本發(fā)明涉及食品安全與衛(wèi)生領域，特別涉及香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的應用。

背景技術：

食品在加工貯藏及運輸?shù)母鱾€環(huán)節(jié)都容易受到食源性致病菌的污染，為了保持食品的新鮮衛(wèi)生，避免腐爛變質(zhì)，人們需要在食品中添加各種各樣的防腐劑，而其中主要以人工合成的化學類防腐劑居多，但有的化學防腐劑對人類具有一定的危害性，給食品安全帶來潛在的風險。

生物膜是微生物鑲嵌并生長在自身產(chǎn)生的胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS,主要是胞外多糖、蛋白質(zhì)和胞外DNA)中的微生物群體，其多附著在物體的表面。生物膜是微生物對環(huán)境的一種適應，是與游離態(tài)相對應的一種生長狀態(tài)，它可增強細菌的耐藥性、環(huán)境適應性及對宿主免疫系統(tǒng)攻擊的耐受性，這在食品安全與醫(yī)療領域帶來嚴重的風險。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是常見的食源性致病菌，常引起食品安全問題，對人體健康造成威脅，嚴重的可引起死亡。這些致病菌為了適應外界環(huán)境，常聚集在一起，形成生物膜，從而抵御外界環(huán)境尤其是抗生素等抗菌物質(zhì)的清除，成為持續(xù)性感染的源頭。傳統(tǒng)的抗菌物質(zhì)對生物膜的作用效果較差，而現(xiàn)在的方法主要集中在化學或生物的方法，如化學合成藥物、酶解等方法，這些方法要么工藝復雜、要么成本較高、甚至對人體還有副作用。因此開發(fā)出新型、高效、安全的天然抗生物膜物質(zhì)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。香辛料是我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷恼{(diào)味劑，而且大多數(shù)都具有抑制細菌生長的作用，但是其對生物膜是否有抑制及清除作用仍鮮有報道。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術問題，就是提出香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)：

香辛料提取物在食源性致病菌生物膜抑制和清除上的應用，所述香辛料提取物為香辛料醇提取物或香辛料水提取物。

優(yōu)選地，所述香辛料提取物為大蒜、肉桂、辣木葉、辣木莖、丁香的提取物中的一種或兩種。

優(yōu)選地，所述食源性致病菌為金黃色葡萄球菌或大腸桿菌或副溶血弧菌。

優(yōu)選地，所述香辛料提取物按以下方法制備：香辛料備原料破碎處理獲得料渣，按料液比1:6～12(m/v)加入提取液，用超聲波輔助提取，溫度為40～60℃，提取時間為0.5～1.5h，減壓抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)條件為50～60℃，轉(zhuǎn)入具塞試管定容后即得。

優(yōu)選地，所述提取液為80％的乙醇或者水。

優(yōu)選地，所述香辛料提取物對食源性致病菌生物膜的抑制具體體現(xiàn)為抑制食源性致病菌生物膜的形成，抑制代謝活性和抑制產(chǎn)生胞外多糖，且辛香料提取物對食源性致病菌的最小抑菌濃度為6.25mg/mL-12.5mg/mL。具體地，辣木莖提取物和大蒜提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為12.5mg/mL；肉桂提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度為6.25mg/mL，辣木葉提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度為12.5mg/mL；肉桂提取物和大蒜提取物對副溶血弧菌的最小抑菌濃度均為6.25mg/mL。

優(yōu)選地，所述香辛料提取物對食源性致病菌生物膜的清除具體體現(xiàn)為進入成熟的生物膜中并殺死其中部分食源性致病菌以及分解生物膜的胞外多糖。

因為生物膜具有較強的抗逆性，因此對生物膜的控制應采用多種方法聯(lián)合，本發(fā)明為香辛料提取物在食源性致病菌生物膜控制中的應用提供了理論基礎，為研究健康、安全的抗生物膜產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

附圖說明

圖1為不同香辛料提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈的大小示意圖；

圖2為不同香辛料提取物對大腸桿菌抑菌圈的大小示意圖；

圖3為不同香辛料提取物對副溶血弧菌抑菌圈的大小示意圖；

圖4為辣木莖或大蒜的提取物以及辣木莖與大蒜提取物的復配物對金黃色葡萄球菌的MIC對比圖；

圖5為肉桂或辣木葉的提取物以及肉桂與辣木葉提取物的復配物對大腸桿菌的MIC對比圖；

圖6為肉桂或大蒜的提取物以及肉桂與大蒜提取物的復配物對副溶血弧菌的MIC對比圖；

圖7為辣木莖或大蒜的提取物以及辣木莖與大蒜提取物的復配物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制效果對比圖；

圖8為辣木莖與大蒜提取物對金黃色葡萄球菌生物膜代謝活性的影響對比圖；

圖9為辣木莖與大蒜提取物對金黃色葡萄球菌胞外多糖的影響示意圖；

圖10為肉桂或辣木葉的提取物以及肉桂與辣木葉提取物的復配物對大腸桿菌生物膜形成量的影響對比圖；

圖11為肉桂與辣木葉提取物對大腸桿菌生物膜代謝活性的影響對比圖；

圖12為肉桂與辣木莖提取物對大腸桿菌胞外多糖的影響示意圖；

圖13為肉桂或大蒜的提取物以及肉桂與大蒜提取物的復配物對副溶血弧菌生物膜形成量的影響對比圖；

圖14為肉桂與大蒜提取物對副溶血弧菌生物膜代謝活性的影響對比圖；

圖15為肉桂與大蒜提取物對副溶血弧菌胞外多糖的影響示意圖；

圖16為辣木莖提取物、大蒜提取物以及它們的提取物復合物對金黃色葡萄球菌生物膜的清除率對比圖；

圖17為不同濃度的辣木莖和大蒜提取物對金黃色葡萄球菌成熟生物膜胞外多糖的影響對比圖；

圖18為肉桂提取物、辣木葉提取物以及它們的提取物復合物對大腸桿菌生物膜的清除率對比圖；

圖19為不同濃度的肉桂與辣木葉提取物對大腸桿菌成熟生物膜胞外多糖的影響對比圖；

圖20為肉桂提取物、大蒜提取物以及它們的提取物復合物對副溶血弧菌生物膜的清除率對比圖；

圖21為不同濃度的肉桂與大蒜提取物對副溶血弧菌成熟生物膜胞外多糖的影響對比圖；

圖22為CLSM觀察大蒜提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用效果圖；

圖23為CLSM觀察肉桂提取物對大腸桿菌生物膜的抑制作用效果圖；

圖24為CLSM觀察肉桂提取物對副溶血弧菌生物膜的抑制作用效果圖；

圖25為CLSM觀察大蒜提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的清除作用效果圖；

圖26為CLSM觀察肉桂提取物對大腸桿菌生物膜的清除作用效果圖；

圖27為CLSM觀察肉桂提取物對副溶血弧菌生物膜的清除作用效果圖。

具體實施方式

為讓本領域的技術人員更加清晰直觀的了解本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1 香辛料等植物提取物的制備

將小茴香、花椒、胡椒、迷迭香、肉桂、丁香干燥、粉碎，洋蔥、辣木葉、辣木莖、大蒜、生姜分別用榨汁機絞碎，按料液比1:6～12(m/v)分別加入80％乙醇(v/v)或去離子水，然后用超聲波輔助提取，溫度為40～60℃，提取時間為0.5～1.5h。減壓抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)條件為50～60℃，轉(zhuǎn)入具塞試管中，定容后使質(zhì)量濃度為1g/mL(即1g香辛料提取物定容為1mL)，密封后保存于4℃冰箱中備用。

實施例2 菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血弧菌分別接種于TSB培養(yǎng)基中，置于搖床中37℃，120r/min培養(yǎng)12h。將菌懸液離心收集菌體，10倍梯度稀釋后與配制好的10mL 0.5麥氏比濁管(0.25％BaCl₂ 0.2mL，1％H₂SO₄ 9.8mL)進行濁度比較，并用平板計數(shù)法驗證，最終確定其活菌含量約為10⁸CFU/mL。

實施例3 牛津杯法測定香辛料提取物的抑菌能力

在配制好的TSA固體培養(yǎng)基上加入200μL稀釋至10⁸CFU/mL的菌液，涂布均勻后，用無菌鑷子將滅菌并冷卻至常溫的牛津杯呈三角形放置在平板上，在每個牛津杯中加入100μL各提取液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察并測量抑菌圈直徑，每次實驗以80％乙醇和無菌水作對照。不同提取物對三種食源性致病菌的抑菌圈的大小見附圖1-3。

實施例4 二倍稀釋法測定香辛料提取物對三種菌的最小抑制濃度(MIC)

在96孔細胞培養(yǎng)板中先加入100μL滅菌后的MH肉湯培養(yǎng)基，然后在第一列加入稀釋后的提取物100μL，混合均勻后從中吸取100μL至下一列中，依次至六個濃度梯度，然后再在每孔中加入100μL濃度為10⁶CFU/mL的菌液，這樣每列的濃度分別為50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.13mg/mL和1.56mg/mL。每列三個重復，第七行為不加提取物和菌液的空白對照，第八行為不加提取物的陰性對照。不同提取物對三種食源性致病菌的最低抑菌濃度見附圖4-6，“**”表示其與對照組差異極顯著。

實施例5 結(jié)晶紫法定量測定香辛料提取物對生物膜形成的影響

在96孔板中加入TSB培養(yǎng)基，再加入提取物和菌液；同時設空白對照和陰性對照。蓋上蓋子，并用保鮮膜包裹密封，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定的時間；取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，并在每孔中加入250μL生理鹽水清洗兩遍，去除浮游菌；將96孔板放入60℃鼓風干燥機中干燥15min；在每孔中加入200μL0.1％的結(jié)晶紫溶液，染色10min；棄去結(jié)晶紫溶液，在每孔中加入250μL的生理鹽水清洗三遍，除去未染色的結(jié)晶紫；60℃鼓風干燥機中干燥15min；在每孔中加入200μL33％冰乙酸，靜置10min。在酶標儀中測其在595nm波長下的OD值。

計算抑制率：

抑制率(％)＝(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％。

實施例6 XTT減低法測生物膜中的代謝活性

(1)在96孔板中加入TSB培養(yǎng)基、提取物和菌液；同時設空白對照和陰性對照。蓋上蓋子，用保鮮膜包裹密封，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定的時間；

(2)取出96孔細胞培養(yǎng)板，棄去內(nèi)容物；

(3)在每孔中加入100μL PBS緩沖液，然后將XTT溶液和甲萘醌溶液按12.5:1混合后，每孔加入13.5μL，避光孵育4h，溫度與培養(yǎng)溫度相同；

(4)在420nm波長下測其吸光值。

(5)計算抑制率

抑制率(％)＝(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％。

實施例7 測定提香辛料取物對胞外多糖產(chǎn)生的影響

(1)將在含有不同濃度提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的菌液于5000r/min離心10min，除去上清液，將菌重懸于10mL滅菌生理鹽水中，煮沸10min，常溫下冷卻20min；

(2)加入50μL的Pronase E，37℃避光孵育2h；

(3)加入200μL的質(zhì)量濃度為10％的TCA溶液，冰水放置30min；

(4)10000r/min離心30min，收集上清液，加入等體積的乙醇溶液，-20℃放置1h；

(5)10000r/min離心20min，去掉上清液，沉淀物用95％的乙醇洗滌兩次；

(6)最終沉淀重懸于1mL無菌去離子水中，加入質(zhì)量濃度5％的重蒸酚和濃硫酸，沸水浴10min；

(7)每個樣品吸取200μL加入96孔細胞培養(yǎng)板，在420nm波長下測定吸光值；

(8)計算抑制率

抑制率(％)＝(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％。

實施例8 香辛料提取物對成熟生物膜內(nèi)活菌數(shù)的影響

在50mL離心管中放入一塊滅菌后的蓋玻片，然后加入10mL TSB培養(yǎng)基，接入相應的致病菌，使其終濃度約為10⁶CFU/mL。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在37℃下，而副溶血弧菌在30℃下培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)后的蓋玻片取出用生理鹽水洗三遍之后放入新的含有相應濃度提取物的10mL生理鹽水的50mL離心管中繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后將蓋玻片取出，用生理鹽水洗三遍后放入新的含有10mL生理鹽水的離心管中，超聲波震蕩10min。梯度稀釋后，取100μL菌液均勻涂布于TSA平板中，相應溫度培養(yǎng)24h后觀察計數(shù)。

實施例9 激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)觀察生物膜的立體結(jié)構

(1)在普通培養(yǎng)皿中放入滅菌的載玻片，然后加入15mL含有不同濃度提取物的TSB培養(yǎng)基，接入菌種，使每個培養(yǎng)皿中的終濃度達到10⁶CFU/mL；金黃色葡萄球菌和大腸桿菌放置于37℃，而副溶血弧菌置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；

(2)從培養(yǎng)皿中取出載玻片，用PBS沖洗三遍，用濾紙輕輕擦去多余液體；

(3)避光環(huán)境下在載玻片上滴加5μL ConA-FITC混合溶液，4℃放置30min；

(4)在相同位置上再滴加5μL PI溶液，4℃放置15min；

(5)放置于CLSM中觀察生物膜的結(jié)構。

實施例10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用SPSS22.0軟件進行平均值和標準偏差的計算，并對其進行顯著性分析(P＜0.01為差異極顯著，0.01＜P＜0.05為差異顯著)。

實施例11 大蒜乙醇提取物、辣木莖乙醇提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用

將不同濃度的辣木莖和大蒜的乙醇提取物及它們1:1(v/v)復配后，對金黃色葡萄球菌生物膜的形成進行抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的形成都有抑制作用，都表現(xiàn)出較強的濃度依賴(附圖7)；對金黃色葡萄球菌生物膜的代謝活性、胞外多糖的產(chǎn)生也具有很強的抑制作用(附圖8、附圖9)。注：圖中提取物的濃度由低到高均為1/8×MIC-2×MIC；相同字母表示兩兩之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示兩兩之間差異顯著(P＜0.05)

實施例12 辣木葉乙醇提取物和肉桂乙醇提取物對大腸桿菌生物膜的抑制作用

將不同濃度的辣木葉乙醇提取物和肉桂乙醇提取物及它們1:1(v/v)復配后，對大腸桿菌生物膜的形成進行抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些提取物對大腸桿菌生物膜的形成都有抑制作用，都表現(xiàn)出較強的濃度依賴(附圖10)；對大腸桿菌生物膜的代謝活性、胞外多糖的產(chǎn)生也具有很強的抑制作用(附圖11、附圖12)。注：圖中提取物的濃度由低到高均為1/8×MIC-2×MIC；相同字母表示兩兩之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示兩兩之間差異顯著(P＜0.05)

實施例13 肉桂乙醇提取物和大蒜乙醇提取物對副溶血弧菌生物膜的抑制作用

將不同濃度的肉桂乙醇提取物和大蒜乙醇提取物及它們1:1(v/v)復配后，對副溶血弧菌生物膜的形成進行抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些提取物對大副溶血弧菌生物膜的形成都有抑制作用，都表現(xiàn)出較強的濃度依賴(附圖13)；對副溶血弧菌生物膜的代謝活性、胞外多糖的產(chǎn)生也具有很強的抑制作用(附圖14、附圖15)。

實施例14 大蒜乙醇提取物、辣木莖乙醇提取物對金黃色葡萄球菌成熟生物膜的清除作用

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)48h后形成成熟的生物膜，將不同濃度的辣木莖和大蒜的乙醇提取物及它們的1:1(v/v)復配物加入其中，同時設陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h；然后分別測生物膜量、胞外多糖的產(chǎn)生量，計算清除率。結(jié)果表明，這些提取物對金黃色葡萄球菌生物膜都有清除作用(附圖16)；對金黃色葡萄球菌胞外多糖也具有很強的清除能力(附圖17)。注：相同字母表示兩兩之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示兩兩之間差異顯著(P＜0.05)。

實施例15 辣木葉乙醇提取物和肉桂乙醇提取物對大腸桿菌成熟生物膜的清除作用

大腸桿菌培養(yǎng)48h后形成成熟的生物膜，將不同濃度的辣木葉乙醇提取物和肉桂乙醇提取物及它們的1:1(v/v)復配物加入其中，同時設陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h；然后分別測生物膜量、胞外多糖的產(chǎn)生量，計算清除率。結(jié)果表明，這些提取物對大腸桿菌生物膜都有清除作用(附圖18)；對大腸桿菌胞外多糖也具有很強的清除能力(附圖19)。注：相同字母表示兩兩之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示兩兩之間差異顯著(P＜0.05)。

實施例16 肉桂乙醇提取物和大蒜乙醇提取物對副溶血弧菌成熟生物膜的清除作用

副溶血弧菌培養(yǎng)48h后形成成熟的生物膜，將不同濃度的辣木葉乙醇提取物和肉桂乙醇提取物及它們的1:1(v/v)復配物加入其中，同時設陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)24h；然后分別測生物膜量、胞外多糖的產(chǎn)生量，計算清除率。結(jié)果表明，這些提取物對副溶血弧菌生物膜都有清除作用(附圖20)；對副溶血弧菌胞外多糖也具有很強的清除能力(附圖21)。注：相同字母表示兩兩之間差異不顯著(P＞0.05)，不同字母表示兩兩之間差異顯著(P＜0.05)。

實施例17 CLSM觀察提取物對三種菌生物膜的抑制作用

激光共聚焦掃描顯微鏡除了能夠觀察細菌生物膜的平面圖像，還能夠?qū)ι锬さ牧Ⅲw結(jié)構進行三維掃描，而且在熒光染料的作用下還能夠直觀地觀察胞外多糖及細胞的多少。通過CLSM觀察細菌生物膜的形成及抑制情況，其結(jié)果如圖22-24所示。注：a、b為對照組，c、d為實驗組。

由圖22可知，a中，細菌聚集較明顯，多糖含量較多且主要分布在細菌周圍，而c中多糖分布均勻，細菌分布相對分散；而b與d則清晰地表明了對照組的多糖厚度比實驗組的要厚。因此，2×MIC濃度的大蒜提取物處理金黃色葡萄球菌除了能夠殺死一部分的細胞外，還能抑制胞外多糖的分泌，從而減少生物膜的形成。

由圖23可知，a中的多糖明顯比c中的要多，而且多糖聚集比較明顯且包圍著細菌，而c中的多糖和細胞則非常分散；通過b和d的比較，可以很直觀的看出多糖含量的變化。說明2×MIC濃度的肉桂提取物對大腸桿菌的生物膜形成具有很強的抑制作用。

由圖24可知，通過a與c以及b與d的比較發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過2×MIC濃度的肉桂提取物處理之后，死細胞的數(shù)量明顯增多，而多糖含量明顯減少，說明肉桂對副溶血弧菌具有較強的殺滅作用，且能夠有效地減少胞外多糖的產(chǎn)生。

實施例18 CLSM觀察提取物對三種菌生物膜的清除能力

提取物處理成熟的生物膜后，其結(jié)構的變化如附圖25-27所示。注：a、b為對照組，c、d為實驗組。

由圖25可知，a中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)48h后形成了生物膜，大量的胞外多糖聚集在細菌周圍，而c中雖然有大量的細菌，但其多糖含量非常少，且都是死細菌，b與d相比也能夠發(fā)現(xiàn)實驗組多糖含量比對照組減少了很多，說明大蒜提取物出了能夠殺死細菌，還能夠在一定程度上清除生物膜的多糖。

圖26是為肉桂提取物處理大腸桿菌生物膜前后的對比，由圖可知，對照組的生物膜生長得比較均一，多糖包裹著細菌，且分布均勻。而經(jīng)過處理之后，細菌分布比較分散，多糖含量減少，死細菌數(shù)量明顯增多。說明肉桂對成熟的生物膜仍然具有較強的清除能力。

圖27是為肉桂提取物處理副溶血弧菌生物膜前后的對比，由圖可知，在對照組中副溶血弧菌生物膜形成量比較大，由多糖包裹著的生物膜，整體呈橙綠色，說明主要是由多糖組成，且死細菌較少。而在實驗組中，大部分生物膜已經(jīng)被清除掉，且顏色變?yōu)槌赛S色，說明胞外多糖減少了且死細菌的數(shù)量增加。這些說明肉桂對副溶血弧菌的生物膜具有良好的清除能力。圖22-27中，a、b、c、d主要用于體現(xiàn)對比效果。