本發(fā)明涉及一種利用水產(chǎn)蛋白和羽毛粉發(fā)酵制備魚粉替代蛋白的方法，屬于水產(chǎn)品加工與利用的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

魚粉因適口性佳、營養(yǎng)豐富，尤其是氨基酸組成平衡及未知生長因子的含量豐富，一直以來是水產(chǎn)飼料中不可缺少的優(yōu)質(zhì)蛋白源。水產(chǎn)飼料中魚粉的用量通常占配方的30%～60%，是其成本中最大的組成部分。隨著世界范圍內(nèi)水生動物飼養(yǎng)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，全球?qū)︳~粉的需求量持續(xù)增長。目前，全球每年魚粉供應(yīng)量約為700萬噸。但由于不良?xì)夂蛴绊懀^度捕撈和海洋環(huán)境的污染，生態(tài)環(huán)境的破壞等多種原因，漁業(yè)資源受到嚴(yán)重破壞導(dǎo)致全球魚粉供應(yīng)量持續(xù)下降，難以滿足整個(gè)水產(chǎn)業(yè)對魚粉的巨大需求。故近年來魚粉價(jià)格一路上揚(yáng)，進(jìn)而導(dǎo)致養(yǎng)殖成本相對升高。然而激烈的市場競爭，水產(chǎn)品的市場價(jià)格卻不斷下降，直接導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益下降，極大地影響了養(yǎng)殖者的生產(chǎn)積極性。在海洋漁業(yè)資源日益緊張的狀況下尋找替代魚粉的蛋白質(zhì)原料是維系水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

羽毛粉由家禽肉制品生產(chǎn)的副產(chǎn)品羽毛加工而成，而羽毛占成年家禽體重的5%～7%左右，具有廣泛而豐富的資源以供加工生產(chǎn)，所以羽毛粉是一種很有開發(fā)前途的動物性蛋白質(zhì)資源。羽毛粉其主要成分是角蛋白，粗蛋白含量為80%～85%，是目前已知的飼料原料中最高的。然而角蛋白結(jié)構(gòu)非常致密，不易溶于水，很難被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，其很難直接應(yīng)用于飼料工業(yè)。目前，飼料工業(yè)主要采取水解技術(shù)將羽毛粉加工成水解羽毛粉來使用。水解羽毛粉主要依靠水解過程中時(shí)間、壓力、溫度的控制。其加工過程為：收集羽毛除塵清洗后，入水解罐中，在高溫高壓的條件下水解。工藝相對先進(jìn)，突出特點(diǎn)是徹底破壞羽毛角蛋白質(zhì)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，從而使它變成畜禽可消化吸收的可溶性蛋白，消化率可達(dá)75%。但水解羽毛粉的消化率仍遠(yuǎn)不及魚粉，并且必需氨基酸含量不足，例如其賴氨酸和蛋氨酸這兩種必需氨基酸含量分別相當(dāng)于魚粉的25%和35%左右，因而現(xiàn)有技術(shù)制備的水解羽毛粉很難在水產(chǎn)飼料中大規(guī)模替代優(yōu)質(zhì)進(jìn)口魚粉。

近年來，酶解和發(fā)酵的生物法處理羽毛粉得到了關(guān)注。專利201110231644.8“利用地衣芽胞桿菌降解羽毛制備菌肽復(fù)合蛋白飼料添加劑的方法”公開了一種通過液態(tài)發(fā)酵的方式生物處理羽毛粉。文獻(xiàn)《羽毛粉麩皮混合固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化》（畜牧與獸醫(yī)，2014年第3期）公開了一種通過固態(tài)表面發(fā)酵的方式生物處理羽毛粉。然而，現(xiàn)有的生物處理羽毛粉的方法很難在我國飼料工業(yè)得到大規(guī)模的應(yīng)用。液態(tài)發(fā)酵的方法雖容易大規(guī)模的生產(chǎn)，但是需購買發(fā)酵罐等相關(guān)設(shè)備投入成本高，并且發(fā)酵生產(chǎn)過程的能耗大，因而，用液態(tài)發(fā)酵的方式處理的羽毛粉很難在飼料工業(yè)大規(guī)模的應(yīng)用。固態(tài)表面發(fā)酵的方式雖不用投入購買昂貴的發(fā)酵設(shè)備，但很難進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)處理羽毛粉所存在的問題，本發(fā)明提供了一種利用水產(chǎn)蛋白和羽毛粉發(fā)酵制備魚粉替代蛋白的方法。本發(fā)明的主要目的是提供一種成本低廉和易大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵處理羽毛粉的方法。本發(fā)明的另一目的是將低值水產(chǎn)蛋白進(jìn)行發(fā)酵高值化利用。

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種利用水產(chǎn)蛋白和羽毛粉發(fā)酵制備魚粉替代蛋白的方法，包括如下步驟：

（1）將斜面保藏的能產(chǎn)角蛋白酶的耐高溫兼性厭氧菌甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）hl-4接入到滅菌后冷卻的lb液體培養(yǎng)基中，于55℃、150r/min培養(yǎng)12h，制備成bacillusmethylotrophicushl-4種子液備用；

（2）將麩皮和水按質(zhì)量比為1：1的比例混合，并混勻制備成麩皮培養(yǎng)基，麩皮培養(yǎng)基于121℃滅菌30min后備用；

（3）將步驟（1）制備的bacillusmethylotrophicushl-4種子液接入到步驟（2）得到的滅菌后冷卻的麩皮培養(yǎng)基中并混勻，然后將接入菌種的麩皮培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤中，裝料厚度為4cm，淺盤中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在55℃，發(fā)酵時(shí)間為48h，發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥和粉碎后制備成bacillusmethylotrophicus菌劑備用；

（4）將水產(chǎn)蛋白絞碎后備用；

（5）將步驟（4）制備的絞碎的水產(chǎn)蛋白和水解羽毛粉按質(zhì)量比為0.5～1.5：1的比例混合，然后添加營養(yǎng)物和水混勻得到含水量為40%～85%范圍內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基；

（6）往步驟（5）制備到的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蛋白酶和步驟（3）制備的bacillusmethylotrophicus菌劑，并混勻；

（7）將步驟（6）得到的加入蛋白酶和bacillusmethylotrophicus菌劑的發(fā)酵培養(yǎng)基堆積在一起，物料的厚度控制在50cm～150cm，并將建堆的發(fā)酵物料用塑料薄膜蓋上密封好，靜置發(fā)酵48h～72h；

（8）成品處理：發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵后獲得的產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎和包裝后，即制得了一種魚粉替代蛋白成品。

所述步驟（1）中所用的能產(chǎn)角蛋白酶的耐高溫兼性厭氧菌甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（bacillusmethylotrophicus）hl-4已于2016年1月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmccno：60002，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓廣東省微生物研究所。

所述步驟（3）中所用的bacillusmethylotrophicushl-4種子液的接種量以接入種子液的質(zhì)量占麩皮培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為0.1%～5%。

所述步驟（4）中所用的水產(chǎn)蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。

所述步驟（5）中所用的營養(yǎng)物為玉米粉、氯化鈣、氯化鋅、氯化亞鐵和磷酸氫二鉀所組成的混合物。所述步驟（5）中所用的營養(yǎng)物的添加量以加入營養(yǎng)物的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量的百分比計(jì)，分別為：玉米粉0.01%～5%，氯化鈣0.01%～5%，氯化鋅0.01%～5%，氯化亞鐵0.01%～5%，磷酸氫二鉀0.01%～5%。

所述步驟（6）中蛋白酶的加入量以添加的蛋白酶的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為0.01%～1%。所述步驟（6）中bacillusmethylotrophicus菌劑的加入量以添加的菌劑的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為0.01%～1%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)。

（1）易大規(guī)模生產(chǎn)?，F(xiàn)有的降解羽毛粉多為常溫的好氧菌，而本發(fā)明采用的是耐高溫兼性厭氧菌bacillusmethylotrophicushl-4作為發(fā)酵菌種，該菌有比較寬的發(fā)酵溫度，在10℃～70℃之內(nèi)都可發(fā)酵，最佳發(fā)酵溫度為50℃～55℃。該菌種是一種兼性厭氧菌，因而可以進(jìn)行大規(guī)模的深層發(fā)酵；另外該菌是耐高溫菌種，其最佳發(fā)酵溫度為50℃～55℃，故固態(tài)發(fā)酵過程的產(chǎn)熱升溫反而有利于菌種的發(fā)酵，因而發(fā)酵過程不用降溫，采取直接的靜置發(fā)酵。綜上所述，本發(fā)明通過耐高溫的兼性厭氧菌來發(fā)酵羽毛粉，可以直接采取靜置的自然發(fā)酵方式，易于大規(guī)模生產(chǎn)。

（2）成本低。液態(tài)好氧發(fā)酵雖也能大規(guī)模生產(chǎn)，但是需進(jìn)行投入昂貴的發(fā)酵，并且整個(gè)發(fā)酵過程的動力消耗和人工成本方面的成本高，再加上后處理成本也高。因而，現(xiàn)有的通過液態(tài)發(fā)酵的方式生物處理羽毛粉成本太高，很難在飼料工業(yè)大規(guī)模的應(yīng)用。而本發(fā)明采用靜置的固態(tài)深層發(fā)酵的方式處理羽毛粉，從發(fā)酵設(shè)備投入、人工、動力消耗和后處理這幾個(gè)方面綜合起來考慮，生產(chǎn)成本與液態(tài)發(fā)酵相比，大大降低。

（3）水產(chǎn)蛋白與羽毛粉的混合發(fā)酵。羽毛粉的蛋白質(zhì)含量雖然高于魚粉，但是其氨基酸分布不均衡，必需氨基酸含量不足。將水產(chǎn)蛋白和羽毛粉進(jìn)行混合發(fā)酵，可使得最終制備的發(fā)酵飼料蛋白的必需氨基酸含量要高于羽毛粉，從而提高其營養(yǎng)品質(zhì)。另外，水產(chǎn)蛋白中含有內(nèi)源蛋白酶，可有助于原料蛋白的進(jìn)一步降解。

（3）與物理和化學(xué)作用的協(xié)同處理。本發(fā)明的發(fā)酵原料是水解羽毛粉而不是直接以羽毛粉。水解羽毛粉是羽毛粉在高溫和高壓的情況下水解的產(chǎn)物，它在一定程度上破壞了角蛋白胱氨酸之間的雙硫鍵。這有助于后面的生物處理，不但縮短了后面發(fā)酵處理的時(shí)間，而且還提高了發(fā)酵效果。

（4）蛋白酶和角蛋白酶的協(xié)同作用。本發(fā)明通過角蛋白酶和蛋白酶的協(xié)同作用，充分將羽毛粉蛋白降解。本發(fā)明制備的發(fā)酵飼料蛋白胃蛋白消化率可達(dá)到90%以上，而水解羽毛粉的胃蛋白消化率只有70%。

本發(fā)明提供了一種利用水產(chǎn)蛋白和羽毛粉發(fā)酵制備魚粉替代蛋白的方法。本發(fā)明得到的魚粉替代蛋白在華南地區(qū)的對蝦、軍曹魚和羅非魚等水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖試驗(yàn)表明，用本發(fā)明制備的魚粉替代蛋白可大幅度替代優(yōu)質(zhì)進(jìn)口魚粉，明顯降低飼料成本，取得顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面就水產(chǎn)蛋白的種類、發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵方式的選擇結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1：將斜面保藏的能產(chǎn)角蛋白酶的耐高溫兼性厭氧菌bacillusmethylotrophicushl-4接入到滅菌后冷卻的lb液體培養(yǎng)基中，于55℃、150r/min培養(yǎng)12h，制備成bacillusmethylotrophicushl-4種子液備用；將麩皮和水按質(zhì)量比為1：1的比例混合，并混勻制備成麩皮培養(yǎng)基，麩皮培養(yǎng)基于121℃滅菌30min后備用；將制備的bacillusmethylotrophicushl-4種子液接入到滅菌后冷卻的麩皮培養(yǎng)基中并混勻，然后將接入菌種的麩皮培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤中，裝料厚度為4cm，淺盤中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在55℃，發(fā)酵時(shí)間為48h，發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥和粉碎后制備成bacillusmethylotrophicus制劑備用。將南極磷蝦絞碎后備用；將1噸絞碎的南極磷蝦和1噸水解羽毛粉混合，并添加50公斤玉米粉、2公斤氯化鈣、2公斤氯化鋅、1.8公斤氯化亞鐵、2公斤磷酸氫二鉀和50公斤水進(jìn)行混勻，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1公斤蛋白酶和8公斤bacillusmethylotrophicus菌劑，并混勻；加入bacillusmethylotrophicus菌劑和蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行建堆，建堆的物料厚度為120cm，并將建堆的發(fā)酵物料用塑料薄膜蓋上密封好，靜置發(fā)酵66h；發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎和包裝后即可制備成一種魚粉替代蛋白成品。

實(shí)施例2：將斜面保藏的能產(chǎn)角蛋白酶的耐高溫兼性厭氧菌bacillusmethylotrophicushl-4接入到滅菌后冷卻的lb液體培養(yǎng)基中，于55℃、150r/min培養(yǎng)12h，制備成bacillusmethylotrophicushl-4種子液備用；將麩皮和水按質(zhì)量比為1：1的比例混合，并混勻制備成麩皮培養(yǎng)基，麩皮培養(yǎng)基于121℃滅菌30min后備用；將制備的bacillusmethylotrophicushl-4種子液接入到滅菌后冷卻的麩皮培養(yǎng)基中并混勻，然后將接入菌種的麩皮培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤中，裝料厚度為4cm，淺盤中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋滅菌的濕紗布，再將淺盤置于已滅菌的固體發(fā)酵房內(nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在55℃，發(fā)酵時(shí)間為48h，發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥和粉碎后制備成bacillusmethylotrophicus菌劑備用。將羅非魚下腳料絞碎后備用；將1.1噸絞碎的羅非魚下腳料和1噸水解羽毛粉混合，并添加50公斤玉米粉、2公斤氯化鈣、2公斤氯化鋅、1.8公斤氯化亞鐵、2公斤磷酸氫二鉀和50公斤水進(jìn)行混勻，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2公斤蛋白酶和8公斤bacillusmethylotrophicus菌劑，并混勻；加入bacillusmethylotrophicus菌劑和蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行建堆，建堆的物料厚度為130cm，并將建堆的發(fā)酵物料用塑料薄膜蓋上密封好，靜置發(fā)酵70h；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)干燥、粉碎和包裝后即可制備成一種魚粉替代蛋白成品。