本發(fā)明涉及一種具有緩解羅非魚鋁毒性的益生菌飼料及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鋁是地殼中最豐富的金屬元素，在環(huán)境中無處不在。近年來，由于環(huán)境惡化酸雨頻發(fā)，導(dǎo)致越來越多的鋁進(jìn)入河流和湖泊，對水體造成污染，影響水生生物的健康和生長性能。金屬鋁不僅對生命體沒有生物學(xué)功能，而且是一種對生命體具有極大危害的有毒金屬之一。一些研究報(bào)道0.11-0.22mg/L的鋁就會(huì)對魚類造成損傷。鋁對水體生物的毒害首先表現(xiàn)在對魚生長性能和存活率的影響。魚類暴露于鋁污染的水體后，其生理變化主要表現(xiàn)在心血管、血液系統(tǒng)、新陳代謝、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等方面。鋁對魚類的毒性主要與活性氧形成相關(guān)，其具有很強(qiáng)的促氧化特性。羅非魚是一類市場占有率很高的魚類制品食材，高含量的鋁污染會(huì)導(dǎo)致在魚肌肉組織中蓄積，當(dāng)人類攝入鋁污染的魚肉以后會(huì)導(dǎo)致鋁在人類組織器官內(nèi)蓄積。研究表明鋁的蓄積可以造成人體多種器官系統(tǒng)的損傷。因此，水體鋁污染不僅能夠?qū)е滤a(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，而且也會(huì)對人體健康產(chǎn)生毒害風(fēng)險(xiǎn)。

迄今為止，緩解水生動(dòng)物鋁毒性的研究較少，其主要思路是吸附鋁或者是緩解鋁造成的毒害作用。當(dāng)前研究對水生生物的鋁中毒治療方法主要是在飼料中添加一定抗氧化劑或者是鋁螯合劑。抗氧化劑主要是一些維生素及抗氧化物質(zhì)包括維生素、植物提取物、以及微量元素等，鋁螯合吸附劑的研究在蒙脫土、泡沸石和凹凸棒土上有所涉及。而抗氧化劑使用成本較高，螯合吸附劑使用可能會(huì)破壞水生生物體內(nèi)的離子平衡。鑒于當(dāng)前的研究現(xiàn)狀以及治療方法的有限性，針對水生生物的鋁蓄積和鋁中毒探索一種新的干預(yù)或治療方法顯得十分必要；而上述幾種治療方法的可行性也促使我們繼續(xù)尋找應(yīng)用更廣泛、潛力更巨大，同時(shí)又具有緩解鋁毒性作用的手段。

目前，已經(jīng)有大量學(xué)者研究了益生菌飼料對水生動(dòng)物的益生作用，但在緩解水生生物鋁毒性方面的研究仍未有報(bào)道。因此，探索益生菌飼料在環(huán)境水體中對毒性金屬鋁的減除能力，以及緩解水生生物體內(nèi)鋁蓄積導(dǎo)致的毒性效應(yīng)中的作用，對益生菌飼料的功能進(jìn)一步地進(jìn)行挖掘，為改善污染水體和降低金屬鋁暴露水生生物的毒害作用開辟出新的方法和策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種益生菌飼料，含有活性的≥10⁸CFU/g飼料的植物乳桿菌CGMCC No.9664。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述植物乳桿菌CGMCC No.9664于2014年09月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No.9664，并公開于申請?zhí)枮?01510090228.9的發(fā)明專利申請中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述益生菌飼料是由植物乳桿菌CGMCC No.9664的菌劑與食品學(xué)上可接受的載體組成的。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述益生菌飼料含有魚粉，次粉，玉米淀粉，大豆油，豆粕，酪蛋白，明膠，復(fù)合維生素，復(fù)合礦物鹽，氯化膽堿，VC磷酸酯鈉，磷酸二氫鈣，微晶纖維素中的至少一種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述益生菌飼料按質(zhì)量百分比含有魚粉8～12％，次粉22～28％，玉米淀粉18～23％，大豆油4～8％，豆粕22～24％，酪蛋白8～12％，明膠1～4％，復(fù)合維生素0.5～2％，復(fù)合礦物鹽0.5～2％，氯化膽堿0.1～1％，VC磷酸酯鈉0.1～1％，磷酸二氫鈣0.5～2％，微晶纖維素1～4％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述益生菌飼料質(zhì)量百分比含有魚粉10％，次粉25％，玉米淀粉20.5％，大豆油6.0％，豆粕20％，酪蛋白9.6％，明膠2.4％，復(fù)合維生素1％，復(fù)合礦物鹽1％，氯化膽堿0.5％，VC磷酸酯鈉0.2％，磷酸二氫鈣1.5，微晶纖維素2.3％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)合維生素含有(按mg/kg飼料計(jì))：維生素A，10；維生素D，0,05；維生素E，400；維生素K，40；維生素B₁，50；維生素B₂，200；維生素B₃，500；維生素B₆，50；維生素B₇，5；維生素B₁₁，15；維生素B₁₂，0.1；維生素C，1000；肌醇，2000；膽堿，5000。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)合礦物鹽含有(按mg/kg飼料計(jì))：FeSO₄·7H₂O，372；CuSO₄·5H₂O，25；ZnSO₄·7H₂O，120；MnSO₄·H₂O，5；MgSO₄，2475；NaCl，1875；KH₂PO₄，1000；Ca(H₂PO₄)₂2500。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述益生菌飼料的制備方法，所述方法包括：(1)將植物乳桿菌CGMCC No.9664接種至MRS培養(yǎng)基中，30～37℃培養(yǎng)16～64h，離心，收集活菌濃度≥10¹¹CFU/mL的植物乳桿菌CGMCC No.9664；(2)配制預(yù)混飼料；(3)將步驟(1)制備的活菌與步驟(2)制備的預(yù)混飼料混合，獲得活菌數(shù)≥10⁸CFU/g的飼料。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述預(yù)混飼料按質(zhì)量百分比具體為：魚粉10％，次粉25％，玉米淀粉20.5％，大豆油6.0％，豆粕20％，酪蛋白9.6％，明膠2.4％，復(fù)合維生素1％，復(fù)合礦物鹽1％，氯化膽堿0.5％，VC磷酸酯鈉0.2％，磷酸二氫鈣1.5，微晶纖維素2.3％；

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)合維生素(mg/kg飼料)含有：維生素A，10；維生素D，0,05；維生素E，400；維生素K，40；維生素B₁，50；維生素B₂，200；維生素B₃，500；維生素B₆，50；維生素B₇，5；維生素B₁₁，15；維生素B₁₂，0.1；維生素C，1000；肌醇，2000；膽堿，5000。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)合礦物鹽(mg/kg飼料)含有：FeSO₄·7H₂O，372；CuSO₄·5H₂O，25；ZnSO₄·7H₂O，120；MnSO₄·H₂O，5；MgSO₄，2475；NaCl，1875；KH₂PO₄，1000；Ca(H₂PO₄)₂2500。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將濃縮菌液與所述預(yù)混飼料混合；所述濃縮菌液是將植物乳桿菌CGMCC No.9664菌種以2-4％的接種量接種至MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16～24h，用pH7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用生理鹽水重懸使活菌濃度達(dá)到10¹¹CFU/mL，得到濃縮菌液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將凍干菌粉與所述預(yù)混飼料混合；所述凍干菌粉按下述步驟制備：(1)配制含100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉的凍干保護(hù)劑溶液；(2)將植物乳桿菌CGMCC No.9664菌種以2-4％的接種量接種至MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16～24h，用pH7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用凍干保護(hù)劑重懸使活菌濃度達(dá)到10¹¹CFU/mL，將該懸浮液在溫度37℃下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的凍干菌粉。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將海藻酸鈉微膠囊菌劑與所述預(yù)混飼料混合；所述的海藻酸鈉微膠囊菌劑的按下述步驟制備：(1)將植物乳桿菌CGMCC No.9664菌種按照以2-4％的接種量接種至MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16～24h，用pH7.0～7.2的磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，(2)加入10倍體積20g/L的海藻酸鈉溶液與菌體充分混合，并加入0.4％的Tween-80，磁力攪拌器攪拌乳化15min，使用壓力噴嘴噴入0.2mol/L的CaCl₂溶液中，固化15min，用紗布過濾，生理鹽水沖洗2～3次，得到海藻酸鈉微膠囊菌劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的羅非魚基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成按質(zhì)量百分比含有：魚粉8～12％，次粉22～28％，玉米淀粉18～23％，大豆油4～8％，豆粕22～24％，酪蛋白8～12％，明膠1～4％，復(fù)合維生素0.5～2％，復(fù)合礦物鹽0.5～2％，氯化膽堿0.1～1％，VC磷酸酯鈉0.1～1％，磷酸二氫鈣0.5～2％，微晶纖維素1～4％。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種羅非魚飼喂方法，是將所述益生菌飼料按羅非魚總體重的1～5％每天飼喂1～2次。

本發(fā)明還提供所述益生菌飼料在制備含羅非魚成分的食品、保健品領(lǐng)域的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明含植物乳桿菌CGMCC No.9664的水生動(dòng)物飼料，還具有如下特性：

(1)提高羅非魚的生長性能；

(2)改善鋁暴露羅非魚的血清生化指標(biāo)；

(3)緩解鋁暴露羅非魚體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷；

(4)降低鋁暴露羅非魚體不同組織器官和魚肉中的鋁含量，提高羅非魚魚肉的安全性。

(5)恢復(fù)鋁暴露羅非魚的腸道菌群組成。

將該益生菌飼料用于飼喂鋁暴露羅非魚，能夠提高羅非魚的生長性能，使羅非魚平均增重和日增重分別提高10.41％和12.12％，使鋁暴露羅非魚存活率提高8％，降低鋁暴露羅非魚魚肉內(nèi)的鋁含量至正常水平，提高肉質(zhì)安全性，并能夠緩解鋁暴露羅非魚體內(nèi)的鋁毒性，改善鋁暴露羅非魚的腸道微生態(tài)環(huán)境，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是羅非魚肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)變化情況；

圖2是羅非魚腸道微生物門類多樣性變化情況；

圖3是羅非魚腸道微生物屬類多樣性變化情況。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

按表1所示的基礎(chǔ)配方及營養(yǎng)組成配制飼料配料，具體步驟如下：

(1)將植物乳桿菌CGMCC No.9664按體積比以2-4％的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)18h，pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用生理鹽水重懸浮，使活菌濃度≥10¹¹CFU/mL。

(2)按表1的配方配制預(yù)混飼料，按質(zhì)量百分比具體為：魚粉10％，次粉25％，玉米淀粉20.5％，大豆油6.0％，豆粕20％，酪蛋白9.6％，明膠2.4％，復(fù)合維生素1％，復(fù)合礦物鹽1％，氯化膽堿0.5％，VC磷酸酯鈉0.2％，磷酸二氫鈣1.5，微晶纖維素2.3％；

其中復(fù)合維生素(mg/kg飼料)含有：維生素A，10；維生素D，0,05；維生素E，400；維生素K，40；維生素B₁，50；維生素B₂，200；維生素B₃，500；維生素B₆，50；維生素B₇，5；維生素B₁₁，15；維生素B₁₂，0.1；維生素C，1000；肌醇，2000；膽堿，5000；

復(fù)合礦物鹽(mg/kg飼料)含有：FeSO₄·7H₂O，372；CuSO₄·5H₂O，25；ZnSO₄·7H₂O，120；MnSO₄·H₂O，5；MgSO₄，2475；NaCl，1875；KH₂PO₄，1000；Ca(H₂PO₄)₂2500。

(3)將步驟(1)制備的菌液與步驟(2)制備的預(yù)混飼料混合，以小型顆粒飼料機(jī)進(jìn)行制粒，制粒溫度為65℃，得到含該菌的顆粒飼料；顆粒飼料成型后，將新鮮濃縮菌液使用壓力噴嘴均勻混入顆粒飼料中，得到含該菌的顆粒飼料。所得顆粒飼料的活菌數(shù)≥10⁸CFU/g成品飼料，該益生菌飼料中蛋白含量為29.3％，脂肪含量7.8％。

表1羅非魚基礎(chǔ)飼料的組成及含量

實(shí)施例2植物乳桿菌CGMCC No.9664對鋁暴露羅非魚生長指標(biāo)的影響

選取健康的尼羅羅非魚192尾，初始體重為34.01±0.19g(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。隨機(jī)分成四組，分別為對照組、益生菌組、金屬組和金屬+益生菌組，每組48尾，隨機(jī)分為三個(gè)平行，每個(gè)平行16尾。對照組：飼喂基礎(chǔ)日糧(即按表1配方配制的不含益生菌成分的基礎(chǔ)飼料)；益生菌組：飼喂含益生菌(CGMCC No.9664)飼料；金屬暴露組，飼喂基礎(chǔ)日糧，暴露于含金屬(2.73mg/L的Al³⁺溶液)溶液的水體中；金屬+益生菌(CGMCC No.9664)組，飼喂含益生菌飼料，暴露于含金屬鋁溶液的水體中。羅非魚按羅非魚總體重的3％每天飼喂兩次，分別為上午9點(diǎn)和下午3點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)周期為4周，羅非魚的體重變化，進(jìn)食量和存活率等生長性能指標(biāo)被記錄。增重率＝(終體重-初始體重)/初始體重×100％；飼料系數(shù)＝總進(jìn)食量/(終體重-初始體重)。

這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，益生菌組羅非魚的平均增重和日增重顯著高于對照組，與對照相比平均增重和日增重分別提高了10.41％和12.12％，說明益生菌促進(jìn)了羅非魚的生長。與金屬組相比，益生菌處理后明顯提高了鋁暴露組羅非魚的存活率，且羅非魚的體重被很好的恢復(fù)。

表2羅非魚的生長指標(biāo)變化

注：不同字母代表的組別間具有顯著性差異(P<0.05)

實(shí)施例3植物乳桿菌CGMCC No.9664對鋁暴露羅非魚體內(nèi)鋁含量的降低作用實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)施例2所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解剖，取各部位的組織器官，放入微波消解爐中消解20min，得到的消解液使用電感藕合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS；NexIon-300X；PerkinElmer)測定鋁含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3羅非魚不同部位的鋁含量

注：-表示未檢測到；單位均為μg/g組織濕重；標(biāo)有不同字母的組表示差異顯著(P<0.05)。

對比金屬+益生菌組與金屬組可以發(fā)現(xiàn)，益生菌顯著降低了羅非魚腸道、肝臟和脾臟組織中的鋁含量。雖然對鰓沒有顯著性降低，但是其趨勢仍然是益生菌干預(yù)組要低于金屬暴露組。這一數(shù)據(jù)說明含有植物乳桿菌CGMCC No.9664的益生菌飼料能夠降低鋁暴露羅非魚體內(nèi)的鋁含量。

實(shí)施例4植物乳桿菌CCFM 8610對鋁暴露羅血清生化指標(biāo)改善作用實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)施例2所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對羅非魚進(jìn)行尾部靜脈取血，每個(gè)處理組取15條，血液經(jīng)靜置1h后離心(3000g，10min)得到血清，使用全自動(dòng)生化分析儀(BS-400；Mindray,China)進(jìn)行血清生化分析。測定結(jié)果如附表4所示。

表4羅非魚血清生化指標(biāo)的變化：TP、Glu、TC、TG、LDL-C和HDL-C。

注：不同字母代表的組別間具有顯著性差異(P<0.05)

與對照組相比，鋁暴露能顯著降低羅非魚血清中Glu、TG、LDL-C和HDL-C含量(P<0.05)和顯著增加TC的含量，而通過益生菌飼料干預(yù)，TC、TG、LDL-C和HDL-C含量被明顯調(diào)節(jié)至接近正常水平。以上數(shù)據(jù)表明，植物乳桿菌CGMCC No.9664能夠改善鋁暴露羅非魚的血清生化指標(biāo)，使鋁暴露羅非魚基本恢復(fù)到未受鋁毒害的健康狀態(tài)。

實(shí)施例5植物乳桿菌CGMCC No.9664緩解鋁暴露羅非魚氧化損傷實(shí)驗(yàn)

以實(shí)施例2所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解剖，取肝臟，按照南京建成試劑測試盒的方法分別測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化物酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、還原性谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平。測試結(jié)果如附圖1所示。

如附圖1所示，CGMCC No.9664緩解了因鋁暴露造成的肝臟中SOD、GSH-Px、CAT、GSH和T-AOC的降低，以及MDA的升高。SOD是生物體內(nèi)清除自由基重要的抗氧化酶，可調(diào)節(jié)因氧自由基造成的細(xì)胞損害，并修復(fù)受損細(xì)胞，是生物體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的一種標(biāo)志酶。GSH是維持細(xì)胞生物功能的重要物質(zhì)，GSH-Px和CAT是體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，能將有毒的過氧化物催化成無毒物質(zhì)，兩者都是毒性金屬暴露的生物標(biāo)志物；T-AOC是用于衡量抗氧化能力的綜合指標(biāo)，它的大小可以反映機(jī)體自身氧化代謝的狀態(tài)，在鋁暴露下，會(huì)產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致T-AOC降低；而MDA是一種生物體內(nèi)的自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是生物體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的一種標(biāo)志酶。以上結(jié)果說明，含植物乳桿菌CGMCC No.9664的益生菌飼料緩解了羅非魚鋁中毒引起的氧化應(yīng)激和氧化損傷。

實(shí)施例6植物乳桿菌CGMCC No.9664調(diào)節(jié)鋁暴露羅非魚腸道微生物的組成及植物乳桿菌含量水平測定實(shí)驗(yàn)

以實(shí)施例1所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，每2周收集腸道糞便，使用DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取樣品中所含的DNA，并使用PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA中的V4V5區(qū)，擴(kuò)增引物為515F(5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)，907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。

對擴(kuò)增子進(jìn)行電泳純化，使用膠回收試劑盒(Axygen Biosciences,CA,US)回收純化產(chǎn)物，并用熒光儀(Promega,US)進(jìn)行定量。將純化后的擴(kuò)增子等量混合后，利用Illumina MiSeq^TM測序服務(wù)技術(shù)平臺(tái)對混合物進(jìn)行雙尾測序。測序結(jié)果儲(chǔ)存于ncbi的Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫中。(收錄號(hào)：SRP089871)

使用QIIME(版本1.17)對測序結(jié)果進(jìn)行de-multiplex以及quality-filter。使用UPARSE將相似度在97％以上的片段序列聚類成為分類操作單元(OTUs)，并利用UCHIME識(shí)別并移除嵌合序列。使用DPR分類(http://rdp.cme.msu.edu/)以及SILVA(SSU115)16S rRNA數(shù)據(jù)庫對每個(gè)16S rRNA進(jìn)行比對分類(置信度閾值為70％)。

羅非魚腸道菌群分類結(jié)果如圖2和3，金屬暴露明顯降低腸道微生物多樣性以及顯著改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)。金屬暴露組明顯影響了羅非魚腸道內(nèi)的門類和屬類的組成。在屬水平上，金屬暴露組顯著增加了羅非魚腸道內(nèi)Flavobacterium，Comamonadaceae和Enterovibrio屬的數(shù)量，同時(shí)顯著降低Plesiomonas和Deefgea的數(shù)量。但是，金屬+益生菌組對微生物組成有顯著的恢復(fù)能力，益生菌顯著恢復(fù)了了羅非魚腸道內(nèi)的Comamonadaceae和Enterovibrio屬和Deefgea的豐度。

使用如表5所示引物進(jìn)行植物乳桿菌的定量分析，結(jié)果如表6所示，金屬暴露組能夠明顯降低羅非魚腸道內(nèi)植物乳桿菌的豐度(第4周)，而飼喂含植物乳桿菌CGMCC No.9664飼料則能顯著增加羅非魚腸道內(nèi)該種群的豐度。

表5植物乳桿菌熒光定量PCR特異性引物序列

表6羅非魚糞便樣品中植物乳桿菌的含量分析

以上數(shù)據(jù)表明植物乳桿菌CGMCC No.9664能調(diào)節(jié)鋁暴露羅非魚腸道微生物的組成及豐度。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種具有緩解羅非魚鋁毒性的益生菌飼料及其應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatacaagca agtcttggac cag 23