取液生產(chǎn)灰樹花多糖的菌株Grifolasp. CCTCCM2011113。
2.權(quán)利要求I所述的灰樹花菌菌株sp.)的用途,其特征在于用于由米糠和麩皮提取液生產(chǎn)灰樹花多糖。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)和食品生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了用于發(fā)酵米糠和麩皮提取液生產(chǎn)灰樹花多糖的菌株。該灰樹花菌株已經(jīng)于2011年4月7日保藏在中國武漢的武漢大學(xué)內(nèi)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株編號為CCTCCNo:M2011113，名稱為Grifolasp.JSU10-2。本發(fā)明通過原生質(zhì)體激光誘變，得到了利用廉價原料高產(chǎn)菌絲多糖的菌株，該菌株和原始菌株分別液體發(fā)酵米糠和麩皮復(fù)合培養(yǎng)基，誘變菌株的菌絲干重和多糖分別比原始菌株提高了31.7%和32.6%。
文檔編號C12N1/14GK102816701SQ201110150888
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者劉偉民, 郭春梅, 張建, 徐立平, 顧慧敏, 任曉鋒, 李永轉(zhuǎn), 張志才, 崔鳳杰, 趙杰文, 沈國棟 申請人:江蘇大學(xué)