本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種類海參蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
我們知道，海參屬棘皮動物門，海參綱，是生長在海洋底層巖石上或海藻間的一種棘皮動物。海參為海珍之首，富含人體所需的多種微量元素和多種氨基酸，其肉質(zhì)軟嫩，營養(yǎng)豐富，是典型的高蛋白、低脂肪、無膽固醇食物，自古以來被視為佐膳佳肴及珍貴滋補品。研究表明，海參中所含的人體必需氨基酸含量可達到20%，鮮味氨基酸和藥效氨基酸均可達到36%，因此，海參不僅有滋補、保健作用，而且對于治療高血壓、高血糖、神經(jīng)衰弱等均有明顯功效。
海參雖好，但價格昂貴，對于普通的工薪階層長期食用，還是難以承受的。因此，研發(fā)一種既具有海參營養(yǎng)價值，又能不給食用者造成經(jīng)濟壓力的替代產(chǎn)品就顯得很有必要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中海參產(chǎn)品價格昂貴的不足，本發(fā)明提供一種工藝合理、易于操作、價格便宜、營養(yǎng)價值高的類海參蛋白質(zhì)的制備方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種類海參蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于：其經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海參壁細胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取100～200mg海參壁組織在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫條件下靜置3～5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于2～8℃條件下，10000g離心8～10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積10%～20%的氯仿，劇烈振蕩15～20s，室溫靜置2～3min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于2～8℃條件下，10000g離心10～15min；樣品分為三層：有機相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1～2的比例加入異丙醇，室溫靜置8～10min，于2～8℃條件下，10000g離心8～10min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進行洗滌，再于2～8℃條件下，6000～7500g離心3～5min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5～10min，然后加入25～200μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于55～60℃條件下靜置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得海參壁細胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達載體
將步驟（2）中得到的海參壁細胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機引物：引物L-隨機和R-隨機 PCR擴增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達載體pET32(a)-隨機的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積10%～15%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達載體的菌株；
（4）、蛋白表達
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8～12h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8～12h；將500ml菌液接種至50～80L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至終濃度為0.3～0.4mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心30～60s，用發(fā)酵液體積10%～20%的、濃度為1%的SDS溶液進行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心30～60s，取上清液，即為海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物；
（5）、凝膠過濾
將步驟（4）中的海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物進行凝膠過濾層析，收集蛋白質(zhì)溶液，獲得隨機原核表達產(chǎn)物，即為類海參壁蛋白質(zhì)溶液。
所述的勻漿后的混合物靜置時的室溫控制為15～30℃。
本發(fā)明先是選取海參壁組織通過氯仿抽提方法，獲得海參壁細胞RNA；再采用RT-PCR的方法，得到海參壁細胞的cDNA，然后利用隨機引物進行PCR，得到各種隨機的基因片段，然后將得到的基因片段克隆入原核表達載體，進行誘導(dǎo)表達，得到隨機基因編碼的隨機蛋白，這些隨機蛋白都是來源于海參壁細胞的RNA，即均為海參壁細胞中所含有蛋白或蛋白片段，其氨基酸組成與海參壁細胞的氨基酸組成基本類似，其營養(yǎng)價值高，所得到的蛋白可用于后期產(chǎn)品加工使用，可達到提供與海參營養(yǎng)類似的目的。本發(fā)明采用的原核表達方法，因為原核表達技術(shù)成熟，價格低廉，生產(chǎn)成本低。其制備方法工藝合理，操作可行，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1
一種類海參蛋白質(zhì)的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海參壁細胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取150mg海參壁組織在液氮中磨碎，加入1.5ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為20℃條件下靜置4min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于5℃條件下，10000g離心9min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積16%的氯仿，劇烈振蕩18s，室溫靜置3min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于5℃條件下，10000g離心12min；樣品分為三層：有機相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1.6的比例加入異丙醇，室溫靜置9min，于5℃條件下，10000g離心9min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.2ml、濃度為75%的乙醇溶液進行洗滌，再于5℃條件下，7000g離心4min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥8min，然后加入100μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于58℃條件下靜置9min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得海參壁細胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達載體
將步驟（2）中得到的海參壁細胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機引物：引物L-隨機和R-隨機 PCR擴增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達載體pET32(a)-隨機的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積12%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達載體的菌株；
（4）、蛋白表達
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)10h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)10h；將500ml菌液接種至65L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標，待OD600≈0.5，向其中加入IPTG至終濃度為0.35mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心45s，用發(fā)酵液體積15%的、濃度為1%的SDS溶液進行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心45s，取上清液，即為海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物；
（5）、凝膠過濾
將步驟（4）中的海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物進行凝膠過濾層析，收集蛋白質(zhì)溶液，獲得隨機原核表達產(chǎn)物，即為類海參壁蛋白質(zhì)溶液。
本實施例得到隨機基因編碼的隨機蛋白的氨基酸組成與海參壁細胞的氨基酸組成基本類似，其原料成本低，價格便宜，所得到的類海參壁蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值高。其采用的原核表達方法技術(shù)成熟，易于操作。其制備方法工藝合理，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
實施例2
一種類海參蛋白質(zhì)的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海參壁細胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取200mg海參壁組織在液氮中磨碎，加入2ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為30℃條件下靜置3min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于8℃條件下，10000g離心8min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積20%的氯仿，劇烈振蕩20s，室溫靜置3min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于8℃條件下，10000g離心15min；樣品分為三層：有機相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1: 2的比例加入異丙醇，室溫靜置10min，于8℃條件下，10000g離心10min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.5ml、濃度為75%的乙醇溶液進行洗滌，再于8℃條件下，7500g離心3min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥10min，然后加入200μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于60℃條件下靜置8min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得海參壁細胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達載體
將步驟（2）中得到的海參壁細胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機引物：引物L-隨機和R-隨機 PCR擴增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達載體pET32(a)-隨機的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積15%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達載體的菌株；
（4）、蛋白表達
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；將500ml菌液接種至80L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標，待OD600≈0.6，向其中加入IPTG至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心60s，用發(fā)酵液體積120%的、濃度為1%的SDS溶液進行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心60s，取上清液，即為海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物；
（5）、凝膠過濾
將步驟（4）中的海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物進行凝膠過濾層析，收集蛋白質(zhì)溶液，獲得隨機原核表達產(chǎn)物，即為類海參壁蛋白質(zhì)溶液。
本實施例得到隨機基因編碼的隨機蛋白的氨基酸組成與海參壁細胞的氨基酸組成基本類似，其原料成本低，價格便宜。其制備方法工藝合理，操作可行，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
實施例3
一種類海參蛋白質(zhì)的制備方法，其經(jīng)過下列工藝步驟：
（1）、海參壁細胞RNA的提取
（1.1）、勻漿處理
稱取100mg海參壁組織在液氮中磨碎，加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理；
（1.2）、靜置
將步驟（1.1）中得到的勻漿后的混合物在室溫控制為15℃條件下靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
（1.3）、離心去雜質(zhì)
將步驟（1.2）中得到的靜置后的混合物于2℃條件下，10000g離心10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
將步驟（1.3）中得到的上清液中加入其體積10%的氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2min；
（1.5）、離心
將步驟（1.4）中得到的室溫靜置后的混合物于2℃條件下，10000g離心10min；樣品分為三層：有機相、水相和中間層；
（1.6）、沉淀
將步驟（1.5）中的水相層轉(zhuǎn)移到新試管中，按體積比1:1的比例加入異丙醇，室溫靜置8min，于2℃條件下，10000g離心8min，管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗滌
向步驟（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1ml、濃度為75%的乙醇溶液進行洗滌，再于2℃條件下，6000g離心5min，棄上清液，得洗滌后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
將步驟（1.7）中得到的洗滌后的RNA沉淀室溫放置干燥5min，然后加入25μl無RNase的水，用槍頭吸打混勻，于55℃條件下靜置10min，使RNA溶解，-70℃保存，備用；
（2）、反轉(zhuǎn)錄
將步驟（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得海參壁細胞的cDNA；
（3）、構(gòu)建表達載體
將步驟（2）中得到的海參壁細胞的cDNA以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用大量隨機引物：引物L-隨機和R-隨機 PCR擴增25個循環(huán)后回收，酶切后，回收產(chǎn)物與pET32(a)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到含有表達載體pET32(a)-隨機的大腸桿菌，挑取菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，待菌液濃度為OD值接近1.0時，向其中加入菌液體積10%的甘油，-70℃保存，得到轉(zhuǎn)化入表達載體的菌株；
（4）、蛋白表達
挑取步驟（3）中保存的菌株，接種體積為10ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8h；將10ml菌液加入到500ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)8h；將500ml菌液接種至50L發(fā)酵罐中，跟蹤菌體生長指標，待OD600≈0.4，向其中加入IPTG至終濃度為0.3mM，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h；開罐取菌液，12000g離心30s，用發(fā)酵液體積10%的、濃度為1%的SDS溶液進行重懸，混勻，冰上超聲破碎；12000g離心30s，取上清液，即為海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物；
（5）、凝膠過濾
將步驟（4）中的海參壁RNA隨機原核表達粗產(chǎn)物進行凝膠過濾層析，收集蛋白質(zhì)溶液，獲得隨機原核表達產(chǎn)物，即為類海參壁蛋白質(zhì)溶液。
本實施例得到隨機基因編碼的隨機蛋白的氨基酸組成與海參壁細胞的氨基酸組成基本類似，營養(yǎng)價值高，原料成本低，價格便宜。其采用的原核表達方法技術(shù)成熟，易于操作。其制備方法工藝合理，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。