本發(fā)明涉及食品加工領(lǐng)域，具體涉及一種將紅曲霉和米曲霉分別單獨制曲后，再接入泡菜粉混合發(fā)酵制備米渣蛋白醬油的方法。

背景技術(shù)：

醬油是以蛋白質(zhì)原料為主原料，以淀粉質(zhì)原料為輔原料，提供曲霉適宜的生長環(huán)境，后期發(fā)酵合成具有特殊醬香、酯香、色澤紅潤、體態(tài)醇厚的調(diào)味品。傳統(tǒng)的醬油釀造中蛋白質(zhì)原料多采用大豆、豆粕，但價格高、用量大，且轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在一定的不確定性。如何就地取材、變廢為寶、綜合利用，已成為醬油釀造行業(yè)關(guān)注的熱點。米渣蛋白是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，具有低過敏性、利于消化等特性，且其氨基酸組成適合人體需求。大米經(jīng)過高溫淀粉酶液化水解后，再經(jīng)過板框壓濾機過濾除去糖類物質(zhì)得到的富含蛋白質(zhì)的殘渣，稱為米渣蛋白粉。米渣蛋白粉中蛋白質(zhì)的含量高達60％左右，但是由于大米淀粉糖加工過程中高熱和各種化學(xué)因子的作用，導(dǎo)致米渣蛋白高度聚集，使米渣蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，更加難溶，并且難以降解，因而限制了其在食品在的應(yīng)用。目前米渣蛋白粉主要用于飼料，價格較為便宜，市場價格在2500-4000元/噸。將米渣蛋白粉用于醬油釀造，使淀粉糖企業(yè)、味精企業(yè)產(chǎn)生的大量下腳料——米渣蛋白粉得以充分利用，且新品醬油——米渣蛋白醬油可以達到GB 18186-2000特級釀造醬油的質(zhì)量標(biāo)準，大幅度提高了大米及米渣蛋白粉的附加值，豐富了調(diào)味品市場。但米渣蛋白醬油存在的問題是蛋白質(zhì)利用率偏低，同樣條件下，蛋白質(zhì)利用率明顯低于大豆醬油；其次，米渣蛋白醬油的顏色較為黯淡，風(fēng)味稍遜于大豆醬油。

我國醬油行業(yè)普遍以滬釀3.042米曲霉為主要菌種制曲，此菌種具有生長快、產(chǎn)孢量大、酶系豐富、不產(chǎn)毒素等特點。但單菌種制曲與多菌種制曲相比，成曲酶系較為單一，不能充分的分解蛋白質(zhì)及淀粉類原料，生成游離氨基酸的能力較弱，造成全氮利用率低，導(dǎo)致產(chǎn)品風(fēng)味不足。采用多菌種制曲與發(fā)酵，彌補了米曲霉單一菌種所產(chǎn)生的酶系不全的缺陷，使醬醪中各種酶類的比例更為合理，提高醬油產(chǎn)品質(zhì)量。因此制曲是醬油釀造中至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)，成曲質(zhì)量的好壞直接影響到醬油的品質(zhì)。目前對于多菌種制曲的研究主要在米曲霉和黑曲霉之間混合制曲，也有研究在制曲時添加根霉等，或在發(fā)酵階段添加酵母與乳酸菌，對醬油的風(fēng)味物質(zhì)的形成起到重要的作用。而將紅曲霉應(yīng)用于醬油發(fā)酵的研究還比較少，也未見在發(fā)酵初始時直接將泡菜粉接入進行多菌種耦合發(fā)酵制備醬油的報道。

CN102187994公布了以米渣為主要原料的醬油生產(chǎn)工藝，是將紅色紅曲霉Monascus ruber先在斜面試管活化5-6天，然后接入三角瓶進行一級種子培養(yǎng)，培養(yǎng)3天。米曲霉、黑曲霉先在斜面試管活化2-3天，然后接入三角瓶進行一級種子培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2天。取質(zhì)量百分比為60％米渣、40％麩皮，控制水含量35％，用旋轉(zhuǎn)式蒸鍋0.2-0.4Mpa蒸料1-2小時，快速冷卻至37-40℃接入5％紅曲霉液體種子，30℃通風(fēng)培養(yǎng)24小時后，每隔8小時翻曲一次，到培養(yǎng)第四天，再分別接種5％米曲霉和5％黑曲霉混合液體菌種，30℃通風(fēng)培養(yǎng)2天，氨基酸態(tài)氮為0.93g/100ml。該申請先將紅曲霉接入米渣培養(yǎng)基生長4d后，再接入米曲霉和黑曲霉，經(jīng)本申請人研究發(fā)現(xiàn)，1)當(dāng)紅曲霉接入米渣蛋白粉培養(yǎng)基，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，水分減少，再接入米曲霉和黑曲霉，水分不足，導(dǎo)致生長狀況不佳；2)適于米曲霉制曲的曲料水分含量并不適于紅曲霉制曲，米曲霉制曲所需的水分含量明顯高于紅曲霉制曲，二者生長所需的水分條件有明顯沖突；3)紅曲霉生長、繁殖和代謝影響米曲霉和黑曲霉的生長；正因為混菌制曲中存在的問題，導(dǎo)致蛋白質(zhì)利用率和醬油質(zhì)量尚有提高的空間。另外，該申請所用紅曲霉菌種為紅色紅曲霉Monascus ruber。

CN104172094公開了一種醬油釀造工藝，面粉、麩皮按質(zhì)量比3:1混合，經(jīng)120-122℃、0.15-0.18Mpa蒸料滅菌，抽真空，0.04Mpa、37-38℃接0.3％米曲霉、黑曲霉、紅曲霉或根霉，分開制曲，再混合發(fā)酵，發(fā)酵后再依次接入納豆菌、乳酸菌、生香酵母發(fā)酵，總發(fā)酵時間25-30天。它是以大豆或豆粕為主原料，不同于本發(fā)明所涉及的產(chǎn)品，并且沒有涉及每種曲霉菌的制曲方法，氨基酸態(tài)氮達到1.44g/100ml，蛋白質(zhì)的利用率達到90％左右。

傳統(tǒng)的多菌種制曲多集中在米曲霉和黑曲霉混合制曲。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，旨在提供一種大米蛋白轉(zhuǎn)化率高，并且氨基態(tài)氮、總氮、可溶性無鹽固形物等釀造醬油質(zhì)量指標(biāo)相對較高，紅色指數(shù)也較高，色澤紅潤、醬香醇厚，且具有紅曲特定功能的制備米渣蛋白醬油的方法。

本發(fā)明目的的實現(xiàn)方式為，一種分菌制曲，混菌發(fā)酵制備米渣蛋白醬油的方法，是由下述方法制備的，制備的具體步驟為：

1)用紅曲霉制紅曲成曲

①紅曲霉斜面種子活化：將紅曲霉保藏菌種轉(zhuǎn)接至斜面活化培養(yǎng)基上，斜面活化培養(yǎng)基為PDA馬鈴薯培養(yǎng)基，于28-30℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7-10d；

②液體種子擴大培養(yǎng)：將活化的斜面紅曲霉種子轉(zhuǎn)接至紅曲霉液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d；液體種子可根據(jù)需要逐級擴大；

所述紅曲霉液體種子培養(yǎng)基的成分為：7％丙三醇，3％牛肉浸膏，0.8％硝酸鈉，0.8％蛋白胨，3％葡萄糖，0.1％硫酸鎂；

③紅曲曲料制備：先將米渣蛋白粉用水潤透，再將面粉、麩皮加入，充分混勻，115℃蒸料20min，取出，冷卻至35℃以下，備用；其中米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比6:2:2:6-6.6的比例混合；

④接種：液體種子以質(zhì)量百分比3-5％的接種量接入制備好的紅曲曲料中，控制溫度30-35℃，濕度85-90％，每隔24h翻曲一次，制曲72h得紅曲成曲；

2)用米曲霉制米曲成曲

①米曲曲料制備：先將米渣蛋白粉用水潤透，再將面粉、麩皮加入，充分混勻，115℃蒸料20min，取出，冷卻至35℃以下，備用；其中米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比為6:2:2:7.8的比例混合；

②接種：在米曲曲料中按質(zhì)量比為2‰的接種量接入米曲霉孢子粉，控制溫度30-35℃，濕度85-90％，制曲12h后翻曲，曲料溫度不超過35℃；制曲16h時，第二次翻曲，調(diào)節(jié)溫度，將溫度控制在28-32℃，制曲36h時出曲，得米曲成曲；

3)混菌發(fā)酵：將步驟1)制得的紅曲成曲與步驟2)制得的米曲成曲按質(zhì)量比4:6混合，再按質(zhì)量比接入0.20-0.30％的泡菜粉，然后均勻拌入2.5倍體積、濃度為15.2％的鹽水，于30-35℃耦合發(fā)酵≧30天，得米渣蛋白醬油。

本發(fā)明的優(yōu)點如下：

1、對照GB18186-2000釀造醬油(以大豆或豆粕為主要原料)的質(zhì)量標(biāo)準，選用米渣蛋白粉作為蛋白質(zhì)主料發(fā)酵所得生醬油，感官質(zhì)量和理化指標(biāo)均可達到一級醬油標(biāo)準；

2、選用蛋白酶、糖化酶活力高，適合于米渣蛋白醬油生產(chǎn)的紅曲霉菌種Monascus anka，有利于提高米渣中難降解谷蛋白的利用率和多糖的降解率，總蛋白質(zhì)利用率可達70％；

3、紅曲霉經(jīng)活化、液體種子擴大培養(yǎng)接入米渣蛋白粉固體培養(yǎng)基中控制溫度、濕度，使紅曲霉生長達到最佳，成曲蛋白酶活可達到1600U/g干曲以上、糖化酶活達到700U/g干曲以上；

4、由于紅曲霉與米曲霉制曲條件和時間差異很大，互相沖突，將二者分開制曲，可分別獲得兩種高質(zhì)量的成曲；

5、通過發(fā)酵試驗研究，確定紅曲成曲與米曲成曲按4:6的質(zhì)量比充分混合均勻，并接入0.20-0.30％的泡菜粉，發(fā)酵制得的米渣蛋白生醬油氨基態(tài)氮、總氮、可溶性無鹽固形物等釀造醬油質(zhì)量指標(biāo)相對較高，風(fēng)味怡人，紅色指數(shù)也較高。

附圖說明

圖1為泡菜粉發(fā)酵米渣生醬油的氨基態(tài)氮含量(g/100mL)圖，

圖2為泡菜粉發(fā)酵米渣生醬油的總氮含量(g/100mL)圖，

圖3為泡菜粉發(fā)酵米渣生醬油的電子舌主成分分析圖。

具體實施方式

本發(fā)明是將潤水浸透的米渣蛋白粉與面粉、麩皮混合均勻，原料配比為米渣蛋白粉：面粉：麩皮：水質(zhì)量比為6:2:2:6-6.6，然后蒸料、冷卻，得曲料，備用。紅曲霉用馬鈴薯培養(yǎng)基活化，然后將活化的紅曲霉種子在紅曲霉液體種子培養(yǎng)基中搖床振蕩培養(yǎng)，再以質(zhì)量百分比為3-5％的接種量接入曲料中，控制溫度30-35℃，濕度85-90％，制曲72h得紅曲成曲。采用以上條件，使紅曲霉生長達到最佳，成曲酸性蛋白酶活、糖化酶活均較高。潤水浸透米渣蛋白粉與面粉、麩皮混勻、蒸料、冷卻，接入米曲霉，制曲、翻曲，得米曲成曲；紅曲與米曲按質(zhì)量比4:6混合，并接入0.20-0.30％的泡菜粉，拌入2.5倍、濃度為15.2％的鹽水于30-35℃耦合發(fā)酵至少30天，得米渣蛋白醬油。混菌發(fā)酵階段，每隔3-5d通氣攪拌一次。

本發(fā)明從大量實驗中得出結(jié)論：當(dāng)紅曲成曲與米曲成曲按4:6的質(zhì)量比充分混合均勻，并接入0.20-0.30％的泡菜粉耦合發(fā)酵，使氨基態(tài)氮、總氮、可溶性無鹽固形物等釀造醬油質(zhì)量指標(biāo)相對較高，風(fēng)味怡人，紅色指數(shù)也較高。故紅曲成曲與米曲成曲選擇質(zhì)量比為4:6。

本發(fā)明步驟1)中所用紅曲霉菌種為Monascus anka、Monascus ruber和Monascus purpureus。優(yōu)選出更適合于米渣蛋白醬油生產(chǎn)的紅曲霉菌種Monascus anka)，紅曲霉菌種Monascus anka的特點是酸性蛋白酶活、糖化酶活力高，紅曲霉單獨制曲成曲色價也較高。

PDA馬鈴薯培養(yǎng)基的配制方法是：將200g去皮土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，加熱至沸騰，維持20-30min，8層紗布過濾，棄濾渣；繼續(xù)加熱，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g，補充水分到1000ml。

本申請人做了接入質(zhì)量比P1-P9分別為0％,0.05％,0.10％,0.15％,0.20％,0.25％,0.30％,0.35％,0.50％的泡菜粉后耦合發(fā)酵后所得米渣蛋白醬油，氨基態(tài)氮含量(g/100mL)、總氮含量(g/100mL)、電子舌主成分分析實驗起結(jié)果見圖1、2、3，從圖1、2、3可見，P5、P6、P7氨基態(tài)氮、總氮、風(fēng)味及感官質(zhì)量均明顯優(yōu)于對照，按質(zhì)量比接入0.20-0.30％的泡菜粉較好，優(yōu)選的是按質(zhì)量比接入0.20-0.25％；更優(yōu)選的是按質(zhì)量比接入0.25％的泡菜粉。

本申請人做了接入質(zhì)量比P1-P9分別為0％,0.05％,0.10％,0.15％,0.20％,0.25％,0.30％,0.35％,0.50％的泡菜粉后耦合發(fā)酵后所得米渣蛋白醬油游離氨基酸及含量(mg/100ml)實驗，實驗結(jié)果見下表。

續(xù)表

從上表可見，按質(zhì)量比接入0.20-0.30％的泡菜粉游離氨基酸及含量較好，優(yōu)選的是按質(zhì)量比接入0.20-0.25％；更優(yōu)選的是按質(zhì)量比接入0.25％的泡菜粉。

下面將結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。

實施例1

1)用紅曲霉Monascus anka制紅曲成曲

①紅曲霉Monascus anka斜面種子活化：將紅曲霉保藏菌種轉(zhuǎn)接至斜面活化培養(yǎng)基上，斜面活化培養(yǎng)基為PDA馬鈴薯培養(yǎng)基，于28-30℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7-10d。

PDA馬鈴薯培養(yǎng)基，配制方法為將200g去皮土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，加熱至沸騰，維持20-30min，8層紗布過濾，棄濾渣。繼續(xù)加熱，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g，補充水分到1000ml。

②液體種子擴大培養(yǎng)：將活化的斜面紅曲霉種子轉(zhuǎn)接至紅曲霉液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d；液體種子可根據(jù)需要逐級擴大。

所述紅曲霉液體種子培養(yǎng)基的成分為：7％丙三醇，3％牛肉浸膏，0.8％硝酸鈉，0.8％蛋白胨，3％葡萄糖，0.1％硫酸鎂。

③紅曲曲料制備：先將米渣蛋白粉用水潤透，再將米渣蛋白粉、面粉、麩皮加入，充分混勻，115℃蒸料20min，取出，冷卻至35℃以下，備用。其中米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比6:2:2:6的比例混合。

④接種：液體種子以體積質(zhì)量百分比3％的接種量接入制備好的紅曲曲料中，控制溫度30-35℃，濕度85-90％，每隔24h翻曲一次，制曲72h得紅曲成曲。

測得紅曲成曲蛋白酶活可達1600U/g干曲以上，糖化酶活可達700U/g干曲以上。

2)用米曲霉制米曲成曲

①米曲曲料制備：先將米渣蛋白粉用水潤透，再將米渣蛋白粉、面粉、麩皮加入，充分混勻，115℃蒸料20min，取出，冷卻至35℃以下，備用。其中米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比為6:2:2:7.8的比例混合。

②接種：在米曲曲料中按質(zhì)量比為2‰的接種量接入米曲霉孢子粉，控制溫度30-35℃，濕度85-90％，制曲12h后翻曲，曲料溫度不超過35℃；制曲16h時，第二次翻曲，調(diào)節(jié)溫度，將溫度控制在28-32℃，制曲36h時出曲，得米曲成曲；

3)混菌發(fā)酵：將步驟1)制得的紅曲成曲與步驟2)制得的米曲成曲按質(zhì)量比4:6混合，并接入0.25％的泡菜粉，均勻拌入2.5倍體積、濃度為15.2％的鹽水，于30-35℃耦合發(fā)酵至少30天，得米渣蛋白醬油。

實施例2、同實施例1，不同的是，

1)紅曲霉Monascus purpureus斜面種子活化：將紅曲霉保藏菌種轉(zhuǎn)接至斜面活化培養(yǎng)基上，斜面活化培養(yǎng)基為PDA馬鈴薯培養(yǎng)基，于28-30℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7-10d。

測得紅曲霉Monascus purpureus成曲蛋白酶活可達800U/g干曲以上，糖化酶活可達600U/g干曲以上。蛋白酶活力低于實施例1，曲料紅色較淺。

實施例3、同實施例1，不同的是，

1)紅曲霉Monascus ruber斜面種子活化：將紅曲霉保藏菌種轉(zhuǎn)接至斜面活化培養(yǎng)基上，斜面活化培養(yǎng)基為PDA馬鈴薯培養(yǎng)基，于28-30℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)7-10d。

測得紅曲霉Monascus ruber的成曲蛋白酶活與Monascus anka相近，但糖化酶活力明顯低于Monascus anka和Monascus purpureus。

從例1、2、3說明采用三種紅曲霉(Monascus anka、Monascus purpureus、Monascus ruber)均能制得質(zhì)量良好的紅曲，但以紅曲霉Monascus anka為最優(yōu)，蛋白酶活、糖化酶活力均較高，成曲色價高。

實施例4、同實施例1，不同的是，

1)用紅曲霉Monascus anka制紅曲成曲

①紅曲霉Monascus anka斜面種子活化：將紅曲霉保藏菌種轉(zhuǎn)接至斜面活化培養(yǎng)基上，斜面活化培養(yǎng)基為PDA馬鈴薯培養(yǎng)基，于28-30℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)8d。

③紅曲曲料制備：米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比6:2:2:6.6的比例混合。

④接種：液體種子以體積質(zhì)量百分比3％的接種量接入制備好的紅曲曲料中。

測得紅曲成曲蛋白酶活可達1600U/g干曲以上，糖化酶活可達700U/g干曲以上。

從例1、4說明米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比6:2:2:6-6.6的比例混合，紅曲成曲的蛋白酶活、糖化酶活值最高，故本發(fā)明選擇米渣蛋白粉、面粉、麩皮、水按質(zhì)量比6:2:2:6-6.6的比例混合。