本發(fā)明是一種從富硒大米的米糠里提取硒蛋白的方法，屬于功能性食品深加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

中國(guó)是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)量約為1.85億噸，米糠(包括皮層和胚芽)作為大米加工的副產(chǎn)品，年產(chǎn)量超過(guò)一千萬(wàn)噸，可利用資源相當(dāng)豐富。米糠雖然只占稻米質(zhì)量的6％～8％，卻含有稻米中主要的營(yíng)養(yǎng)成分，有“天然營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”之稱。目前，米糠有效利用率尚不足20％，大部分作為飼料，甚至作為廢料，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。米糠蛋白質(zhì)中主要清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白，米糠蛋白質(zhì)中必需氨基酸齊全，生物效價(jià)較高。米糠蛋白質(zhì)還有一個(gè)最大的優(yōu)點(diǎn)即低過(guò)敏性，它是已知谷物中過(guò)敏性最低的蛋白質(zhì)。因此米粉是最常見(jiàn)的嬰幼兒輔助食品，從大米或米糠中提取的蛋白質(zhì)可作為低敏性蛋白質(zhì)原料用于嬰幼兒食品中。

硒(Selenium，Se)是在地殼中廣泛分布但相對(duì)稀有，已被證明為動(dòng)物和人體必需的微量元素之一。硒能提高人體的免疫力、清除自由基、保護(hù)視神經(jīng)、肝臟和心臟等，而且能防治糖尿病、心腦血管疾病、肝病、克山病大骨節(jié)病等重大疾病。硒在生物體內(nèi)主要有無(wú)機(jī)和有機(jī)兩種化學(xué)形態(tài)，無(wú)機(jī)硒包括硒化物、亞硒酸鹽、硒酸鹽等；有機(jī)形態(tài)硒主要以硒代氨基酸(Selenoaminoacid)和硒蛋白(Selenoprotein)等形式存在。無(wú)機(jī)硒很難被動(dòng)物和人體直接吸收利用，而機(jī)體可以通過(guò)腸壁的主動(dòng)運(yùn)輸吸收利用有機(jī)硒。已有動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)表明，由于無(wú)機(jī)硒有較大的毒性，且不易被吸收，不適合任何動(dòng)物安全使用。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)的營(yíng)養(yǎng)調(diào)查結(jié)果表明，中國(guó)成人每日的硒攝入量?jī)H26～32μg，而中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦日攝入量50～200μg，國(guó)際硒學(xué)會(huì)推薦成人每日硒攝入量60～400μg。我國(guó)有72％缺硒或低硒地區(qū)，這些地區(qū)的人們從當(dāng)?shù)厥澄镏袛z取的硒往往不夠，因此，補(bǔ)硒對(duì)于提高人民健康水平具有重大的意義。

根據(jù)已有的專利檢索，中國(guó)專利CN2012104947660中公開(kāi)了一種米糠硒蛋白粉的制備方法，該方法只使用較高濃度的NaOH溶液提取蛋白質(zhì)，但是由于使用較高的堿濃度，不僅影響到產(chǎn)品的風(fēng)味和色澤(提取物的顏色較深)，而且蛋白質(zhì)中的賴氨酸與丙氨酸或胱氨酸還會(huì)發(fā)生縮合反應(yīng)，生成有毒的物質(zhì)如賴氨酰丙氨酸，使蛋白質(zhì)變性水解(對(duì)腎臟有害)，喪失食用價(jià)值。該專利所得硒蛋白蛋白質(zhì)含量?jī)H為55～63％，硒含量?jī)H為0.17～0.28mg/kg。2014年專利“一種適宜中老年群體食用的富硒蛋白粉及其生產(chǎn)方法(20140104539.1)”公開(kāi)了富硒蛋白粉的生產(chǎn)，該專利是通過(guò)在原料中外加硒的方法實(shí)現(xiàn)，并不是天然有機(jī)硒。2014年專利“一種酶法處理富硒大米生產(chǎn)富硒蛋白粉的方法(201410690328.0)”公開(kāi)了使用酶來(lái)制備蛋白粉，雖然其反應(yīng)條件相對(duì)溫和，但酶容易失活，對(duì)反應(yīng)條件要求較高，提取時(shí)間較長(zhǎng)，且其工藝成本也很高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種從富硒大米糠中提取硒蛋白的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。通過(guò)配制堿提液來(lái)高效斷裂蛋白質(zhì)分子的二硫鍵再用酸調(diào)等電點(diǎn)使硒蛋白析出沉淀，獲得硒蛋白。解決了缺硒地區(qū)補(bǔ)硒的問(wèn)題，高效便捷地提取出了具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的米糠硒蛋白，可用作營(yíng)養(yǎng)輔料或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，具有較高的利用價(jià)值。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的從富硒大米糠中提取硒蛋白的方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的：

(1)原材料預(yù)處理：將新鮮富硒米糠用蒸餾水洗凈，放入烘箱烘干后，用礱谷機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，制得米糠粉。

(2)配液：配制濃度為0.01～0.05mol/L的氫氧化鈉溶液，將保險(xiǎn)粉和二硫蘇糖醇按質(zhì)量比為1∶2～1∶5混合加入到氫氧化鈉溶液中，以高效斷裂蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，保險(xiǎn)粉的用量為步驟(1)制得的米糠粉質(zhì)量的1％。

(3)超聲提?。簩⒉襟E(1)制得的米糠粉與步驟(2)配制提取液按質(zhì)量與體積1∶5～1∶15的比例混合，放入超聲波清洗機(jī)內(nèi)進(jìn)行超聲提取，大幅度提高提取效率，提取溫度35℃～45℃，超聲頻率100Hz，提取時(shí)間2～3小時(shí)，得超聲提取液。

(4)脫色：在超聲提取液中加入活性炭，用量10～30mg/ml，至澄清透明，得脫色提取液。

(5)離心：通過(guò)離心機(jī)3000～5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10～20min，得第一蛋白溶液。

(6)酸沉：用檸檬酸緩沖液調(diào)第一蛋白溶液pH至4.5～6.0，得第二蛋白溶液。

(7)再離心：第二蛋白溶液在3000～5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10～20min，收集沉淀，并用去離子水潤(rùn)洗數(shù)次，得第三蛋白溶液。

(8)除雜：將第三蛋白溶液裝入透析袋進(jìn)行透析，每2h更換透析液一次，去除鹽分和小分子雜質(zhì)，在透析袋內(nèi)得到硒蛋白。

(9)冷凍干燥：將硒蛋白放入-80℃冰箱預(yù)凍4～6h，放入真空冷凍機(jī)進(jìn)行干燥，干燥結(jié)束后即得富硒米糠蛋白粉。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明對(duì)富硒米糠進(jìn)行高效利用，提取出了具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的米糠硒蛋白，可用作營(yíng)養(yǎng)輔料或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，具有較高的利用價(jià)值。

(2)相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提取液的氫氧化鈉溶液濃度適中并混合了保險(xiǎn)粉和二硫蘇糖醇，高效斷裂二硫鍵，不產(chǎn)生賴氨酰丙氨酸，最大程度上保證了所提取的硒蛋白質(zhì)安全有價(jià)值。

(3)本發(fā)明蛋白質(zhì)提取率在80％以上，且提取的硒蛋白雜質(zhì)少，蛋白質(zhì)含量高達(dá)80％～95％，硒蛋白的硒含量高達(dá)0.50～0.58mg/kg，均顯著高于現(xiàn)有的提取技術(shù)。

(3)本發(fā)明選擇的原材料是天然富硒大米糠，提取的是天然谷物的有機(jī)硒蛋白，屬于廢物利用，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，綠色健康。相比無(wú)機(jī)硒，毒性大大降低，使用安全，吸收效果好。

(4)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，不使用酶，提取溫度范圍廣，提取效率高。條件溫和，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，易于工業(yè)推廣。

附圖說(shuō)明

圖1是從富硒大米糠中提取硒蛋白的工藝流程

圖2是溫度對(duì)硒蛋白提取率的影響

圖3是液固比對(duì)硒蛋白提取率的影響

圖4是提取時(shí)間對(duì)硒蛋白提取率的影響

圖5是氫氧化鈉濃度對(duì)硒蛋白提取率的影響

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體實(shí)施方式如下：

實(shí)施例1

(1)原材料與處理：將新鮮富硒米糠用蒸餾水洗凈，放入烘箱烘干；用礱谷機(jī)粉碎，過(guò)100目篩。

(2)配液：配制濃度為0.01mol/L的氫氧化鈉溶液，將保險(xiǎn)粉和二硫蘇糖醇按質(zhì)量比為1∶2混合加入到氫氧化鈉溶液中，保險(xiǎn)粉的用量為步驟(1)制得的米糠粉質(zhì)量的0.5％。

(3)超聲提?。簩⒉襟E(1)制得的米糠粉與步驟(2)配制提取液按質(zhì)量與體積1∶5的比例混合，放入超聲波清洗機(jī)內(nèi)進(jìn)行超聲提取，極大地提高提取效率，設(shè)定提取溫度35℃，超聲頻率100Hz，提取時(shí)間3小時(shí)，得超聲提取液。

(4)脫色：在超聲提取液中加入活性炭，用量10mg/ml，至澄清透明，得脫色提取液。

(5)離心：通過(guò)離心機(jī)3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，得第一蛋白溶液。

(6)酸沉：用檸檬酸緩沖液調(diào)解第一蛋白溶液pH至5.5，得第二蛋白溶液。

(7)再離心：第二蛋白溶液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，收集沉淀，并用去離子水潤(rùn)洗數(shù)次，得第三蛋白溶液。

(8)除雜：將第三蛋白溶液裝入透析袋進(jìn)行透析，每2h更換透析液一次，去除鹽和分和小分子雜質(zhì)，在透析袋內(nèi)得到硒蛋白。

(9)冷凍干燥：將硒蛋白放入-80℃冰箱預(yù)凍4h，放入真空冷凍機(jī)進(jìn)行干燥，干燥結(jié)束后即得富硒米糠蛋白粉。

將得到的硒蛋白粉的蛋白質(zhì)含量和其硒含量進(jìn)行測(cè)定，方法如下：

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.5-2010，采用凱氏定氮法測(cè)定，使用的凱氏定氮儀為Hanon公司的K-9860全自動(dòng)凱氏定氮儀。具體操作步驟如下：稱取充分混勻的固體試樣0.2g～2g、半固體試樣2g～5g或液體試樣10g～25g(約相當(dāng)于30mg～40mg氮)，精確至0.001g，移入干燥的消煮管中，加入0.2g硫酸銅(分析純)、6g硫酸鉀(分析純)及10mL硫酸(分析純)，輕搖后于瓶口放一小漏斗，放在石墨消解儀上小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h～1h。取下放冷，放冷后，放入自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)量蛋白質(zhì)含量。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

硒含量測(cè)定：根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.93-2010，采用氫化物原子熒光光譜法，使用的儀器是BOHUI公司的RGF-6800原子熒光光度計(jì)。具體操作步驟如下：稱取0.5g～2g(精確至0.001g)試樣，液體試樣吸取1.00mL～10.00mL，置于消煮管中，加10.0mL混合酸(硝酸與高氯酸9∶1混合)，蓋上小漏斗冷消化過(guò)夜。次日于石墨消解儀上加熱，并及時(shí)補(bǔ)加硝酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙時(shí)，再繼續(xù)加熱至剩余體積2mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5.0mL鹽酸(6mol/L)，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙出現(xiàn)，將六價(jià)硒還原成四價(jià)硒。冷卻，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，混勻備用。同時(shí)做空白試驗(yàn)。上樣測(cè)定時(shí)，先配制好標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)r達(dá)到0.999以上時(shí)，才開(kāi)始測(cè)定樣品。

采用上述方法提取米糠硒蛋白，測(cè)定的蛋白質(zhì)含量為80.13％，測(cè)定的硒含量為0.50mg/kg。

實(shí)施例2

(1)原材料與處理：將新鮮富硒米糠用蒸餾水洗凈，放入烘箱烘干；用礱谷機(jī)粉碎，過(guò)100目篩。

(2)配液：配制濃度為0.04mol/L的氫氧化鈉溶液，將保險(xiǎn)粉和二硫蘇糖醇按質(zhì)量比為1∶4混合加入到氫氧化鈉溶液中，增加二硫蘇糖醇的量，以提取更多蛋白。保險(xiǎn)粉的用量為步驟(1)制得的米糠粉質(zhì)量的0.5％。

(3)超聲提取：將步驟(1)制得的米糠粉與步驟(2)配制提取液按質(zhì)量與體積1∶10的比例混合，增加料液比，使提取更充分。再放入超聲波清洗機(jī)內(nèi)進(jìn)行超聲提取，提取溫度45℃，超聲頻率100Hz，提取時(shí)間3小時(shí)，得超聲提取液。

(4)脫色：在超聲提取液中加入活性炭，用量30mg/ml，至澄清透明，得脫色提取液。

(5)離心：通過(guò)離心機(jī)3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，得第一蛋白溶液。

(6)酸沉：用檸檬酸緩沖液調(diào)解第一蛋白溶液pH至5.5，得第二蛋白溶液。

(7)再離心：第二蛋白溶液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，收集沉淀，并用去離子水潤(rùn)洗數(shù)次，得第三蛋白溶液。

(8)除雜：將第三蛋白溶液裝入透析袋進(jìn)行透析，每2h更換透析液一次，去除鹽分和小分子雜質(zhì)，在透析袋內(nèi)得到硒蛋白。

(9)冷凍干燥：將硒蛋白放入-80℃冰箱預(yù)凍5h，增加了預(yù)凍時(shí)間，放入真空冷凍機(jī)進(jìn)行干燥，干燥結(jié)束后即得富硒米糠蛋白粉。

參照實(shí)例1的測(cè)定方法，測(cè)定提取的硒蛋白的蛋白質(zhì)含量為93.74％，測(cè)定的硒含量為0.55mg/kg。

實(shí)施例3

(1)原材料與處理：將新鮮富硒米糠用蒸餾水洗凈，放入烘箱烘干；用礱谷機(jī)粉碎，過(guò)100目篩。

(2)配液：配制濃度為0.05mol/L的氫氧化鈉溶液，將保險(xiǎn)粉和二硫蘇糖醇按質(zhì)量比為1∶5混合加入到氫氧化鈉溶液中，保險(xiǎn)粉的用量為步驟(1)制得的米糠粉質(zhì)量的0.5％。

(3)超聲提?。簩⒉襟E(1)制得的米糠粉與步驟(2)配制提取液按質(zhì)量與體積1∶15的比例混合，進(jìn)一步增加料液比，更加充分地提取硒蛋白。將混合液放入超聲波清洗機(jī)內(nèi)進(jìn)行超聲提取，進(jìn)一步調(diào)整最佳提取溫度設(shè)置為40℃，提高提取率，超聲頻率100Hz，提取時(shí)間3小時(shí)，得超聲提取液。

(4)脫色：在超聲提取液中加入活性炭，用量30mg/ml，至澄清透明，得脫色提取液。

(5)離心：通過(guò)離心機(jī)3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，得第一蛋白溶液。

(6)酸沉：用檸檬酸緩沖液調(diào)第一蛋白溶液pH至5.5，得第二蛋白溶液。

(7)再離心：第二蛋白溶液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，收集沉淀，并用去離子水潤(rùn)洗數(shù)次，得第三蛋白溶液。

(8)除雜：將第三蛋白溶液裝入透析袋進(jìn)行透析，每2h更換透析液一次，去除鹽分和小分子雜質(zhì)，在透析袋內(nèi)得到硒蛋白。

(9)冷凍干燥：將硒蛋白放入-80℃冰箱預(yù)凍6h，放入真空冷凍機(jī)進(jìn)行干燥，干燥結(jié)束后即得富硒米糠蛋白粉

參照實(shí)例1的測(cè)定方法，測(cè)定提取的硒蛋白的蛋白質(zhì)含量為95.42％，測(cè)定的硒含量為0.58mg/kg。