本發(fā)明涉及一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品組合物及藥物組合物。

背景技術(shù)：

韓國的肝疾病死亡率非常高，每10萬名人口為23.5名，在40歲年齡段中占死亡原因的首位(41.1名/10萬名)，在50歲年齡段中占死亡原因的第二位(72.4名/10萬名)，在30歲年齡段中占死亡原因的第三位(10名/10萬名)，肝疾病為韓國中年人口的主要死亡原因。

在所述肝疾病中，脂肪肝是指不存在于正常細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪非正常性地沉積在肝細(xì)胞內(nèi)而顯示出的現(xiàn)象。正常肝的約5％是由脂肪組織構(gòu)成，中性脂肪、脂肪酸、磷脂、膽固醇及膽固醇酯為脂肪的主要成分，但一旦發(fā)生脂肪肝時(shí)，大部分的成分會(huì)被中性脂肪所替代，如果中性脂肪的量達(dá)到肝重量的5％以上，則被診斷為脂肪肝。脂肪肝惡化而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪塊變大，則包括核在內(nèi)的細(xì)胞的重要組成成分會(huì)被推向一邊，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的功能降低，并因細(xì)胞內(nèi)蓄積的脂肪而膨脹的肝細(xì)胞會(huì)壓迫肝細(xì)胞之間的微細(xì)血管和淋巴腺，從而使肝內(nèi)的血液和淋巴液的循環(huán)產(chǎn)生障礙。在這樣的情況下，肝細(xì)胞無法得到適當(dāng)?shù)难鯕夤┙o和營養(yǎng)供給，從而會(huì)導(dǎo)致肝功能降低。

非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)并不是酒精所導(dǎo)致的肝損傷，而是指脂肪酸以中性脂肪的形態(tài)在肝的實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)蓄積5％以上的情況。在病理學(xué)上分類為單純性脂肪肝(simplesteatosis)和伴隨炎癥的脂肪肝炎(steatohepatitis)，在長時(shí)間未進(jìn)行治療的情況下，會(huì)轉(zhuǎn)移為肝炎、肝纖維、肝硬化等嚴(yán)重的肝疾病。在韓國，因生活方式的變化，非酒精性肝疾病的發(fā)生頻率也呈增加的趨勢。

另外，白扁豆(dolichoslablablinne)也被稱為藊豆、白藊豆或鵲豆，葉子為三出復(fù)葉，互生，托葉小，呈三角狀卵形，小葉片為寬卵形，葉尖，在莖附近的葉子為寬的楔子形或塊狀，邊緣平直，兩面長有稀疏的絨毛?；榈?，白色，種子為2～5個(gè)，也呈白色。

白扁豆自古以來作為民間療法具有健胃化濕、和中消暑的功效，在韓國授權(quán)專利第0316269號(hào)公開了白扁豆葉的甲醇提取物具有增加生理活性的功效，韓國授權(quán)專利第0929979號(hào)中公開了含有白扁豆的中藥組合物具有能夠減少因抗癌劑的施用而誘導(dǎo)的肝臟和腎臟的毒性的功效，但并沒有關(guān)于對(duì)非酒精性脂肪肝的功效研究方面的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明是基于上述要求而提出的，通過確認(rèn)在使用本發(fā)明的有效成分白扁豆提取物進(jìn)行處理的肝細(xì)胞中，中性脂肪的含量有效地得到減少，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品組合物。

此外，本發(fā)明提供一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝疾病的藥物組合物。

此外，本發(fā)明提供一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于降低因高脂肪食物而增加的體重或血糖的組合物。

此外，本發(fā)明提供一種非酒精性脂肪肝疾病的預(yù)防或治療方法，其包括將白扁豆(dolichoslablablinne)提取物對(duì)個(gè)體進(jìn)行施用的步驟。

此外，本發(fā)明提供一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療人之外的動(dòng)物的脂肪肝疾病的獸醫(yī)學(xué)組合物。

此外，本發(fā)明提供一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或改善動(dòng)物的脂肪肝疾病的飼料添加劑。

發(fā)明的效果

本發(fā)明涉及一種含有白扁豆提取物作為有效成分的用于預(yù)防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品組合物，本發(fā)明的組合物能夠抑制中性脂肪的蓄積，從而能夠在用于預(yù)防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能性食品及醫(yī)藥品中有效使用。

附圖說明

圖1為用不同濃度(0.125mm、0.25mm、0.5mm及1.0mm)的游離脂肪酸對(duì)肝癌細(xì)胞系(hepg2)進(jìn)行處理后，對(duì)中性脂肪的含量進(jìn)行測定的結(jié)果，其中所述游離脂肪酸是以2:1的濃度比混合油酸酯及棕櫚酸酯的。(a)為用尼羅紅(adipored)染色后對(duì)中性脂肪的含量進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，(b)為用油紅o染色后得到的中性脂肪圖像的結(jié)果。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖2為在肝癌細(xì)胞系(hepg2)中對(duì)用1mm的游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪因陽性對(duì)照組18β-甘草次酸(18beta-glycyrrhetinicacid)而減少的程度進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，是在尼羅紅染色后對(duì)中性脂肪的含量進(jìn)行確認(rèn)的圖。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖3為在肝癌細(xì)胞系(hepg2)中對(duì)用1mm的游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪因陽性對(duì)照組18β-甘草次酸(18beta-glycyrrhetinicacid)而減少的程度進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，是在油紅o染色后得到的中性脂肪圖像的結(jié)果。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖4為在肝癌細(xì)胞系(hepg2)中對(duì)用1mm的游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪因白扁豆熱水提取物而減少的程度進(jìn)行確認(rèn)的尼羅紅染色試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖5為在肝癌細(xì)胞系(hepg2)中對(duì)用1mm的游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪因白扁豆熱水提取物而減少的程度進(jìn)行確認(rèn)的油紅o染色試驗(yàn)中所獲得的中性脂肪的圖像。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖6為在肝癌細(xì)胞系(hepg2)中對(duì)用1mm的游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪因白扁豆乙醇提取物而減少的程度進(jìn)行確認(rèn)的尼羅紅染色試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖7為在肝癌細(xì)胞系(hepg2)中對(duì)用1mm的游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪因白扁豆乙醇提取物而減少的程度進(jìn)行確認(rèn)的油紅o染色試驗(yàn)中所獲得的中性脂肪的圖像。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖8為本發(fā)明一實(shí)施例中為了確認(rèn)白扁豆熱水提取物的細(xì)胞毒性而實(shí)施的mts試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的。

圖9為本發(fā)明一實(shí)施例中對(duì)白扁豆熱水提取物和作為對(duì)照組的大豆提取物、黑豆提取物、綠豆提取物及豌豆提取物的減少中性脂肪的含量的程度進(jìn)行比較的尼羅紅染色試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照區(qū)是用未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液處理的，是將用1mm的游離脂肪酸進(jìn)行處理時(shí)的中性脂肪的含量作為100％并以此為基準(zhǔn)來顯示相對(duì)值的。

圖10為本發(fā)明一實(shí)施例中白扁豆熱水提取物對(duì)因高脂肪食物而導(dǎo)致的小鼠的體重增加(a)及肝組織重量的增加(b)帶來的影響的確認(rèn)結(jié)果。con為正常對(duì)照組，hfd為因攝入高脂肪食物而誘發(fā)脂肪肝的高脂肪食物組，hfd+dll-ex為同時(shí)攝取高脂肪食物和25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆熱水提取物的實(shí)驗(yàn)組。(a)中的*和**表示與高脂肪食物組(hfd)相比，攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的組的體重顯著減少，(b)中的##表示與正常組(con)相比，高脂肪食物組(hfd)的肝組織重量有意義地增加(p<0.01)，*和**表示與高脂肪食物組(hfd)相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的實(shí)驗(yàn)組(hfd+dll-ex)的肝組織重量有意義地減少。m100是陽性對(duì)照組，是同時(shí)施用高脂肪食物和水飛薊(milkthistle)提取物(100mg/kg/天)的組。

圖11為本發(fā)明的一實(shí)施例中25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆熱水提取物對(duì)因高脂肪食物而導(dǎo)致的小鼠的總脂肪(a)、腹部皮下脂肪(b)、附睪脂肪組織(c)及小腸脂肪組織(d)的重量帶來的影響的確認(rèn)結(jié)果。##表示與正常組(con)相比，高脂肪食物組(hfd)的總脂肪(a)、腹部皮下脂肪(b)、附睪脂肪組織(c)及小腸脂肪組織(d)的重量有意義地增加(p<0.01)，*和**表示與高脂肪食物組(hfd)相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的實(shí)驗(yàn)組(hfd+dll-ex)的總脂肪(a)、腹部皮下脂肪(b)、附睪脂肪組織(c)及小腸脂肪組織(d)的重量有意義地減少。m100是陽性對(duì)照組，是同時(shí)施用高脂肪食物和水飛薊提取物(100mg/kg/天)的組。

圖12為本發(fā)明的一實(shí)施例中對(duì)25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆熱水提取物是否能減少因高脂肪食物而導(dǎo)致的血液內(nèi)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)的增加進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。##表示與正常組(con)相比，高脂肪食物組(hfd)的alt(a)和ast(b)有意義地增加(p<0.01)，*和**表示與高脂肪食物組(hfd)相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的實(shí)驗(yàn)組(hfd+dll-ex)的alt(a)和ast(b)有意義地減少。m100是陽性對(duì)照組，是同時(shí)施用高脂肪食物和水飛薊提取物(100mg/kg/天)的組。

圖13為本發(fā)明的一實(shí)施例中對(duì)25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆熱水提取物是否能降低因高脂肪食物而導(dǎo)致的血液內(nèi)的中性脂肪(a)、總膽固醇(b)、低密度脂蛋白(c)及游離脂肪酸(d)的增加進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。##表示與正常組(con)相比，高脂肪食物組(hfd)的血液內(nèi)的中性脂肪(a)、總膽固醇(b)、低密度脂蛋白(c)及游離脂肪酸(d)有意義地增加(p<0.01)，*和**表示與高脂肪食物組(hfd)相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的實(shí)驗(yàn)組(hfd+dll-ex)的血液內(nèi)的中性脂肪(a)、總膽固醇(b)、低密度脂蛋白(c)及游離脂肪酸(d)有意義地減少。m100是陽性對(duì)照組，是同時(shí)施用高脂肪食物和水飛薊提取物(100mg/kg/天)的組。

圖14為本發(fā)明的一實(shí)施例中對(duì)25、50、100(mg/kg/天)的白扁豆熱水提取物是否能降低因高脂肪食物而導(dǎo)致的空腹血糖的增加進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。##表示與正常組(con)相比，高脂肪食物組(hfd)的空腹血糖有意義地增加(p<0.01)，*和**表示與高脂肪食物組(hfd)相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的實(shí)驗(yàn)組(hfd+dll-ex)的空腹血糖有意義地減少。m100是陽性對(duì)照組，是同時(shí)施用高脂肪食物和水飛薊提取物(100mg/kg/天)的組。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及一種含有白扁豆提取物作為有效成分的用于預(yù)防或改善非酒精性脂肪肝疾病的健康功能食品組合物。

所述白扁豆提取物可以采用本領(lǐng)域公知的通常的提取溶劑。作為優(yōu)選的提取溶劑，可以使用水、碳原子數(shù)為1～4的無水或含水低級(jí)醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、異丙醇及正丁醇等)、所述低級(jí)醇和水的混合溶劑、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷、二乙醚或乙酸丁酯，進(jìn)一步優(yōu)選為水或乙醇，再進(jìn)一步優(yōu)選為水。

在利用所述水進(jìn)行熱水提取時(shí)，加入相對(duì)于白扁豆重量為5～10倍體積的水，在90～110℃下加熱2～3小時(shí)進(jìn)行提取。優(yōu)選地，將提取溶液用濾紙進(jìn)行過濾后進(jìn)行冷凍干燥來使用，但并不限定于此。

此外，利用乙醇進(jìn)行提取時(shí)，加入相對(duì)于白扁豆重量為5～10倍體積的80％的乙醇，在20～25℃的常溫下浸漬22～24小時(shí)進(jìn)行提取。優(yōu)選地，將提取溶液用濾紙進(jìn)行過濾后進(jìn)行冷凍干燥來使用，但并不限定于此。

所述白扁豆提取物的特征在于減少肝組織的中性脂肪的含量，所述非酒精性脂肪肝疾病的特征在于選自非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及非酒精性肝硬化中的任一種，但并不限定于此。

相對(duì)于組合物總重量，所述白扁豆提取物優(yōu)選為0.1～10重量％，但并不限定于此，可以將所述本發(fā)明的組合物添加到以預(yù)防或改善非酒精性脂肪肝疾病為目的的食品中來制備健康功能性食品，所述健康功能性食品并不特別地限定于此，可以是健康功能性食品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、營養(yǎng)劑、醫(yī)藥食品(pharmafood)、健康食品、營養(yǎng)食品(nutraceutical)、設(shè)計(jì)食品(designerfood)、食品添加劑等所有形態(tài)的食品，優(yōu)選可以為包括肉類、香腸、面包、巧克力、糖果類、點(diǎn)心類、餅干類、比薩餅、拉面、其它面類、口香糖類、冰淇淋類的乳制品，各種湯、飲料、茶、功能飲料、酒精飲料及維生素復(fù)合劑等。此時(shí)，添加的方法可以適當(dāng)?shù)厥褂猛ǔ５姆椒ǎ⒖梢愿鶕?jù)使用目的(預(yù)防、健康或治療性處置)來適當(dāng)?shù)貨Q定添加量。

所述本發(fā)明的組合物還可以進(jìn)一步包含除了有效成分之外的多種成分，對(duì)這些多種成分沒有特別的限制，優(yōu)選可以為各種營養(yǎng)劑、維生素、電解質(zhì)、風(fēng)味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機(jī)酸、保護(hù)膠體增稠劑、ph調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、酒精、碳酸飲料中使用的碳酸化劑等。此外，為了賦予適口性及/或功能性，可以含有用于制備天然果汁、果汁飲料及蔬菜飲料的果肉，這些成分可以單獨(dú)或組合使用。

此外，本發(fā)明涉及一種含有白扁豆提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝疾病的藥物組合物。

所述白扁豆提取物可以采用本領(lǐng)域公知的通常的提取溶劑。作為優(yōu)選的提取溶劑，可以使用水、碳原子數(shù)為1～4的無水或含水低級(jí)醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、異丙醇及正丁醇等)、所述低級(jí)醇和水的混合溶劑、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1,3-丁二醇、己烷、二乙醚或乙酸丁酯，進(jìn)一步優(yōu)選為水或乙醇，再進(jìn)一步優(yōu)選為水。

在利用所述水進(jìn)行熱水提取時(shí)，加入相對(duì)于白扁豆重量為5～10倍體積的水，在90～110℃下加熱2～3小時(shí)進(jìn)行提取。優(yōu)選地，將提取溶液用濾紙進(jìn)行過濾后進(jìn)行冷凍干燥來使用，但并不限定于此。

此外，利用乙醇進(jìn)行提取時(shí)，加入相對(duì)于白扁豆重量為5～10倍體積的80％的乙醇，在20～25℃的常溫下浸漬22～24小時(shí)進(jìn)行提取。優(yōu)選地，將提取溶液用濾紙進(jìn)行過濾后進(jìn)行冷凍干燥來使用，但并不限定于此。

所述白扁豆提取物的特征在于減少肝組織的中性脂肪的含量，所述非酒精性脂肪肝疾病的特征在于選自非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎及非酒精性肝硬化中的任一種，但并不限定于此。

本發(fā)明的藥物組合物可以含有藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物中包含的藥學(xué)上可接受的載體是在制劑時(shí)通常使用的載體，包括鹽水、滅菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、褐藻膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但并不限定于此。

本發(fā)明的藥物組合物中，除了所述成分之外，還可以進(jìn)一步包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑、稀釋劑、表面活性劑、粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑及保存劑等。

本發(fā)明的藥物組合物可以為口服或非口服施用，優(yōu)選為口服施用方式。本發(fā)明的藥物組合物的適合的施用量可以根據(jù)制劑化方法、施用方式、患者的年齡、體重、性別、疾病狀態(tài)、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速度及反應(yīng)感應(yīng)性等因素進(jìn)行不同的處置。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物的施用量是以成人為基準(zhǔn)為0.001～100mg/kg。

本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實(shí)施的方法，并利用藥學(xué)上可接受的載體及/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而制備成單位用量形態(tài)或加入到大容量容器中來制備。此時(shí)，劑型可以為油或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液、糖漿劑或乳化液形態(tài)，或者是浸膏劑、散劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，還可以進(jìn)一步包含分散劑或穩(wěn)定劑。

此外，本發(fā)明涉及一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于降低因高脂肪食物而增加的體重或血糖的組合物。

此外，本發(fā)明涉及一種非酒精性脂肪肝疾病的預(yù)防或治療方法，其包括將白扁豆(dolichoslablablinne)提取物對(duì)個(gè)體進(jìn)行施用的步驟。

所述個(gè)體包括患有非酒精性脂肪肝疾病的患者，還包括具有患非酒精性脂肪肝疾病可能性的人在內(nèi)的所有動(dòng)物。

此外，本發(fā)明涉及一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或治療人之外的動(dòng)物的脂肪肝疾病的獸醫(yī)學(xué)組合物。

本發(fā)明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的獸醫(yī)學(xué)組合物可以進(jìn)一步包含根據(jù)常規(guī)方法的適當(dāng)?shù)馁x形劑及稀釋劑?？梢园诒景l(fā)明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的獸醫(yī)學(xué)組合物中的賦形劑及稀釋劑的例子有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、褐藻膠、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、十六烷醇、十八烷醇、液態(tài)石蠟、山梨醇酐單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯及礦物油。

本發(fā)明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的獸醫(yī)學(xué)組合物可以進(jìn)一步包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、香料、乳化劑、防腐劑等，本發(fā)明的獸醫(yī)學(xué)組合物可以采用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行劑型化，使得在對(duì)動(dòng)物施用后能夠提供活性成分的迅速、持續(xù)或緩慢的釋放，劑型可以為散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠、軟質(zhì)或硬質(zhì)明膠膠囊、栓劑、滅菌注射溶液、滅菌外用劑等形態(tài)。

本發(fā)明的獸醫(yī)學(xué)組合物的施用量會(huì)根據(jù)動(dòng)物的年齡、性別、體重而有所不同，可以將0.1～100mg/kg的量一日施用一次至數(shù)次，可以根據(jù)施用途徑、疾病的程度、性別、體重、年齡等來增減施用量。因此，在任何方面來說，所述施用量并不能限定本發(fā)明的范圍。

此外，本發(fā)明涉及一種含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為有效成分的用于預(yù)防或改善動(dòng)物的脂肪肝疾病的飼料添加劑。

所述飼料添加劑可以是含有20～90重量％的白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的高濃縮液、粉末或顆粒形態(tài)。

本發(fā)明的飼料添加劑可以進(jìn)一步包含選自檸檬酸、富馬酸、己二酸、乳酸、蘋果酸等有機(jī)酸或磷酸鈉、磷酸鉀、酸性焦磷酸鹽、聚磷酸鹽(聚合磷酸鹽)等磷酸鹽或多元酚、焦兒茶酸(catechin)、α-生育酚、迷迭香提取物(rosemaryextract)、維生素c、綠茶提取物、甘草提取物、殼聚糖、鞣酸、植酸等天然抗氧化劑中的一種以上。

本發(fā)明的含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物的動(dòng)物飼料添加劑及包含其的飼料可以和作為輔助成分的氨基酸、無機(jī)鹽類、維生素、抗生物質(zhì)、抗菌物質(zhì)、抗氧化、抗霉菌酶、消化及吸收提高劑、生長促進(jìn)劑、疾病預(yù)防劑等物質(zhì)一起使用。

所述飼料添加劑可以單獨(dú)在食用載體中與其它飼料添加劑組合施用。此外，所述飼料添加劑可以作為表面鋪料(top-dressing)或?qū)⑺鼈冎苯优c動(dòng)物飼料混合，或者與飼料分開以另外的口服劑型、注射或通過皮膚，或者與其它成分組合的方式容易地施用。通常，如本領(lǐng)域公知的那樣，可以采用單次施用一天的施用量或分多次施用一天的施用量。將所述飼料添加劑與動(dòng)物飼料分開進(jìn)行施用的情況下，如本領(lǐng)域公知的那樣，作為提取物的施用形態(tài)，可以將它們與非-毒性制藥方面可接受的食用載體進(jìn)行組合而制備成即釋或緩釋劑型。這種食用載體可以是固體或液體，例如，玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆片、花生油、橄欖油、芝麻油及丙二醇。在使用固體載體時(shí)，提取物的施用型可以是片劑、膠囊劑、散劑、錠劑或含糖片劑或微分散型的表面鋪料。使用液體載體時(shí)，可以是軟明膠膠囊劑或糖漿劑或液體懸浮液劑、乳液劑或溶液劑的施用形態(tài)。此外，施用形態(tài)可以含有助劑，例如保存劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑或溶液促進(jìn)劑等。此外，含有白扁豆(dolichoslablablinne)提取物作為飼料添加劑的動(dòng)物飼料可以是為了滿足動(dòng)物食物需求所通常使用的任意的含蛋白質(zhì)有機(jī)谷粉。這種含蛋白質(zhì)谷粉通常主要由玉米、大豆谷粉或玉米/大豆谷粉混合物構(gòu)成。所述飼料添加劑可以通過浸漬、噴灑或混合來添加到所述動(dòng)物飼料中，并加以利用。

本發(fā)明的獸醫(yī)學(xué)組合物或飼料添加劑可以適用于寵物的食物中。

下面，利用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)說明。這些實(shí)施例僅是為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例是顯而易見的。

[試劑]

1)油紅o(oilredo；西格瑪(cat#o-0625)，fw408.5)儲(chǔ)備溶液的制備

將0.35g的油紅o溶解于100ml的異丙醇(isopropanol)中制備后，利用0.2μm的過濾器(filter)進(jìn)行過濾，并于常溫下保存。

2)油紅o工作溶液的制備

將6ml的所述油紅o儲(chǔ)備溶液和4ml的ddh2o混合后，利用0.2μm的過濾器進(jìn)行過濾，并于常溫下放置20分鐘。

3)10％的福爾馬林溶液的制備

在63ml的ddh2o中稀釋27ml的福爾馬林原液而得到儲(chǔ)備溶液(37％，默克公司，cat#k36658003)，將該儲(chǔ)備溶液與10ml的10xpbs混合。

4)將100％的異丙醇(isopropanol；默克公司，cat#k36543834)作為空白對(duì)照。

5)60％的異丙醇的制備

將6ml的所述100％的異丙醇和4ml的ddh2o混合制得。

實(shí)施例1.肝癌細(xì)胞系(hepg2)的培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞系(hepg2)是購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection，attc)并使用。肝癌細(xì)胞系(hepg2)是用含有10％的fbs、1％的青霉素-鏈霉素的dmem(dulbecco'smodifiedeagle'smedium(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基))培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)。將上述細(xì)胞在37℃下，在5％的co2培養(yǎng)器中培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞以一定的數(shù)量(3×10⁴細(xì)胞/500μl孔)接種到24孔板并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在24孔板中接種細(xì)胞后，待細(xì)胞完全附著到24孔上而具有細(xì)胞的形態(tài)后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到75％的飽和度(confluence)時(shí)進(jìn)行使用。

實(shí)施例2.游離脂肪酸(freefattyacid；ffa)的制備

(1)100mm的棕櫚酸酯(西格瑪p-0500)及100mm的油酸酯(西格瑪o-75010)儲(chǔ)備溶液的制備

在70℃下，利用0.1m的naoh溶液作為溶劑來制備，并利用0.2μm的過濾器過濾后，進(jìn)行滅菌。

(2)未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa(西格瑪a-6003)溶液的制備

將三蒸水(ddh2o)作為溶劑使用而制備后進(jìn)行滅菌，并在4℃下冷藏保存。

(3)使油酸酯和棕櫚酸酯的濃度為2:1進(jìn)行混合的5mm的混合脂肪酸儲(chǔ)備溶液的制備

在60℃下，將上述(2)中制備的溶解于三蒸水中的未包含游離脂肪酸的5％(w/v)的bsa溶液作為溶劑使用，制備10ml的脂肪酸儲(chǔ)備溶液，使得上述(1)中制備的各個(gè)脂肪酸的濃度達(dá)到5mm。對(duì)于上述(1)中制備的100mm的棕櫚酸酯及100mm的油酸酯儲(chǔ)備溶液，取165μl(1.65mm)的棕櫚酸酯(palmitate)及330μl(3.3mm)的油酸酯(oleate)，并一滴一滴地滴到9.505μl的5％(w/v)的bsa溶液的同時(shí)進(jìn)行搖動(dòng)而使其混合(vortexing(渦流))。之后，在常溫下冷卻后，用0.2μm的過濾器過濾(上述制備的混合溶液在-20℃下保存3～4周也穩(wěn)定)。

(4)包含1％(w/v)的bsa的1mm的混合游離脂肪酸的制備

在無菌環(huán)境下，在上述(3)中制備的包含5％(w/v)bsa的5mm混合游離脂肪酸(油酸酯及棕櫚酸酯以2:1的濃度比混合的游離脂肪酸)溶液(10ml)和含有0.5％的fbs/1％的青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中混合包含495μl的naoh的生長培養(yǎng)基(40ml)，從而制備50ml，使得ffa的最終濃度為1mm，bsa為1％(w/v)。

(5)bsa對(duì)照溶液的制備

在含有10ml的5％的ffa-游離bsa溶液+40ml的0.5％的fbs/1％的青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中混合包含495μl的naoh的生長培養(yǎng)基，使得最終體積為50ml。

(6)陽性對(duì)照溶液的制備

將10～100μm的18β-甘草次酸(18beta-glycyrrhetinicacid)作為陽性對(duì)照組使用。

實(shí)施例3.白扁豆提取物的制備

(1)白扁豆熱水提取物的制備

在200g的白扁豆中加入2l的水，在90～100℃的溫度下加熱2～3小時(shí)，然后過濾提取物。之后，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行減壓干燥來獲得白扁豆熱水提取物，為了將所述獲得的白扁豆熱水提取物用于實(shí)驗(yàn)，將其溶解于10％(v/v)的二甲基亞砜(dmso)中并進(jìn)行使用。

(2)白扁豆乙醇提取物的制備

在200g的白扁豆中加入2l的80％的乙醇，在20～25℃的常溫下浸漬22～24小時(shí)，然后過濾提取物。之后，利用減壓濃縮機(jī)進(jìn)行濃縮，并利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行減壓干燥來獲得白扁豆乙醇提取物，為了將所述獲得的白扁豆乙醇提取物用于實(shí)驗(yàn)，將其溶解于10％(v/v)二甲基亞砜中并進(jìn)行使用。

實(shí)施例4.中性脂肪的含量評(píng)價(jià)

(1)尼羅紅染色(adipored染色)試驗(yàn)

利用1mm的游離脂肪酸(ffa)來處理包含肝癌細(xì)胞系(hepg2)的培養(yǎng)基，在24小時(shí)后稍微吸出(suction)培養(yǎng)基。

在37℃的條件下以500μl/孔的量噴灑adipored溶液(將300μl的adipored溶解于10ml的pbs中而制得)后，在黑暗條件的常溫下輕微搖動(dòng)(shaking)15分鐘進(jìn)行反應(yīng)。在該過程中，為了使染料的光褪色(photobleaching)最小化，用鋁箔包裹板來進(jìn)行保存。

待反應(yīng)結(jié)束后，使用分光光度計(jì)(spectrophotometer)，在激發(fā)波長(excitation)為485nm、發(fā)射波長(emission)為572nm的條件下對(duì)其進(jìn)行測定。

(2)油紅o染色試驗(yàn)

從上述肝癌細(xì)胞系(hepg2)中去除培養(yǎng)基后，利用0.5ml的pbs緩沖溶液來清洗細(xì)胞，并完全去除pbs緩沖溶液。之后，在常溫下添加0.5ml的10％的福爾馬林，并孵化(incubation)10分鐘。

去除上述的福爾馬林，并添加0.5ml的新鮮福爾馬林后至少孵化1小時(shí)以上(上述細(xì)胞在染色之前可以在福爾馬林溶液中保存數(shù)日，需要用鋁箔和石蠟?zāi)?parafilm)包裹，以防止細(xì)胞干燥)。

之后，用吸液管去除福爾馬林，然后使用0.5ml的ddh2o來清洗2次。在常溫下利用60％的異丙醇(isopropanol)來清洗細(xì)胞5分鐘。在常溫下使細(xì)胞完全干燥(此時(shí)可以利用干燥機(jī)(drier)進(jìn)行干燥)。

在上述干燥的細(xì)胞中添加0.5ml的油紅o溶液，并在常溫下孵化10分鐘，然后去除油紅o溶液，并立即添加ddh2o重復(fù)清洗4次。盡可能地去除染色溶液的碎片，之后利用熒光顯微鏡獲取圖像。

完全去除水氣，并在干燥狀態(tài)下添加0.5ml的溶解于100％的異丙醇中的油紅o染色溶液，輕輕搖動(dòng)10分鐘進(jìn)行孵化。此時(shí)，用吸液管向上下進(jìn)行混合，使得油紅o染色能夠很好地滲透，然后移至96孔板中，并在500nm下測定od(光密度)。測定100％的異丙醇的od值來用作基準(zhǔn)值(0點(diǎn))。

4.1.對(duì)肝癌細(xì)胞系(hepg2)中因游離脂肪酸而增加的中性脂肪的含量進(jìn)行確認(rèn)

為了確認(rèn)白扁豆提取物對(duì)于非酒精性脂肪肝(nafld)的功效，使用作為細(xì)胞模型的由游離脂肪酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞性非酒精性脂肪肝模型。

用以2:1的重量比混合油酸和棕櫚酸的游離脂肪酸分別以0.125mm、0.25mm、0.5mm及1.0mm的濃度對(duì)肝癌細(xì)胞系(hepg2)進(jìn)行處理后，通過尼羅紅染色試驗(yàn)和油紅o染色試驗(yàn)來確認(rèn)中性脂肪的含量變化的結(jié)果，確認(rèn)了中性脂肪的含量與游離脂肪酸的濃度的增加呈比例地增加(圖1)。

4.2.利用白扁豆提取物對(duì)肝癌細(xì)胞系(hepg2)中用游離脂肪酸處理而生成的中性脂肪的含量的減少效果進(jìn)行確認(rèn)

首先，將已知具有分解中性脂肪的效果的物質(zhì)18β-甘草次酸以不同濃度(0、10μm、30μm、50μm及100μm)進(jìn)行處理，從而確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪的含量減少的程度。

如圖2中所示，對(duì)利用不同濃度(0、10μm、30μm、50μm及100μm)的18β-甘草次酸處理的肝癌細(xì)胞系實(shí)施尼羅紅染色試驗(yàn)的結(jié)果，可知18β-甘草次酸具有能夠減少約10～15％左右的中性脂肪含量的效果。在油紅o染色試驗(yàn)結(jié)果的圖像中也獲得了隨著18β-甘草次酸的濃度的增加中性脂肪減少的圖像(圖3)。

之后，通過尼羅紅染色試驗(yàn)和油紅o染色試驗(yàn)對(duì)肝癌細(xì)胞系(hepg2)中的中性脂肪因白扁豆熱水提取物而減少的情況進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，確認(rèn)了對(duì)于白扁豆熱水提取物10μg/ml、50μg/ml及100μg/ml的濃度約有28％左右的中性脂肪會(huì)隨著濃度顯著減少的效果，其中所述中性脂肪是利用1mm的油酸酯及棕櫚酸酯的混合(2:1)游離脂肪酸對(duì)肝癌細(xì)胞系(hepg2)進(jìn)行處理所生成的中性脂肪(圖4及圖5)。

此外，白扁豆乙醇提取物與所述白扁豆熱水提取物相比減少的程度稍微會(huì)弱一些，但如圖6及圖7所示，在尼羅紅染色試驗(yàn)和油紅o染色試驗(yàn)結(jié)果中，確認(rèn)了降低肝細(xì)胞內(nèi)中性脂肪含量的效果為10～15％左右。

4.3.白扁豆熱水提取物及豆類(大豆、黑豆、綠豆及豌豆)提取物的中性脂肪含量減少效果的比較

為了確認(rèn)在其它的豆類提取物中是否也有白扁豆熱水提取物在肝細(xì)胞內(nèi)減少中性脂肪含量的效果，將大豆提取物、黑豆提取物、綠豆提取物及豌豆提取物作為對(duì)照組使用來實(shí)施尼羅紅試驗(yàn)，從而分析中性脂肪含量的變化。尼羅紅試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，除了本發(fā)明的白扁豆提取物之外，在其它的豆類提取物中未顯示出減少中性脂肪的效果，僅在白扁豆提取物中確認(rèn)了中性脂肪得到顯著減少的效果(圖9)。

實(shí)施例5.對(duì)白扁豆提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)行確認(rèn)

為了確認(rèn)本發(fā)明的白扁豆熱水提取物的細(xì)胞毒性，實(shí)施了mts試驗(yàn)。mts試驗(yàn)采用通常的實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施，其結(jié)果如圖8所示，觀察到在以500μg/ml的高濃度處理的情況下，細(xì)胞生存率也幾乎沒有變化，從而確認(rèn)了幾乎不會(huì)顯示出細(xì)胞毒性。

實(shí)施例6.白扁豆提取物對(duì)高脂肪食物小鼠的效果的確認(rèn)

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為120只8周齡雄性c57bl/6j小鼠，購自samtako公司，適應(yīng)2周后用于實(shí)驗(yàn)。之后，通過隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)(randomizedcompleteblockdesign)分為正常食物對(duì)照組(con，10％的脂肪)、高脂肪食物對(duì)照組(hfd，60％的脂肪)、施用高脂肪食物的同時(shí)施用上述實(shí)施例3的(1)中制備的白扁豆熱水提取物的組(25mg/kg/天，50mg/kg/天，100mg/kg/天)及作為陽性對(duì)照組的施用高脂肪食物的同時(shí)施用水飛薊提取物(100mg/kg/天)的組，共飼養(yǎng)9周，水和實(shí)驗(yàn)食物則自由供給。每組使用20只小鼠。以各組為對(duì)象，將上述高脂肪食物和提取物每天以口服施用方式供給9周。在9周期間，每周測定一次體重的變化，并測定食物攝取量、肝重量、腹部脂肪重量。飼養(yǎng)室的溫度維持在22±1℃，濕度維持在50±5％，以12小時(shí)為間隔來調(diào)節(jié)黑暗和光照。從中央實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(centrallab.animalinc.)購入10％的正常食物和60％的高脂肪食物并進(jìn)行供應(yīng)。

(2)體重變化和肝組織、總脂肪、腹部皮下脂肪、附睪脂肪組織及小腸脂肪組織的變化

確認(rèn)了上述實(shí)施例3的(1)中制備的白扁豆熱水提取物對(duì)因高脂肪食物而增加的小鼠體重帶來的影響，其結(jié)果為，與高脂肪食物組相比，攝取高脂肪食物的同時(shí)攝取本發(fā)明的實(shí)施例3的(1)中制備的白扁豆熱水提取物的組的體重顯示出顯著低的結(jié)果。尤其，在施用100mg/kg/天的白扁豆熱水提取物的組中，顯示出體重的增加顯著低的結(jié)果(圖10a)。

確認(rèn)了實(shí)施例3的(1)中制備的白扁豆熱水提取物是否能減少因高脂肪食物而增加的肝組織重量，其結(jié)果為，與高脂肪食物組相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和本發(fā)明的白扁豆熱水提取物的組的肝組織重量顯示出顯著減少的結(jié)果。

高脂肪食物的長期攝入會(huì)誘發(fā)非酒精性脂肪肝。因此，在本實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)了因攝取高脂肪食物而誘發(fā)脂肪肝的高脂肪食物組(hfd)的肝組織重量與正常對(duì)照組(con)的肝組織重量相比顯著增加，在同時(shí)施用高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的組中顯示出肝組織的重量顯著低的結(jié)果。尤其，在施用高脂肪食物的同時(shí)施用100mg/kg/天的白扁豆熱水提取物的組中顯示出肝組織的重量顯著低的結(jié)果(圖10b)。這樣的結(jié)果是能夠支持本發(fā)明的白扁豆熱水提取物具有防止因高脂肪食物而誘發(fā)的肝組織的脂肪蓄積的效果的結(jié)果。

此外，確認(rèn)了本發(fā)明的白扁豆熱水提取物對(duì)因高脂肪食物而引起的小鼠的總脂肪、腹部皮下脂肪、附睪脂肪組織及小腸脂肪組織的增加帶來的影響，其結(jié)果為，與高脂肪食物組相比，在同時(shí)攝取高脂肪食物和白扁豆熱水提取物的組中顯示出總脂肪、腹部皮下脂肪、附睪脂肪組織及小腸脂肪組織的增加顯著減少的結(jié)果。尤其，在施用100mg/kg/天的白扁豆熱水提取物的組中顯示出顯著低的結(jié)果(圖11)。

這樣的結(jié)果說明本發(fā)明的生藥提取物具有預(yù)防或治療肥胖的效果。

(3)血中的alt、ast的變化

確認(rèn)了本發(fā)明的白扁豆熱水提取物是否能減少因高脂肪食物而引起的血中的alt和ast的增加，其結(jié)果為，與高脂肪食物組相比，同時(shí)攝取高脂肪食物和本發(fā)明的實(shí)施例3的(1)中制備的白扁豆熱水提取物的組的alt和ast顯示出顯著減少的結(jié)果(圖12)。

這樣的結(jié)果表明本發(fā)明的白扁豆熱水提取物的食物添加能夠減少血中的sgpt(alt)和sgot(ast)酶活性，這說明本發(fā)明的生藥提取物能夠改善因高脂肪食物而產(chǎn)生的非酒精性脂肪，從而顯示出抑制肝損傷的功效。

(4)血液內(nèi)的中性脂肪、總膽固醇、低密度脂蛋白、游離脂肪酸的變化

確認(rèn)了本發(fā)明的實(shí)施例3的(1)中制備的白扁豆熱水提取物是否能減少因高脂肪食物而增加的血液內(nèi)的中性脂肪、總膽固醇、低密度脂蛋白及游離脂肪酸的數(shù)值，其結(jié)果為，在高脂肪食物組中顯著增加的中性脂肪，總膽固醇、低密度脂蛋白及游離脂肪酸數(shù)值在施用白扁豆熱水提取物的組中顯示出隨著濃度較顯著減少的結(jié)果(圖13)。

因此，白扁豆熱水提取物的食物添加能夠顯著減少血液內(nèi)的脂質(zhì)水平，從而改善因高脂肪食物而誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝。

(5)空腹時(shí)的血中糖濃度變化

確認(rèn)了本發(fā)明的白扁豆熱水提取物是否能減少因高脂肪食物而導(dǎo)致的血中糖濃度，其結(jié)果為，與高脂肪食物組相比，在同時(shí)攝取高脂肪食物和本發(fā)明的白扁豆熱水提取物的組中血中糖濃度會(huì)隨著濃度顯著減少(圖14)。

因此，顯示出本發(fā)明的白扁豆熱水提取物的食物添加能夠顯著減少血清內(nèi)糖濃度。